專利名稱：從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法
技術領域：
本發明涉及植物提取物的分離純化領域，具體是一種從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法。
(二)技術背景紫杉醇是近二十年來世界上發現的最有希望的抗癌藥物，對治療乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌、肝癌等癌癥均有良好療效，對癌細胞有極強的殺傷力，而毒副作用極小。因此成為目前藥品行業研究的重點。
紫杉醇屬于二萜類生物堿。最開始是從天然植物紅豆杉中提取分離紫杉醇。紅豆杉是珍稀物種，天然紅豆杉資源極為有限，而且紅豆杉生長緩慢，天然紅豆杉無法滿足紫杉醇生產的需要量。為了開辟紫杉醇的新的來源，人們研究了從人工種植的曼地亞紅豆杉中提取分離紫杉醇、紅豆杉細胞培養生產紫杉醇及多種生物合成、半合成、全合成紫杉醇工藝。無論采用何種工藝，由于紫杉醇合成率低、成本高，所以紫杉醇價格昂貴。另外從多種結構相近的衍生物、同系物的混合物中分離純化出紫杉醇藥物，特別是紫杉醇與三尖杉寧堿的分離，是很困難的工作。分離純化過程中收率稍有升降，即意味著珍貴的紫杉醇的得失多少，效益上將有巨大差異。所以如何改進紫杉醇的分離純化工藝，是目前普遍重視的課題。
目前的分離方法主要有硅膠柱層析法、氧化鋁柱層析法，純化方法主要有C18柱層析、氟苯基柱層析等反相層析法和硅膠柱層析正相層析法。
有關紫杉醇的分離純化工藝的專利申請有多件，如加拿大植原藥物公司1999年申請的中國專利99815315.X“從含紫杉醇物質生產紫杉醇的高產率提取方法”用丙酮/水沉淀法制備高純度紫杉醇，復旦大學1998年申請的中國專利“一種清潔純化紫杉醇的方法”使用填充色譜柱正構烷烴淋洗純化紫杉醇粗產物，梅縣梅雁生物工程研究所2001申請的中國專利“從紅豆杉細胞培養液濾液中富集提取紫杉醇的方法”將大孔吸附樹脂與試液充分混合進行吸附富集，有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇，濃縮得到高含紫杉醇的濃縮物。
現有的分離純化方法的不足之處在于，紫杉醇一次收率(即從投料開始，經過按順序的工藝流程，而得到的產出物收得率，以有效成份紫杉醇計算。不包括副產出物的反復投入)僅為70％；而且要使用易燃、易爆或有毒溶劑，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等，對人體有害，污染環境，生產操作過程危險性高；此外上樣量小，一般硅膠柱層析時硅膠與樣品的比例為150比0.9～1.0。
發明內容本發明的目的是提供一種收率高、且生產操作安全的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法。
本發明的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，包含下述步驟①紫杉醇含量為9～20％的紫杉醇粗產品為原料樣品；②用大孔吸附樹脂作固定相，大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9～1.4；③用能與水混溶的、濃度為40～70％極性溶劑水溶液為流動相；④用柱層析法分離純化紫杉醇，樣品溶液從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣；⑤流動相洗脫時，層析柱內流出液流速為0.6～1.5升/小時；⑥按時間分段收集經層析后的流出液，每小時收集1份，至HPLC檢測紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時終止，按時間段收集的流出液分為三部分；⑦第I部分流出液中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑧第II部分流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A；⑨第III部分流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B。
本發明從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法的優點為1、分離純化效果好，很方便地將紫杉醇含量為9～20％的紫杉醇粗產品純化為含紫杉醇40～60％的紫杉醇中間產品；2、收率高，紫杉醇一次性收率高達80％左右；3、操作安全，不使用易燃、易爆或有毒溶劑；4、上樣量大，大孔吸附樹脂與樣品的重量比高達10比0.9～1.5，是一般硅膠柱層析時硅膠上樣量的15倍；5、可除去紫杉醇粗產品中的水溶性雜質。
具體實施方式
實施例1①原料樣品中紫杉醇含量為15.6％的紫杉醇粗產品100克，其中紫杉醇凈含量15.6克；
②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95％(V/V)極性溶劑乙醇中，然后加水至乙醇濃度為60％(V/V)，樣品與乙醇水溶液重量比約為1比5；③大孔吸附樹脂AB-8 1000克，與樣品的重量比為10比1，裝入外徑6厘米可充填高度100厘米的玻璃層析柱內；④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣，即將樣品溶液倒入層析柱中，調節層析柱出口閥門，控制層析柱內溶液流速為1升/小時；⑤ 按時間分段收集經層析后的流出液，每小時收集1份，至HPLC檢測紫杉醇濃度為0.2毫克/毫升時終止；⑥1～4份流出液為第I部分，其中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑦5～20份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A8.35克，其中含紫杉醇37.4％，即紫杉醇凈含量為3.12克，占原料中紫杉醇的20％；⑧21～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 18.2克，其中含紫杉醇54.2％，即紫杉醇凈含量為9.86克，占原料中紫杉醇的63.2％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.98克，占原料中紫杉醇的83.2％，即紫杉醇的一次性收率為83.2％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.9％。
實施例2使用大孔吸附樹脂D101，①～⑥步其它條件與實施例1相同；⑦5～20份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A8.55克，其中含紫杉醇38.5％，即紫杉醇凈含量為3.29克，占原料中紫杉醇的21.09％；⑧21～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 17.5克，其中含紫杉醇53.5％，即紫杉醇凈含量為9.36克，占原料中紫杉醇的60.01％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.65克，占原料中紫杉醇的81.1％，即紫杉醇的一次性收率為81.1％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.6％。
實施例3使用大孔吸附樹脂D201，①～⑥步其它條件與實施例1相同；⑦5～20份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A8.765克，其中含紫杉醇40.2％，即紫杉醇凈含量為3.52克，占原料中紫杉醇的22.57％；⑧21～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 18.5克，其中含紫杉醇50.2％，即紫杉醇凈含量為9.19克，占原料中紫杉醇的59.53％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.81克，占原料中紫杉醇的82.1％，即紫杉醇的一次性收率為82.1％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為47.0％。
實施例4使用大孔吸附樹脂AK-9，①～⑥步其它條件與實施例1相同；⑦5～20份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A8.60克，其中含紫杉醇37.8％，即紫杉醇凈含量為3.25克，占原料中紫杉醇的20.84％；⑧21～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B17.4克，其中含紫杉醇51.2％，即紫杉醇凈含量為8.91克，占原料中紫杉醇的57.11％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.16克，占原料中紫杉醇的77.9％，即紫杉醇的一次性收率為77.9％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為46.8％。
實施例5①與實施例1相同；②紫杉醇樣品原料溶于200毫升極性溶劑丙酮中，然后加水至丙酮濃度為40％(V/V)，樣品與丙酮水溶液重量比約為1比6；③～⑤與實施例1相同；⑥1～2份流出液為第I部分，其中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑦3～6份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A11.5克，其中含紫杉醇30.2％，即紫杉醇凈含量為3.59克，占原料中紫杉醇的23.0％；⑧17～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 19.7克，其中含紫杉醇48.3％，即紫杉醇凈含量為9.52克，占原料中紫杉醇的61.0％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為12.11克，占原料中紫杉醇的42.0％，即紫杉醇的一次性收率為42.0％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為84.0％。
實施例6①原料樣品中紫杉醇含量為9.5％的紫杉醇粗產品140克，其中紫杉醇凈含量13.3克；②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95％(V/V)極性溶劑乙醇中，然后加水至乙醇濃度為70％(V/V)，樣品與乙醇水溶液重量比約為1比4；③與實施例1相同；④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣，即將樣品溶液倒入層析柱中，調節層析柱出口閥門，控制層析柱內溶液流速為0.6升/小時；⑤與實施例1相同；⑥第1份流出液為第I部分，其中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑦2～16份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A8.72克，其中含紫杉醇30.2％，即紫杉醇凈含量為2.63克，占原料中紫杉醇的19.8％；⑧16～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 20.55克，其中含紫杉醇41.8％，即紫杉醇凈含量為8.59克，占原料中紫杉醇的64.59％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為11.22克，占原料中紫杉醇的84.4％，即紫杉醇的一次性收率為84.4％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為38.3％。
實施例7①原料樣品中紫杉醇含量為11.8％的紫杉醇粗產品95克，其中紫杉醇凈含量11.2克；②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95％(V/V)極性溶劑乙醇中，然后加水至乙醇濃度為50％(V/V)，樣品與乙醇水溶液重量比約為1比6；③與實施例1相同；④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣，即將樣品溶液倒入層析柱中，調節層析柱出口閥門，控制層析柱內溶液流速為1.5升/小時；⑤與實施例1相同；⑥1～6份流出液為第I部分，其中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑦7～23份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A4.59克，其中含紫杉醇36.1％，即紫杉醇凈含量為1.66克，占原料中紫杉醇的14.79％；
⑧24～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 11.98克，其中含紫杉醇56.2％，即紫杉醇凈含量為6.73克，占原料中紫杉醇的60.1％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為8.39克，占原料中紫杉醇的74.9％，即紫杉醇的一次性收率為74.9％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為50.6％。
實施例8①原料樣品中紫杉醇含量為18.6％的紫杉醇粗產品120克，其中紫杉醇凈含量22.32克；②紫杉醇樣品原料溶于300毫升95％(V/V)極性溶劑乙醇中，然后加水至乙醇濃度為65％(V/V)，樣品與乙醇水溶液重量比約為1比4.5；③與實施例1相同；④從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣，即將樣品溶液倒入層析柱中，調節層析柱出口閥門，控制層析柱內溶液流速為1.2升/小時；⑤與實施例1相同；⑥1～3份流出液為第I部分，其中基本無紫杉醇，集中處理，回收溶劑；⑦4～18份流出液為第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A 11.31克，其中含紫杉醇38.3％，即紫杉醇凈含量為4.33克，占原料中紫杉醇的19.41％；⑧19～終止的流出液為第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B 27.34克，其中含紫杉醇52.9％，即紫杉醇凈含量為14.46克，占原料中紫杉醇的64.8％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量共為18.79克，占原料中紫杉醇的84.2％，即紫杉醇的一次性收率為84.2％。
紫杉醇中間產品A和B中的紫杉醇凈含量平均為48.6％。
權利要求
1 一種從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，包含下述步驟①紫杉醇含量為9～20％的紫杉醇粗產品為原料樣品；②用大孔吸附樹脂作固定相，大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9～1.4；③用能與水混溶的、濃度為40～70％極性溶劑水溶液為流動相；④用柱層析法分離純化紫杉醇，樣品溶液從大孔吸附樹脂的層析柱頂端上樣；⑤流動相洗脫時，層析柱內流出液流速為0.6～1.5升/小時；⑥按時間分段收集經層析后的流出液，每小時收集1份，至HPLC檢測紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時終止；⑦流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A；⑧流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B。
2 如權利要求1所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中的所述的大孔吸附樹脂為AB-8、或D101、或D201、或AK-9。
3 如權利要求1或2所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的極性溶劑為乙醇、或丙酮。
4 如權利要求1至3中任一項所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的極性溶劑水溶液的濃度為55～65％。
5 如權利要求4所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的極性溶劑水溶液的濃度為58～62％。
6 如權利要求1至5中任一項所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.9～1.2。
7 如權利要求6所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的大孔吸附樹脂與樣品的重量比為10比0.95～1.05。
8 如權利要求1至7中任一項所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的層析柱內流出液流速為0.8～1.2升/小時。
9 如權利要求8所述的從紫杉醇粗產品分離純化紫杉醇的方法，其特征為其中所述的層析柱內流出液流速為0.9～1.1升/小時。
全文摘要
本法用大孔吸附樹脂如AB－8、D101、D201、AK－9作固定相，40～70％極性溶劑如乙醇、丙酮的水溶液為流動相，柱層析法分離純化紫杉醇，流出液流速為0.6～1.5升/小時，每小時收集1份，至紫杉醇濃度低于0.2毫克/毫升時終止，按時間分段收集流出液；流出液中紫杉醇含量小于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品A；流出液中紫杉醇含量大于三尖杉寧堿含量，濃縮干燥得紫杉醇中間產品B。本法便于將9～20％的紫杉醇粗產品分離純化為40～60％的紫杉醇中間產品；一次性收率高達80％；操作安全，不使用易燃、易爆或有毒溶劑；上樣量大，大孔吸附樹脂與樣品的重量比高達10比0.9～1.5，是一般層析上樣量的15倍；可除去粗產品中的水溶性雜質。
文檔編號C07D305/00GK1526708SQ0313591
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月22日 優先權日2003年9月22日
發明者丁志堅, 徐位坤 申請人:丁志堅