專利名稱：紫杉醇和厚葉蕨醇的層析分離方法
技術領域：
本發明涉及分離紫杉醇和紫杉醇類似物厚葉蕨醇(cephalomannin)，該分離由紅豆杉屬植物(Taxus)的植物提取物或其細胞培養物開始。具體地講，是通過正相硅膠柱上用層析方法將厚葉蕨醇與紫杉醇分離。
紫杉醇的主要天然來源是太平洋漿果紫杉(短葉紅豆杉)的樹皮。還已發現紫杉醇存在于其它漿果紫杉的地上部分和根中，包括歐洲漿果紫杉(金黃歐洲紅豆杉)、亞洲漿果紫杉(西藏紅豆杉和中國紅豆杉)，以及為觀賞目的培育的紫杉樹(例如，密生紅豆杉)。
從天然來源中分離紫杉醇的方法復雜且成本高，這部分因為在植物材料中的濃度較低，還因為它的一種同類物厚葉蕨醇的存在。紫杉醇和厚葉蕨醇的濃度及其之間的比率依目標植物的種類和部位隨植物材料而變化。一般來說，現已發現紫杉醇和厚葉蕨醇的含量范圍分別為0.001％至0.08％和0.001％至0.22％(K.M.Witherup等，J.Nat.Prod.，53，1249，1990；R.G.Kelsey等，J.Nat.Prod.，55，912，1992；N.C.Wheeler等，J.Nat.Prod.，55，432，1992)。具體地講，作為可再生的植物材料，密生紅豆杉類是制備紫杉醇最常用的原料，與其它種相比其中含有的厚葉蕨醇的濃度最高。
即使是基于紫杉細胞培養物的紫杉醇制備技術，最近其已得到實質性的提高，避免了對成本高的植物材料的常規提取，除紫杉醇外，仍得到了相當量的厚葉蕨醇。
紫杉醇和厚葉蕨醇之間結構的差別僅在于化合物的側鏈部分，因此給出了相似的化學性質。因此，這兩種化合物具有非常相似的層析性質，因此將這些相關化合物徹底分離非常困難。人們已提出了一些層析方法，這些方法主要基于使用反相色譜或高成本的鍵合相柱(J.H.Cardellina，J.Liq.Chromatogr.，14，659，1991；S.L.Richheimer等，Anal.Chem.64，2323，1992；E.R.M.Wickremesinhe等，J.LiqChromatogr.，16，3263，1993；K.M.Witherup等，J.Liq.Chromatogr.，12，2117，1989)，但是這些方法不易于大的商業規模操作。因此，分離紫杉醇和厚葉蕨醇的方法仍具有極其重要的實踐上的意義。
過去，基于這兩種化合物對氧化劑的不同反應性，曾有人提出了紫杉醇和厚葉蕨醇的分離方法。發現存在于厚葉蕨醇的甲基巴豆酸殘基的雙鍵可以被四氧化鋨氧化(D.G.I.Kingston等，J.Nat.Prod.，55，259，1992)或被臭氧氧化(J.T.Beckvermit等，J.Org.Chem.，61，9038，1996)，而紫杉醇在這些氧化反應期間不進行任何轉變。另一研究考慮用溴處理紫杉醇和厚葉蕨醇的混合物(J.M.Rimoldi等，J.Nat.Prod.，59，167，1996)。用溴處理，在受控的溫度和時間條件下進行，形成了二溴厚葉蕨醇，而紫杉醇不受此化學試劑的影響。但是，這些方法的缺點是使用如四氧化鋨這樣的毒性試劑，且在無論如何導致了厚葉蕨醇被破壞和轉變為其衍生物，而只有通過困難的合成方法才能由這樣的衍生物再生為厚葉蕨醇。因此，仍需要找到低成本的、簡單、安全和有效的分離厚葉蕨醇和紫杉醇的方法。因此，本發明的主要目的是提供從其混合物或紫杉提取物中分離紫杉醇和厚葉蕨醇的簡單方法。
本發明的原料可以只是任何比例的厚葉蕨醇和紫杉醇的混合物，或者是鮮或干的紅豆杉的根、葉、枝、種子或其混合物的提取物。本發明的方法還可以包括由細胞培養物獲得的提取物。這些原料是本領域技術人員已知的，故不需要在本文中進一步敘述。
所述提取物可以是粗或者純的提取物，后者已經過常規溶劑處理并進行了初步的色譜純化。這些技術也是本領域技術人員熟知的，故不需要在本文中進一步敘述。取決于用于制備的試驗條件，原料可以是固體、漿狀物或者半固體膠狀物。在其溶解于本文中描述的溶劑之一后，該物質可以直接進行柱層析。
本發明的層析純化，根據其組分使用占原料重量約50至100份的普通、正相硅膠。
用本發明溶劑進行的柱層析是快速的，不需要高壓，在正常重力條件下進行。
表1顯示了厚葉蕨醇和紫杉醇在薄層層析分析中用硅膠和本發明的系列溶劑的行為，使這兩種化合物的分離是令人滿意的。
表1紫杉醇和厚葉蕨醇在硅膠板上的Rf溶劑 R1R2紫杉醇厚葉蕨醇甲酸正丁酯H n-C4H90.17 0.12甲酸異丁酯H i-C4H90.20 0.15甲酸叔丁酯H t-C4H90.20 0.13甲酸正丁酯CH3n-C4H90.36 0.28甲酸仲丁酯CH3s-C4H90.35 0.24乙酸異丁酯CH3i-C4H90.31 0.19乙酸叔丁酯CH3t-C4H90.19 0.09乙酸芐基酯CH3PhCH20.28 0.16用本發明描述的溶劑在正相硅膠柱上通過層析分離紫杉醇和厚葉蕨醇有許多優點。
首先，通過柱層析得到了實際上不含厚葉蕨醇的紫杉醇，以及幾乎不含紫杉醇的厚葉蕨醇。其次，正相硅膠的使用比文獻中描述的反相硅膠的使用提供了相當的經濟上的益處，第三，用一種溶劑進行柱洗脫允許其快速回收循環，不需要采取工業的連續制備相關操作中的分級蒸餾。原料中與紫杉醇和厚葉蕨醇同時存在的任何其它組分均可通過層析純化除去。
將洗脫的級分真空蒸發至干，并用適宜的溶劑將殘余物結晶，以所需的晶型獲得紫杉醇和厚葉蕨醇。
因此，通過增加所得量的收率，并創立此抗腫瘤藥的廉價的制備方法，本發明描述的方法為制備大量的不含厚葉蕨醇的紫杉醇提供了簡單的解決方案。
實施例1由含厚葉蕨醇的密生紅豆杉提取物中分離紫杉醇通過HPLC分析，發現由620kg密生紅豆杉(全植物)按照V.Senilh等描述的方法(J.Nat.Prod.47，131，1984)制備的290g提取物含有183g紫杉醇和81g厚葉蕨醇。將此提取物溶解于3.5升乙酸叔丁酯中，并加樣到含60kg硅膠的柱上。共洗脫出1200升的叔丁基。用350升溶劑洗脫后，得到400升含紫杉醇和少于3％厚葉蕨醇的級分，以及200升含厚葉蕨醇和少于3％紫杉醇的另一種級分。將這兩種級分分別真空濃縮至干，并用己烷-丙酮將此殘余物結晶。于是，獲得了154g紫杉醇和70g厚葉蕨醇，它們的HPLC純度大于99％，且它們的理化數值和光譜值與文獻(G.N.Chmurny等，J.Nat.Prod.55，414，1992；C.J.Falzone等，Tetrahedron Letters，33，1169，1992；V.Senilh等，J.Nat.Prod.47，131，1984)的記載相符。
實施例2從其混合物中分離紫杉醇和厚葉蕨醇將含70g紫杉醇和30g厚葉蕨醇的混合物溶解于1.5升甲酸叔丁酯中，并上樣到含10kg懸浮于同樣溶劑的硅膠上。將此柱用甲酸叔丁酯洗脫，并在HPLC/TLC分析后合并級分。分別將含紫杉醇和厚葉蕨醇的級分濃縮至干，并用適當比例的丙酮和庚烷將這些殘余物結晶，得到HPLC純度超過99％的紫杉醇和厚葉蕨醇。
權利要求
1.分離紫杉醇和厚葉蕨醇的方法，其中包括獲得含紫杉醇和厚葉蕨醇的原料；將原料溶解于具有如下結構式的溶劑中以形成混合物 其中R1是氫原子或甲基，而R2為含有4至7個碳原子的烷基或芳基烷基。將此混合物進行柱層析以獲得紫杉醇的洗脫級分、厚葉蕨醇的洗脫級分和一種殘余物；并分別干燥紫杉醇和厚葉蕨醇級分以分別獲得獨立的紫杉醇和厚葉蕨醇的結晶。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述原料含有任何比例的厚葉蕨醇和紫杉醇。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述原料是鮮和干的紅豆杉的根、葉、枝、種子或其混合物的提取物。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述原料是得自紅豆杉屬物質的細胞培養物的提取物。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述原料是固體、漿狀物和半固體膠狀物形式。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述溶劑結構包括R1為氫原子或甲基，而R2為正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。
7.分離紫杉醇和厚葉蕨醇的方法，其中包括獲得含紫杉醇和厚葉蕨醇的原料；將此原料溶解于下式結構的溶劑中以形成混合物 其中R1是氫原子或甲基，而R2為含有4至7個碳原子的烷基或芳烷基；將所述混合物用正相硅膠柱用上式的單一溶劑作為洗脫劑進行柱層析，得到紫杉醇的洗脫級分、厚葉蕨醇的洗脫級分和一種殘余物；及分別干燥紫杉醇和厚葉蕨醇級分，以分別獲得獨立的紫杉醇和厚葉蕨醇的結晶形式。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述式的溶劑包括R1為氫原子或甲基，而R2為正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。
9.根據權利要求7所述的方法，其中所述硅膠的用量為原料的約50至100重量份。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述原料含有任何比例的厚葉蕨醇和紫杉醇。
11.根據權利要求7所述的方法，其中所述原料是鮮或干的紅豆杉根、葉、枝、種子或其混合物的提取物。
12.根據權利要求7所述的方法，其中所述原料是由紅豆杉屬物質的細胞培養物獲得的提取物。
13.根據權利要求7所述的方法，其中所述原料是固體、漿狀物或半固體漿狀物的形式。
14.權利要求7所述的方法，其中所述式的溶劑包括R1為氫原子或甲基，而R2是正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。
全文摘要
分離紫杉醇和厚葉蕨醇以及其它相關化合物的方法，其中包括獲得含紫杉醇和厚葉蕨醇的原料；將原料溶解于任何一種特定的溶劑如甲酸丁酯和乙酸丁酯中以形成混合物；將此混合物進行柱層析以獲得紫杉醇的洗脫級分、厚葉蕨醇的洗脫級分和一種殘余物；并分別干燥紫杉醇和厚葉蕨醇級分以分別獲得獨立的紫杉醇和厚葉蕨醇的結晶。
文檔編號C07D305/14GK1396917SQ01804134
公開日2003年2月12日 申請日期2001年11月9日 優先權日2000年11月28日
發明者B·加貝塔, G·齊尼 申請人:因德納有限公司