專利名稱：流感疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的流感病毒抗原制劑，制備它們的方法以及它們在預防或治療中的用途。具體而言，本發明涉及滅活的流感疫苗，它們是破裂的，而不是完整的病毒疫苗，而且它們在沒有有機汞防腐劑存在的條件下是穩定的。此外，所述疫苗含有按照標準試驗為的穩定的血細胞凝集素。所述疫苗可通過適于這種疫苗的任何途徑，如肌內，皮下，皮內或粘膜，如鼻內給予。
流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，它可影響人類和牲畜。流感造成的經濟損失是巨大的。
流感病毒是一種有被膜的RNA病毒，粒徑大小約為125nm。它主要由與核蛋白有關的核糖核酸(RNA)核心或內層核殼組成，被具有脂雙層結構的病毒被膜和外層糖蛋白圍繞。病毒被膜內層主要由基質蛋白組成，外層主要由宿主衍生的脂質物質組成。表面糖蛋白神經氨酸苷酶(NA)和血細胞凝集素(HA)作為10-12nm長的突起存在于微粒表面上。這些表面蛋白，特別是血細胞凝集素可確定流感亞型的抗原特異性。
目前所用的流感疫苗或為滅活的，或為活的減毒流感疫苗。滅活的流感疫苗由三種可能的抗原制劑形式組成滅活的全病毒，亞毒粒，其中純化的病毒顆粒是用去污劑或其它試劑破裂的，從而使脂質被膜(也稱作“斷裂(split)”疫苗)或純化的HA和NA(亞單位疫苗)穩定。這些滅活疫苗通過肌內(i.m.)或鼻內(i.n.)給予。目前還沒有市售的減毒活疫苗。
所有種類的流感疫苗通常都是三價的疫苗。它們通常含有來源于兩個流感A病毒株和一個流感B病毒株的抗原。通過單輻射免疫擴散(SRD)測量可知，在絕大多數情況下，標準的0.5ml可注射劑量含有15μg來源于每株病毒的血細胞凝集素抗原成分(J.M.Wood等用于測定流感血細胞凝集素抗原的改進的單輻射免疫擴散技術適于有效測定滅活全病毒和亞單位疫苗，J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，單輻射擴散和免疫電泳技術用于測定流感病毒血細胞凝集素抗原的國際協作研究，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。
每個季節摻入流感疫苗中的流感病毒株都是由國際衛生組織與國家的健康專家和疫苗制造商合作確定的。
典型流感的流行可導致肺炎和下呼吸道疾病的發病率上升，這一點可由住院或死亡率的增加來證明。老年人和那些患有基礎慢性病的人最有可能經歷這種并發癥，但幼小的嬰兒也可能會患上嚴重的疾病。因此，這些人群特別需要保護。
目前，用來控制與每年流感流行有關的發病率和死亡率的努力都是以肌內給予滅活的流感疫苗為基礎的。這種疫苗在預防呼吸道疾病和流感并發癥方面的效果在健康成年人中為75％，在老年人中則低于50％。
用于測量流感疫苗的效果有一個國際標準。對流感有效的疫苗的European Union官方標準在下面的表中列出。理論上，為了滿足European Union的要求，對于疫苗中所含的所有流感株而言，流感疫苗必須滿足表中所列的其中一個標準。然而在實踐中，所有株都需要滿足至少兩個或全部三個標準，特別是對于新的疫苗，如通過不同途徑遞送的新疫苗而言。在某些情況下，兩個標準就足夠了。例如，所有株滿足3個標準中的兩個就可以接受，而第三個標準只有一部分而不是所有毒株都滿足(例如，三株中的兩株)。成年人群(18-60歲)和老年人群(＞60歲)的要求是不同的。
*血清轉變率是對每一疫苗株而言，接種后，血清血細胞凝集素抑制(HI)滴度至少增加4倍的疫苗接種者百分比。
**轉變因數是對每一疫苗株而言，接種后，血清HI幾何平均滴度(GMT)增加的倍數。
***保護率是(對每一疫苗株而言)，接種后，血清HI滴度等于或大于1∶40的疫苗接種者百分比，且它通常被認為可指示保護。
對于能夠在市場上銷售的新的流感疫苗而言，它不僅需要滿足那些標準，而且在實踐中還需至少與目前市售的可注射疫苗同樣有效。就抗原量和所需給予次數而言，它還需要在銷售時是活的。
目前市售的流感疫苗是斷裂或可注射亞單位疫苗。這些疫苗通常是通過用有機溶劑或去污劑使病毒顆粒破裂，分離或純化病毒蛋白至各種程度而制備的。斷裂疫苗是通過用溶解濃度的有機溶劑或去污劑使感染性或滅活的整個流感病毒斷裂，隨后除去增溶劑和某些或絕大部分病毒脂質物質而制備的。斷裂疫苗通常含有污染基質蛋白及核蛋白，有時含有脂質，及膜被膜蛋白。斷裂疫苗通常含有絕大多數或全部病毒結構蛋白，但無需與全病毒中所含的比例相同。另一方面，亞單位疫苗主要由高度純化的病毒表面蛋白，血細胞凝集素和神經氨酸苷酶組成，它是在接種后，負責激發所需中和病毒的抗體的表面蛋白。
目前所用的很多疫苗都需要防腐劑來防止變質。經常使用的防腐劑是硫柳汞，它是一種含汞的化合物。一些公眾已經表達了他們對含汞化合物所造成影響的擔心。現在，還沒有適當的監視系統能夠檢測低到中等劑量的有機汞制劑對神經系統發育的作用，而對接受高劑量有機汞制劑的兒童所進行的專門研究則要花費若干年的時間才能完成。某些評論者強調，含硫柳汞疫苗的潛在危險不應被夸大描述(Offit；P.A.JAMA Vol.283；No16)。雖然如此，找到能夠替換在生產過程中使用硫柳汞制備疫苗的選擇性方法仍將十分有益。因此，現在仍然需要研究沒有硫柳汞的疫苗，特別是像流感疫苗這樣，以年為基礎，至少被推薦給某些人群的疫苗。
迄今為止，在生產/純化過程和/或終產品疫苗中，對商用滅活流感疫苗使用防腐劑是標準的操作方法。使用防腐劑是為了在純化的不同階段防止微生物生長。對來源于卵的流感疫苗而言，通常可把硫柳汞加入到粗制尿囊液中，而且還可在病毒加工過程中第二次加入。因此，在該過程結束時，會有殘留的硫柳汞存在，從而還需要把終產品疫苗中的防腐劑調節至所需的防腐濃度，例如，調節到大約100μg/ml的濃度。
在流感疫苗中使用硫柳汞作為防腐劑的次要作用是一種穩定作用。市售流感疫苗中的硫柳汞可使疫苗的HA成分，特別但不僅使B株流感的HA穩定。某些A株血細胞凝集素，例如，H3也需要穩定。因此，雖然希望除去流感疫苗中的硫柳汞，或至少降低終產品疫苗中硫柳汞的濃度，但還需要克服沒有硫柳汞存在條件下，HA不夠穩定的問題。
本發明已經發現使用不含有機汞制劑的替代試劑可使滅活流感制劑中的HA穩定。與沒有穩定賦形劑，通過相同方法生產的不穩定抗原制劑相比，在更大程度上，HA保持穩定，因而可通過定量標準方法，特別是SRD而隨時間檢測。SRD方法是按照上文所述進行的。重要的是，HA需保持穩定多達12個月，這是終產品流感疫苗的標準要求。
一方面，本發明提供一種滅活的流感病毒制劑，它含有在沒有硫柳汞存在條件下，或低水平硫柳汞條件下穩定的血細胞凝集素抗原，其中的血細胞凝集素可通過SRD測定法檢測。
低水平的硫柳汞是指使來源于流感B的HA穩定性降低的那些水平，如此就需要使用穩定賦形劑使HA穩定。低水平的硫柳汞通常為5μg/ml或更低。
通常，穩定的HA是指與沒有任何穩定賦形劑，通過相同方法生產的不穩定抗原制劑相比，在更大程度上可通過定量標準方法，特別是SRD而隨時間檢測的HA。HA的穩定優選在超過一年的時間里，基本維持HA的活性不變。優選穩定是指在6個月的貯藏期，更優選1年的貯藏期后，還能使含有HA的疫苗提供可接受的保護。
適當地，穩定是通過穩定賦形劑，優選膠束修飾賦形劑(micellemodifying excipient)進行的。膠束修飾賦形劑通常是可被摻入由去污劑形成的膠束中的一種賦形劑，所述去污劑用于，或適于使單獨或組合的膜蛋白HA，如去污劑Tween 80，Triton X 100和脫氧膽酸鹽溶解。
不希望受理論的限制，相信賦形劑是通過與終產品制劑中的脂質，去污劑和/或蛋白相互作用而使HA穩定的。可形成賦形劑與蛋白和脂質的混合膠束，如Tween和脫氧膽酸鹽與殘留脂質和/或Triton X-100的膠束。表面蛋白可由那些復合膠束維持溶解。優選，蛋白聚集是利用含有適宜賦形劑的膠束，如含有帶負電去污劑的膠束的電荷排斥而限制的。
適宜的膠束修飾賦形劑包括帶正電，帶負電或兩性的帶電兩親分子，如烷基硫酸酯，或烷基-芳基-硫酸酯；非-離子型兩親分子，如烷基多聚糖苷或其衍生物，如Plantacare(可從Henkel KGaA購得)，或烷基醇聚亞烷基醚或其衍生物，如Laureth-9。
優選的賦形劑是α-生育酚，或α-生育酚的衍生物，如α-生育酚琥珀酸酯。用于本發明中的其它優選生育酚衍生物包括D-α-生育酚，D-δ-生育酚，D-γ-生育酚和DL-α-生育酚。可使用的生育酚優選衍生物包括醋酸酯，琥珀酸酯，磷酸酯，甲酸酯，丙酸酯，丁酸酯，硫酸酯和葡萄糖酸酯。特別優選α-生育酚琥珀酸酯。α-生育酚或衍生物的量足以使血細胞凝集素穩定。
其它適宜的賦形劑可通過本領域的標準方法確定，并按照這里所述，使用進行穩定性分析的SRD方法進行測試。
在優選方面，本發明提供一種流感病毒抗原制劑，它含有至少一種穩定的流感B株血細胞凝集素抗原。
另一方面，本發明提供一種制備穩定的血細胞凝集素抗原的方法，該方法包括在有穩定膠束修飾賦形劑，優選α-生育酚或其衍生物，如α-生育酚琥珀酸酯存在的條件下純化抗原。
本發明進一步提供含有這里所述的抗原制劑的疫苗，和它們在預防受試者流感感染或疾病的方法中的用途，該方法包括給予受試者本發明的疫苗。
該疫苗可通過任何適宜的遞送途徑，如皮內，粘膜，例如，鼻內，肌內或皮下給予。其它遞送途徑為本領域所熟知。
優選皮內遞送。任何適宜的裝置都可用于皮內遞送，例如，短針頭裝置，如在US4,886,499，US 5,190,521，US 5,328,483，US 5,527,288，US 4,270,537，US 5,015,235，US 5,141,496，US 5,417,662中描述的那些。皮內疫苗還可通過下列裝置及其功能等同物給予，即它們可限制針在皮膚中的有效刺入長度，如在WO99/34850和EP1092444中描述的那些，這兩篇文獻引入此處作為參考。其它適宜的是噴射注射裝置，它們經由刺入角質層并產生到達真皮的噴射流的液體噴射注射器或針把液體疫苗遞送到真皮。噴射注射裝置在US 5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US 5,649,912，US 5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US 5,466,220，US 5,339,163，US 5,312,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US 4,596,556，US 4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO97/37705和WO97/13537中描述。其它適宜的是沖擊式粉末/顆粒遞送裝置，它利用壓縮空氣加速粉末形式的疫苗穿過皮膚外層到達真皮。此外，常規的注射器也可用于皮內給予的經典mantoux方法中。然而，常規注射器的使用需要非常熟練的操作人員，因此優選無需非常熟練的使用者即可準確遞送的裝置。
本發明因此提供一種預防受試者流感感染或疾病的方法，該方法包括皮內給予受試者本發明的流感疫苗。
本發明還擴展到與本發明疫苗結合的皮內裝置，特別是在WO99/34580或EP1092444中公開的裝置。
本發明還提供了膠束修飾賦形劑，優選α-生育酚或其衍生物作為血細胞凝集素的穩定劑在制備流感疫苗中的用途。
本發明特別，但不僅僅用于B株流感血細胞凝集素的穩定。
優選本發明的穩定HA可穩定6個月，更優選12個月。
優選α-生育酚以酯形式存在，更優選琥珀酸酯或醋酸酯，最優選琥珀酸酯。
α-生育酚或其衍生物的優選濃度為1μg/ml-10mg/ml，更優選10μg/ml-500μg/ml。
本發明的疫苗通常含有A株和B株病毒的抗原，通常以兩個A株和一個B株的三價組合物形式存在。然而，不排除二價和單價的疫苗。單價疫苗在大流行情況下可能較有利，例如，它對于生產大量疫苗并盡可能快地給藥非常重要。
用于本發明中的非活性流感抗原制劑選自斷裂病毒抗原制劑，亞單位抗原(或是重組表達的，或是從全病毒制備的)，滅活的全病毒，它們是用甲醛，β-丙內酯化學滅活的，或是以其它方式，如U.V.或熱滅活的。優選所述抗原制劑或是斷裂病毒制劑，或是從全病毒制備的亞單位抗原，特別是在斷裂過程之后，通過純化表面抗原而制備的。最優選斷裂病毒制劑。
對于流感病毒制劑每株而言，血細胞凝集素抗原的濃度優選1-1000μg/ml，更優選3-300μg/ml，最優選約30μg/ml，這些是通過SRD測定法測量的。
本發明的疫苗還可進一步含有佐劑或免疫刺激劑，例如但不限制于任何來源的去毒脂質A和脂質A的無毒衍生物，皂苷，和其它能夠刺激TH1型反應的試劑。
很早以前人們就已經知道了腸細菌脂多糖(LPS)是免疫系統的有效刺激劑，雖然它在佐劑中的使用已經由于其毒性作用而被禁止。LPS的無毒衍生物，即通過除去核心碳水化合物基團而產生的單磷酰基脂質A(MPL)，和來源于還原性末端葡糖胺的磷酸酯已經由Ribi等描述(1986，細菌內毒素的免疫學和免疫藥理學，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)，并具有下列結構 MPL的其它去毒形式是通過除去二糖主鏈3-位的酰基鏈而產生的，被稱作3-O-脫酰基化單磷酰基脂質A(3D-MPL)。它可通過GB2122204B中教導的方法純化和制備，這篇參考文獻還公開了二磷酰基脂質A及其3-O-脫酰基變體的制備。
3D-MPL的優選形式是含有粒徑小于0.2μm的微小顆粒的乳液，其制造方法在WO94/21292中公開。含有單磷酰基脂質A和表面活性劑的含水制劑已經在WO9843670A2中描述。
在本發明組合物中配制的細菌性脂多糖衍生的佐劑可以是從細菌源純化并加工的，或可選擇性地，它們可以是合成的。例如，純化的單磷酰基脂質A在Ribi等1986(supra)中描述，來源于沙門氏菌的3-O-脫酰基化單磷酰基或二磷酰基脂質A在GB2220211和US4912094中描述。其它純化及合成的脂多糖也已經描述過(Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP 0 549 074 B1)。特別優選的細菌性脂多糖佐劑是3D-MPL。
因此，可用于本發明中的LPS衍生物是結構與LPS或MPL或3D-MPL相似的那些免疫刺激劑。另一方面，本發明的LPS衍生物可以是酰化的單糖，它是上述MPL結構的亞部分。
皂苷在Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.有關皂苷的生物和藥理活性的評論，Phytomedicine vol 2 pp 363-386)中教導。皂苷是廣泛分布在植物界和海洋動物界中的甾族化合物或三萜烯糖苷。皂苷可在水中形成膠體溶液，振搖時產生泡沫，而且可使膽固醇沉淀。當皂苷接近細胞膜時，它們在膜中產生孔樣結構，導致膜破裂。紅細胞溶血就是這種現象的一個例子，它是皂苷的某些，但非全部的性質。
皂苷被認為是用于全身給予的疫苗中的佐劑。現有技術中已經廣泛研究了各種皂苷的佐劑和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner)。例如，Quil A(來源于南美皂樹的樹皮)及其一部分已經在US5,057,540和“作為疫苗佐劑的皂苷”，Kensil，C.R.，Crit Rev TherDrug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55；和EP 0 362 279 B1中描述。含有Quil A級分的顆粒狀結構，也被稱作免疫刺激復合物(ISCOMS)是溶血性的，而且已經用于制造疫苗(Morein，B.，EP 0109 942 B1；WO96/11711；WO96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC純化的Quil A的級分)已經被描述為有效的系統佐劑，它們的生產方法在美國專利號5,057,540和EP 0 362 279 B1中描述。已經用于全身接種研究中的其它皂苷包括來源于其它植物種類，如絲石竹和肥皂草的那些(Bomford等，Vaccine，10(9)572-577，1992)。
增強系統包括無毒脂質A衍生物和皂苷衍生物的組合，特別是在WO94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或WO96/33739中公開的較少反應原性的組合物，其中QS21是用膽固醇猝滅的。
WO95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，它含有QS21和3D-MPL的水包油乳液，是一種優選的制劑。
因此，本發明其中一個實施方案提供一種疫苗，它含有用去毒的脂質A或脂質A的無毒衍生物作為佐劑，更優選用單磷酰基脂質A或其衍生物作為佐劑的本發明的流感抗原制劑。
優選所述疫苗還含有皂苷，更優選QS21。
優選所述制劑還含有水包油乳液。本發明還提供一種生產疫苗制劑的方法，包括把本發明的抗原制劑與藥學上可接受的賦形劑，如3D-MPL混合。
本發明的疫苗還可含有至少一種表面活性劑，特別是非離子型表面活性劑。適宜的非離子型表面活性劑選自辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，市售的TritonTM系列)，聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(TweenTM系列)和通式(I)的聚氧乙烯醚或酯(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n為1-50，A是一個鍵或-C(O)-，R是C1-50的烷基或苯基C1-50烷基；和這些之中兩個或多個的組合。
落在通式(I)范圍之內的優選表面活性劑是n為4-24，更優選6-12，最優選9；R是C1-50，優選C4-C20烷基，最優選C12烷基。
辛基苯氧基聚氧乙醇和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯在“表面活性劑系統”EdsAttwood和Florence(1983，Chapman和Hal1)中描述。辛基苯氧基聚氧乙醇(octoxynols)，包括t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100TM)也在Merck Index Entry 6858(第1162頁，12thEdition，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)中描述。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯(Tween 80TM)在Merck Index Entry 7742(第1308頁，12thEdition，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)中描述。兩者都是使用所述方法制造的，或從市場上，如Sigma Inc.購買的。
特別優選的非離子型表面活性劑包括Triton X-45，t-辛基苯氧基聚乙氧乙醇(Triton X-100)，Triton X-102，Triton X-114，TritonX-165，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128，Breij 35，聚氧乙烯-9-十二烷基醚(laureth 9)和聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚(steareth 9)。Triton X-100和laureth 9是特別優選的。還特別優選聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯(Tween 80TM)。
通式(I)其它適宜的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚，聚氧乙烯-4-十二烷基醚，聚氧乙烯-35-十二烷基醚，和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。
聚氧乙烯十二烷基醚的其它術語或名稱在CAS目錄中公開。聚氧乙烯-9-十二烷基醚的CAS目錄號為9002-92-0。聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯十二烷基醚在Merck索引(12thedentry 7717，Merck &Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)中描述。Laureth 9是通過使環氧乙烷與十二烷基醇反應形成的，平均具有9個氧化乙烯單位。
這里所述的疫苗制劑中可含有來源于所述不同表面活性劑組的兩種或多種非離子型表面活性劑。具體而言，優選聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯(Tween 80TM)和octoxynol，如t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton)X-100TM的組合。其它特別優選的非離子型表面活性劑的組合包括laureth 9加聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯或octoxynol或兩者。
非離子型表面活性劑，如上面討論的那些在終產品疫苗組合物中的優選濃度如下聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，如Tween 80TM0.01-1％，最優選約0.1％(w/v)；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇，如TritonX-100TM或Triton系列的其它去污劑0.001-0.1％，最優選0.005-0.02％(w/v)；通式(I)的聚氧乙烯醚，如laureth 90.1-20％，優選0.1-10％，最優選0.1-1％或約0.5％(w/v)。
對于某些疫苗制劑而言，制劑中還可含有其它疫苗成分。本發明的制劑還可含有膽酸或其衍生物，特別是鹽的形式。這些包括膽酸的衍生物及其鹽，特別是膽酸的鈉鹽或膽酸的衍生物。膽酸及其衍生物的例子包括膽酸，脫氧膽酸，鵝去氧膽酸，石膽酸，熊去氧膽酸，豬去氧膽酸和衍生物，如前述膽酸的甘氨酸-，牛磺酸-，酰胺丙基-1-丙磺酸-，酰胺丙基-2-羥基-1-丙磺酸衍生物，或N，N-雙(3D葡萄糖酸酰胺丙基)脫氧膽酰胺。特別優選的例子是脫氧膽酸鈉(NaDOC)，它可存在于終產品疫苗中。
本發明還提供含有疫苗給予裝置的試劑盒，所述疫苗給予裝置中填充有本發明的疫苗。這種給予裝置包括，但不限制于針頭裝置，液體噴射裝置，粉末裝置和噴霧裝置(鼻內用)。
本發明的流感病毒抗原制劑可通過常規的含胚卵方法產生，或通過組織培養，使病毒生長或表達重組流感病毒表面抗原的任何一種新的生產方法產生。病毒生長的適宜細胞底物包括，例如，狗腎細胞，如MDCK，或來源于MDCK克隆的細胞，MDCK-樣細胞，猴腎細胞如AGMK細胞，包括Vero細胞，適宜的豬細胞系，或適于生產流感病毒疫苗的任何其它哺乳動物細胞類型。適宜的細胞底物還包括人類細胞，例如，MRC-5細胞。適宜的細胞底物不限制于細胞系；還包括原代細胞，如雞胚成纖維細胞。
流感病毒抗原制劑可通過商業上應用的任何一種方法生產，例如在專利號DD 300 833和DD 211 444中描述的斷裂流感病毒方法，這兩篇文獻引入此處作為參考。通常斷裂流感病毒是使用溶劑/去污劑，如三-正-丁基磷酸酯，或二乙醚與TweenTM組(也稱為“Tween-醚”斷裂)處理產生的，而且該過程仍然用于某些生產設備中。現在所用的其它斷裂劑包括去污劑或蛋白水解酶或膽酸鹽，例如專利號DD 155 875中描述的脫氧膽酸鈉，這篇文獻引入此處作為參考。可用作斷裂劑的去污劑包括陽離子型去污劑，如溴化十六烷基三甲銨，或非離子型去污劑，如上面描述的那些，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的方法中)和Triton N-101，或任意兩種或多種去污劑的組合。
斷裂疫苗的制備方法包括多個不同的過濾和/或其它分離步驟，如以各種不同方式組合的超速離心，超濾，區帶離心和層析(例如，離子交換)，以及任選的滅活步驟，例如加熱，使用甲醛，或β-丙內酯或U.V.，這個步驟可在斷裂之前或之后進行。斷裂過程可分批進行，或按照連續或半-連續的過程進行。
本發明優選的斷裂流感疫苗抗原制劑含有生產過程中保留的殘余量的Tween 80和/或Triton X-100，盡管它們可在制備斷裂抗原之后加入，或調節它們的濃度。優選Tween 80和Triton X-100同時存在。這些無毒表面活性劑在疫苗劑量中的最終濃度的優選范圍是Tween 800.01％-1％，更優選約0.1％(v/v)Triton X-1000.001-0.1(％w/v)，更優選0.005-0.02％(w/v)。
可選擇性地，本發明的流感病毒抗原制劑可來源于除活流感病毒之外的來源，例如血細胞凝集素抗原可重組產生。
現在，在下列非限制性實施例中進一步描述本發明。
實施例實施例1-使用α-生育酚琥珀酸酯作為沒有防腐劑的疫苗(硫柳汞含量降低的疫苗)的穩定劑制備流感病毒抗原制劑單價斷裂疫苗是按照下列過程制備的。
病毒接種物的制備在接種含胚卵當天，通過使工作接種物與磷酸鹽緩沖鹽水混合而制備新鮮的接種物，其中磷酸鹽緩沖鹽水含有0.5mg/ml的硫酸慶大霉素和25μg/ml的氫化可的松。(病毒株-依賴性的)。所述病毒接種物在2-8℃保持。
含胚卵的接種使用9-11天的含胚卵進行病毒復制。凈化卵殼。用0.2ml病毒接種物接種卵。將接種的卵在適宜溫度下(病毒株-依賴性的)溫育48-96小時。在溫育階段結束時，通過冷卻殺死胚胎，并將卵在2-8℃貯藏12-60小時。
收獲收獲冷凍含胚卵的尿囊液。通常，每只卵可收獲8-10ml的粗制尿囊液。
來源于尿囊液的全病毒的濃縮和純化1.澄清將收獲的尿囊液通過中速離心(4000-14000g)而澄清。
2.吸附步驟為了在澄清的病毒混合物中獲得CaHPO4凝膠，根據病毒株的不同加入0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L CaCl2溶液，使CaHPO4的終濃度達到1.5g-3.5g CaHPO4/升。
沉淀至少8小時后，除去上清液，然后根據所用CaHPO4量的不同，通過加入0.26mol/L EDTA-Na2溶液而再次溶解含有流感病毒的沉淀物。
3.過濾將重懸浮的沉淀物在6μm濾過膜上過濾。
4.蔗糖梯度離心以含有100μg/ml硫柳汞的線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))通過等密度離心濃縮流感病毒。流速為8-15升/小時。
離心結束時，通過4個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)-級分155-52％的蔗糖-級分2大約52-38％的蔗糖-級分338-20％的蔗糖*-級分420-0％的蔗糖*病毒株-依賴性的級分3可降至15％的蔗糖。
對于其它疫苗制劑而言，僅使用級分2和3。
級分3是通過用磷酸鹽緩沖液滲濾而洗滌的，以便把蔗糖含量降至大約低于6％。使該稀釋級分中的流感病毒沉淀，從而除去可溶性污染物。
將沉淀重懸浮并完全混合，從而獲得均勻的懸浮液。把級分2與級分3的重懸浮沉淀混合，加入磷酸鹽緩沖液，使體積達到約40升。該產物是單價的全病毒濃縮物。
5.使用脫氧膽酸鈉進行蔗糖梯度離心將單價的全流感病毒濃縮物加入ENI-Mark II超速離心機。K3轉子含有線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，此外還覆蓋了脫氧膽酸鈉梯度。在斷裂過程中存在0.1％(w/v)的Tween 80，對于B株病毒而言，還加入了0.5mM生育酚琥珀酸酯。最高的脫氧膽酸鈉濃度為0.7-1.5％(w/v)，而且是毒株依賴性的。流速為8-15升/小時。
離心結束時，利用3個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)。級分2用于進一步加工。各級分蔗糖含量的限度(47-18％)根據毒株不同而改變，并在評估后固定。
6.無菌過濾斷裂病毒級分是在0.2μm的濾過膜上過濾的。含有0.025％(w/v)Tween 80和(對于B株病毒而言)0.5mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖液可用于進行稀釋。濾過后的級分2的終體積是該級分原體積的5倍。
7.滅活將過濾的單價物質在22±2℃至多溫育84小時(根據病毒株的不同，可縮短溫育時間)。然后加入含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液，使總蛋白含量降至最高250μg/ml。對于B株病毒而言，則使用含有0.025％(w/v)Tween 80和0.25mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行稀釋，使總蛋白含量降至250μg/ml。加入甲醛至50μg/ml的終濃度，20℃±2℃滅活至少72小時。
8.超濾在帶有20kDa MWCO醋酸纖維素膜的超濾裝置中，將滅活的斷裂病毒物質濃縮至少2倍。然后用含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液洗滌該物質，接著用含有0.01％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。對于B株病毒而言，則使用含有0.01％(w/v)Tween 80和0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行洗滌。
9.最后的無菌過濾超濾后的物質是在0.2μm的濾過膜上過濾的。清洗濾過膜，如果需要，使用含0.01％(w/v)Tween 80和(對于B株病毒而言)0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋該物質，使蛋白濃度不超過500μg/ml。
10.貯藏將最終的單價疫苗在2-8℃最多貯藏18個月。
穩定性表1.通過SRD對最終的單價疫苗中的時間依賴性HA含量(μg/ml)進行的比較
*按照許可的FLUARI XTM生產的，**按照實施例1生產的，但沒有生育酚琥珀酸酯，ON正在進行的，ND沒有測出實施例2-使用α-生育酚琥珀酸酯作為硫柳汞含量降低的疫苗的穩定劑制備流感疫苗三個病毒株，A/New Caldonia/20/99(H1N1)IV-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17和B/Yamanashi/166/98的最終的單價疫苗是按照實施例1描述的方法生產的。
混合將適量的最終的單價疫苗分別與終HA濃度為30μg/ml的A/NewCaldonia/20/99(H1N1)IVR-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17，和終HA濃度為39μg/ml的B/Yamanashi/166/98混合。分別把Tween 80和Triton X-100調節至580μg/ml和90μg/ml。用磷酸鹽緩沖鹽水把終體積調節至3升。用0.8μm的醋酸纖維素膜過濾三價混合物，獲得最終的三價疫苗。把最終的三價疫苗填充到注射器中，每支至少0.5mL。
表2.通過SRD測量的，從注射器回收的最終的三價疫苗中，時間依賴性HA含量的比較
實施例3-用于測量血細胞凝集素含量的SRD方法用瓊脂糖凝膠包被玻璃平板(12.4-10.0cm)，該瓊脂糖凝膠含有NIBSC推薦的濃度的抗-流感HA血清。凝膠凝固后，將72樣品孔(3mm)用力壓到瓊脂糖中。把10微升參照物和樣品的適當稀釋物裝到孔中。在保濕室中室溫(20-25℃)溫育平板24小時。之后，用NaCl-溶液浸泡平板過夜，并在蒸餾水中簡單洗滌。然后壓縮凝膠并干燥。完全干燥時，將該平板在考馬斯亮藍溶液中染色10分鐘，在甲醇和醋酸的混合物中褪色兩次，直至見到清晰的染色區。干燥平板后，在成直角的兩個方向上，測量抗原孔周圍的染色區直徑。或者，可使用測量表面的裝置。建立抗原稀釋度對表面的劑量-反應曲線，并按照標準斜率測定法計算結果(Finney，D.J.(1952).Statistical Methods inBiological Assay.LondonGriffin，Quoted inWood，JM等(1977).J.Biol.Standard.5，237-247)。
實施例4-α-生育酚穩定的流感疫苗(硫柳汞含量降低)的臨床試驗使用按照實施例2所述獲得的注射器進行臨床試驗H3N2A/Panama /2007/99 RESVIR-17
H1N1A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116BB/Yamanashi/166/98表3
n.d.＝C.I.，比例p＝n/N沒有定義，因為p*(1-p)*N＜9n/N＝作為(亞)人群(N)受試者數一部分的反應者(n)，即，血清轉變或顯著增加，還可見CPMAP/BWP/214/96，1997年3月12日，p.17ffGMT＝幾何平均滴度，倒數
95％C.I.＝95％置信區間，SPR＝血清保護率接種前或接種后，保護滴度≥40的受試者比例滴度＝HI-抗體滴度血清轉變率＝抗體從接種前＜10到接種后≥40的受試者比例GMT倍數＝GMT增加的倍數顯著增加＝接種前抗體滴度≥10到接種后抗體增加4倍(滴定的兩個步驟)的受試者比例req.＝EU要求血清轉變＝neg到pos或g.e.4-倍(neg滴度＜10，pos滴度≥40)＝血清轉變(＜10到≥40)或顯著增加的受試者比例結果表明，所述疫苗能夠提供與含有硫柳汞作為防腐劑的疫苗相等的保護。
實施例5a-使用α-生育酚琥珀酸酯作為沒有硫柳汞的疫苗的穩定劑制備流感病毒抗原制劑單價斷裂疫苗是按照下列過程制備的。
病毒接種物的制備在接種含胚卵當天，通過把接種工作物與磷酸鹽緩沖鹽水混合而制備新鮮的接種物，其中磷酸鹽緩沖鹽水含有0.5mg/ml的硫酸慶大霉素和25μg/ml的氫化可的松。(病毒株-依賴性的)。所述病毒接種物在2-8℃保持。
含胚卵的接種使用9-11天的含胚卵進行病毒復制。凈化卵殼。用0.2ml病毒接種物接種卵。將60,000個接種卵在適宜的溫度下(病毒株-依賴性的)溫育48-96小時。在溫育階段結束時，通過冷卻殺死胚胎，并將卵在2-8℃貯藏12-60小時。
收獲收獲冷凍含胚卵的尿囊液。通常，每只卵可收獲8-10ml的粗尿囊液。
來源于尿囊液的全病毒的濃縮和純化澄清將收獲的尿囊液通過中速離心(4000-14000g)而澄清。
沉淀步驟把飽和磷酸銨溶液加入到澄清的病毒混合物中，使硫酸銨終濃度達到0.5mol/L。沉淀至少1小時后，通過在深度濾器(通常為0.5μm)上過濾而除去沉淀物。
過濾將澄清的粗制全病毒在具有有效無菌膜(通常為0.2μm)的濾過膜上過濾。
超濾將無菌過濾的粗制單價全病毒在帶有1000kDa MWCO BIOMAXTM膜的盒上濃縮至少6倍。把濃縮的存留物用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌至少1.8倍。
蔗糖梯度離心以線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))通過等密度離心濃縮流感病毒。流速為8-15升/小時。
離心結束時，通過4個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)-級分155-52％的蔗糖-級分2大約52-38％的蔗糖-級分338-20％的蔗糖*-級分420-0％的蔗糖*病毒株-依賴性的級分3可降至15％的蔗糖。
對于其它疫苗制劑而言，或者僅使用級分2或者使用級分2和進一步純化的級分3。
級分3是通過用磷酸鹽緩沖液滲濾而洗滌的，以便把蔗糖含量降至大約低于6％。任選地，可省略該步驟。使該稀釋級分中的流感病毒沉淀，從而除去可溶性污染物。
將沉淀重懸浮并完全混合，從而獲得均勻的懸浮液。把級分2與級分3的重懸浮沉淀混合，加入磷酸鹽緩沖液，使體積達到約40升。該產物是單價的全病毒濃縮物。
使用脫氧膽酸鈉進行蔗糖梯度離心將單價的全流感病毒濃縮物加入ENI-Mark II超速離心機。K3轉子含有線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，此外還覆蓋了脫氧膽酸鈉梯度。在斷裂過程中存在0.1％(w/v)的Tween 80，對于B株病毒而言，加入0.5mM生育酚琥珀酸酯。最高的脫氧膽酸鈉濃度為0.7-1.5％(w/v)，而且是毒株依賴性的。流速為8-15升/小時。
離心結束時，利用3個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)。級分2用于進一步加工。各級分蔗糖含量的限度(47-18％)根據毒株不同而改變，并在評估后固定。
無菌過濾斷裂病毒級分是在0.2μm的濾過膜上過濾的。含有0.025％(w/v)Tween 80和(對于B株病毒而言)0.5mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖液可用于進行稀釋。濾過后的級分2的終體積是該級分原體積的5倍。
滅活將過濾的單價物質在22±2℃至多溫育84小時(根據病毒株的不同，可縮短溫育)。然后加入含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液，使總蛋白含量降至最高450μg/ml。對于B株病毒而言，則使用含有0.025％(w/v)Tween 80和0.25mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行稀釋，使總蛋白含量降至450μg/ml。加入甲醛至100μg/ml的終濃度，20℃±2℃滅活至少72小時。
超濾在帶有20kDa MWCO的醋酸纖維素膜的超濾裝置中，將滅活的斷裂病毒物質濃縮至少2倍。然后用含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液洗滌該物質，接著用含有0.01％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。對于B株病毒而言，則使用含有0.01％(w/v)Tween 80和0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行洗滌。
最后的無菌過濾超濾后的物質是在0.2μm的濾過膜上過濾的。清洗濾過膜，如果需要，使用含0.01％(w/v)Tween 80和對于B株系病毒而言的0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋該物質，使蛋白濃度不超過500μg/ml。
貯藏將最終的單價疫苗在2-8℃最多貯藏18個月。
穩定性表4.通過SRD對最終的單價疫苗中的時間依賴性HA含量(μg/ml)進行的比較
**按照實施例1生產的，沒有生育酚琥珀酸酯。
實施例5b-使用α-生育酚琥珀酸酯作為沒有硫柳汞的疫苗的穩定劑制備流感病毒抗原制劑優選的實施例5a方法的改進如下收獲全病毒之后是沉淀步驟(硫酸銨沉淀)。然后是澄清步驟，其中流體是通過中速離心(4000-14000g)澄清的。因此，與實施例5a相比，沉淀和澄清步驟是的順序相反的。
無菌過濾，超濾和超速離心(蔗糖梯度離心)步驟是按照實施例5a進行的。然而，無需對由超速離心步驟產生的部分再加工。
本過程中的其余步驟與實施例5a描述的相同。
因此，本實施例的概括過程如下收獲沉淀(硫酸銨)澄清無菌過濾超濾超速離心斷裂(優選脫氧膽酸鈉)無菌過濾滅活超濾最終的無菌過濾實施例5a的另外一個優選變化包括第一次無菌過濾之前的預過濾步驟。其中使用的是不能無菌過濾，但能在無菌過濾之前，除去污染物，如白蛋白的膜。這樣所得的產率更高。進行預過濾的適宜膜約為0.8-1.8μm，例如1.2μm。預過濾步驟可在實施例5a或實施例5b的方案中使用。
實施例6-使用α-生育酚琥珀酸酯作為沒有硫柳汞的疫苗的穩定劑制備流感病毒抗原制劑三個病毒株，A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17和B/Yamanashi/166/98的最終的單價疫苗是按照實施例5描述的方法生產的。
混合將適量的最終的單價疫苗分別與終HA濃度為30μg/ml的A/NewCaldonia/20/99(H1N1)IVR-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17，和終HA濃度為36μg/ml的B/Johannesburg/5/97混合。分別把Tween 80和Triton X-100調節至580μg/ml和90μg/ml。用磷酸鹽緩沖鹽水把終體積調節至3升。用0.8μm的醋酸纖維素膜過濾三價混合物，獲得最終的三價疫苗。把最終的三價疫苗填充到注射器中，每支至少0.5mL。
表5.通過SRD對最終的三價疫苗的時間依賴性HA含量(μg/ml)進行的比較
*制劑是以39μg/ml的目標濃度為基礎的。**制劑是以34μg/ml的目標濃度為基礎的。
實施例7-使用十二烷基硫酸鈉作為沒有防腐劑的疫苗(硫柳汞含量降低的疫苗)的穩定劑制備流感病毒抗原制劑B/Johannesburg/5/99的單價全病毒濃縮物是按照實施例1所述獲得的使用脫氧膽酸鈉進行蔗糖梯度離心將單價的全流感病毒濃縮物加入ENI-Mark II超速離心機。K3轉子含有線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，此外還覆蓋了脫氧膽酸鈉梯度。在斷裂過程中存在0.1％(w/v)的Tween 80。最高的脫氧膽酸鈉濃度為0.7-1.5％(w/v)，而且是毒株依賴性的。流速為8-15升/小時。
離心結束時，利用3個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)。級分2用于進一步加工。各級分蔗糖含量的限度(47-18％)根據毒株不同而改變，并在評估后固定。
無菌過濾取10ml級分2的樣品進行進一步的加工。斷裂病毒級分是在0.2μm的濾過膜上過濾的。含有0.025％(w/v)Tween 80和0.5mM十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液可用于進行稀釋。濾過后的級分2的終體積是該級分原體積的5倍。
滅活將過濾的單價物質在22±2℃至多溫育84小時(根據病毒株的不同，可縮短溫育時間)。然后加入含有0.025％(w/v)Tween 80和0.5mM十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液，使總蛋白含量降至最高250μg/ml。加入甲醛至50μg/ml的終濃度，20℃±2℃滅活至少72小時。
超濾在帶有20kDa MWCO的醋酸纖維素膜的超濾裝置中，將滅活的斷裂病毒物質濃縮至少2倍。然后用4個體積含有0.01％(w/v)Tween 80和0.5mM十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該物質。
最后的無菌過濾超濾后的物質是在0.2μm的濾過膜上過濾的。清洗濾過膜，如果需要，使用含0.01％(w/v)Tween 80和0.5mM十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋該物質，使蛋白濃度不超過500μg/ml。
貯藏最終的單價疫苗在2-8℃貯藏。
表7.通過SRD測量的最終的單價疫苗的時間依賴性HA含量的比較
*按照實施例7生產的，沒有加入十二烷基硫酸鈉。
實施例8-使用Plantacare或Laureth-9作為沒有防腐劑的疫苗(硫柳汞含量降低的疫苗)的穩定劑制備流感病毒抗原制劑B/Yamanashi/166/98的單價全病毒濃縮物是按照實施例1所述獲得的片段化用pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水把單價全流感病毒的濃縮物稀釋至蛋白濃度為1,000μg/ml。加入Plantacare2000UP或Laureth-9至1％(w/v)的終濃度。輕輕混合該物質30分鐘。然后將該物質覆蓋在桶中的蔗糖墊15％(w/w)上。25,000rpm和20℃，在Beckman甩出式轉子SW28中超速離心2小時。
無菌過濾取上清液進行進一步的加工。將斷裂病毒級分在0.2μm的濾過膜上過濾。
滅活如果需要，加入磷酸鹽緩沖鹽水，從而使總蛋白含量降至最高500μg/ml。加入甲醛至100μg/ml的終濃度，20℃±2℃滅活至少6天。
超濾在滅活物質中將Tween 80和Triton X 100分別調節至0.15％和0.02％。在帶有30kDa MWCO的醋酸纖維素膜的超濾裝置中，將滅活的斷裂病毒物質濃縮至少2倍。然后，用4個體積的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該物質。
最后的無菌過濾將超濾后的物質在0.2μm的濾過膜上過濾。清洗濾過膜，然后使用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋該物質，使蛋白濃度不超過500μg/ml。
貯藏最終的單價疫苗在2-8℃貯藏。
表8.通過SRD測量的最終的單價疫苗的時間依賴性HA含量的比較
實施例9-老年組中經由ID和IM給予的α-生育酚穩定的流感疫苗(硫抑汞含量降低的疫苗)的臨床試驗A 流感病毒抗原制劑的制備單價斷裂疫苗是按照下列過程制備的。
病毒接種物的制備在接種含胚卵當天，通過使工作接種物與磷酸鹽緩沖鹽水混合而制備新鮮的接種物，其中磷酸鹽緩沖鹽水含有0.5mg/ml的硫酸慶大霉素和25μg/ml的氫化可的松。(病毒株-依賴性的)。所述病毒接種物在2-8℃保持。
含胚卵的接種使用9-11天的含胚卵進行病毒復制。凈化卵殼。用0.2ml病毒接種物接種卵。將接種的卵在適宜溫度下(病毒株-依賴性的)溫育48-96小時。在溫育階段結束時，通過冷卻殺死胚胎，并將卵在2-8℃貯藏12-60小時。
收獲收獲冷凍含胚卵的尿囊液。通常，每只卵可收獲8-10ml的粗尿囊液。
來源于尿囊液的全病毒的濃縮和純化
1.澄清將收獲的尿囊液通過中速離心(4000-14000g)而澄清。
2.吸附步驟為了在澄清的病毒混合物中獲得CaHPO4凝膠，根據病毒株的不同加入0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L CaCl2溶液，使CaHPO4的終濃度達到1.5g-3.5g CaHPO4/升。
沉淀至少8小時后，除去上清液，然后根據所用CaHPO4量的不同，通過加入0.26mol/L EDTA-Na2溶液而再次溶解含有流感病毒的沉淀物。
3.過濾將重懸浮的沉淀物在6μm濾過膜上過濾。
4.蔗糖梯度離心以含有100μg/ml硫柳汞的線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))通過等密度離心濃縮流感病毒。流速為8-15升/小時。
離心結束時，通過4個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)-級分155-52％的蔗糖-級分2大約52-38％的蔗糖-級分338-20％的蔗糖*-級分420-0％的蔗糖*病毒株-依賴性的級分3可降至15％的蔗糖。
對于其它疫苗制劑而言，僅使用級分2和3。
級分3是通過用磷酸鹽緩沖液滲濾而洗滌的，以便把蔗糖含量降至大約低于6％。使該稀釋級分中的流感病毒沉淀，從而除去可溶性污染物。
將沉淀重懸浮并完全混合，從而獲得均勻的懸浮液。把級分2與級分3的重懸浮沉淀混合，加入磷酸鹽緩沖液，使體積達到約40升，這個體積適于120,000個卵/批。該產物是單價的全病毒濃縮物。
5.使用脫氧膽酸鈉進行蔗糖梯度離心將單價的全流感病毒濃縮物加入ENI-Mark II超速離心機。K3轉子含有線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，此外還覆蓋了脫氧膽酸鈉梯度。在斷裂過程中存在0.1％(w/v)的Tween 80，對于B株病毒而言，還加入了0.5mM生育酚琥珀酸酯。最高的脫氧膽酸鈉濃度為0.7-1.5％(w/v)，而且是毒株依賴性的。流速為8-15升/小時。
離心結束時，利用3個不同的級分回收轉子的內含物(蔗糖是在折射計中測量的)。級分2用于進一步加工。各級分蔗糖含量的限度(47-18％)根據毒株不同而改變，并在評估后固定。
6.無菌過濾斷裂病毒級分是在0.2μm的濾過膜上過濾的。含有0.025％(w/v)Tween 80和(對于B株病毒而言)0.5mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖液可用于進行稀釋。濾過后的級分2的終體積是該級分原體積的5倍。
7.滅活將過濾的單價物質在22±2℃至多溫育84小時(根據病毒株的不同，可縮短溫育時間)。然后加入含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液，使總蛋白含量降至最高250μg/ml。對于B株病毒而言，則使用含有0.025％(w/v)Tween 80和0.25mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行稀釋，使總蛋白含量降至250μg/ml。加入甲醛至50μg/ml的終濃度，20℃±2℃滅活至少72小時。
8.超濾在帶有20kDa MWCO的醋酸纖維素膜的超濾裝置中，將滅活的斷裂病毒物質濃縮至少2倍。然后用含有0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液洗滌該物質，接著用含有0.01％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。對于B株病毒而言，則使用含有0.01％(w/v)Tween 80和0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水進行洗滌。
9.最后的無菌過濾超濾后的物質是在0.2μm的濾過膜上過濾的。清洗濾過膜，如果需要，使用含0.01％(w/v)Tween 80和(對于B株病毒而言)0.1mM生育酚琥珀酸酯的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋該物質，使蛋白濃度不超過1,000μg/ml，使血細胞凝集素的濃度超過180μg/ml。
10.貯藏將最終的單價疫苗在2-8℃最多貯藏18個月。
B 流感疫苗的制備三個病毒株，A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17和B/Johannesburg/5/99的最終的單價疫苗是按照上面部分A描述的方法生產的。
混合將適量的最終的單價疫苗分別與終HA濃度為60μg/ml的A/NewCaldonia/20/99(H1N1)IVR-116，A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17，和終HA濃度為68μg/ml的B/Johannesburg/5/99混合。分別把Tween 80，Triton X-100和生育酚琥珀酸酯調節至1,000μg/ml，110μg/ml和160μg/ml。用磷酸鹽緩沖鹽水把終體積調節至3升。用0.8μm的醋酸纖維素膜過濾三價混合物，獲得最終的三價疫苗。把最終的三價疫苗填充到注射器中，每支至少0.165mL。
疫苗的給予疫苗是在預先填充的注射器中提供的，并在三角肌區皮內給予。皮內(ID)注射用針在EP1092444中描述，它具有一個皮膚刺入限制器，從而確保適當的皮內注射。注射部位形成的風團(斑塊)證實了ID給藥的良好質量，研究人員測量了接種30分鐘后，受試者風團的準確大小。
一劑(100μl)含有下列成分
B.將上述疫苗與標準的三價斷裂流感疫苗FluarixTM進行比較Fluarix疫苗是在預先填充的注射器中提供的，并在三角肌區肌內給予。所用針頭的長度至少為2.5cm/l英寸(23號)，以便確保適當的肌內注射。
一劑(0.5ml)含有下列成分
結果給予疫苗時，全部分組的平均年齡為70.4±6.2歲標準偏差(S.D.)，女性/男性的比例為1.7∶1。
據報道，有10/65(15.4％)的疫苗接種者出現注射部位疼痛，這是FluarixTMIM給藥的最普遍癥狀。在ID組中，有3/65(4.6％)的疫苗接種者出現疼痛。這種差異在統計學上是顯著的(p＝0.038；Fisher精確檢驗)。因此，優選ID遞送硫柳汞含量降低的產品。
結論在老年組中，硫柳汞含量降低的流感疫苗的ID和IM給予可提供100％血清保護。
就幾何平均滴度，血清保護率，血清轉變率和換算因數而言，在IM和ID接種個體中，都可見到對接種的可比較反應，其中ID組接受了少于2.5倍的抗原。在兩個治療組中，在與疫苗有關的誘導/非誘導性全身癥狀的整個發病率方面，沒有可辨別的差異。
實施例10-硫柳汞含量降低的疫苗的皮內遞送按照實施例9所述(區別在于，混合是獨立進行的，且疫苗沒有填充到注射器中)制備的硫柳汞含量降低的斷裂流感疫苗的免疫原性是使用標準針頭在豚鼠中通過ID遞送而評估的。
給每組中的5只動物用完全滅活的三價流感病毒鼻內給藥，其中所述完全滅活的三價流感病毒在200μl的總體積中含有5μg HA。激發28天后通過皮內或肌內途徑接種動物。皮內劑量在0.1ml中含有0.1，0.3，或1.0μg三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒，使用標準針頭在豚鼠背部給藥。肌內劑量在0.1ml的體積中含有10μg三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒，在豚鼠的后腿給藥。各組如下1組-0.1μg 三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒ID；2組-0.3μg 三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒ID；3組-1.0μg 三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒ID4組-1.0μg 三價，硫柳汞含量降低的斷裂流感病毒IM接種14天后，采集動物的血液，并使用標準的血細胞凝集素測定法(HI)評估接種誘導的抗體滴度。結果在

圖1表示。對所有三個毒株的強烈HI反應都是由接種誘導的。沒有見到明顯的劑量反應，表明當通過ID途徑給藥時，非常低劑量的，硫柳汞含量降低的抗原仍然能夠誘導非常有效的HI抗體反應。通過ID或IM接種誘導的HI滴度之間沒有顯著性差異。因此，在豚鼠中獲得的結果證實，ID途徑與IM途徑相比，硫柳汞含量降低的三價斷裂流感抗原可在動物中誘導相似水平的HI抗體。
實施例11-硫柳汞含量降低的，含有佐劑的流感疫苗的皮內遞送在第0天，用含有5μg三價全滅活流感病毒的200μl疫苗鼻內給予豚鼠而進行激發。
接種-第28天-按照實施例9所述，制備每株三價斷裂流感病毒含有0.1μg HA的疫苗(區別在于混合步驟導致1.0μg/ml的終抗原濃度，從而給予和實施例9中60μg/ml相比，0.1μg/100μl的劑量)。含佐劑或不含佐劑，最終的三價制劑是用結核菌素注射器皮內給予100μl。
放血-第42天加入佐劑的作用是利用HI測定法測量抗體反應而評估的(第0，28，42天)。
所有ID實驗都是用標準注射用針進行的。
結果G1-G5是指5組豚鼠，每組5只。
G1 斷裂，三價，硫柳汞含量降低的，0.1μgG2 斷裂，三價，硫柳汞含量降低的，0.1μg+3D-MPL 50μg
G3 斷裂，三價，硫柳汞含量降低的，0.1μg+3D-MPL 10μgG4 斷裂，三價，硫柳汞含量降低的，0.1μg+3D-MPLin 50μg+QS21 50μgG5 斷裂，三價，硫柳汞含量降低的，0.1μg+3D-MPLin 10μg+QS21 10μg3D+MPLin+QS21是指一種佐劑制劑，它包括含膽固醇的單層脂質體，具有含二油酰基磷脂酰膽堿的脂質雙層，其中QS21和3D-MPL與脂質雙層相連，或包埋在脂質雙層內。這種佐劑制劑在EP 0 822 831B中描述，這篇文獻公開的內容引入此處作為參考。
HI滴度抗-A/New Caledonia/20/99
HI滴度抗-A/Panama/2007/99
HI滴度抗-B/Johannesburg/5/99
因此，無論是含佐劑還是不含佐劑的硫柳汞含量降低的三價斷裂流感病毒抗原，都是一種有效的免疫原，而且當通過ID或IM途徑給藥時，能夠誘導較強的HI反應。這些反應至少與標準Fluarix制劑誘導的反應同樣有效。
實施例12-比較含有硫柳汞和沒有硫柳汞的疫苗在豬中的皮內遞送為了評估ID途徑給予的斷裂流感疫苗的免疫原性(加上或減去硫柳汞)，使用了豬模型。因為群體的絕大多數已經歷了至少一次流感的感染，因此流感疫苗必須能夠加強預先存在的免疫反應。因此，要努力進行動物試驗，以便更好地模擬人類的情況。
在該實驗中，對4周齡的豬通過鼻內途徑給藥。每組5只，共6組動物是如下給藥的1組-在第0天和第14天，用三價全滅活病毒(50μg每種HA)激發兩次；2組-在第0天和第14天，用三價全滅活病毒(50μg每種HA)激發兩次；3組-在第0天，用三價全滅活病毒(50μg每種HA)激發一次；4組-在第0天和第14天，用三價全滅活病毒(25μg每種HA)激發兩次；5組-在第0天，用三價全滅活病毒(25μg每種HA)激發一次；6組-在第0和第14天，用三價全滅活病毒(12.5μg每種HA)激發兩次。
在最后一次激發后的第28天，通過ID途徑用100μl中的3μg HA的三價斷裂抗原給動物接種(病毒株A/New Caledonia H1N1，A/PanamaH3N2，和B/Johannesburg)。1組接受含有硫柳汞防腐劑的標準FluarixTM作為疫苗抗原。所有其它組都接受沒有防腐劑的抗原。
該實驗所得的HI結果在圖2中表示(通過用各種抗原劑量激發，并通過皮內途徑用3μg三價流感抗原加上或減去硫柳汞接種，而在豬中誘導的抗-流感血細胞凝集素抑制滴度)。
在該實驗中，可對B株病毒誘導相對較低的HI低度，而抗A/H3N2毒株的本低較高。當減少激發劑量時，仍然可以觀察到接種反應的有益作用。在幾乎所有的情況下，抗原濃度或激發劑量數的降低(用50μg激發兩次)都可導致對接種的反應增強。而使用50μg激發兩次的1組和2組動物對接種的反應并不明顯，在這些條件下，似乎沒有防腐劑的抗原(2組)的作用至少與FluarixTM(1組)的相同。其它激發的動物(3-6組)對于利用ID途徑，使用沒有防腐劑的三價流感抗原進行接種的強烈反應是很清楚的，而且這種反應甚至可在B株中見到，雖然HI滴度仍然很低。
權利要求
1.一種滅活的流感病毒制劑，它含有在沒有硫柳汞存在條件下，或低水平硫柳汞條件下穩定的血細胞凝集素抗原，其中的血細胞凝集素可通過SRD測定法檢測。
2.根據權利要求1所述的滅活流感病毒制劑，它含有膠束修飾賦形劑。
3.根據權利要求2所述的滅活流感病毒制劑，其中所述賦形劑包括足以使HA穩定量的α-生育酚或其衍生物。
4.根據權利要求3所述的滅活流感病毒制劑，其中所述α-生育酚是以α-生育酚琥珀酸酯的形式存在的。
5.根據權利要求4所述的滅活流感病毒制劑，其中所述α-生育酚琥珀酸酯的濃度為1μg/ml-10mg/ml。
6.根據權利要求5所述的滅活流感病毒制劑，其中所述α-生育酚琥珀酸酯的濃度為10-500μg/ml。
7.根據權利要求2所述的滅活流感病毒制劑，其中所述賦形劑包括足以使HA穩定量的帶正電或帶負電或兩性的兩親分子。
8.根據權利要求7所述的滅活流感病毒制劑，其中所述帶電的兩親分子是以烷基硫酸酯，或烷基-芳基-硫酸酯的形式存在的。
9.根據權利要求8所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基硫酸酯，或烷基-芳基-硫酸酯的濃度為1μg/ml-10mg/ml。
10.根據權利要求9所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基硫酸酯，或烷基-芳基-硫酸酯的濃度為10-500μg/ml。
11.根據權利要求2所述的滅活流感病毒制劑，其中所述賦形劑含有足以使HA穩定量的非-離子型兩親分子。
12.根據權利要求11所述的滅活流感病毒制劑，其中所述非-離子型兩親分子是以烷基多聚糖苷或其衍生物的形式存在的。
13.根據權利要求12所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基多聚糖苷是Plantacare。
14.根據權利要求12或13所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基多聚糖苷的濃度為1μg/ml-10mg/ml。
15.根據權利要求14所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基多聚糖苷的濃度為10-500μg/ml。
16.根據權利要求11所述的滅活流感病毒制劑，其中所述非-離子型兩親分子是以烷基醇聚亞烷基醚或其衍生物的形式存在的。
17.根據權利要求16所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基醇聚亞烷基醚是Laureth-9。
18.根據權利要求16或17所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基醇聚亞烷基醚的濃度為1μg/ml-10mg/ml。
19.根據權利要求18所述的滅活流感病毒制劑，其中所述烷基醇聚亞烷基醚的濃度為10-500μg/ml。
20.根據權利要求1-19任何一項所述的滅活流感病毒制劑，其中所述流感病毒抗原制劑選自斷裂病毒抗原制劑，亞單位抗原，化學或其它方式滅活的全病毒。
21.根據權利要求20所述的滅活流感病毒制劑，其中所述流感抗原制劑是斷裂病毒抗原制劑。
22.根據權利要求1-21任何一項所述的滅活流感病毒制劑，它含有A株和B株血細胞凝集素。
23.根據權利要求22所述的滅活流感病毒制劑，它是三價的流感病毒制劑。
24.根據前述權利要求任何一項所述的滅活流感病毒制劑，它含有穩定的B株流感HA。
25.一種流感病毒抗原制劑，它含有至少一種穩定的流感血細胞凝集素抗原和穩定賦形劑，該賦形劑選自權利要求1-19所述的賦形劑。
26.根據權利要求25所述的流感病毒抗原制劑，它含有至少一種穩定的B株流感血細胞凝集素抗原。
27.根據權利要求25或26所述的流感病毒抗原制劑，其中所述賦形劑是α-生育酚或其衍生物，如α-生育酚琥珀酸酯。
28.根據權利要求27所述的流感病毒抗原制劑，其中所述α-生育酚或其衍生物的量足以使血細胞凝集素穩定。
29.一種含有權利要求1-28任何一項所述的流感病毒制劑的流感疫苗。
30.根據權利要求29所述的流感疫苗，其中按照SRD測定法測量的每株流感疫苗的血細胞凝集素抗原的濃度為1-1000μg/ml。
31.根據權利要求29或30所述的流感疫苗，它還含有佐劑。
32.一種制備穩定的血細胞凝集素抗原的方法，該方法包括在有α-生育酚或其衍生物，如α-生育酚琥珀酸酯存在的條件下純化抗原。
33.一種預防受試者中的流感感染或疾病的方法，包括給予受試者權利要求29-31所述的疫苗。
34.根據權利要求33所述的方法，其中疫苗是皮內，鼻內，肌內，口服或皮下遞送的。
35.α-生育酚或其衍生物作為血細胞凝集素穩定劑在制備流感疫苗中的用途。
全文摘要
本發明描述了一種滅活的流感病毒制劑，它含有在沒有硫柳汞存在條件下，或低水平硫柳汞條件下穩定的血細胞凝集素抗原，其中的血細胞凝集素可通過SRD測定法檢測。所述流感病毒制劑可含有足以使血細胞凝集素穩定量的膠束修飾賦形劑，如α－生育酚或其衍生物。
文檔編號C07K14/11GK1533434SQ02814655
公開日2004年9月29日 申請日期2002年5月29日 優先權日2001年5月30日
發明者U·埃希霍恩, U 埃希霍恩 申請人:史密絲克萊恩比徹姆藥品兩合公司德累斯頓薩克西舍斯血清漿液廠, 史密絲克萊恩比徹姆藥品兩合公司德累