專利名稱：抗trail－r抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及識別參與細胞凋亡的細胞膜分子TRAIL受體1(TRAIL-R1)或TRAIL受體2(TRAIL-R2)的抗TRAIL受體(TRAIL-R)抗體。
此外，本發明涉及含有抗TRAIL-R抗體作為有效成分的預防藥或治療藥以及使用該預防藥或治療藥抵抗由表達TRAIL-R的細胞引起的疾病，并且本發明尤其涉及抵抗惡性腫瘤所用的治療藥物。
背景技術：
在活的生物體中，由正常細胞改變所引起的生理性細胞死亡被稱為凋亡，而所述凋亡不同于壞死，壞死為病理性細胞死亡[參見Kerr等(1972)Br.J.Cancer 26，239]。凋亡是一般在例如胚胎發生過程和淋巴細胞(T細胞和B細胞)選擇中所觀察到的現象[參見Itoh，S.等(1991)Cell 66，233-243]。人們認為，當本來應該通過凋亡清除的細胞未被清除時，可以引起癌癥、狼瘡、皰疹病毒感染和其它問題。此外，當本來應該存活的細胞通過凋亡清除時，可以引起諸如AIDS、早老性癡呆、帕金森病、肌萎縮性側索硬化、多發性硬化、色素性視網膜炎、再生障礙性貧血、心肌硬塞、腦卒中或毒性物質誘導的肝病等疾病和病理病癥[參見Kataoka，S.等(1996)The Oncologist 1，399-401]。
在細胞凋亡期間，觀察到各種特征性現象，例如細胞表面彎曲、核染色質凝聚、染色體DNA碎裂和線粒體功能喪失。各種內在和外在信號被認為引起這些細胞改變。已有報道，癌基因例如myc和bcl-2以及腫瘤抑制基因例如p53作為內在信號參與細胞凋亡的誘導[參見KATAOKA等，(1993)JIKKEN IGAKU 11，17，2324-2328]。已知化療藥物、輻射等作為外在信號誘導細胞凋亡[參見KATAOKA等，(1994)SAISHIN IGAKU 49，6，1152-1157]。
作為參與細胞凋亡的分子，已經鑒定出屬于腫瘤壞死因子家族(TNF家族)例如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和Fas配體的分子。已有報道，TNF-α和TNF-β誘導癌細胞凋亡[參見Schmid等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83，1881；參見Dealtry等，(1987)Eur.J.Immunol.17，689]。由于具有突變Fas或Fas配體的小鼠發生自身免疫病的病癥，因此強有力的表明，Fas配體具有通過細胞凋亡清除周邊自身反應性淋巴細胞的功能[參見Krammer等，(1994)Curr.Op.Immunol.6，279-289；參見Nagata等，(1995)Science 267，1449-1456]。已有報道，與Fas特異性結合的激動性小鼠單克隆抗體發揮作用使針對癌細胞的細胞凋亡誘導活性至與TNF-α所發揮的水平相同的水平[Yonehara等，(1989)J.Exp.Med.169，1747-1756]。
這些TNF家族分子通過與細胞表面特異性受體結合將各種信號傳遞至細胞。TNF家族分子的多種受體是已知的，它們被稱為TNF受體家族分子。
TNF受體家族分子由胞外結構域的富半胱氨酸重復的存在來限定。其中，Fas和TNFR1，均為Fas配體和TNF-α的受體，在細胞內含有被稱為“死亡結構域”的區域，該區與果蠅自殺基因reaper共享同源性[參見Golstein，P.等，(1995)Cell 81，185-186；參見White，K.等(1994)Science 264，677-683]，并且該死亡結構域是細胞凋亡信號轉導所必不可少的。Fas的活化啟動含有死亡結構域的銜接分子FADD/MORT1的締合，然后誘導與FADD/MORT1結合的caspase-8的活化。活化caspase-8激活序列中的下游caspase分子，從而最終導致細胞凋亡[參見Nagata，S.，(1997)Cell 88，355-365]。
最近，已經發現誘導細胞凋亡的新型TNF家族分子。Wiley等[參見Immunity(1995)3，673-682]將所述分子命名為“TNF相關細胞凋亡誘導配體”，或者簡稱為“TRAIL”。該分子也稱為“Apo-2配體”或“Apo-2L”[參見Pitt，R.M.等(1996)J.Biol.Chem.271，12687-12690]。為了方便起見，在本說明書中，將該分子稱為TRAIL。
與Fas配體不同，在許多人體組織(例如脾臟、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小腸、大腸、外周血淋巴細胞、胎盤和腎臟)中，檢測出顯著性水平的TRAIL。在某些細胞系中，TRAIL經組成型轉錄。也已表明，TRAIL以比通過TNF誘導快得多的節拍快速激活細胞凋亡，其時間框類似于Fas的死亡信號轉導[參見Marsters，S.A.等，(1996)Curr.Biol.6，750-752]。
現在，5種蛋白已經被鑒定為TRAIL受體。已有報道，2種受體TRAIL-R1(也稱為DR4)和TRAIL-R2(也稱為DR5)在胞內區中均具有死亡結構域。TRAIL-R1的轉錄物在包括脾臟、外周血淋巴細胞、小腸和胸腺在內的許多人體組織中被識別。在包括脾臟、外周血淋巴細胞和卵巢在內的許多組織中檢測出TRAIL-R2的轉錄物[參見Pan，G.等(1997)Science 276，111-113；參見Pan，G.等(1997)Science 277，815-818；參見Walczak，H.等(1997)EMBO J 16(17)5386-5397]。
在癌細胞中存在由可變剪接產生的TRAIL-R2的兩種形式和包含440個氨基酸的高表達量的TRAIL-R2已有報道[參見Screaton，G.R.等，(1997)Curr Biol 7(9)，693-696；參見Arai，T.等，(1998)CancerLetters 133，197-204]。
重組人TRAIL是一種包含TRAIL胞外區的重組蛋白，并且在許多類型的癌細胞中誘導細胞凋亡已有報道[參見Griffith，T.S.等(1998)Curr.Opin.Immunol.，10，559-563]。
此外，采用人結腸癌細胞和乳腺癌細胞，所述重組人TRAIL對攜帶腫瘤的小鼠模型產生影響[參見Walczak，H.等(1999)NatureMedicine 5，2，157-163]。與也屬于TNF受體家族并且具有細胞凋亡誘導活性的TNF-α或FAS配體不同，TRAIL對小鼠或獼猴的正常組織不造成損害[參見Ashkenazi，A.等(1999)J.Clin.Invest.104，155-162]。
根據這些報道，人們認為，TRAIL選擇性地誘導腫瘤細胞死亡。然而，這樣的選擇性尚未有理論支持，因為TRAIL受體也在正常細胞中表達。此外，所述重組人TRAIL誘導正常人肝細胞凋亡最近也有報道[參見Jo，M.等(2000)Nature Medicine 6，No.5，564-567]以及也誘導人腦細胞凋亡已有報道[參見Nitsch，R.等(2000)The Lancet 356，827-828]。因為誘導肝細胞凋亡的激動性抗Fas抗體在非常短的時間內誘導暴發性肝炎，因而引起小鼠和黑猩猩死亡，TRAIL對肝細胞的細胞死亡誘導引起人們注意到一個特別有意義的問題。利用TRAIL作為人用藥品的安全性一直成問題[參見Nagata，S.等(2000)NatureMedicine 6，5，502-503]。
也有報道，TRAIL對肝細胞的細胞死亡誘導活性的存在與否取決于重組TRAIL蛋白的類型[參見Lawrence，D.(2001)NatureMedicine 7，4，383-385]。然而，重組TRAIL蛋白的安全性仍在研究之中。
最近，首次報道了抗Fas抗體當給予小鼠時不誘導肝病[參見Ichikawa，K.等(2000)International Immunology 12，No.4，555-562]。還沒有證實不引起肺病的已知重組Fas配體。這表明，可以獲得具有配體所沒有的活性的抗體。然而，還未揭示出所述抗體誘導T細胞凋亡但卻沒有肝毒性的原因的理論背景。例如，就諸如TRAIL的一種不同抗原而論，尚未證實是否可以獲得沒有毒性的激動性抗體。
TRAIL與TRAIL-R1、TRAIL-R2或者它們兩者結合，并誘導細胞凋亡。然而，通過所述受體，誘導肝細胞凋亡的信號通過TRAIL介導尚未被證實。此外，基于通過給激動性抗體加入TRAIL-R1/R2選擇性是否可以避免肝毒性的構思，一直沒有進行過研究。
有效治療惡性腫瘤的方法包括清除癌細胞和保護正常組織或細胞。其作用機制為通過重組人TRAIL誘導細胞凋亡的藥物可能對正常組織、特別肝臟和腦造成損害，即使所述藥物能夠清除癌細胞。
目前，使用單克隆抗體例如靶向CD20(細胞膜上存在的一種受體)的嵌合抗體和靶向Her2/neu的人源化抗體來抵抗目標疾病惡性腫瘤，其治療效果已得到普遍認可。由于抗體的特征包括血液中半壽期長和對抗原的高特異性，因此它們尤其可用作抗腫瘤藥。例如，就靶向腫瘤特異性抗原的抗體而論，認為所給予的抗體在腫瘤中累積。因此，可以預期通過免疫系統的補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞介導細胞毒性攻擊癌細胞。另外，諸如放射性核素、細胞毒性物質等藥物與所述抗體的結合能夠將與所述抗體結合的藥物有效傳遞至腫瘤部位。同時，由于到達其它非特異性組織的藥物量減少，因此可以預期副作用降低。當腫瘤特異性抗原具有誘導細胞死亡的活性時，給予具有激動性活性的抗體，而當腫瘤特異性抗原參與細胞增殖和存活時，給予具有中和活性的抗體。因此，由于所述抗體的活性，可以預期腫瘤特異性抗體的累積和腫瘤生長的抑制或者腫瘤的消退。
人們認為，因為上述特征，適于將抗體用作抗腫瘤藥。另外，如果抗體是針對TRAIL受體的抗體，則可以獲得可以避免對肝臟造成損害的抗體，并且該抗體具有針對癌細胞的等同細胞凋亡誘導活性，而對肝臟造成損害是用重組人TRAIL所不能避免的。
發明概述本發明的第一個目的是提供一種新型抗體或其分子類似物，所述新型抗體或其分子類似物能夠與人TRARIL-R1和/或人TRAIL-R2結合并且特異性地誘導癌細胞凋亡，而不會引起正常人肝細胞的損害，但重組人TRAIL卻可能對正常人肝細胞產生損害。本發明的第二個目的是提供一種包含上述抗體或其分子類似物作為有效成分的預防藥或治療藥，以抵抗目前難以治療的各種惡性腫瘤，包括實體瘤。
由于對制備抗人TRAIL-R1和人TRAIL-R2的抗體進行了深入研究，我們通過下述步驟從培養上清液中成功地獲得了單克隆抗體通過基因工程技術，用人TRAIL-R1或人TRAIL-R2免疫能夠產生人抗體的轉基因小鼠，采用Kohler和Milstein等的方法[參見(1975)Nature 256，495]，產生雜交瘤，從而產生與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合的新型單克隆抗體，該方法一般用于單克隆抗體的生產。
此外，我們由于發現所述新型單克隆抗體通過與癌細胞表面存在的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合而特異性地誘導癌細胞凋亡，而完成了本發明。
本發明描述如下(1)一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合。
上述抗體或其功能性片段具有至少一種選自以下(a)-(c)的特性(a)具有誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞凋亡的活性；(b)對表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常細胞沒有影響；和(c)不誘導人肝細胞毒性。
在本發明中，優選具有所有上述特性(a)-(c)的抗體或其功能性片段。此外，本發明的抗體或其功能性片段也包括具有至少一種以上(a)-(c)的特性的抗體或其功能性片段，并且(1)本發明抗體或其功能性片段與TRAIL-R2結合，但不與TRAIL-R1結合，或者(2)本發明抗體或其功能性片段既與TRAIL-R2結合也與TRAIL-R1結合。
(2)上述抗體是一種由小鼠-小鼠雜交瘤例如E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304或KMTR1產生的單克隆抗體，最好是人抗體。由E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、0304或KMTR1產生的單克隆抗體類型為免疫球蛋白G(IgG)，而由G-3-10產生的單克隆抗體類型為免疫球蛋白M(IgM)。上述雜交瘤中的H-48-2、E-11-13、F-4-8、L-30-10、0304和KMTR1已分別進行國際保藏，保藏信息如下。
癌細胞的實例包括結腸癌細胞、Colo205、神經膠質瘤U251細胞和T細胞淋巴瘤Jurkat細胞。癌細胞適于從這些細胞中挑選出來。
(3)本發明的抗體或其功能性片段對于人肝細胞在細胞數為7.5×104且反應時間為24小時的條件下的LD50值為0.01μg/ml或0.01μg/ml以上，優選0.1μg/ml或0.1μg/ml以上，更優選2-10μg/ml，再更優選10-100μg/ml，或者最優選10μg/ml或10μg/ml以上(例如100μg/ml或100μg/ml以上)。同時，本發明的抗體或其功能性片段對于癌肝細胞(例如Colo205細胞、U251細胞或Jurkat細胞)在細胞數為2.5×103且反應時間為48小時的條件下的LD50值為100μg/ml或100μg/ml以下，優選10μg/ml或10μg/ml以下，更優選0.7μg/ml或0.7μg/ml以下，再更優選0.02-0.11μg/ml，或者最優選0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。此外，在本發明中特別優選的抗體或其功能性片段具有一個各LD50值的綜合值，其中對于人肝細胞在細胞數為7.5×104且反應時間為24小時的條件下的LD50值為2-100μg/ml，而對于癌細胞在細胞數為2.5×103且反應時間為48小時的條件下的LD50值為0.02-0.11μg/ml。
通過用110-120μl反應體積/反應系統(孔)進行測量，獲得本發明抗體對于肝細胞或癌細胞的上述LD50值。
(4)此外，本發明的抗體或其功能性片段對于人肝細胞在細胞數為7.5×104且反應時間為24小時的條件下的LD50值要比本發明的抗體或其功能性片段對于癌細胞在細胞數為2.5×103且反應時間為48小時的條件下的LD50值高2倍或2倍以上，優選10倍或10倍以上，更優選50倍或50倍以上(例如50-100倍)，再更優選100倍或100倍以上(例如100-250倍)，再更優選250倍至1000倍，或者最優選1000倍或1000以上。
(5)此外，本發明的抗體或其功能性片段可以抑制腫瘤(例如來源于將Colo205細胞移植到裸鼠的腫瘤)的生長或者使腫瘤消退。在這種情況下，給予本發明的抗體或其功能性片段后，可以抑制腫瘤細胞增殖或可以實現腫瘤消退的時間為至少9天，優選至少11天，或者更優選至少13天。在下文中，優選的時間順序如下至少30天，至少60天，最優選至少120天。另外，將本發明的抗體或其功能性片段給予攜帶腫瘤的待測動物(例如攜帶腫瘤的實驗動物的體重為20g)的劑量為0.1μg/生物體(5μg/kg)至100μg/生物體(5mg/kg)。例如，劑量為100μg/生物體或5mg/kg，優選20μg/生物體或1mg/kg，更優選4μg/生物體或200μg/kg，或再更優選1μg/生物體或50μg/kg。也可以給予0.5μg/生物體(25μg/kg)的劑量。給藥頻率為例如每周1-3次，或者每隔1天進行給藥。
此外，本發明的抗體(例如0304抗體或E-11-13抗體)或其功能性片段在攜帶腫瘤的小鼠中的抗腫瘤效應如下(a)當將本發明的抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后4天，可以誘發平均14％或14％以上的腫瘤縮小。在這種情況下，平均14％或14％以上的腫瘤縮小可以保持至少7天。
(b)當將本發明的抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后4天，可以誘發平均65％或65％以上的腫瘤縮小。
(c)當將本發明的抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后7天，可以誘發平均80％或80％以上的腫瘤縮小。在這種情況下，平均80％或80％以上的腫瘤縮小可以保持至少4天。
(d)當將本發明的抗體或其功能性片段以25μg/小鼠的濃度給予12周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后3天，可以誘發平均45％或45％以上的腫瘤縮小。
(e)當將本發明的抗體或其功能性片段以25μg/小鼠的濃度給予12周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后5天，可以誘發平均65％或65％以上的腫瘤縮小。在這種情況下，平均65％或65％以上的腫瘤縮小可以保持至少27天。
(f)當將本發明的抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有300mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，初次給藥后4天，可以誘發平均39％或39％以上的腫瘤縮小。在這種情況下，平均39％或39％以上的腫瘤縮小可以保持至少14天。
相關腫瘤的實例包括至少一種選自以下的腫瘤結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦腫瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生、男性胚細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構母細胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤和維耳姆斯氏瘤。
(6)一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有以下的氨基酸序列由雜交瘤E-11-13產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO17和19；由雜交瘤L-30-10產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO21和23；由雜交瘤H-48-2產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO25和27；由雜交瘤0304產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO29和31；或由雜交瘤KMTR1產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO33和35。
上述抗體或其功能性片段具有以下的氨基酸序列由從雜交瘤E-11-13中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO16和18編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤L-30-10中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO20和22編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤H-48-2中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO24和26編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤0304中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO28和30編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；或由從雜交瘤KMTR1中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO32和34編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列。
(7)一種產生與TRAIL-R2結合的單克隆抗體的雜交瘤，所述雜交瘤選自E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304和KMTR1。
(8)一種生產抗TRAIL-R2單克隆抗體的方法，所述方法包括培養上述雜交瘤，從所得培養物中收集與TRAIL-R2結合的抗體。
(9)一種生產抗TRAIL-R2單克隆抗體的方法，所述方法包括從上述雜交瘤中分離編碼的單克隆抗體的基因，構建帶有所述基因的表達載體，將所述表達載體導入宿主中，以表達上述單克隆抗體，然后收集來自所述宿主或者所得宿主的培養上清液或分泌物的抗TRAIL-R2單克隆抗體。
宿主的實例包括選自大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞以及哺乳動物的任何宿主。
(10)一種預防性或治療性抗腫瘤藥物，所述藥物包含作為有效成分的上述抗體或其功能性片段。
所述腫瘤的實例包括至少一種選自以下的腫瘤結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦腫瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生、男性胚細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構母細胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤和維耳姆斯氏瘤。
本發明詳細解釋如下。本說明書包括日本專利申請號(申請日為2001年5月18日)、日本專利申請號(申請日為2001年8月9日)和日本專利申請號(申請日為2001年10月11日)的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容，所述日本專利申請為本申請的優先權文件。
所述抗TRAIL-R1單克隆抗體和抗TRAIL-R2單克隆抗體具有誘導癌細胞凋亡的活性已有報道[參見Griffith，T.S.等(1999)J.Immunol.162，2579-2605；參見Chuntharapai，A.等(2001)J.Immunol.166，4891-4898]。然而，這些抗體來源于小鼠。
另外，對正常人肝細胞的細胞毒性值得關注，該細胞毒性也是重組人TRAIL蛋白的問題。
令人驚奇的是，已經表明，本發明的新型人抗TRAIL-R2單克隆抗體不僅沒有誘發針對來源于人正常組織的細胞的細胞毒性而且沒有誘發針對來源于正常肝細胞的細胞毒性的副作用，而重組人TRAIL蛋白對正常肝細胞的細胞毒性被人們所關注。我們獲得了一種新型抗TRAIL-R2單克隆抗體。也就是說，我們通過在世界上首次成功地制備可能有改進的安全性和治療效果優點的新型單克隆抗體，因而完成了本發明。所述單克隆抗體最好是人抗體。已經避開了其抗原性，該抗原性就來源于小鼠的抗體而論總是成問題。
免疫球蛋白G(IgG)、A(IgA)、E(IgE)或M(IgM)的任何抗體類型都可以適合用作所述抗體。通常，更優選IgG。
如下通過明確地給出本發明中所用的詞和短語的含義，詳細地解釋本發明。
1.TRAIL及抗體本發明的抗體是一種針對腫瘤壞死因子(TNF)相關細胞凋亡誘導配體(TRAIL)的受體(TRAIL-R)的抗體。本發明的抗體是(1)與TRAIL-R1反應的抗體、(2)與TRAIL-R2反應的抗體或(3)與TRAIL-R1和TRAIL-R2兩者反應的抗體。在本發明中，抗體(1)可以稱為“抗TRAIL-R1抗體”，而抗體(2)和(3)可以稱為“抗TRAIL-R2抗體”。另外，兩種TRAIL受體即TRAIL-R1和TRAIL-R2在本說明書中為簡便起見，可以將其稱為“TRAIL-R1和R2”。因此，例如“TRAIL-R1和R2表達載體”的描述(參見下文實施例1)意在解釋兩種表達載體即TRAIL-R1的表達載體以及TRAIL-R2的表達載體。
本發明的“抗體”是具有對人TRAIL-R1和R2或其如上定義的部分有反應性的抗體或其部分，并且包括這些抗體的功能性片段。所述“功能性片段”是指保留所述抗體對抗原的一個或多個作用的抗體部分(部分片段)。功能性片段的具體實例包括F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、二硫鍵連接的Fv、單鏈Fv(scFv)及其聚合物(D.J.King.，Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.，1998 T.J.International Ltd)。
本發明中的“人抗體”是指作為人源化抗體基因的表達產物的抗體。
本發明抗體的實例包括具有誘導表達人TRAIL-R1和R2的癌細胞凋亡特性的各種抗體，如下文實施例7中所描述的。
本發明的抗體包括包含重鏈和/或輕鏈的單克隆抗體，其中所述抗體的重鏈和/或輕鏈的每個氨基酸序列中具有缺失、取代或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列。通過例如涉及對編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列進行部分改變的方法，可以在本發明抗體的氨基酸序列中引入上述部分氨基酸改變(缺失、取代、插入或添加)。通過采用已知的定點誘變的標準方法(Proc Natl Acad Sci USA，1984第81卷5662)，可以在所述核苷酸序列中引入所述部分改變。在此，所述抗體為免疫球蛋白，其中構成所述免疫球蛋白的所有區，包括重鏈可變區和重鏈恒定區以及輕鏈可變區和輕鏈恒定區都從編碼免疫球蛋白的基因獲得。
本發明的抗體也包括具有任何免疫球蛋白類別和同種型的抗體。
可以通過以下生產方法，生產本發明的抗TRAIL-R1和R2抗體。具體地說，例如，將上述人TRAIL-R1和R2或其部分與用于增加抗原的抗原性的合適物質(例如牛血清白蛋白)結合，用結合的產物、必要時與免疫增強劑(例如弗氏完全或不完全佐劑)一起免疫非人類哺乳動物，包括人抗體生產的轉基因小鼠等。或者，也可以如下進行免疫通過引入編碼人TRAIL-R1或人TRAIL-R2的基因，然后給予在細胞表面過度表達TRAIL-R1或TRAIL-R2的動物細胞。單克隆抗體可以通過下述步驟獲得培養通過將從免疫動物獲得的抗體生產細胞與不能產生自身抗體的骨髓瘤細胞融合獲得的雜交瘤，然后選擇產生顯示對免疫所用的抗原有特定親和性的單克隆抗體的克隆。
本發明的抗體包括采用本領域技術人員已知的基因工程技術經改變轉變為具有不同亞類的抗體。例如，本發明抗體轉換為IgG2或IgG4亞類使得獲得對Fc受體具有低結合活性的抗體。另外，本發明抗體轉換為IgG1或IgG3亞類使得獲得對Fc受體具有高結合活性的抗體。此外，對Fc受體的結合活性也可以通過人工改變本發明抗體的恒定區的氨基酸序列而改變或者通過與具有這種改變序列的恒定區序列結合而改變。此外，通過將放射性核素例如碘、釔、銦或锝(J.W.Goding，Monoclonal Antibodiesprinciples and practice.，1993，Academic Press)、細菌毒素例如綠膿毒素、白喉毒素或溶素、化療藥例如甲氨蝶呤、絲裂霉素或加利車霉素(D.J.King，Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies.，1998 T.J.International Ltd.；M.L.Grossbard.，Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.，1998Marcel Dekker Inc)或其它前體藥物例如美登木素生物堿(Chari等，Cancer Res.，1992，第52卷127；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，第93卷8681)與本發明的抗體結合，可以進一步增強對諸如癌癥等疾病的治療效果。
此外，我們已經發現具有與TRAIL-R2結合的特性、但不具有與TRAIL-R1結合的特性的本發明抗體包括不誘導人肝細胞毒性的抗體。因此，本發明也提供一種用于生產沒有肝細胞毒性的抗TRAIL-R2抗體的方法，所述方法包括選擇不與來自與TRAIL-R2結合的抗體群體的TRAIL-R1結合的抗體的步驟。然而，沒有肝細胞毒性的本發明抗體并不限于具有與TRAIL-R2結合的特性、但不具有與TRAIL-R1結合的特性的抗體。
在單克隆抗體產生中，本發明包括下述操作步驟。具體地說，所述步驟是例如(1)純化生物聚合物和/或制備在細胞表面過度表達抗原蛋白的細胞(這些生物聚合物和/或細胞用作免疫原)；(2)通過注射抗原、血液收集物免疫動物，測試抗體效價，然后確定切取脾臟等的時間，接著制備抗體生產細胞；(3)制備骨髓瘤細胞(在下文稱為“骨髓瘤”)；(4)將所述抗體生產細胞與骨髓瘤進行細胞融合；(5)選擇產生靶抗體的一組雜交瘤；(6)分離單細胞克隆(克隆)；(7)必要時，培養雜交瘤，用于大量生產單克隆抗體，或者培育其體內移植有所述雜交瘤的動物；和(8)研究如此生產的單克隆抗體的生理學活性和識別特異性，或者測試作為標記試劑的特征。
上述步驟詳細描述了抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體的生產方法，但是所述抗體的生產方法并不限于該方法。例如，也可以使用除脾細胞以外的抗體生產細胞和骨髓瘤。
(1)抗原的純化作為抗原，可以使用人TRAIL-R1和R2的胞外區與人IgG的Fc區的融合蛋白(在下文稱為TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc)。可以通過將編碼TRAIL-R1或R2與人IgG的Fc區的融合蛋白的DNA整合到動物細胞的表達載體中，將所述表達載體導入動物細胞中，然后純化所得轉染子后細胞株的培養上清液，獲得TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc。或者，也可以使用ALEXIS等的市售TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc。此外，也可以用來自人細胞系的細胞膜的純化TRAIL-R1和R2作為抗原。此外，TRAIL-R1和R2的一級結構是已知的[參見Pan，G.等(1997)Science 276，111-113和Science 277，815-818；參見Walczak，H.等(1997)EMBO J 16(17)5386-5397]。因此，按照本領域技術人員已知的方法，用TRAIL-R1和R2的氨基酸序列化學合成肽，然后也可以用所述肽作為抗原。
作為免疫原，用表達載體pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ轉染到L929細胞中并且在細胞表面過度表達TRAIL-R1和R2δ的細胞是有效的，所述表達載體中含有編碼缺失死亡結構域和胞內區死亡結構域C末端側氨基酸的人TRAIL-R1和R2的DNA(在下文稱為TRAIL-R1和R2δ)。可以通過將編碼人TRAIL-R1δ蛋白的DNA和編碼人TRAIL-R2δ蛋白的DNA分別整合到動物細胞表達載體pEFneo中，制備pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ[參見Ohashi.H.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91，158-162]。編碼TRAIL-R1和R2的DNA、載體、宿主等并不限于此。
具體地說，培養通過用pEF-TRAIL-R1和R2δ轉染L929細胞獲得的轉染子細胞株。采用通過其中插入了pEFneo載體的細胞所獲得的新霉素抗體性狀作為指標，并且采用山羊抗TRAIL-R1和R2多克隆抗體(DAKO)證實TRAIL-R1和R2δ的表達，可以制備在細胞表面過度表達人TRAIL-R1和R2δ的L929細胞。
(2)抗體生產細胞的制備步驟將(1)中獲得的抗原、弗氏完全或不完全佐劑或助劑例如硫酸鋁鉀混合，然后用所述混合物作為免疫原免疫實驗動物。最優選用能夠產生人源化抗體的轉基因小鼠作為實驗動物，這樣的小鼠描述于Tomizuka等的出版物[Tomizuka等，Proc Natl Acad Sci USA，2000，第97卷722]中。
小鼠免疫時給予免疫原的方法可以是皮下注射、腹膜內注射、靜脈內注射、皮內注射、肌內注射或爪墊注射中的任一種。優選皮下注射、腹膜內注射、爪墊注射或靜脈內注射。
免疫可以進行1次，或以適當間隔(優選3天至1周的間隔或者2周的間隔)重復進行(多次)。隨后，測量所述免疫動物血清中針對所述抗原的抗體效價，將顯示具有足夠高抗體效價的動物用作抗體生產細胞源，以提高下述步驟的效率。一般而言，從最后一次免疫后3-5天的動物收獲的抗體生產細胞優選用于后續細胞融合步驟。
本文中所用的測定抗體效價的方法的實例包括各種已知技術，例如放射免疫測定(在下文稱為“RIA法”)、酶聯免疫吸附測定(在下文稱為“ELISA法”)、熒光抗體法和被動血凝測定法。鑒于例如檢測靈敏度、快速、準確性和操作自動化的可能性，更優選RIA法或ELISA法。
在本發明中，可以按照例如ELISA法，通過以下程序測量抗體效價。首先，將純化或部分純化的重組人TRAIL-R1和R2吸附至固相(例如96孔ELISA板)的表面。尚未吸附抗原的固相表面再用與所述抗原無關的蛋白例如牛血清白蛋白(在下文稱為“BSA”)封閉。洗滌所述表面后，讓孔表面與作為第一抗體的經過連續稀釋的樣品(例如小鼠血清)接觸。使所述樣品中的抗TRAIL-R1和R2抗體與上述抗原結合。加入作為第二抗體的針對人抗體的酶標抗體，以與人抗體結合。洗滌后，加入所述酶的底物，然后測量由于底物降解引起的顯色所致的吸光度的變化等。通過該方法，計算抗體效價。
(3)骨髓瘤細胞的制備可以使用能夠產生自身抗體并且來源于哺乳動物例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人的細胞作為骨髓瘤細胞。一般而言，優選使用得自小鼠的已建立細胞系，例如8-氮鳥嘌呤抗性小鼠(得自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton D.E.等，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，81，1-7(1978)]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler，G.等，European J.Immunology，6，511-519(1976)]、Sp2/O-Ag14(SP-2)[Shulman，M.等，Nature，276，269-270(1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Keamey，J.F.等，J.Immunology，123，1548-1550(1979)]和P3X63Ag8(X63)[Horibata，K.和Harris，A.W.Nature，256，495-497(1975)]。將這些細胞系在例如以下的培養基中傳代培養8-氮鳥嘌呤培養基[通過將8-氮鳥嘌呤加入到補充谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素和胎牛血清(在下文稱為“FCS”)的RPMI-1640培養基中而制備的培養基]、Iscove氏改進的Dulbecco氏培養基(在下文稱為“MDM”)或Dulbecco氏改進的Eagle培養基(在下文稱為“DMEM”)。在細胞融合前3-4天，采用正常培養基(例如含有10％FCS的DMEM培養基)進行傳代培養，以確保在細胞融合當天可得到至少2×107細胞。
(4)細胞融合抗體生產細胞是血漿細胞或淋巴細胞，所述血漿細胞或淋巴細胞是其祖細胞并且可以從動物任何部位獲得。一般而言，所述細胞可以來源于例如脾臟、淋巴結、骨髓、扁桃體、外周血或它們的合適組合。最常使用脾細胞。
在最后一次免疫后，從具有預定抗體效價的小鼠中取出脾臟，其中脾臟是存在抗體生產細胞的一個部位，從而制備脾細胞即抗體生產細胞。目前，用于將脾細胞與在步驟(3)中獲得的骨髓瘤細胞融合的最常用方法是利用聚乙二醇的方法，聚乙二醇的細胞毒性比較低并且用該方法使融合程序簡單化。例如該方法包括下述步驟。
將脾細胞和骨髓瘤細胞用無血清培養基(例如DMEM)或磷酸緩沖鹽溶液(在下文稱為“PBS”)充分洗滌，然后進行充分混合，使得脾細胞與骨髓瘤細胞的細胞數目比率約為5∶1至10∶1，然后離心。棄去上清液，然后使沉淀細胞群充分松散。向沉淀中邊攪拌邊滴加1ml含有50％(w/v)聚乙二醇(分子量為1,000-4,000)的無血清培養基。隨后，緩慢加入10ml無血清培養基，然后離心。再次棄去上清液。將沉淀的細胞懸浮于含有適量次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(在下文稱為“HAT”)的溶液(在下文稱為“HAT培養基”)和人白介素-6(在下文稱為“IL-6”)的正常培養基中，然后將懸浮液加入到培養板(在下文也簡稱為“板”)的各孔中，然后在5％CO2氣體存在下、于37℃培養約2周。在培養期間，可適當地補充HAT培養基。
(5)雜交瘤的選擇當上述骨髓瘤細胞是抗8-氮鳥嘌呤細胞株即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)有缺陷的細胞時，非融合的骨髓瘤細胞和骨髓瘤-骨髓瘤融合細胞都不能在含有HAT的培養基中存活。盡管兩種抗體生產細胞的融合細胞或者抗體生產細胞與骨髓瘤細胞的雜交瘤細胞可以存活，但是兩種抗體生產細胞的融合細胞僅有有限的壽命。因此，在含有HAT的培養基中連續培養時，僅抗體生產細胞與骨髓瘤細胞的雜交瘤細胞存活，致使可以選擇出所述雜交瘤細胞。
用于雜交瘤生長形成集落，則將HAT培養基更換為缺乏氨基蝶呤的培養基(在下文稱為“HT培養基”)。此后，收集培養上清液的一部分，然后通過ELISA法測量例如抗TRAIL-R1和R2抗體效價。然而，當將上述融合蛋白用作ELISA抗原時，也必需去除產生與人IgG的Fc區特異性結合的抗體的克隆的步驟，以便不選擇出這種克隆。這種克隆的存在與否可以采用人IgG的Fc區作為抗原通過例如ELISA加以證實。
使用抗8-氮鳥嘌呤細胞株的方法見以上的示例性說明。根據雜交瘤的選擇方法也可使用其它細胞株。在此情況下，根據所用的方法使用不同的培養基組分。
(6)克隆步驟將采用與步驟(2)中測量抗體效價的相似方法證明生產特異性抗體的雜交瘤細胞轉移到另一板中，然后進行克隆。克隆方法的實例包括有限稀釋法，其中進行稀釋，使得板的各孔含有一個雜交瘤細胞，然后進行培養；軟瓊脂法，其中在軟瓊脂培養基中進行培養，然后收集集落；用顯微操作器挑出單細胞后進行培養的方法；和“分選器克隆法(sorter clone method)”，其中通過細胞分選器分離單細胞。有限稀釋法是便捷的常用方法。
對于檢測出抗體效價的每個孔，通過有限稀釋法將克隆程序重復2-4次，然后選擇具有穩定抗體效價的細胞株作為抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體生產雜交瘤細胞株。
另外，作為本發明的人抗TRAIL-R2單克隆抗體生產細胞的小鼠-小鼠雜交瘤H-48-2于2001年5月18日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(International Patent OrganismDepositary at the National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))。國際保藏號為FERM BP-7599。另外，同時于2001年8月8日，將雜交瘤E-11-13進行國際保藏，保藏號為FERM BP-7698；將雜交瘤F-4-8進行國際保藏，保藏號為FERM BP-7699；將雜交瘤L-30-10進行國際保藏，保藏號為FERM BP-7700。另外，同時于2002年5月10日，將雜交瘤0304進行國際保藏，保藏號為FERM BP-8037；將雜交瘤KMTR1進行國際保藏，保藏號為FERM BP-8038。因此，例如當采用小鼠-小鼠雜交瘤制備抗體時，可以通過步驟(7)和以下步驟(如下所述)制備所述抗體，而省去步驟(1)-(6)時。此外，進行體內培養例如在小鼠腹水中進行培養，然后可以從所述腹水中分離出抗體。
(7)培養雜交瘤以制備單克隆抗體克隆完成后，將雜交瘤在正常培養基中培養，更換為HT培養基。
用大培養瓶通過滾動-劃線系統(roll-streak system)培養，或者通過旋動培養法，進行大規模培養。采用本領域技術人員已知的方法例如凝膠過濾，純化得自大規模培養的上清液，以便可以獲得作為有效成分的本發明預防藥或治療藥中所含有的抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體。此外，雜交瘤也可以在同源小鼠(例如BALB/c小鼠)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔腹膜內增殖，可以獲得含作為有效成分的本發明預防藥或治療藥中所含有的大量抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體的腹水。作為便捷的純化方法，也可以使用例如市售單克隆抗體純化試劑盒(例如，MAbTrap GII試劑盒；AmershamPharmacia Biotech)。
如此獲得的單克隆抗體對人TRAIL-R1和R2具有高度抗原特異性。
(8)單克隆抗體的證實如此獲得的單克隆抗體的同種型和亞類的測定可以如下進行。鑒定方法的實例包括Ouchterlony法、ELISA法和RIA法。盡管Ouchterlony法是便捷的，但是當單克隆抗體的濃度低時，需要富集步驟。
相比之下，當使用ELISA法或RIA法時，培養上清液可與抗原包被的固相整體反應。通過再利用各種免疫球蛋白同種型和亞類的抗體作為第二抗體，可以鑒定出所述單克隆抗體的同種型和亞類。
此外，可以通過Folin-Lowry法以及通過運用280nm吸光度的計算方法(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)，進行蛋白質的定量。
單克隆抗體所識別的表位的鑒定如下進行。首先，制備單克隆抗體所識別的分子的各個部分結構。為了制備所述部分結構，例如，一種方法用已知的寡肽合成技術生產所述分子的各種部分肽；一種方法通過基因工程技術將編碼目標部分肽的DNA序列整合到合適的表達質粒中，然后在宿主(例如大腸桿菌)內、外生產所述肽。一般而言，為達到上述目標，這兩種方法常常結合使用。例如，通過本領域技術人員已知的基因工程技術，可以制備從抗原蛋白的C末端或N末端開始適當順序減小長度的一系列多肽。隨后，研究所述單克隆抗體對它們的反應性，以確定大致識別位點。
其次，更準確地講，采用本領域技術人員已知的寡肽合成技術，合成各種各樣的對應于所述位點的寡肽、所述肽的突變體等。然后，檢查所述單克隆抗體(作為有效成分包含于本發明預防藥或治療藥中)與這些肽結合的能力，或者檢查所述肽在所述單克隆抗體與抗原結合中的競爭性抑制活性，從而更加精細地鑒定出所述表位。作為獲得種類繁多的寡肽的便捷方法，也可以使用市售試劑盒(例如SPOTs試劑盒，GENOSYS BIOTECHNOLOGIES)和采用multipin合成法等的一系列multipin肽合成試劑盒(Chiron)。
此外，從抗體生產細胞例如雜交瘤細胞中克隆編碼人單克隆抗體的基因，將所述基因整合到合適的載體中，然后將所述載體導入宿主(例如哺乳動物細胞系、大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞)中。因此，可以制備采用基因重組技術產生的重組抗體(P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000OXFORD UNIVERSITY PRESS，J.W.Goding.，Monoclonal Antibodiesprinciples and practice.，1993 ACADEMIC PRESS)。
一種用于從雜交瘤中制備編碼單克隆抗體的基因的方法包括通過PCR等方法制備分別編碼單克隆抗體的輕鏈可變區、輕鏈恒定區、重鏈可變區和重鏈恒定區的DNA的步驟。在這種情況下，可以將根據抗TRAIL-R抗體基因或氨基酸序列設計的寡DNA用作引物，而可將從所述雜交瘤中制備的DNA用作模板。將這些DNA整合到合適的載體中，然后將所述載體導入表達宿主中。或者，將這些DNA分別整合到合適的載體中，從而引起共表達。
本文所用的載體的實例包括可以在宿主微生物中自主復制的噬菌體或質粒。質粒DNA的實例包括從大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillussubtilis)或酵母中獲得的質粒。噬菌體DNA的實例是λ噬菌體。
轉化所用的宿主的實例并沒有具體的限制，只要它可以表達靶基因即可，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)、酵母、動物細胞(例如COS細胞和CHO細胞)和昆蟲細胞。
將基因導入宿主的方法是已知的，并且可以使用任何這樣的方法(例如利用鈣離子的方法、電穿孔法、原生質球法、乙酸鋰法、磷酸鈣法和脂質轉染法)。另外，將基因導入動物(如下所述)的方法的實例包括微注射法、通過電穿孔或脂質轉染法將基因導入ES細胞的方法以及核移植法。
在本發明中，可以通過培養轉化體，從培養物中收集抗體，獲得抗TRAIL-R抗體。術語“培養物”是指(a)培養上清液、(b)培養細胞或培養微生物或其破碎的細胞或微生物或(c)轉化體的分泌物中的任一種。為了培養轉化體，使用適合本文所用的宿主的培養基，并且使用靜置培養法，即一種采用滾瓶等的培養法。
培養后，當在微生物或細胞內產生靶蛋白時，通過破碎所述微生物或細胞收集抗體。此外，當在微生物或細胞外產生靶抗體時，使用全部培養液，或者通過離心等除去所述微生物或細胞。隨后，可以采用通用生物化學方法中一種方法或其與各種用于蛋白質分離和純化的色譜法的適當組合，從上述培養物中分離并純化靶抗體。
此外，通過利用轉基因動物繁殖技術，產生在其內源基因中整合了靶抗體的基因的動物宿主，例如轉基因牛、轉基因山羊、轉基因綿羊或轉基因豬。然后可以從所述轉基因動物分泌的乳中大量獲得抗體基因源性單克隆抗體(Wright，G.等(1991)Bio/Technology 9，830-834)。可以采用已知的營養培養基，在體外培養雜交瘤，所述營養培養基用來讓所述雜交瘤增殖、維持和保存，以便根據各種條件例如待培養細胞類型的特征、實驗或研究的目的及培養方法，使所述雜交瘤在培養上清液中產生單克隆抗體；或者可以采用從已知基本培養基誘導和制備的任何營養培養基。
(9)抗體的特征本發明的抗體具有下述功能特性(a)-(c)，每種特性可以通過例如下文關于(a)-(c)中每項描述的方法加以證實。
(a)當培養人癌細胞、在培養液中含有本發明的抗體并且檢查細胞的存活率時，所述抗體具有誘導表達TRAIL-R1和/或R2的癌細胞凋亡的活性。
(b)當培養人正常組織源性細胞、在培養液中含有本發明的抗體并且檢查細胞的存活率時，所述抗體對表達TRAIL-R1和/或R2的正常細胞沒有影響。
(c)當培養人肝細胞、在培養液中含有本發明的抗體并且檢查細胞的存活率時，所述抗體不誘導肝細胞毒性。
本發明抗體的細胞凋亡誘導活性可以用LD50值(在給定實驗條件下引起細胞的50％死亡的抗體濃度)作為指標來表示。在下文所述的實驗條件下，LD50值為100μg/ml或100μg/ml以下，優選10μg/ml或10μg/ml以下，更優選0.7μg/ml或0.7μg/ml以下，再更優選0.02-0.11μg/ml，或者最優選0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。
此外，術語“對正常細胞沒有影響”或“不誘導肝細胞毒性”是指本發明抗體對正常細胞(人肝細胞)的細胞凋亡誘導活性不太顯著。當用LD50值作為指標時，在下文所述的實驗條件下，LD50值為0.01μg/ml或0.01μg/ml以上，優選0.1μg/ml或0.1μg/ml以上，更優選2-10μg/ml，再更優選10-24μg/ml，或者最優選24μg/ml或24μg/ml以上。
本發明的抗體具有上述活性(a)-(c)中的任一種。所述抗體是一種具有新特征的物質，因為它最好具有上述活性(a)即誘導癌細胞凋亡的活性和上述活性(b)和(c)即不誘導對正常細胞、特別是正常肝細胞的損害的活性。因此，本發明的抗體可用作抵抗惡性腫瘤的預防藥或治療藥中所含有的成分。
正常細胞或癌細胞凋亡誘導活性可以用LD50值作為指標來表示。本發明的LD50值可以如下計算。培養正常細胞(例如人肝細胞)或癌細胞(例如人結腸癌細胞系Colo205；ATCC CCL-222)，然后向培養基中加入本發明的抗體。一段時間后，通過MTT測定(Green，L.M.等，J.Immunological Methods，70257-268(1984))、LDH測定等，測量細胞的存活率。
根據存活率對加入的抗體濃度所作的曲線圖，確定對應于50％的存活率的抗體濃度作為LD50值。
可以根據曲線圖讀出LD50值，或者通過回歸計算找出圖中曲線的公式，計算出LD50值。
在對癌細胞(Colo205)進行的一個實驗中，將2.5×103細胞以100μl培養基/孔接種到96孔平底板的各孔中，然后在5％CO2存在下于37℃進行培養。第二天，加入所述抗體，讓混合物在上述環境中靜置48小時，然后測量細胞的存活率(反應溶液的總體積110-120μl)。在本發明中，將上述條件描述為“細胞數為2.5×103且反應時間為48小時”。
在對正常細胞(肝細胞)進行的一個實驗中，將7.5×104細胞以100μl培養基/孔接種到96孔平底板的各孔中，然后在5％CO2存在下于37℃進行培養。第二天，加入所述抗體，讓混合物在上述環境中靜置24小時，然后測量細胞的存活率(反應溶液的總體積110-120μl)。在本發明中，將上述條件描述為“細胞數為7.5×104且反應時間為24小時”。
本發明的抗體包括具有以下特性的抗體當在上述條件下測量LD50值時，對于正常細胞(人肝細胞)而言，LD50值例如為0.01μg/ml(10ng/ml)或0.01μg/ml以上，或者優選0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。可以說正常細胞的LD50值越高，安全性越高。因此，更優選LD50值為2-100μg/ml的抗體。本發明的抗體包括具有以下特性的抗體當在上述條件下測量LD50值時，對于癌細胞而言，LD50值例如為100μg/ml或100μg/ml以下，或者優選0.7μg/ml或0.7μg/ml以下。可以說癌細胞的LD50值越低，殺死腫瘤細胞的活性越高。因此，更優選LD50值為0.02-0.11μg/ml的抗體。具體地說，本發明的E-11-13抗體、L-30-10抗體和KMTR1抗體具有顯示人肝細胞的LD50值為2-100μg/ml或以上(例如2-24μg/ml，優選100μg/ml)且癌細胞的LD50值為0.02-0.11μg/ml的特性。也就是說，這些抗體既對正常細胞具有安全性又對腫瘤細胞具有細胞凋亡誘導效應。此外，令人驚奇的是，本發明的抗體在攜帶腫瘤的小鼠模型中顯著抑制腫瘤細胞增殖。
下一步檢查在其中“細胞數為7.5×104且反應時間為24小時”的條件下測量的正常細胞的LD50值與在其中“細胞數為2.5×103且反應時間為48小時”的條件下測量的癌細胞的LD50值的比值。如上所述，正常細胞的LD50值越高，安全性越高，而癌細胞的LD50值越低，殺死腫瘤細胞的活性越高。因此，正常細胞的LD50值與癌細胞的LD50值的比值較高的抗體可能一般認為是有用的(較高的安全性和較強的癌細胞凋亡誘導活性)。假設癌細胞的LD50值與正常細胞的LD50值之比(表示正常細胞的LD50值比癌細胞的LD50值高多少倍)為N/C比。本發明的抗體具有N/C＝2或2以上的特性，即正常細胞的LD50值比癌細胞的LD50值高2倍或2倍以上。優選正常細胞的LD50值比癌細胞的LD50值高10倍或10倍以上(N/C＝10或10以上)，更優選N/C＝10-25。在下文，順序優選的N/C比如下N/C＝50，N/C＝50或50以上，N/C＝50-100，N/C＝100或100以上，N/C＝100-1000，N/C＝250-1000，最優選N/C＝1000或1000以上。
藥用組合物含有通過純化本發明的人抗TRAIL-R1和R2抗體制備的制備物的制劑也包括在本發明的范圍內。這樣的制劑除含有所述抗體外最好還含有生理上可接受的稀釋劑或載體，可以是與其它抗體或其它藥物例如抗生素的混合物。合適載體的實例包括但不限于生理鹽水溶液、磷酸緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽葡萄糖溶液和緩沖生理鹽水。或者，可以將所述抗體凍干，然后必要時通過加入上述重建緩沖水溶液后使用。這種預防藥或治療藥可以各種形式給予。這些藥物的給藥形式的實例包括利用溶媒的口服給藥，例如通過片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑給藥，或者利用溶媒的胃腸外給藥，例如通過注射、滴注或栓劑給藥。
劑量將根據癥狀、患者的年齡、體重等而變化。通常，就口服給藥而論，劑量為約0.01mg-1000mg/天/成人，可以給予1次或在幾種不同情況下分開給藥。此外，就胃腸外給藥而論，可以通過皮下注射、肌內注射或靜脈內注射給予約0.01mg-1000mg/次的劑量。
本發明的抗體或藥用組合物可以用于治療或預防可能由表達TRAIL-R1和R2的細胞引起的各種疾病或癥狀。這類疾病或癥狀的實例包括各種各樣的惡性腫瘤。
這樣的腫瘤類型的實例包括結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦腫瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生、男性胚細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構母細胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤和維耳姆斯氏瘤。應用本發明抗體的腫瘤類型的數目并不限于一種類型，多種類型的腫瘤可以同時發生。
制劑的實例本發明的分子以無菌溶液或懸浮液的安瓿形式使用，所述無菌溶液或懸浮液通過將所述分子溶于水或藥理學上可接受的非水溶液中來制備。另外，安瓿可以裝入無菌粉末制劑(最好是在將本發明的分子凍干的情況下)，所述無菌粉末制劑當使用時可以用藥學上可接受的溶液稀釋。
附圖簡述

圖1顯示對在生產人抗TRAIL-R1單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中的Colo205的細胞死亡誘導活性。
圖2顯示對在生產人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中的Colo205的細胞死亡誘導活性。
圖3顯示對在生產人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中的Colo205的細胞死亡誘導活性(不加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體)。
圖4顯示對在生產人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中的HUVEC的細胞死亡誘導活性。
圖5a顯示人重組TRAIL(陽性對照)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5b顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(H-48-2)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5c顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(E-11-13)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5d顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(L-30-10)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5e顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(F-4-8)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5f顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(W-40-5)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5g顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(0304)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5h顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(0322)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5i顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(KMTR1)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5j顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(D1M)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5k顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(0304，不加入山羊抗人IgG抗體)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖5l顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體(KMTR1，不加入山羊抗人IgG抗體)對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性。
圖6顯示當每隔1天給予小鼠1μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13、F-4-8、H-48-2、L-30-10和W-40-5共3次后腫瘤大小的測量結果。
圖7顯示當給予小鼠4μg、20μg和100μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13共4次后腫瘤大小的測量結果。
圖8顯示當每隔1天給予攜帶300mm3腫瘤的小鼠20μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13共3次后腫瘤大小的測量結果。
圖9顯示當每隔1天給予攜帶100mm3腫瘤的小鼠20μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體0304共3次后腫瘤大小的測量結果。
圖10顯示當給予攜帶100mm3腫瘤的小鼠25μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體0304共3次后腫瘤大小的測量結果。
圖11a顯示重組純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對Colo205細胞的細胞死亡誘導活性(不加入山羊抗人IgG抗體)。
圖11b顯示重組純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對Colo205細胞的細胞死亡誘導活性(加入山羊抗人IgG抗體)。
實施本發明的最佳模式通過以下實施例將更加具體地描述本發明。本發明并不限于這些實施例中所描述的實施方案。
實施例1抗原的制備為了獲得在細胞膜上過度表達人TRAIL-R1和R2的細胞，制備人TRAIL-R1和人TRAIL-R2的質粒表達載體(通過去除人TRAIL-R1和R2的全長氨基酸的胞內區中的死亡結構域和死亡結構域C末端側氨基酸而制備的，在下文稱為TRAIL-R1和R2δ)。通過PCR法制備編碼TRAIL-R1和R2δ的DNA。
a)全長人TRAIL-R1和R2表達載體的構建為了進行模板PCR，用保留編碼人TRAIL-R1和R2的cDNA的質粒載體pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2作為模板。通過下述方法構建pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2。通過聚合酶鏈式反應(PCR)，將EcoR I序列添加到5′末端，而將Not I序列和終止密碼子添加到3′末端，對全長人TRAIL-R1 DNA和人TRAIL-R2 DNA進行修飾。用人胎盤源性cDNA(Clontech)作為模板，對于TRAIL-R1，使用合成引物5′-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3′(SEQ ID NO1)和5′-TTTCTCGAGGCGGCCGCTTATCACTCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTG-3′(SEQ ID NO2)，而對于TRAIL-R2，使用合成引物5′-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-TTTCTCGAGGCGGCCGCTCATTAGGACATGGCAGAGTCTGCATTACCT-3′(SEQ ID NO4)，使用鉑PfxDNA聚合酶(Gibco BRL)，進行30個循環的PCR反應(每個循環由94℃20秒、60℃30秒和68℃90秒組成)。分離經修飾的TRAIL-R1序列和TRAIL-R2序列作為EcoRI-Not I片段，然后將其連接到已經用同樣的酶切割的pcDNA3(Invitrogen)載體中。將所得的質粒命名為pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2。在通過可變剪接形成的兩種片段中，pcDNA3-TRAIL-R2中整合的TRAIL-R2包含由1320bp cDNA編碼的440個氨基酸。在下文，實施例中的所有PCR的反應溫度用GeneAmp PCR系統9700(Perkin Elmer Japan)進行調節。
b)人TRAIL-R1和R2δ表達載體的構建通過下述方法構建人TRAIL-R1和R2δ表達載體的構建。為了制備包含具有1-351的氨基酸序列的TRAIL-R1部分肽的表達質粒以及包含具有1-348的氨基酸序列的TRAIL-R2部分肽的表達質粒，進行PCR反應，以將EcoR I序列添加到TRAIL-R1和R2部分肽的5′末端，而將Not I序列和終止密碼子添加到TRAIL-R1和R2部分肽的3′末端。對于TRAIL-R1，使用寡核苷酸引物5′-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3′(SEQ ID NO1)和5′-TTCTACGAGCGGCTTATCACAGCCTCCTCCTCTGAGA-3′(SEQID NO5)，而對于TRAIL-R2，使用寡核苷酸引物5′-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-TTCTACGAGCGGCCGCTTATCACAAGTCTGCAAAGTCATC-3′(SEQ ID NO6)，使用鉑PfxDNA聚合酶(Gibco BRL)、pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2，進行25個循環的PCR(每個循環由94℃20秒、65℃30秒和68℃75秒組成)。分離經修飾的TRAIL-R1和R2部分肽作為EcoR I-Not I片段。然后將所述EcoR I-Not I片段連接到已經用EcoR I和Not I酶切割的pEFneo載體中。將所得的質粒命名為pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ。
c)人TRAIL-R1和R2δ表達細胞的構建采用LipofectAMINE Plus(Gibco BRL)，將b)中制備的pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ導入L929細胞(美國典型培養物保藏中心保藏號CCL-1(American Type Culture Collection No.CCL-1))中。通過手冊中描述的方法進行轉染。在培養瓶中在5％CO2氣體存在下、于37℃培養細胞(培養面積為75cm2)24小時后，向培養物中加入1mg/ml G418(Gibco BRL)，然后再培養1周。隨后，用山羊抗人TRAIL-R1多克隆抗體和山羊抗人TRAIL-R2多克隆抗體(DAKO)，進行FACS分析。因而證明獲得了G418抗性性狀的轉染細胞在細胞膜表面表達包含351個氨基酸的TRAIL-R1δ和包含348個氨基酸的TRAIL-R2δ。
總是利用自動化DNA合成系統(3948型，Perkin Elmer Japan，Applied Biosystems division)，按照手冊[參見Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.(1981)J.Am.Chem.Soc.103，3185-3191]，進行寡核苷酸例如PCR引物的合成。合成結束后，從支持體中切下每種寡核苷酸，然后進行去保護。將所得的溶液干燥并固化，將所述產物溶于蒸餾水中，然后于-20℃深低溫保藏待用。
實施例2人抗體生產小鼠的產生免疫所用的小鼠具有這樣一種遺傳背景其中它們是內源Ig重鏈和κ輕鏈均被破壞的純合子，并且所述小鼠同時帶有第14號染色體片段(SC20)，該染色體片段含有人Ig重鏈基因座和人Igκ鏈轉基因(KCo5)。讓具有人Ig重鏈基因座的系A小鼠與具有人Igκ鏈轉基因的系B小鼠雜交，產生這些小鼠。系A小鼠是內源Ig重鏈和κ輕鏈均被破壞的純合子并且帶有可遺傳到子代的第14號染色體片段(SC20)，例如Tomizuka等報道中描述的也是如此(Tomizuka等，ProcNatl Acad Sci USA.，2000，第97卷722)。此外，系B小鼠(轉基因小鼠)是內源Ig重鏈和κ輕鏈均被破壞的純合子，并且帶有人Igκ鏈轉基因(KCo5)，例如Fishwild等報道中描述的也是如此(Nat Biotechnol.，1996，第14卷845)。
通過Tomizuka等報道中描述的方法(Tomizuka等，Proc Natl AcadSci USA.，2000，第97卷722)，分析通過使系A的雄性小鼠與系B的雌性小鼠雜交獲得的子代小鼠、或者使系A的雌性小鼠與系B的雄性小鼠雜交獲得的子代小鼠。在血清中同時檢測出具有人Ig重鏈和κ輕鏈的個體(人抗體生產小鼠)根據(Ishida和Lonberg，IBC′s 11thAntibody Engineering，Abstract 2000；Ishida，I.等，Cloning&Stem Cells4，85-96(2002))進行篩選并將其用于以下免疫實驗中。具有上述小鼠的遺傳背景改變的小鼠(Isao ISHIDA，2002，JIKKEN IGAKU 20，6，846-851)也用于所述免疫實驗中。另外，上述人抗體生產小鼠可得自Kirin Brewery Co.，Ltd(通過聯系)。
實施例3抗人TRAIL-R1和R2的人單克隆抗體的制備在本實施例中，依照在例如Introduction of Experimental Protocolsfor Monoclonal Antibody(Monoclonal Antibody Jikken Sosa Nyumon，Tamie ANDO等編著，KODANSHA，1991)中描述的通用方法，制備單克隆抗體。用實施例1中制備的表達TRAIL-R1和R2δ的L929細胞或者人TRAIL-R1和R2的胞外區和人IgG1的Fc區的融合蛋白作為免疫原。免疫所用的動物是在實施例2中產生的人抗體(人免疫球蛋白)生產小鼠。
為了制備抗人TRAIL-R1的人單克隆抗體，用實施例1中制備的表達TRAIL-R1δ的L929細胞通過右爪墊注射初次免疫人抗體生產小鼠(3×106細胞/小鼠)。初次免疫后，每3天通過左爪墊和右爪墊輪流注射用所述L929細胞進行免疫10次。此外，在獲得脾臟和淋巴結前3天(如下所述)，用所述L929細胞通過雙爪墊注射進行免疫。為了制備抗人TRAIL-R2的人單克隆抗體，用實施例1中制備的表達TRAIL-R2δ的L929細胞腹膜內初次免疫人抗體生產小鼠(1×107細胞/小鼠)。初次免疫后，每周5次或6次用所述L929細胞進行腹膜內免疫。此外，在獲得脾臟前3天(如下所述)，用所述L929細胞或人TRAIL-R2的胞外區和人IgG1的Fc區的融合蛋白通過尾靜脈注射進行免疫。此外，將包含人TRAIL-R2的胞外區和人IgG1的Fc區的融合蛋白與弗氏完全佐劑混合。然后所述人抗體生產小鼠用所述混合物進行皮下初次免疫。隨后，將同一種蛋白與弗氏不完全佐劑混合，所述小鼠每2周用所述混合物皮下免疫2次。此外，在獲得脾臟前3天(如下所述)，用同一種蛋白通過尾靜脈注射進行免疫。
通過手術從所述免疫小鼠獲得脾臟和/或淋巴結。然后將該器官置入10ml含有350mg/ml碳酸氫鈉、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的無血清DMEM培養基(Gibco BRL)(在下文稱為“無血清DMEM培養基”)中。然后，然后用刮刀將該器官在篩網(細胞濾過器Falcon)上切碎。將通過所述篩網的細胞懸浮液離心，以沉淀細胞。該細胞用無血清DMEM培養基洗滌2次，將其懸浮于無血清DMEM培養基中，然后對細胞數計數。同時，將在含10％FCS(Sigma)的DMEM培養基(Gibco BRL)(在下文稱為“含血清DMEM培養基”)中在5％CO2氣體存在下于37℃下進行培養以便細胞濃度不超過1×108細胞/ml的骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC No.CRL-1581)以相同的方式用無血清DMEM培養基洗滌。然后，將所述細胞懸浮于無血清DMEM培養基中，然后對細胞數計數。將所收集的細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤懸浮液以5∶1的細胞數比率混合。將該混合物離心，從而完全去除上清液。向該沉淀中溫和地加入作為融合劑的1ml 50％(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)，同時用移液管管尖攪拌沉淀。接著，分2次溫和地加入于37℃預熱的1ml無血清DMEM培養基，然后加入另外的7ml無血清DMEM培養基。離心后，通過去除上清液獲得的融合細胞通過下述有限稀釋法進行篩選。通過將雜交瘤細胞在含有10％胎牛血清(FCS)、次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)(在下文稱為“HAT”，Sigma)的DMEM培養基中，對所述細胞進行篩選。此外，采用含有10％FCS和HT(Sigma)的DMEM培養基，通過有限稀釋法，獲得單克隆。在96孔微量滴定板(Beckton Dickinson)中進行培養。通過下文描述的酶聯免疫吸附測定(ELISA)和熒光激活細胞分選儀(FACS)或通過測量誘導癌細胞的細胞死亡的活性，對產生抗人TRAIL-R1和R2人單克隆抗體的雜交瘤克隆進行篩選并對每個雜交瘤所產生的人單克隆抗體進行表征。
通過實施例4和5中描述的ELISA以及實施例中6描述的FACS分析，獲得大量產生具有人免疫球蛋白γ鏈(hIgγ)和人免疫球蛋白輕鏈κ并且對人TRAIL-R1和/或R2具有特異性反應性的人單克隆抗體的雜交瘤。此外，在包括本實施例在內的以下實施例中的任一實施例以及顯示實施例試驗結果的表和附圖中，產生本發明的各種人抗人TRAIL-R1和R2單克隆抗體的雜交瘤克隆都用符號表示。用符號表示的克隆加上位于所述符號之前或之后的術語“抗體”是指由各雜交瘤所產生的抗體或者由攜帶從所述雜交瘤分離的抗體基因(全長或可變區)的宿主細胞所產生的重組抗體。另外，在原文清楚的范圍內，雜交瘤克隆的名稱可以表示抗體的名稱。以下的雜交瘤克隆代表單克隆1-13、1-18、1-32、1-40、1-43、2-6、2-11、2-12、2-18、2-47、2-52、3-1、3-7、3-10、3-23、3-33、3-42、3-53、1-13-6、1-32-9、1-40-4、1-43-43、2-6-48、2-11-5、2-12-10、2-47-11、2-52-12、3-10-19、3-23-8、3-33-7、3-42-3、3-53-15、2-18-2、3-1-7、E-11、E-14、L-30、N-18、X-14、E-11-13、E-14-4、F-4-2、F-4-8、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-144、X-51-4、X-51-12、A-11、G-3、H-34、I-22、I-35、J-21、J-26、K-8、K-16、K-57、L-4、P-28、P-36、W-42、X-13、X-60、Z-23、1-39、A-4-27、A-4-29、G-3-10、H-34-2、K-57-12、W-42-2、0304、0322、KMTR1和D1M。這些克隆中的H-48-2于2001年5月18日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(International Patent Organism Depositary at theNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))。國際保藏號為FERM BP-7599。此外，E-11-13、F-4-8和L-30-10同時于2001年8月8日保藏于上述國際保藏中心。E-11-13的國際保藏號為FERMBP-7698，F-4-8的國際保藏號為FERM BP-7699，而L-30-10的國際保藏號為FERM BP-7700。此外，E-11-13、F-4-8和L-30-10同時于2001年10月11日保藏于上述國際保藏中心。E-11-13的國際保藏號為FERM BP-7770，F-4-8的國際保藏號為FERM BP-7768，而L-30-10的國際保藏號為FERM BP-7769。此外，0304和KMTR1同時于2002年5月10日保藏于上述國際保藏中心。0304的國際保藏號為FERMBP-8037，而KMTR1的國際保藏號為FERM BP-8038。
實施例4具有人免疫球蛋白輕鏈κ(Igκ)的人抗TRAIL-R1人單克隆抗體或人抗TRAIL-R2人單克隆抗體的檢測加入0.5μg/ml人TRAIL-R1和R2的胞外區和人IgG1的Fc區的融合蛋白(在下文稱為“TRAIL-R1-hFc”和“TRAIL-R2-hFc”(ALEXIS)，對于TRAIL-R2-hFc，包含1-183個氨基酸的區也用作TRAIL-R2的胞外區)的磷酸緩沖鹽溶液(在下文稱為“PBS”)。向96孔ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)的各孔中加入50μl如此制備的溶液，并將其在室溫下保溫1小時或者在4℃下保溫過夜，從而使TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc包被在微量滴定板中。隨后棄去上清液，向各孔中加入封閉劑(SuperBlock(注冊商標)Blocking Buffer(封閉緩沖液)，PIERCE)，然后在室溫下保溫30分鐘，從而封閉其中TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc未結合的部分。因此，制備各孔用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc包被的微量滴定板。
向各孔中加入各雜交瘤的培養上清液(50μl)，在室溫下進行反應1小時，然后各孔用含有0.1％Tween20的PBS(PBS-T)洗滌2次。隨后，將辣根過氧化物酶標記的山羊抗人Igκ抗體(50μl/孔，BiosourceInternational)用含10％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的PBS-T稀釋2000倍。向各孔中加50μl如此制備的溶液，然后在室溫下保溫30分鐘。該微量培養板用PBS-T洗滌3次，然后向各孔中加100μl TMB顯色底物溶液(DAKO)，然后在室溫下保溫20分鐘。向各孔中加入0.5M硫酸(100μl/孔)，以終止反應。用微量培養板讀出儀(MTP-300，Corona Electric)，測量450nm波長(參比波長為570nm)的吸光度。此外，采用通過實施例10中描述的方法獲得的純化抗體，將由雜交瘤0304、0322、KMTR1和D1M產生的抗體進行上述實驗。
表1和表2顯示在如此獲得的抗人TRAIL-R1和R2抗體中的抗體部分的特征。表1顯示所得人抗TRAIL-R1單克隆抗體的亞類和交叉反應性。表2顯示所得人抗TRAIL-R2單克隆抗體的亞類和交叉反應性。
表1
+有反應性-無反應性表2
+有反應性-無反應性實施例5各種單克隆抗體亞類的鑒定通過與實施例4的方法相似的方法，制備各孔用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc封閉的微量培養板，然后各孔用PBS-T洗滌2次。向用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc封閉的微量培養板各孔中加入實施例4中獲得的各雜交瘤的培養上清液(50μl)，進行反應1小時，然后各孔用PBS-T洗滌2次。隨后，向各孔中加入分別用辣根過氧化物酶標記并稀釋2000倍的綿羊抗人IgG1抗體、綿羊抗人IgG2抗體或綿羊抗人IgG3抗體或綿羊抗人IgG4抗體(50μl/孔，The BindingSite)，然后在室溫下保溫1小時。用PBS-T洗滌3次后，向各孔中加入底物緩沖液(TMB，100μl/孔，DAKO)，然后在室溫下保溫20分鐘。接著，加入0.5M硫酸(100μl/孔)，以終止反應。用微量培養板讀出儀(MTP-300，Corona Electric)，測量450nm波長(參比波長為570nm)的吸光度。另外，采用通過實施例10中的方法獲得的純化抗體，將由雜交瘤0304、0322、KMTR1和D1M產生的抗體進行上述實驗。以上表1和表2顯示所得結果。
實施例6各種單克隆抗體對TRAIL-R1和R2表達細胞的反應性試驗通過FACS分析，檢查實施例4中獲得的各種單克隆抗體對實施例1中制備的表達TRAIL-R1δ的L929細胞和表達TRAII-R2δ的L929細胞的反應性。將L929細胞、表達TRAIL-R1δ的L929細胞和表達TRAIL-R2δ的L929細胞以2×106/ml的濃度懸浮于含有1％兔血清、0.1％NaN3和1％FCS的PBS染色緩沖液(SB)中。向96孔圓底板(Beckton Dickinson)中加入該細胞懸浮液(100μl/孔)。離心(2000rpm，4℃，2分鐘)后，去除上清液，然后加入實施例3中培養的雜交瘤的培養上清液(50μl)。攪拌混合物，讓其在冰上靜置30分鐘，然后進行離心(2000rpm，4℃，2分鐘)，以去除上清液。沉淀用SB(100μl/孔)洗滌2次后，加入30μl 0.0125mg/ml RPE熒光標記兔抗人IgκF(ab′)2抗體(DAKO)，然后在冰上保溫30分鐘。用SB洗滌2次后，將該細胞懸浮于300μl SB中，然后通過FACS(FACScan，Beckton Dickinson)測量每種細胞的熒光強度。結果，觀察到所有抗體都僅對表達TRAIL-R1δ的L929細胞或表達TRAIL-R2δ的L929細胞具有強結合活性，而沒有觀察到對L929細胞的結合活性。因此，表明它們是對TRAIL-R1和TRAIL-R2特異性結合的抗體。
實施例7對癌細胞的細胞死亡誘導活性用從實施例3或實施例4-6中獲得的產生人抗TRAIL-R1單克隆抗體或人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤培養上清液測量對Colo205(ATCC No.CCL-222)細胞的細胞死亡誘導活性，該Colo205細胞為結腸癌細胞。制備2.5×104/ml的濃度、在含有10％FCS的RPMI培養基中培養的Colo205細胞。向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，加入50μl/孔雜交瘤培養上清液。此外，當人抗TRAIL-R1單克隆抗體或人抗TRAIL-R2單克隆抗體為IgG時，向各孔中加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)(10μl/孔)，終濃度為5μg/ml。用所得雜交瘤的一部分制備不補充山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的孔。用終濃度為100ng/ml的人重組TRAIL蛋白(DAKO)作為陽性對照。用人IgG(Biogenesis)作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養48小時后，依照用法說明書中介紹的方法，制備MTS試劑(CellTiter 96 AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation AssayPromega)，然后向各孔中加入20μl該試劑。在5.0％CO2氣體下于37℃再培養2小時后，用微量培養板讀出儀(1420 ARVO多標記計數器WALLAC)，測量490nm波長(參比波長為630nm)的吸光度。采用線粒體的還原能力作為指標，計算細胞的存活率。通過以下公式計算各孔中細胞的存活率存活率(％)＝100×(a-b)/(c-b)(其中“a”表示試驗孔的測量值，“b”表示無細胞孔的測量值，而“c”表示陰性對照孔的測量值)。圖1-3及表3和表4顯示所得結果。表3顯示對Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性(在產生人抗TRAIL-R1單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中)。表4顯示對Colo205和人正常肝細胞的細胞死亡誘導活性(在產生人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤的培養上清液中)。
表3
++存活率為80％或80％以上+存活率為21％至79％-存活率為20％或20％以下表4
++存活率為80％或80％以上+存活率為21％至79％-存活率為20％或20％以下結果表明，與陰性對照相比，人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體明顯具有誘導Colo205細胞的細胞死亡活性。此外，已經顯示人抗TRAIL-R2單克隆抗體的一部分(其為IgG)甚至在不存在山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的情況下(在沒有與人抗TRAIL-R2單克隆抗體交聯的情況下)也具有誘導細胞死亡的活性。
實施例8對正常細胞的細胞死亡誘導活性用實施例4-6中獲得的產生人抗TRAIL-R2單克隆抗體的雜交瘤培養上清液測量對HUVEC(Biowhittaker)的細胞死亡誘導活性，該HUVEC細胞為正常人臍靜脈內皮細胞。制備5×104/ml的濃度、在EGM-2培養基(Biowhittaker)中培養的HUVEC細胞。向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。將細胞在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，加入50μl/孔雜交瘤的培養上清液。此外，當人抗TRAIL-R1單克隆抗體或人抗TRAIL-R2單克隆抗體為IgG時，向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)，終濃度為5μg/ml。用人IgG(Biogenesis)作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養48小時后，依照用法說明書中介紹的方法，制備MTS試劑(Cell Titer 96 AQueousNon-Radioactive CellProliferation AssayPromega)，然后向各孔中加入20μl該試劑。在5.0％CO2氣體下于37℃再培養2小時后，用微量培養板讀出儀(1420 ARVO多標記計數器WALLAC)，測量490nm波長(參比波長為630nm)的吸光度。采用線粒體的還原能力作為指標，計算細胞的存活率。通過與實施例7中的公式類似的公式，計算各孔中細胞的存活率。
圖4顯示所得結果。人抗TRAIL-R2單克隆抗體和陰性對照顯示幾乎相同的結果，表明該人抗TRAIL-R2單克隆抗體對HUVEC細胞沒有顯示出細胞毒性。
實施例9對正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性用從實施例4-6中獲得的產生人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體的雜交瘤培養上清液測量對正常人肝細胞(在下文稱為“HH細胞”)(Tissue Transformation Technologies)的細胞死亡誘導活性。首先，將冷凍HH細胞于37℃解凍，然后用CM5300培養基(CEDRA)將其制備濃度為7.5×105/ml的細胞。向用膠原蛋白I型封閉的96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。在5.0％CO2氣體下于37℃培養4.5小時后，更換培養基。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，再次更換培養基。隨后，加入50μl/孔雜交瘤的培養上清液，然后向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)，終濃度為5μg/ml。用人IgG(Biogenesis)作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，在顯微鏡下觀察HH細胞的形態變化。人抗TRAIL-R2單克隆抗體的結果和陰性對照的結果幾乎相同，表明該人抗TRAIL-R2單克隆抗體對HH細胞也沒有顯示出細胞毒性。
實施例10各種抗體的制備按照下述方法，純化來自從實施例4、6和7中獲得的雜交瘤的培養上清液的人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體。采用rmp A蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)、0.8×40cm柱(Bio-Rad)、PBS作為吸附緩沖液而0.02M甘氨酸緩沖液(pH 3)作為洗脫緩沖液，將含有人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體的培養上清液進行親和純化。通過加入1M Tris(pH 9.0)，將洗脫部分的pH調至7.2左右。采用透析膜(10000cut，Spectrum Laboratories)，用PBS置換如此制備的抗體溶液，然后，用孔徑為0.22μm的MILLEX-GV濾膜(Millipore)過濾除菌，從而獲得純化人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體。測量280nm的吸光度，然后用1.4 OD＝1mg/ml計算該純化抗體的濃度。
按照下述方法，制備含有人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體的培養上清液。首先，讓人抗TRAIL-R1和R2單克隆抗體生產雜交瘤在含有10ng/ml重組人IL-6(R&D Systems)和10％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培養基(Kyokutoseiyaku)中適應。將經適應的雜交瘤進行深低溫保藏。其次，為了抗體純化，讓雜交瘤的一部分在含有牛胰島素(5μg/ml，Gibco BRL)、人運鐵蛋白(5μg/ml，Gibco BRL)、乙醇胺(0.01mM，Sigma)、亞硒酸鈉(2.5×10-5mM，Sigma)、10ng/ml重組人IL-6(R&D Systems)和1％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培養基(Kyokutoseiyaku)中適應。將雜交瘤細胞在培養瓶中培養，并且當雜交瘤的活細胞比率達到90％時，收集培養上清液。將所收集的上清液上樣至10μm濾器和0.2μm濾器(German Science)，從而去除多種廢物例如雜交瘤。
實施例11純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對癌細胞和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性用實施例10中獲得的純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體測量對結腸癌細胞Colo205(ATCC No.CCL-222)的細胞死亡誘導活性。制備2.5×104/ml的濃度、在含有10％FCS的RPMI培養基中培養的Colo205細胞，然后向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，加入所述純化抗體(10μl/孔)，終濃度為10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml。此外，向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)，終濃度為10μg/ml。用所得雜交瘤的一部分制備不補充山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的孔。用終濃度為0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的人重組TRAIL蛋白(R&D SYSTEMS)作為陽性對照。用人抗HSA抗體作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養48小時，以使所述抗體與細胞表面的受體反應。每個反應系統的體積為120μl。另外，對于0304和KMTR1，進行其中不加入作為交聯劑的山羊抗人IgG(γ)特異性單克隆抗體的實驗(在表5中描述為“單獨的”)。在這種情況下，每個反應系統的體積為110μl。培養后，依照用法說明書中介紹的方法，制備MTS試劑(Cell Titer 96 AQueousNon-Radioactive CellProliferation AssayPromega)。向各孔中加入20μl該試劑。在5.0％CO2氣體下于37℃培養2小時后，用微量培養板讀出儀(1420 ARVO多標記計數器WALLAC)，測量490nm波長(參比波長為630nm)的吸光度。采用線粒體的還原能力作為指標，計算細胞的存活率。運用與實施例7中的公式類似的公式，計算各孔中細胞的存活率。
接著，用從實施例10中獲得的人抗TRAIL-R2單克隆抗體測量對HH細胞(Tissue Transformation Technologies，and In VitroTechnologies)的細胞死亡誘導活性。首先，將冷凍HH細胞于37℃解凍，然后用CM5300培養基(CEDRA)將其制備濃度為7.5×105/ml的細胞。向用膠原蛋白I型封閉的96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。在5.0％CO2氣體下于37℃培養4.5小時后，更換培養基。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，將培養基更換為無血清培養基[含有胰島素(20μg/ml，Sigma)、胰高血糖素(7ng/ml，Sigma)、氫化可的松(7.5μg/ml，Sigma)和人EGF(20ng/ml，Beckton Dickinson)的DMEM培養基(Sigma)]或CM5300培養基。隨后，向各孔中加入所述純化抗體(10μl/孔)，終濃度為0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml，然后加入10μl山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)，終濃度為10μg/ml和100μg/ml。用所得雜交瘤的一部分制備不補充山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的孔。用人抗HSA抗體作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，讓所述抗體和細胞表面的受體反應。每個反應系統的體積為120μl。另外，對于0304和KMTR1，進行其中不加入作為交聯劑的山羊抗人IgG(γ)特異性單克隆抗體的實驗(在表5中描述為“單獨的”)。在這種情況下，每個反應系統的體積為110μl。培養后，HH細胞用PBS洗滌2次，向各孔中加入100μl PBS，然后加入Triton X-100(10μl/孔)，終濃度為0.8％。讓細胞于37℃靜置1小時，致使活的HH細胞裂解。將裂解液轉移至(50μl/孔)一個不同的96孔平底板中，然后進行LDH測定。依照用法說明書中介紹的方法，制備供LDH測定用的試劑(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromega)，然后向各孔中加入50μl該試劑。將板避光，然后讓其在室溫下靜置30分鐘。加入50μl/孔反應終止溶液(1M乙酸Promega)。用微量培養板讀出儀(1420 ARVO多標記計數器WALLAC)，測量492nm波長的吸光度。采用LDH的酶促活性作為指標，計算細胞的存活率。通過與實施例7中的公式類似的公式，計算各孔中細胞的存活率。
此外，用計算出的存活率，按照下述方法計算LD50值。在圖中，將縱軸為各種抗體濃度下的計算存活率對橫軸為加入細胞中的抗體濃度作圖。將相鄰的作圖點相互連接，以繪出曲線。通過回歸計算找出表示該曲線的公式。運用該公式，計算出對應于50％的存活率的抗體濃度，從而得出LD50值。
圖5a-5l和表5顯示所得結果。在圖5中，實線加實心圓(-●-)表示正常人肝細胞，而虛線加實心菱形符號(--◆--)表示Colo205細胞。此外，圖5k和圖5l顯示其中不加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的實驗結果。表5顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對結腸癌細胞Colo205和正常人肝細胞的細胞死亡誘導活性(LD50值)。將2.5×103結腸癌細胞Colo205以100μl培養基/孔接種到96孔平底板中，第二天，向該細胞中加入純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體。當細胞和抗體之間的反應時間達到48小時時，獲得LD50值。將7.5×104正常細胞(人肝細胞)以100μl培養基/孔接種到96孔平底板中，第二天，向正常細胞(人肝細胞)中加入純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體。當細胞和抗體之間的反應時間達到24小時時，獲得LD50值。與陰性對照相比，顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體明顯具有誘導Colo205細胞的細胞死亡的活性。此外，與人重組TRAIL和純化抗體H-48-2相比，顯示純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13、L-30-10和KMTR1的人肝細胞毒性低。
此外，實施例4的結果表明，KMTR1既與TRAIL-R1受體結合，也與TRAIL-R2受體結合。可以預見，該抗體可以通過或者TRAIL-R1受體或TRAIL-R2受體轉導細胞死亡誘導信號。
由于所述肝細胞顯示甚至當加入10μg/ml L-30-10時的存活率為50％或50％以上，因此L-30-10的LD50為10μg/ml或10μg/ml以上。當根據抗體濃度對存活率所作的曲線圖進行回歸計算時，LD50為24μg/ml。由于所述肝細胞顯示當加入0.1μg/ml F-4-8時的存活率為50％或50％以下，因此F-4-8的LD50為0.1μg/ml或0.1μg/ml以下。同樣，根據與L-30-10的方法相似的方法，進行回歸計算，LD50為0.002μg/ml。KMTR1和D1M的LD50值均證明為10μg/ml或10μg/ml以上。此外，在其中不加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的情況下(在下文稱為“在“單獨的”情況下”)，肝細胞的存活率從未低于50％，甚至當以100μg/ml的抗體體積加入KMTR1時也是如此。因此，證明在“單獨的”情況下，LD50為100μg/ml或100μg/ml以上。
接著，測量正常肝細胞的LD50值與Colo 205的LD50值之比(表示正常人肝細胞的LD50值比Colo 205細胞的LD50值高多少倍)(N/C比)。結果，就純化抗體E-11-3而論，N/C＝25.45(10倍或10倍以上)；就D1M而論，N/C＝67或67以上(10倍或10倍以上)；就單獨的0304而論，N/C＝50(10倍或10倍以上)；就L-30-10而論，N/C＝240(100倍或100倍以上)；以及就單獨的KMTR1而論，N/C＝1000倍或1000倍以上。因此，就功效和安全性而論，表明所有抗體都是極好的(表5)。
表5
通過相似的方法，檢查純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對U251細胞(得自神經膠質瘤，Riken Genebank No.RCB0461)和Jurkat細胞(得自T細胞淋巴瘤，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的細胞死亡誘導活性。在對U251細胞進行的一個實驗中，將1.0×104細胞以100μl培養基/孔接種到96孔平底板中，然后在5％CO2存在下于37℃進行培養。第二天，加入所述抗體。在上述環境下培養48小時后，測量細胞的存活率。在對Jurkat細胞進行的一個實驗中，將4.0×104細胞以100μl培養基/孔接種到96孔平底板中，然后加入所述抗體。在5％CO2存在下于37℃培養48小時后，測量細胞的存活率。各種抗體的LD50值(單位μg/ml)如下所示。
E-11-13對U251細胞的LD50為0.3，而對Jurkat細胞的LD50為0.1。
L-30-10對U251細胞的LD50為0.17，而對Jurkat細胞的LD50為0.13。
H-48-2對U251細胞的LD50為0.24，而對Jurkat細胞的LD50為0.07。
F-4-8對U251細胞的LD50為0.03，而對Jurkat細胞的LD50為0.004。
W-40-5對U251細胞的LD50為1.0，而對Jurkat細胞的LD50為0.48。
除對U251細胞之外，還用另一個系統進行測定，其中順鉑溶液(NIPPON KAYAKU)與所述抗體一起同時加入，終濃度為4μg/ml。
實施例12純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體對攜帶腫瘤的小鼠的影響按照下述方法，用攜帶腫瘤的小鼠模型檢查實施例10中獲得的人抗TRAIL-R2單克隆抗體的作用。
給4-6周齡Balb/c裸鼠(購自CLEA Japan)在其背部皮下移植5×106/小鼠結腸癌細胞Colo 205。移植后1周至10天，測量已粘連的腫瘤大小。將5只或7只平均腫瘤大小約100mm3或300mm3的攜帶腫瘤的小鼠分為一組。將所述純化抗體(溶于200μl PBS中)以1μg/小鼠、4μg/小鼠、20μg/小鼠、25μg/小鼠和100μg/小鼠給予攜帶腫瘤的小鼠腹腔內，然后測量腫瘤大小。用相同體積的人抗HSA抗體作為所述抗體的陰性對照。
圖6-10顯示上述實驗的結果。在其中給予每只小鼠1μg純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13、F-4-8、H-48-2、L-30-10和W-40-5的組中，在已給予H-48-2的組中觀察到消退效應。抗腫瘤效應以E-11-13、L-30-10、F-4-8和W-40-5的遞減次序越來越低(圖6)。在圖6中，如果每隔1天給予所述抗體3次，則當從初次給藥計算時，觀察到至少持續13天的生長抑制和消退效應(H-48-2克隆)。
在給予每只小鼠4μg、20μg和100μg E-11-13的組中，在所有小鼠中都證實有抗腫瘤效應。使用20μg/小鼠的劑量，觀察到最高的腫瘤消退效應(圖7)。在圖7中，如果每隔1天給予所述抗體4次，則當從初次給藥計算時，觀察到至少持續11天的生長抑制和消退效應。每隔1天給予每只小鼠20μg所述抗體4次(移植后第7天、第9天、第11天和第13天給予)的組中腫瘤體積隨時間的變化如下。
初次給藥后第2天(對應于圖7中的第9天)，平均腫瘤體積為109.5mm3；初次給藥后第4天(對應于圖7中的第11天)，平均腫瘤體積為85.1mm3；初次給藥后第6天(對應于圖7中的第13天)，平均腫瘤體積為64.3mm3；初次給藥后第8天(對應于圖7中的第15天)，平均腫瘤體積為61.8mm3；和初次給藥后第11天(對應于圖7中的第18天)，平均腫瘤體積為78.9mm3。
開始給藥后第4天的腫瘤體積約為85.1mm3，并且觀察到14％或14％以上的腫瘤縮小。這種縮小保持到給藥后第11天，表明本發明的抗體具有高抗腫瘤效應。
將E-11-3以20μg/小鼠給予7只為一組的其中腫瘤平均約為300mm3的攜帶腫瘤的小鼠。結果，觀察到顯著的腫瘤消退(圖8)。在圖8中，如果每隔1天給予所述抗體3次，則當從初次給藥計算時，觀察到至少持續18天的生長抑制和消退效應。每隔1天給予每只小鼠20μg所述抗體3次(移植后第9天、第11天和第13天給予)的組中腫瘤體積隨時間的變化如下。
初次給藥后第2天(對應于圖8中的第11天)，平均腫瘤體積為246.9mm3；初次給藥后第4天(對應于圖8中的第13天)，平均腫瘤體積為181.8mm3；
初次給藥后第5天(對應于圖8中的第14天)，平均腫瘤體積為146.2mm3；初次給藥后第6天(對應于圖8中的第15天)，平均腫瘤體積為110.8mm3；初次給藥后第7天(對應于圖8中的第16天)，平均腫瘤體積為82.7mm3；初次給藥后第9天(對應于圖8中的第18天)，平均腫瘤體積為57.5mm3；初次給藥后第11天(對應于圖8中的第20天)，平均腫瘤體積為81.3mm3；初次給藥后第13天(對應于圖8中的第22天)，平均腫瘤體積為108.1mm3；初次給藥后第15天(對應于圖8中的第24天)，平均腫瘤體積為127.8mm3；和初次給藥后第18天(對應于圖8中的第27天)，平均腫瘤體積為163.3mm3。
開始給藥后第4天的腫瘤體積約為181.8mm3，并且觀察到39％或39％以上的腫瘤縮小。這種縮小保持到給藥后甚至第18天，表明本發明的抗體具有高抗腫瘤效應。
0304抗體的活性評價如下。給6周齡Balb/c裸鼠(購自CLEAJapan)在其背部皮下移植5×106/小鼠結腸癌細胞Colo205。移植后8天，測量已粘連的腫瘤大小。將5只平均腫瘤大小約100mm3的攜帶腫瘤的小鼠分為一組。將所述純化抗體(溶于200μl PBS中)以20μg/小鼠給予攜帶腫瘤的小鼠腹腔內，然后測量腫瘤大小。已每隔1天給予0304(20μg/小鼠)3次(移植后第8天、第10天和第12天給予)的組中的所有小鼠都證實抗腫瘤效應(圖9)。腫瘤體積隨時間的變化如下。
初次給藥后第2天(對應于圖9中的第10天)，平均腫瘤體積為142.092mm3；初次給藥后第4天(對應于圖9中的第12天)，平均腫瘤體積為34.138mm3；初次給藥后第7天(對應于圖9中的第15天)，平均腫瘤體積為18.641mm3；和初次給藥后第11天(對應于圖9中的第19天)，平均腫瘤體積為9.339mm3。
開始給藥后第4天的腫瘤體積約為34.138mm3，并且觀察到65％或65％以上的腫瘤縮小。這種縮小保持到給藥后甚至第11天，表明本發明的抗體具有極高的抗腫瘤效應。
接著，給12周齡Balb/c裸鼠(購自CLEA Japan)在其背部皮下移植5×106/小鼠結腸癌細胞Colo205。移植后10天，測量已粘連的腫瘤大小。將5只平均腫瘤大小約100mm3的攜帶腫瘤的小鼠分為一組。將所述純化抗體(溶于200μl PBS中)以20μg/小鼠給予攜帶腫瘤的小鼠腹腔內，然后測量腫瘤大小。用相同體積的人抗HSA抗體作為所述抗體的陰性對照。已給予每只小鼠25μg 0304共3次(移植后第10天、第13天和第15天給予)的組中的所有小鼠都證實抗腫瘤效應(圖10)。腫瘤體積隨時間的變化如下。
初次給藥后第3天(對應于圖10中的第13天)，平均腫瘤體積為54.626mm3；初次給藥后第5天(對應于圖10中的第15天)，平均腫瘤體積為32.357mm3；初次給藥后第8天(對應于圖10中的第18天)，平均腫瘤體積為15.895mm3；初次給藥后第12天(對應于圖10中的第22天)，平均腫瘤體積為14.377mm3；初次給藥后第15天(對應于圖10中的第25天)，平均腫瘤體積為26.654mm3；
初次給藥后第19天(對應于圖10中的第29天)，平均腫瘤體積為27.565mm3；初次給藥后第25天(對應于圖10中的第35天)，平均腫瘤體積為30.802mm3；初次給藥后第29天(對應于圖10中的第39天)，平均腫瘤體積為27.092mm3；和初次給藥后第32天(對應于圖10中的第42天)，平均腫瘤體積為32.921mm3。
初次給藥后第12天(對應于圖10中的第22天)，證實在5只小鼠中3只小鼠中腫瘤消失。
初始給藥后第3天的平均腫瘤體積約為54.626mm3，并且觀察到45％或45％以上的腫瘤縮小。此外，給藥后第5天的平均腫瘤體積約為32.357mm3，并且觀察到65％或65％以上的腫瘤縮小。這種縮小保持到給藥后第32天。準確地說，65％或65％以上的縮小保持到至少27天。因此，表明本發明的抗體具有極高的抗腫瘤效應。
此外，在圖10中，則當從初次給藥計算時，觀察到持續至少32天的生長抑制和消退效應。
另外，在圖9和圖10中，“溶媒”代表PBS(200μl)，其用作給藥時溶解抗體的介質。
如實施例11中所述，單獨的0304或KMTR1抗體可以顯示細胞死亡誘導活性。此外，如本實施例中所述，證明0304在攜帶腫瘤的小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤效應。因此，預期可以單獨顯示細胞死亡誘導活性和抗腫瘤活性的抗體能夠顯示抗腫瘤活性，并且給予針對由表達TRAIL-R1和TRAIL-R2的細胞引起的疾病的預防藥或治療藥、特別是給予針對惡性腫瘤的治療藥時并不依賴于患者的生理條件(例如免疫細胞的類型或數目)。
實施例13純化人抗TRAIL-R1和TRAIL-R2單克隆抗體對TRAIL-R1和TRAIL-R2的結合親和性按照下述方法，采用BIACORE 2000(Biacore)，對實施例10中獲得的純化人抗TRAIL-R單克隆抗體對TRAIL-R的結合親和性進行研究。
1)TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc的固定化將TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc用10mM乙酸(pH 4.0)稀釋至終濃度為10μg/ml，然后通過胺偶聯方法將其固定在傳感器芯片CM5上。固定化條件如下。按照用法說明書中描述的方法，進行NHS活化和乙醇胺阻斷。按照用法說明書中描述的人工注射法，進行TRAIL-R1-hFc的偶聯和TRAIL-R2-hFc的偶聯。
(固定化條件)流速5μl/分鐘NHS活化7分鐘偶聯人工注射乙醇胺阻斷7分鐘證明在上述條件下，將377.4RU TRAIL-R1-hFc或495.4RUTRAIL-R2-hFc固定在傳感器芯片上。
2)再生條件和再現性的證實將20μg/ml純化人抗TRAIL-R1單克隆抗體2-6加到固定有TRAIL-R1-hFc的傳感器芯片上達2分鐘。因而證實了所述抗體與TRAIL-R1-hFc的結合。隨后，加入50mM NaOH達15秒，證實結合抗體從TRAIL-R1-hFc完全解離(在下文完全解離被稱為“再生”)。接著，通過KINJECT方法(結合1分鐘，解離1分鐘)，將純化人抗TRAIL-R1單克隆抗體2-6以20μl/分鐘的流速加入到再生TRAIL-R1-hFc中，然后加入50mM NaOH達15秒，以再生TRAIL-R1-hFc。將該循環重復9次。甚至在上述循環的9次重復后，發現固定在傳感器芯片上的TRAIL-R1-hFc量或其上結合的抗體量沒有變化。因而表明，TRAIL-R1-hFc再生，沒有因加入50mM NaOH達15秒而失活。用在其上固定有TRAIL-R2-hFc的傳感器芯片和20μg/ml純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13，進行相似的檢查。結果，證明TRAIL-R2-hFc可以在相同的再生條件下再生。
3)相互作用的檢查純化人抗TRAIL-R1單克隆抗體1-13、2-6和2-12中的每種用HBS-EP(Biacore)連續稀釋至2.1nM、4.2nM、8.4nM、16.8nM、33.5nM、67.0nM和134.0nM。通過KINJECT方法(結合2分鐘，解離6分鐘)，以20μl/分鐘的流速順序加入各抗體的稀釋系列，從而獲得sensorgram。同樣，純化人抗TRAIL-R2單克隆抗體E-11-13、L-30-10、H-48-2、F-4-8、W-40-6和X-14-4中的每種用HBS-EP(Biacore)連續稀釋至0.52nM、1.05nM、2.1nM、2.09nM、4.19nM和8.38nM。通過KINJECT方法(結合2分鐘，解離2分鐘)，以20μl/分鐘的流速順序加入各抗體的稀釋系列，從而獲得sensorgram。運用每種sensorgram和BIAevaluation軟件ver3.2(Biacore)，對各抗體進行動力學分析。作為擬合模型，用Bivalent模型進行全局擬合，致使找出結合速率常數和解離速率常數。另外，根據這兩個常數，計算解離常數(Kd值)。另外，在減去對照細胞和緩沖液校正值后，用所述sensorgram進行擬合。表6和表7顯示所得結果。在該表中，“kass”表示結合速率常數，“kdiss”表示解離速率常數，而“KD”表示解離常數。
表6
表7
實施例14單克隆抗體編碼基因的制備和重組抗體表達載體的構建(1)E-11-13、L-30-10和H-48-2抗體基因的cDNA克隆和表達載體的構建雜交瘤E-11-13、L-30-10和H-48-2在含有10ng/ml重組人IL-6(R&D Systems)和10％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培養基(Kyokutoseiyaku)中培養。通過離心收集細胞后，加入TRIZOL(GibcoBRL)，然后依照用法說明書提取總RNA。用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)，按照所附的用法說明書，對抗體cDNA的可變區進行克隆。用5μg總RNA作為模板，制備第一鏈cDNA。
1)第一鏈cDNA的合成總RNA 5μg/3μl
5′CDS 1μlSMART oligo 1μl反應后，將具有上述組成的溶液于70℃保溫2分鐘后，加入具有下列組成的溶液5x緩沖液2μlDTT 1μlDNTP混合物1μl和Superscript II 1μl接著于42℃保溫1.5小時。
此外，在加入100μl Tricine緩沖液后，于72℃保溫7分鐘，從而獲得第一鏈cDNA。
2)通過PCR擴增重鏈基因和輕鏈基因以及重組抗體表達載體的構建對于cDNA擴增，使用Z-Taq(Takara)。
cDNA 2μl10x Z-Taq緩沖液5μldNTP混合物4μlZ-Taq 1μl引物1引物2用雙蒸水制備具有以上組成的反應溶液，終體積為50μl，然后進行PCR。
為了擴增重鏈，使用UMP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech)和hh-6引物(5′-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTCCTT-3′)(SEQ ID NO7)，將98℃1秒和68℃30秒的循環重復30次。此外，用1μl反應溶液作為模板，使用NUMP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech)和hh-3引物(5′-GTG CAC GCC GCT GGT CAGGGC GCC TG-3′)(SEQ ID NO8)，將98℃1秒和68℃30秒的循環重復20次。隨后，用PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR擴增產物，然后用hh-4(5′-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3′)(SEQ IDNO9)作為引物，測定核苷酸序列。根據序列信息，發現E-11-13、L-30-10和H-48-2的3個克隆的N端區序列相同。因此，使用共同引物進行亞克隆并測定核苷酸序列。根據序列信息，合成tnH48KBgl(5′-ATA TAG ATC TCT CAG TTA GGA CCC AGA GGG AAC C-3′)(SEQ ID NO10)。使用該引物，也從相反方向測定該序列。用特異性引物tnCHNhe(5′-GAT GGG CCC TTG GTG CTA GCT GAG GAGACG G-3′)(SEQ ID NO11)，進行PCR(98℃1秒、60℃30秒和72℃30秒)。經擴增的重鏈cDNA片段用Sal I和Nhe I消化，然后將其導入已經用相同的酶切割的N5KG1-Val Lark載體(N5KG1的修飾載體，得自IDEC Pharmaceuticals)(美國專利6001358)中。用該載體作為模板，進行測序，以便證實所插入的序列與通過直接測序測定的序列相同。
用UMP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech)和hh-2引物(5′-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3′)(SEQ ID NO12)，通過將98℃1秒和68℃30秒的循環重復30次，擴增輕鏈。此外，用1μl反應溶液為模板、NUMP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech)和hk-6引物(5′-T GGC GGG AAG ATG AAG ACAGAT GGT G-3′)(SEQ ID NO13)，將98℃1秒和68℃30秒的循環重復20次。隨后，用PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR擴增產物，然后用hk-6(5′-tggc ggg aag atg aag aca gat ggt g-3′)引物測定核苷酸序列。根據序列信息，發現3個克隆的N端區序列完全相同。因此，使用共同引物進行亞克隆。根據序列信息，合成tnH48Hsal(5′-ATATGT CGA CTA CGG GGG GGCTTT CTG AGA GTC-3′)(SEQ ID NO14)。使用該引物，也從相反方向進行測序。用特異性引物和tnCkBsi(5′-AAG ACA GAT GGT GCA GCC ACC GTA CGT TTG AT-3′)(SEQID NO15)，進行PCR(98℃1秒、60℃30秒和72℃30秒)。經擴增的輕鏈cDNA片段用Bgl II和BsiW I消化，然后將其導入已經用相同的酶切割的N5KG1-Val Lark載體中。用該載體作為模板，進行測序，以便證實所插入的序列與通過直接測序測定的序列相同。
編碼E-11-13重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA以及重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別如以下所示。
<E-11-13重鏈可變區>(SEQ ID NO16)GTCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCATCAGTAAAAGTTCCTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTTCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGACAGTGGCTGAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC<E-11-13重鏈可變區>(SEQ ID NO17)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIISKSSYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTFYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLTVAEFDYWGQGTLVTVSSAS
<E-11-13輕鏈可變區>(SEQ ID NO18)TCACAGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG<E-11-13輕鏈可變區>(SEQ ID NO19)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGPGTKVDIKRT重鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO16的5′末端起第30號腺嘌呤(A)。抗體可變區和恒定區的邊界位于從5′末端起第461號腺嘌呤(A)和第462號鳥嘌呤(G)之間。在氨基酸序列中，重鏈可變區的范圍是從SEQ ID NO17的N末端至第144號絲氨酸(S)殘基，而恒定區的范圍是第145號丙氨酸(A)和以后的殘基。對純化重鏈蛋白N末端的分析揭示出，重鏈信號序列的范圍是從SEQID NO17的N末端至第26號絲氨酸(S)殘基，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO17的第27號谷氨酰胺(Q)。
輕鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO18的5′末端起第35號A，而可變區的范圍是從5′末端至第415號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可變區的范圍是從SEQ ID NO19的N末端至第127號賴氨酸(K)。對純化輕鏈蛋白N末端的分析揭示出，輕鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO19的N末端至第20號甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO19的第21號谷氨酸(E)。
編碼L-30-10重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA以及重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別示于以下。
<L-30-10重鏈可變區>(SEQ ID NO20)GTCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGTTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGGAGTAACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAATGTCTATTATAGAGGGAGCACCTACTACAATTCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGTCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTCAGTGGCTGAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC<L-30-10重鏈可變區>(SEQ ID NO21)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSRSNYWGWIRQPPGKGLEWIGNVYYRGSTYYNSSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTVADTAVYYCARLSVAEFDYWGQGILVTVSSAS<L-30-10輕鏈可變區>(SEQ ID NO22)AGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAG
CTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCAGCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCGACTGGCCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG<L-30-10輕鏈可變區>(SEQ ID NO23)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGSPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPLTFGPGTKVDIKRT重鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO20的5′末端起第30號腺嘌呤(A)。抗體可變區和恒定區的邊界位于從5′末端起第461號腺嘌呤(A)和第462號鳥嘌呤(G)之間。在氨基酸序列中，重鏈可變區的范圍是從SEQ ID NO21的N末端至第144號絲氨酸(S)殘基，而恒定區的范圍是第145號丙氨酸(A)和以后的殘基。通過基因序列預測軟件(Signal P ver.2)預測，重鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO21的N末端至第26號絲氨酸(S)。對純化重鏈蛋白N末端的分析揭示出，重鏈信號序列的范圍是從SEQ DI NO21的N末端至第26號絲氨酸(S)，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO21的第27號谷氨酰胺(Q)。
輕鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO22的5′末端起第31號A，而可變區的范圍是從5′末端至第411號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可變區的范圍是從SEQ ID NO23的N末端至第127號賴氨酸(K)。對純化輕鏈蛋白N末端的分析揭示出，輕鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO23的N末端至第20號甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO23的第21號谷氨酸(E)。
編碼H-48-2重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA以及重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別示于以下。
<H-48-2重鏈可變區>(SEQ ID NO24)TCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCCATTATAGTGGGAGTACTTTCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATTTCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGACTGTGTATTACTGTGCGAGACAGGGGTCTACTGTGGTTCGGGGAGTTTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC<H-48-2重鏈可變區>(SEQ ID NO25)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGSIHYSGSTFYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTTVYYCARQGSTVVRGVYYYGMDVWGQGTTVTVSSAS
<H-48-2輕鏈可變區>(SEQ ID NO26)AGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG<H-48-2輕鏈可變區>(SEQ ID NO27)METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLYTFGQGTKLEIKRT重鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO24的5′末端起第29號腺嘌呤(A)。抗體可變區和恒定區的邊界位于從5′末端起第484號腺嘌呤(A)和第485號鳥嘌呤(G)之間。在氨基酸序列中，重鏈可變區的范圍是從SEQ ID NO25的N末端至第152號絲氨酸(S)殘基，而恒定區的范圍是第153號丙氨酸(A)和以后的殘基。通過基因序列預測軟件(Signal P ver.2)預測，重鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO25的N末端至第26號絲氨酸(S)。對純化重鏈蛋白N末端的分析揭示出，重鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO25的N末端至第26號絲氨酸(S)，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO25的第27號谷氨酰胺(Q)。
輕鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO26的5′末端起第31號A，而可變區的范圍是從5′末端至第417號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可變區的范圍是從SEQ ID NO27的N末端至第129號賴氨酸(K)。對純化輕鏈蛋白N末端的分析揭示出，輕鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO27的N末端至第20號甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端為SEQ ID NO27的第21號谷氨酸(E)。(2)0304抗體基因的cDNA克隆和表達載體的構建通過離心收集雜交瘤0304細胞，然后依照使用ISOGEN RNA提取試劑(NIPPON GENE)的方案，純化約900μg RNA。接著，用OligotexTM-dT30<Super>(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，從300μgRNA獲得13μg polyA+RNA。用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech company)，按照所附的說明，用所得的polyA+RNA作為材料，進行克隆實驗，從而獲得抗體基因可變區的cDNA。具體地說，用1.0μg純化polyA+RNA作為材料，通過逆轉錄酶合成第一鏈cDNA。用所得的cDNA作為模板，并且使用以下引物組人抗體重鏈(在下文所述重鏈也稱為“H-鏈”)恒定區和輕鏈(在下文所述輕鏈也稱為“L-鏈”)恒定區的DNA的各種特異性PCR引物(對于H-鏈為IgGlp，對于L-鏈為hk-2)、以及SMART RACE cDNA擴增試劑盒中所附的UMP引物(與所制備的合成cDNA 5′端的共同序列互補的寡核苷酸)，通過PCR擴增H-鏈前導序列和可變區(在下文也稱為“HV”)和L-鏈前導序列和可變區(在下文也稱為“LV”)。在PCR中，使用TaKaRa LA TaqTM(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，該酶為LA PCR的Taq DNA聚合酶。將模板DNA加入到含有1xLA PCR緩沖液II(含有Mg2+)和dNTP混合物各400μM(終濃度)、2種類型的引物各0.2μM和2.5單位TaKaRa LA TaqTM/50μl的溶液中。通過touchdown PCR(94℃5秒和72℃3分鐘(5個循環)→94℃5秒，70℃10秒和72℃3分鐘(5個循環)→94℃5秒，68℃10秒和72℃3分鐘(20個循環))，進行反應。通過乙醇沉淀、瓊脂糖凝膠電泳收集PCR擴增片段，然后用QIAquick Gel Extraction Kit(凝膠提取試劑盒)(QIAGEN)進行純化，該試劑盒是一種使用膜的DNA純化試劑盒。用ABI PRISM3700 DNA分析儀(Applied Biosystems)，測定純化HV和LV片段的DNA核苷酸序列。此外，用TA克隆法，將HV和LV擴增片段分別亞克隆到pGEM-T Easy載體系統(Promega)中。分析如此獲得的克隆的質粒DNA中插入DNA的核苷酸序列。將該結果與對PCR產物所進行的直接序列分析的結果進行比較。用于測定DNA核苷酸序列的引物序列(H-鏈hh-4；L-鏈hk-5和hk-6；對于pGEM-TEasy載體SP6和T7)示于表8中。對每種HV和LV PCR片段所進行的直接序列分析結果和(亞克隆的)多克隆的DNA核苷酸序列分析結果完全相同。
用0304抗體L-鏈的DNA作為模板，并且用已經設計將限制性酶切位點添加到連接末端的引物，通過PCR擴增0304 L-鏈前導序列和可變區。本文所用的引物組序列示于表8(C23LBCL和C23LBsi)。通過乙醇沉淀收集所得的PCR片段，將其用限制性酶Bgl II消化，然后用BsiW I切割。將消化產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以便收集約400bp片段。用QIAquick Gel Extraction Kit(凝膠提取試劑盒)(該試劑盒是一種使用膜的DNA純化試劑盒)(QIAGEN)進行純化。同時，將載體N5KG4-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals，N5KG1的修飾載體(美國專利6001358))同樣用限制性酶Bgl II和BsiW I順序消化，然后進行去磷酸化處理(用堿性磷酸酶(E.coli C75)(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)處理)。然后通過瓊脂糖電泳和DNA純化試劑盒收集約9kb以下的DNA。這兩種片段用T4 DNA連接酶連接，然后將其導入大腸桿菌DH5α中，以獲得轉化體。選擇通過將0304抗體L-鏈前導序列加上可變區插入到N5KG4-Val Lark中制備的質粒DNA N5KG4-0304L。測定插入片段周邊的DNA核苷酸序列，從而證實在所述DNA核苷酸序列中沒有突變等。為了將H-鏈可變區等插入如此獲得的N5KG4-0304L中，該質粒DNA順序用限制性酶Nhe I和Sal I切割，進行去磷酸化處理，然后純化約9.3kb載體DNA。同時，用抗體H-鏈的質粒DNA作為模板，通過PCR擴增0304抗體H-鏈基因前導序列和可變區。擴增所用的引物組(T0304Sal和T0304Nhe)示于表8。
將如此獲得的PCR片段用限制性酶Nhe I和Sal I切割，進行瓊脂糖凝膠電泳，從而純化約450bp片段。將這兩種類型的DNA連接，然后將其導入大腸桿菌中，以獲得轉化體，然后對具有其中插入了靶H-鏈前導序列和可變區的克隆進行選擇。測定插入部分的DNA核苷酸序列，從而實證在通過PCR擴增的插入序列和用作模板的基因序列之間沒有差異。
編碼0304重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA以及重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列分別示于以下。
<0304重鏈可變區>(SEQ ID NO28)CTCAACAACC ACATCTGTCC TCTAGAGAAA ACCCTGTGAG CACAGCTCCT CACCATGGACTGGACCTGGA GGATCCTCTT CTTGGTGGCA GCAGCTACAA GTGCCCACTC CCAGGTGCAGCTGGTGCAGT CTGGGGCTGA GATGAAGAAG CCTGGGGCCT CAGTCAAGGT CTCCTGCAAGACTTCTGGAT ACACCTTCAC CAATTATAAG ATCAACTGGG TGCGACAGGC CCCTGGACAAGGACTTGAGT GGATGGGATG GATGAACCCT GACACTGATA GCACAGGCTA TCCACAGAAGTTCCAGGGCA GAGTCACCAT GACCAGGAAC ACCTCCATAA GCACAGCCTA CATGGAGCTGAGCAGCCTGA GATCTGAGGA CACGGCCGTG TATTACTGTG CGAGATCCTA TGGTTCGGGGAGTTATTATA GAGACTATTA CTACGGTATG GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACCGTCTCCTCA<0304重鏈可變區>(SEQ ID NO29)MDWTWRILFL VAAATSAHSQ VQLVQSGAEM KKPGASVKVS CKTSGYTFTN YKINWVRQAPGQGLEWMGWM NPDTDSTGYP QKFQGRVTMT RNTSISTAYM ELSSLRSEDT AVYYCARSYGSGSYYRDYYY GMDVWGQGTT VTVSS<0304輕鏈可變區>(SEQ ID NO30)GAGGAACTGC TCAGTTAGGA CCCAGAGGGA ACCATGGAAG CCCCAGCTCA GCTTCTCTTCCTCCTGCTAC TCTGGCTCCC AGATACCACC GGAGAAATTG TGTTGACACA GTCTCCAGCC
ACCCTGTCTT TGTCTCCAGG GGAAAGAGCC ACCCTCTCCT GCAGGGCCAG TCAGAGTGTTAGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAACAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTATGATGCATCCA ACAGGGCCAC TGGCATCCCA GCCAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACAGACTTCACTC TCACCATCAG CAGCCTAGAG CCTGAAGATT TTGCAGTTTA TTACTGTCAGCAGCGTAGCA ACTGGCCGCT CACTTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGA<0304輕鏈可變區>(SEQ ID NO31)MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGGGTKVEIKR重鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO28的5′末端起第55號腺嘌呤(A)。抗體可變區的范圍是從5′末端至第489號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，重鏈可變區的范圍是從SEQ ID NO29的N末端至第145號絲氨酸(S)殘基。通過基因序列預測軟件(Signal Pver.2)預測，重鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO29的N末端至第19號絲氨酸(S)。成熟蛋白的N末端被認為是SEQ ID NO29的第20號谷氨酰胺(Q)。
輕鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO30的5′末端起第34號A，而可變區的范圍是從5′末端至第414號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可變區的范圍是從SEQ ID NO31的N末端至第127號賴氨酸(K)。通過基因序列預測軟件(Signal P ver.2)預測，輕鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO31的N末端至第20號甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被認為是SEQ ID NO31的第21號谷氨酸(E)。
表8合成DNA的核苷酸序列
(3)KMTR1抗體基因的cDNA克隆通過離心收集雜交瘤KMTR1細胞，然后用ISOGEN RNA提取試劑(NIPPON GENE)，按照所附方案，純化約900μg RNA。接著，用OligotexTM-dT30<Super>(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，從300μgRNA中獲得13μg polyA+RNA。用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech company)，按照所附說明，用所得的polyA+RNA作為材料，進行克隆實驗，從而獲得所述抗體基因可變區的cDNA。具體地說，用1.0μg純化polyA+RNA作為材料，通過逆轉錄酶合成第一鏈cDNA。用所得的cDNA作為模板，并且使用以下引物組人抗體重鏈(在下文所述重鏈也稱為“H-鏈”)恒定區和輕鏈(在下文所述輕鏈也稱為“L-鏈”)恒定區的DNA的各種特異性PCR引物(對于H-鏈為IgGlp，對于L-鏈為hk-2)以及SMART RACE cDNA擴增試劑盒中所附的UMP引物(與所制備的合成cDNA 5′端的共同序列互補的寡核苷酸)，通過PCR擴增H-鏈前導序列和可變區(在下文也稱為“HV”)和L-鏈前導序列和可變區(在下文也稱為“LV”)。在PCR中，使用TaKaRa LA TaqTM(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，該酶為供LA PCR用的Taq DNA聚合酶。將模板DNA加入到含有1xLA PCR緩沖液II(含有Mg2+)和dNTP混合物各400μM(終濃度)、2種類型的引物各0.2μM和2.5單位TaKaRa LA Taq/50μl的溶液中。通過touchdown PCR(94℃5秒和72℃3分鐘(5個循環)→94℃5秒，70℃10秒和72℃3分鐘(5個循環)→94℃5秒，68℃10秒和72℃3分鐘(20個循環))，進行反應。通過乙醇沉淀、瓊脂糖凝膠電泳收集PCR擴增片段，然后用QIAquick Gel Extraction Kit(凝膠提取試劑盒)(QIAGEN)進行純化，該試劑盒是一種使用膜的DNA純化試劑盒。用ABI PRISM3700DNA分析儀(Applied Biosystems)，測定純化HV和LV片段的DNA核苷酸序列。此外，用TA克隆法，將HV和LV擴增片段分別亞克隆到pGEM-T Easy載體系統(Promega)中。分析如此獲得的克隆的質粒DNA中插入DNA的核苷酸序列。將該結果與對PCR產物所進行的直接序列分析的結果進行比較。用于測定DNA核苷酸序列的引物序列(H-鏈hh-4；L-鏈hk-5和hk-6；對于pGEM-T Easy載體SP6和T7)示于以上表8中。對每種HV和LV PCR片段所進行的直接序列分析的結果和(亞克隆的)多克隆的DNA核苷酸序列分析結果完全相同。顯示了如此測定的KMTR1細胞上表達的人抗體基因H-鏈和L-鏈的DNA核苷酸序列和氨基酸序列。
<KMTR1重鏈可變區>(SEQ ID NO32)GAGCTCTGAG AGAGGAGCCC AGCCCTGGGA TTTTCAGGTG TTTTCATTTG GTGATCAGGACTGAACAGAG AGAACTCACC ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GCTTTTTCTT GTGGCTATTTTAAAAGGTGT CCAGTGTGAG GTACAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTGGGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGAGCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT CTCAGCTATT AGTGGTAGTGGTGGTAGCAG ATACTACGCA GACTCCGTGA AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATTCCAAGAACAC GCTGTATCTG CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATTACTGTGCGAA AGAGAGCAGT GGCTGGTTCG GGGCCTTTGA CTACTGGGGC CAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCCTCA<KMTR1重鏈可變區>(SEQ ID NO33)MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGRSLRLS CAASGFTFSS YAMSWVRQAPGKGLEWVSAI SGSGGSRYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKESSGWFGAFDYWG QGTLVTVSS<KMTR1輕鏈可變區>(SEQ ID NO34)GATCTTAAAA GAGGTTCTTT CTCTGGGATG TGGCATGAGC AAAACTGACA AGTCAAGGCAGGAAGATGTC GCCATCACAA CTCATTGGGT TTCTGCTGCT CTGGGTTCCA GCCTCCAGGGGTGAAATTGT GCTGACTCAG TCTCCAGACT TTCAGTCTGT GACTCCAAAG GAGAAAGTCACCATCACCTG CCGGGCCAGT CAGAGCATTG GTAGTAGCTT ACACTGGTAC CAGCAGAAACCAGATCAGTC TCCAAAGCTC CTCATCAAGT ATGCTTCCCA GTCCTTCTCA GGGGTCCCCTCGAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAG ATTTCACCCT CACCATCAAT AGCCTGGAAGCTGAAGATGC TGCAGCGTAT TACTGTCATC AGAGTAGTAG TTTACCGATC ACCTTCGGCCAAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGA<KMTR1輕鏈可變區>(SEQ ID NO35)MSPSQLIGFL LLWVPASRGE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQSIGS SLHWYQQKPDQSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAAAYYCHQS SSLPITFGQGTRLEIKR
重鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO32的5′末端起第81號腺嘌呤(A)。抗體可變區的范圍是從5′末端至第497號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，重鏈可變區的范圍是從SEQ ID NO33的N末端至第139號絲氨酸(S)殘基。通過基因序列預測軟件(Signal Pver.2)預測，重鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO33的N末端至第19號半胱氨酸(C)。成熟蛋白的N末端被認為是SEQ ID NO33的第20號谷氨酸(E)。
輕鏈DNA的翻譯起始位點是ATG密碼子，始于從SEQ ID NO34的5′末端起第66號A，而可變區的范圍是從5′末端至第443號腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可變區的范圍是從SEQ ID NO35的N末端至第126號賴氨酸(K)。通過基因序列預測軟件(Signal P ver.2)預測，輕鏈信號序列的范圍是從SEQ ID NO35的N末端至第19號甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被認為是SEQ ID NO35的第20號谷氨酸(E)。
實施例15重組抗體的制備將實施例14中構建的重組抗體表達載體導入宿主細胞中，從而制備重組抗體表達細胞。使用例如CHO細胞的dhfr缺陷型細胞株(ATCC CRL-9096)作為宿主表達細胞。將該載體通過電穿孔導入宿主細胞中。用一種限制性酶將約2μg抗體表達載體線性化。在350V和500μF的條件下，用Bio-Rad電穿孔儀，將該基因導入4×106CHO細胞中，然后將該細胞接種到96孔培養板中。加入對應于所述表達載體的選擇標記的藥物，然后繼續進行培養。集落得到證實后，通過實施例4中描述的方法，對抗體表達系進行選擇。如實施例10中描述的方法，從所選細胞中純化所述抗體。
實施例16重組抗體對癌細胞的細胞死亡誘導活性用實施例15中獲得的重組人抗TRAIL-R2單克隆抗體，測量對結腸癌細胞Colo205(ATCC No.CCL-222)的細胞死亡誘導活性。制備濃度為1.0×105/ml、在含有10％FCS的RPMI培養基中培養的Colo205細胞，然后向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl懸浮液。在5.0％CO2氣體下于37℃培養24小時后，以終濃度為10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和10000ng/ml加入純化抗體E11(CHO-3)和H48(CHO-3)(10μl/孔)。此外，向各孔中以終濃度為10μg/ml和100μg/ml加入10μl山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體(Sigma)。對于所得的雜交瘤，制備沒有補充山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的各孔。用終濃度為1ng/ml和10ng/ml的人重組TRAIL蛋白(R&D SYSTEMS)作為陽性對照。用人抗HSA抗體作為陰性對照。在5.0％CO2氣體下于37℃培養48小時后，按照用法說明書中描述的方法，制備MTS試劑(Cell Titer 96 AQueousNon-Radioactive CellProliferation AssayPromega)。向各孔中加入20μl所述試劑。在5.0％CO2氣體下于37℃培養2小時后，用微量培養板讀出儀(1420 ARVO多標記計數器VALLAC)，測定490nm波長(參比波長為630nm)的吸光度。采用線粒體的還原力作為指標，計算細胞的存活率。用與實施例7中描述的公式相似的公式，計算各孔中細胞的存活率。
圖11a和圖11b顯示所得結果。圖11a顯示其中不加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的實驗結果，而圖11b顯示其中加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體的實驗結果。
如圖11a所示，重組抗體E11(CHO-3)和H48(CHO-3)就單獨的抗體而論具有誘導Colo205細胞的細胞死亡活性。此外，如圖11b所示，當加入山羊抗人IgG(γ)特異性多克隆抗體時，顯示所述重組抗體的細胞死亡誘導活性等同于從雜交瘤培養上清液中純化的抗體的細胞死亡誘導活性。
本文中所引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用全部結合到本文中。
工業應用性按照本發明，提供一種具有極高安全性、可用作抵抗由表達TRAIL-R1和R2的細胞引起的疾病、尤其是惡性腫瘤并且可以避免對肝臟造成損害的預防藥或治療藥的分子。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1合成DNASEQ ID NO2合成DNASEQ ID NO3合成DNASEQ ID NO4合成DNASEQ ID NO5合成DNASEQ ID NO6合成DNASEQ ID NO7合成DNASEQ ID NO8合成DNASEQ ID NO9合成DNASEQ ID NO10合成DNASEQ ID NO11合成DNASEQ ID NO12合成DNASEQ ID NO13合成DNASEQ ID NO14合成DNASEQ ID NO15合成DNASEQ ID NO36合成DNASEQ ID NO37合成DNASEQ ID NO38合成DNASEQ ID NO39合成DNASEQ ID NO40合成DNASEQ ID NO41合成DNASEQ ID NO42合成DNA
SEQ ID NO43合成DNASEQ ID NO44合成DNASEQ ID NO45合成DNA
權利要求
1.一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段與TRAIL-R1和TRAIL-R2結合。
2.權利要求1的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有至少一種選自以下(a)-(c)的特性(a)具有誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞凋亡的活性；(b)對表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常細胞沒有影響；和(c)不誘導人肝細胞毒性。
3.一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有所有以下特性(a)-(c)(a)具有誘導表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌細胞凋亡的活性；(b)對表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常細胞沒有影響；和(c)不誘導人肝細胞毒性。
4.權利要求2或3的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段與TRAIL-R2結合，但不與TRAIL-R1結合。
5.權利要求2或3的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段既與TRAIL-R2結合又與TRAIL-R1結合。
6.權利要求1-5中任一項的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段是由小鼠-小鼠雜交瘤產生的單克隆抗體。
7.權利要求1-6中任一項的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段是人抗體。
8.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.01μg/ml或0.01μg/ml以上。
9.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。
10.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為2-10μg/ml。
11.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為10μg/ml或10μg/ml以上。
12.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為10-100μg/ml。
13.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為100μg/ml或100μg/ml以上。
14.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于癌細胞而言，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為100μg/ml或100μg/ml以下。
15.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于癌細胞而言，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為10μg/ml或10μg/ml以下。
16.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于癌細胞而言，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.7μg/ml或0.7μg/ml以下。
17.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于癌細胞而言，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.02-0.11μg/ml。
18.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于癌細胞而言，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。
19.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，對于人肝細胞而言，當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為2-100μg/ml；而對于癌細胞，當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時，所述抗體或其功能性片段的LD50值為0.02-0.11μg/ml。
20.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的2倍或2倍以上。
21.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的10倍或10倍以上。
22.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的50倍或50倍以上。
23.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的50-100倍。
24.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的100倍或100倍以上。
25.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的100-1000倍。
26.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的250-1000倍。
27.權利要求1-7中任一項的抗體或其功能性片段，其中人肝細胞當細胞數為7.5×104且反應時間為24小時時的LD50值是癌細胞當細胞數為2.5×103且反應時間為48小時時的LD50值的1000倍或1000倍以上。
28.權利要求8-27中任一項的抗體或其功能性片段，其中反應體積在110μl和120μl之間。
29.權利要求2、3和14-28中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述癌細胞是Colo205細胞。
30.權利要求2或3中的抗體或其功能性片段，其中所述癌細胞是Colo205細胞、U251細胞或Jurkat細胞。
31.權利要求1-30中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段可以抑制腫瘤生長或者使腫瘤消退。
32.權利要求31的抗體或其功能性片段，其中所述腫瘤是至少一種選自以下的腫瘤結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦腫瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生、男性胚細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構母細胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤、維耳姆斯氏瘤等。
33.權利要求31的抗體或其功能性片段，其中所述腫瘤來源于移植在裸鼠體內的Colo205細胞。
34.權利要求31-33中任一項的抗體或其功能性片段，其中腫瘤生長可以被抑制或者可以實現腫瘤消退的時間為至少9天。
35.權利要求31-34中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段的劑量為100μg/生物體或5mg/kg。
36.權利要求31-34中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段的劑量為20μg/生物體或1mg/kg。
37.權利要求31-34中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段的劑量為4μg/生物體或200μg/kg。
38.權利要求31-34中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段的劑量為1μg/生物體或50μg/kg。
39.權利要求1-38中任一項的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段是免疫球蛋白G抗體。
40.一種抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后4天誘導平均14％或14％以上的腫瘤縮小。
41.權利要求40的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段可以保持平均14％或14％以上的腫瘤縮小至少7天。
42.權利要求40的抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后4天誘導平均65％或65％以上的腫瘤縮小。
43.權利要求40的抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后7天誘導平均80％或80％以上的腫瘤縮小。
44.權利要求43的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段可以保持平均80％或80％以上的腫瘤縮小至少4天。
45.權利要求40的抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以25μg/小鼠的濃度給予12周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后3天誘導平均45％或45％以上的腫瘤縮小。
46.權利要求45的抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以25μg/小鼠的濃度給予12周齡帶有100mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后5天誘導平均65％或65％以上的腫瘤縮小。
47.權利要求46的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段可以保持平均65％或65％以上的腫瘤縮小至少27天。
48.權利要求40的抗體或其功能性片段，當將所述抗體或其功能性片段以20μg/小鼠的濃度給予4-6周齡帶有300mm3腫瘤的攜帶腫瘤的小鼠時，可以在初次給藥后4天誘導平均39％或39％以上的腫瘤縮小。
49.權利要求48的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段可以保持平均39％或39％以上的腫瘤縮小至少14天。
50.權利要求40的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段是0304抗體。
51.權利要求40的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段是E-11-13抗體。
52.一種與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段由以下雜交瘤產生E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304或KMTR1。
53.一種與TRAIL-R1和/或TRAIL-R2結合的抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段由以下雜交瘤產生；保藏號為FERMBP-7599的雜交瘤H-48-2、保藏號為FERM BP-7698或FERM BP-7770的雜交瘤E-11-13、保藏號為FERM BP-7699或FERM BP-7768的雜交瘤F-4-8、保藏號為FERM BP-7700或FERM BP-7769的雜交瘤L-30-10、保藏號為FERM BP-8037的雜交瘤0304或保藏號為FERM BP-8038的雜交瘤KMTR1。
54.一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有以下的氨基酸序列由雜交瘤E-11-13產生的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO17和19；由雜交瘤L-30-10產生的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO21和23；由雜交瘤H-48-2產生的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO25和27；由雜交瘤0304產生的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO29和31；或由雜交瘤KMTR1產生的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO33和35。
55.一種抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有以下的氨基酸序列由從雜交瘤E-11-13中分離的核酸序列、分別為SEQID NO16和18編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤L-30-10中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO20和22編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤H-48-2中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO24和26編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；由從雜交瘤0304中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO28和30編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列；或由從雜交瘤KMTR1中分離的核酸序列、分別為SEQ ID NO32和34編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區的成熟部分的氨基酸序列。
56.一種產生與TRAIL-R2結合的單克隆抗體的雜交瘤，所述雜交瘤選自E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304和KMTR1。
57.一種產生與TRAIL-R2結合的單克隆抗體的雜交瘤，所述雜交瘤選自保藏號為FERM BP-7599的雜交瘤H-48-2、保藏號為FERMBP-7698或FERM BP-7770的雜交瘤E-11-13、保藏號為FERM BP-7699或FERM BP-7768的雜交瘤F-4-8、保藏號為FERM BP-7700或FERMBP-7769的雜交瘤L-30-10、保藏號為FERM BP-8037的雜交瘤0304和保藏號為FERM BP-8038的雜交瘤KMTR1。
58.一種抗TRAIL-R2單克隆抗體的生產方法，所述方法包括培養權利要求56或57的雜交瘤，并且從所得的培養物中收集與TRAIL-R2結合的抗體。
59.一種抗TRAIL-R2單克隆抗體的生產方法，所述方法包括從權利要求56或57的雜交瘤中分離編碼抗TRAIL-R2單克隆抗體的基因，構建具有所述基因的表達載體，將所述表達載體導入宿主中，以表達所述單克隆抗體，并且從所得的宿主或者所述宿主的培養上清液或分泌物中收集抗TRAIL-R2單克隆抗體。
60.權利要求59的生產方法，其中所述宿主是選自大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞以及哺乳動物的任何宿主。
61.一種抵抗腫瘤的預防藥或治療藥，所述預防藥或治療藥包含作為有效成分的權利要求1-55中任一項的抗體或其功能性片段。
62.權利要求61的預防藥或治療藥，其中所述腫瘤是任一種選自以下的腫瘤結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦腫瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生、男性胚細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構母細胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤、維耳姆斯氏瘤等。
全文摘要
抗TRAIL－R1和TRAIL－R2的抗體或其功能性片段，所述抗體具有至少一種選自以下(a)－(c)的特性(a)具有誘導表達TRAIL－R1和/或TRAIL－R2的癌細胞凋亡的活性；(b)對表達TRAIL－R1和/或TRAIL－R2的人正常細胞沒有影響；和(c)不誘導對人肝細胞的損害。
文檔編號C07K16/18GK1599754SQ0281417
公開日2005年3月23日 申請日期2002年5月17日 優先權日2001年5月18日
發明者森英治, 片岡之郎 申請人:麒麟麥酒株式會社