專利名稱：大豆異黃酮及用大孔吸附樹脂制備該大豆異黃酮的方法
技術領域：
本發明涉及大豆異黃酮及其制備方法，尤其涉及采用經過篩選的專一性大孔吸附樹脂制備的高純度大豆異黃酮產品及其工業化生產方法。
大豆異黃酮是一種植物性雌激素，它具有雌激素的生理功能，研究表明，大豆異黃酮可有效抑制人類乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等常見的多發性病癥，對防治中老年婦女骨質疏松具有重要的作用，卻沒有一般激素的副作用。鑒于大豆異黃酮優異的保健功能，研究和提取大豆異黃酮已成為本領域的一個熱點。
大豆異黃酮是大豆及大豆制品中所含有的異黃酮類生物活性物質，包括12種異構體成分，它們在大豆中的總含量很低，平均只有0.2～0.3％左右，而且在水中的溶解度較低，主要溶于醇溶性溶劑中，另外，大豆中成分復雜，有許多成分如大豆低聚糖、色素等與大豆異黃酮的性質相近，較難分離，使生產制備高純度的異黃酮成為技術難度較大的課題。
在本發明以前，有關提取制備大豆異黃酮的研究報道已有很多，根據這些現有技術的記載，大豆異黃酮的提取制備方法一般包括大豆原料的脫脂、用水溶性醇溶液進行提取、用吸附柱處理提取液(稱上柱)、醇溶液洗脫等過程，洗脫液經濃縮干燥即得到大豆異黃酮產品。上述方法中，影響產品的得率和純度的因素主要是上柱和洗脫條件的確定，一般選用的吸附樹脂是乙基-乙烯基苯-二乙烯基苯、苯乙烯-二乙烯基苯、或聚苯乙烯聚合物，可以是離子化的或非離子化的，但試驗結果表明，這樣的樹脂對吸附大豆異黃酮的專一性不強，經過一次吸附、洗脫后制備的異黃酮成分的總純度最多只有20～30％(可參見日本公開特許公報，昭62-126186)，為得到高純度的大豆異黃酮，必須進一步采取重結晶等其它精制手段，例如申請號是98119864.3的中國專利公開的方法中，采用了二步水解，第一次水解在柱層析前進行，第二次水解在柱層析后進行，產物還需進行精制，才能得到高純度的異黃酮產品；再如美國專利USP.5,679,806，提取產物需經過包括活性炭脫色、甲醇結晶等多次精制的過程，這樣產品的純度提高了，但多次操作導致損失大，使產品得率降低，生產成本大大提高，因而無法工業化生產。
據考證，目前只有美國和日本的個別廠家有此產品上市，國內從事此項研究的單位很多，但僅停留在實驗室階段，阻礙研究進展的主要原因是尚未篩選到有特異吸附功能的專一性樹脂，產品純度及得率低，生產工藝繁瑣，導致生產成本高，產品缺乏市場競爭力。
本發明的目的之一是提供一種高純度的大豆異黃酮產品，其以四種主要異構體成分的總量計的純度在50％以上，可用作食品添加劑或用于保健食品的制造。
本發明的另一主要目的在于提供一種提取制備高純度大豆異黃酮的工藝方法，通過篩選出有特異性的大孔吸附樹脂，配合相適應的操作處理，采用一步法吸附解脫純化工藝，制備出純度高達50％以上的大豆異黃酮產品，降低了生產成本，從而實現工業化生產。
在大豆異黃酮包括的12種異構體成分中，公認的主要成分有4種，它們是黃豆苷(Daidzin，簡稱D)、黃豆苷原(Daidzein，簡稱De)、染料木素(亦稱染料木苷，Genistin，簡稱G)和染料木因(亦稱染料木黃酮，Genistein，簡稱Ge)，其結構式如下 黃豆苷 染料木素(染料木苷)Daidzin(D) Genistin(G) 黃豆苷原 染料木因(染料木黃酮)Daidzein(De)Genistein(Ge)異黃酮苷分解得到相應的苷原，大量的體外試驗證實，大豆異黃酮具有生理活性的成分是苷原，而經體內試驗表明含糖苷的異黃酮同樣具有上述功能，這是因為生物體內腸道細菌酶具有切除糖苷的能力，異黃酮糖苷可通過腸道細菌作用后成為苷原，經小腸吸收后以游離異黃酮的形式起作用。有人在用動物模型試驗大豆異黃酮對大鼠血脂和過氧化狀態的影響時，分別用異黃酮苷原和異黃酮糖苷作喂養試驗，結果表明兩者的作用特點和效果基本一致，同等重量的苷原略優于糖苷，可以斷定是分子量不同所引起的差異。因此本發明人認為將大豆異黃酮用作食品添加劑或保健食品時，沒有必要將異黃酮苷先行分解成苷原。
根據本發明的第一個方面，提供了一種大豆異黃酮產品，其基本上由上述四種異構體組成，其純度為50％以上，是指其它異構體忽略不計，而基于四種主要的異黃酮異構體D、De、G、Ge總含有量計的純度。
根據本發明的第二個方面，提供了該大豆異黃酮的一種制備方法，以大豆的脫脂產物為原料，該制備方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝劑對該提取液進行絮凝澄清及用極性大孔吸附樹脂分離純化該澄清后的提取液。
本發明的方法是從大豆中提取異黃酮，所述的原料可以包括大豆、豆胚或豆粕。如果使用大豆、豆胚作原料，需要先進行脫脂處理。也可以以脫脂豆粕為原料，直接進行提取。
根據本發明優選的技術方案，大豆異黃酮的制備方法包括以下過程(1)用濃度為65～78％的甲醇溶液提取原料制成提取液，提取溫度70～78℃，提取時間2-5小時，然后濃縮提取液并回收甲醇；(2)將上述提取液稀釋成總固形物含量≤20％的溶液后加入絮凝劑，絮凝澄清；(3)將澄清液加到裝填有極性大孔吸附樹脂的吸附柱中；(4)以60～80％乙醇溶液解吸。
發明人在實際操作中發現，傳統的靜置沉淀分離不利于濃縮液的上柱吸附分離，所以本發明在上柱前要求加入絮凝劑對濃縮液進行絮凝澄清，絮凝劑可以使用本領域常用的絮凝劑，其中有效的絮凝劑優選明膠、甲殼素、氨基化甲殼素(或稱JA澄清劑)，加入絮凝劑的目的主要是為了除去溶液中的蛋白質等雜質，確保提取液中的有效成分在通過吸附柱時被樹脂充分吸附。絮凝劑可以按常規方法使用，但優選在使用前將其配成1～2％的溶液，并將上述的提取濃縮液適當稀釋(通常使用去離子水)后添加絮凝劑，添加時要施以慢速攪拌，添加完畢后靜置2-4小時即可達到澄清的要求，絮凝劑的添加量可以按照常規方法或通過試驗確定，優選是使該絮凝劑在提取液中的濃度為200～400ppm。
絮凝澄清后的上清夜可以直接上柱，也可以向其中加入乙醇，并使乙醇在澄清液中的濃度不大于10％，即用含有0-10％乙醇(工業乙醇)的澄清液上柱。
極性大孔吸附樹脂的篩選是實現本發明目的的關鍵所在，本發明經過對弱極性、極性的多種適用于分離純化黃酮類樹脂的吸附解脫特性的試驗比較，最終確定為極性大孔吸附樹脂，尤其是篩選出一類用聚苯乙烯再交聯上功能極化基團的特效極性大孔吸附樹脂，增加了對大豆異黃酮的親和力，使物料中的異黃酮組分特別是所述的四種主要組分能被充分吸附，在水洗過程中只能洗去寡糖、色素等雜質，而在解吸時又能最大限度地解脫下來，從而保證了最終產品的純度。根據發明人的篩選結果，聚苯乙烯與酰胺基團交聯形成的吸附樹脂具有非常好的效果，具體實例包括南開大學生產的標號為ADS-5、ADS-17、ADS-7的大孔吸附樹脂等產品。
用于上柱后進行解吸的溶液，一般使用乙醇，優選60～80％的乙醇。根據本發明優選的技術方案，澄清液上柱及用乙醇溶液解吸時，速度控制在1-3倍柱體積/小時。在用乙醇解吸前，先用水洗，以除去其中的寡糖、色素等雜質，然后用乙醇解吸，收取到的解吸液蒸發除去乙醇和部分水分，然后經濃縮干燥，優選采用真空濃縮干燥，即可得到最終的異黃酮產品。
除以上所述，在實施本發明方法的過程中所涉及的其它操作，例如提取液或澄清液中濾渣的分離，可以采用離心分離，也可以直接過濾(真空抽濾等)，上柱和解吸過程的具體操作屬于本領域的基本技能，而涉及到的有機溶劑回收和物料的濃縮等，均可采用常規的常壓或減壓操作或其它可行的操作，這些不屬于本發明的范疇，本發明亦沒有特別限定。
發明人還采用HPLC方法對本發明方法得到的產品中異黃酮含量進行了定性和定量分析檢測，從得到的峰圖中可以看出，本發明各樣品的雜峰都很少，與標樣的峰圖對比，可知其中主要是D、De、G、Ge四個異構體的峰(見圖2、4、5)，其它異構體忽略不計，僅以這四種異構體的含量計算，已超過50％。作為對比，圖6是將豆粕的提取液經濃縮、脫溶等一般方法制備的異黃酮產品的HPLC譜圖，由于儀器和吸附柱的不同雖然使試驗中出峰時間不同，但從圖譜中可見雜峰眾多，并可知其成品(四種主要成分)的純度小于30％。
從檢測結果可以證實，由于本發明使用了專一性的吸附樹脂，樹脂中的功能性極化基團如酰胺基團與異黃酮分子中的酚羥基形成氫鍵(而不同于現有技術的吸附依靠分子間的范德華力)，達到特異性吸附的目的，因而在清洗時能把許多雜質洗去，使解吸液中的雜質含量降低至最少，大大提高了解吸液經干燥后產品中異黃酮的純度，體現在檢測結果中就是雜峰很少，主要是D、De、G、Ge四個異構體的峰，并且從譜圖分析可得出，其它異構體忽略不計，僅四種主要異構體D、De、G、Ge的總量已超過50％。
綜上所述，本發明成功地篩選和使用了特效極性大孔吸附樹脂從大豆及大豆產品中分離純化異黃酮，同時通過提取、分離、濃縮、澄清各工藝環節中最佳條件的確定，成功實現大豆異黃酮的一步吸附解吸純化，制備出以主要成分計算的純度高達50％的大豆異黃酮產品，通常產品的得率大于0.4％(因原料中異黃酮含量的多少而異)，即1公斤大豆原料可生產4克以上，純度大于50％的大豆異黃酮產品，做到了提高原料利用率，降低生產成本，并且工藝簡單，易于控制，產品質量穩定，有效成分含量高，為工業化生產提供可能，所以本發明的實施對利用大豆異黃酮，開發系列抗腫瘤新藥和保健食品的發展將起到巨大的推動作用，對推動大豆行動計劃，促進大豆綜合利用起到積極作用，為大豆的深加工開辟了新的領域。


圖1是本發明制備方法的工藝流程示意圖。
圖2是實施例1從豆粕中分離制備出異黃酮產品的HPLC峰圖。
圖3是D、De、G、Ge四種異構體標準樣品的HPLC峰圖。
圖4是實施例1制備出的異黃酮產品樣品與標樣疊加試驗的HPLC峰圖。
圖5是實施例3從豆胚分離制備出異黃酮產品的HPLC峰圖。
圖6是采用未經本發明吸附柱分離的產品作出的HPLC峰圖。
下面通過實施例進一步詳細說明本發明，但不應對本發明的實施范圍構成任何限制。
實施例1取1kg脫脂豆粕，加入12kg 70％甲醇，在78℃水浴中回流萃取2小時，離心分離(3800rpm×10min)，取上清液在旋轉蒸發儀中蒸發回收甲醇，使溶液濃縮成近似膏狀，用去離子水稀釋至其中固形物含量約15-20％，攪拌同時加入1％明膠溶液作為絮凝劑，使絮凝劑的最終濃度為400ppm，然后靜置2～3小時，使其澄清。取上清液加入工業乙醇配成含10％乙醇的水溶液，上柱，上柱速度控制為每小時2倍柱體積，所用吸附柱內裝填聚苯乙烯交聯成的大孔吸附樹脂ADS-5(極性樹脂，南開大學生產)。然后先用去離子水清洗柱，再用60％乙醇溶液解吸，解吸速度為2.5倍柱體積/小時，收集解吸液在旋轉蒸發儀上蒸發掉乙醇及部分水分，最后采用真空濃縮進行干燥，粉碎，得大豆異黃酮原粉4.23g，定量測定出其純度為51％。
為對上述產品的的組成和純度作出確定，首先用這四種異構體的標樣和上述產品樣品分別作出HPLC峰圖，見圖2和圖3，其中De和Ge采用美國Sigma公司提供的試劑級標樣，D和G采用日本國際農業研究中心提供的試劑級標樣。然后再將該標樣與本實施例制備的產品樣品同時進樣，即進行疊加試驗，結果見圖4的峰圖。
測定方法依次將樣品的甲醇萃取液經0.45μm微濾后，各取一定量溶液注入反相化學鍵合柱，經過與標樣比較，根據標樣的保留時間定性，根據標樣的峰面積定量。該定量檢測方法可參見發明人的研究報告(發表在《食品與發酵工業》，2000年第五期，P7)。
主要儀器高壓液相色譜儀(日本島津LC-6A)紫外檢測器SPD-6AV中心控制器SLC-6A色譜柱箱CTO-6A數據處理裝置C-R3A超純水器Milli-Q50
色譜條件色譜柱Shim-pack clc-ods碳18柱0.15m×6.0mmΦ流動相甲醇∶5％乙酸＝30∶70流速1.0ml/min(8.5分鐘前)；1.5ml/min(8.5分鐘后)波長254nm檢測靈敏度0.08AUFS柱溫50℃進樣量10μl紙速0.2cm/min比較各峰圖，可以看到，圖3與圖2中各有四個出峰時間基本相同的峰，而從圖4看到，這四個主峰完全疊加在一起，由此證明本發明產品中的異黃酮應該是由這四種主要成分組成，經計算其含量為51％。
實施例2取1kg整大豆，粉碎，過40目篩后用正己烷脫脂(可以使用索氏提取器)。用11kg 75％甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取3小時，然后用減壓抽濾法過濾，除去濾渣，將濾液在旋轉蒸發儀中濃縮至膏狀，并同時回收甲醇。將濃縮液稀釋至其中固形物含量約15-20％，然后邊攪拌邊加入2％明膠溶液至明膠的濃度為400ppm，靜置2小時使其絮凝澄清，取上清液加入工業乙醇配成5％的醇溶液，上柱，上柱速度控制為每小時1倍柱體積，柱中裝ADS-17大孔吸附樹脂(極性樹脂，南開大學生產)。用去離子水清洗后，用75％乙醇溶液解吸，解吸速度為2倍柱體積/小時，將收集的解吸液濃縮成濃漿狀，同時回收乙醇，然后將濃縮液干燥，粉碎，得到3.81g異黃酮原粉，檢測方法同實施例1，產品純度為52％。
實施例3取1kg豆胚，粉碎，過40目篩，用正己烷脫脂，然后用12kg 78％的甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取4小時，將提取液離心分離，取上清液在旋轉蒸發儀中減壓濃縮，回收甲醇，取濃縮液用去離子水稀釋至固形物含量約20％，加入1％甲殼素溶液，加入量為其在濃縮液中濃度達到300ppm，邊加邊攪拌，使其中的蛋白質等雜質絮凝沉淀，靜置3小時后取上清液上柱，上柱速度控制為每小時2倍柱體積，柱內裝極性大孔吸附樹脂ADS-7(南開大學生產)，用去離子水洗去糖等雜質，然后用80％乙醇溶液解吸，解吸速度為1倍柱體積/小時，收集解吸溶液濃縮干燥后得到異黃酮原粉20.01克，產品色譜圖見圖5，檢測方法同實施例1，D、De、G、Ge總純度為50.5％。
實施例4取1kg脫脂豆粕，用14kg 65％的甲醇溶液在75℃水浴中回流萃取5小時，萃取液抽濾分離除去殘渣，取上清液在旋轉蒸發儀中減壓濃縮，回收甲醇，取濃縮液稀釋后，向溶液中加入2％JA澄清劑，輕輕攪拌，靜置2小時后，取上清液上柱，柱內裝大孔吸附樹脂ADS-7(極性樹脂，南開大學生產)，上柱速度控制為每小時2倍柱體積，然后用純水洗去糖類等雜質，用70％乙醇解吸，解吸速度每小時1.5倍柱體積，收集解吸液，濃縮干燥后得到4.01g經檢測純度為48.5％的大豆異黃酮原粉(檢測方法同實施例1)。
實施例5取1kg脫脂豆粕，用12kg 75％的甲醇溶液在75℃的水浴中回流萃取3小時，萃取液離心分離(3800r.p.m×10min)，取上清液用旋轉蒸發儀減壓濃縮，然后加水稀釋成固形物含量20％，加入2％甲殼素溶液作為絮凝劑，按實施例4的敘述完成后面過程，得4.0g純度為49.95％的大豆異黃酮原粉(檢測方法同實施例1)。
實施例6取1kg大豆，粉碎，過40目篩，用正己烷脫脂后，用13kg 65％的甲醇溶液在75℃水浴中回流萃取4小時，離心分離(3800r.p.m×10min)，取上清液用旋轉蒸發儀減壓濃縮至膏狀，同時回收甲醇。濃縮液加水稀釋成固形物含量20％后，用2％的JA澄清劑絮凝澄清，取上清夜加入乙醇配成10％乙醇溶液上柱，上柱速度為每小時3倍柱體積，柱內裝有大孔吸附樹脂ADS-5(極性樹脂，南開大學生產)，用去離子水清洗后，加65％乙醇溶液解吸，收集解吸液濃縮干燥后得3.5g純度為50.5％的大豆異黃酮原粉(檢測方法同實例1)。
權利要求
1.大豆異黃酮制品，其基本上由黃豆苷、黃豆苷原、染料木素和染料木因組成，以這四種異構體成分總量計的純度為50％以上。
2.大豆異黃酮的制備方法，以大豆的脫脂產物為原料，該制備方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝劑對該提取液進行絮凝澄清及用極性大孔吸附樹脂分離純化該澄清后的提取液。
3.權利要求2所述的制備方法，其包括以下過程(1)用濃度為65～78％的甲醇溶液提取原料制成提取液，提取溫度70～78℃，提取時間2-5小時，然后濃縮提取液并回收甲醇；(2)上述提取液稀釋成總固形物含量≤20％的溶液后加入絮凝劑，絮凝澄清；(3)澄清液加到裝填有極性大孔吸附樹脂的吸附柱中；(4)以60～80％乙醇溶液解吸。
4.權利要求3所述的制備方法，其中，所用絮凝劑包括明膠、甲殼素、氨基化甲殼素。
5.權利要求3或4所述的制備方法，絮凝澄清時，絮凝劑配成1～2％的溶液加入，使該絮凝劑在提取液中的濃度為200～400ppm。
6.權利要求2或3所述的制備方法，其中，所述極性大孔吸附樹脂是聚苯乙烯與功能極化基團交聯的樹脂。
7.權利要求6所述的制備方法，其中，該極性大孔吸附樹脂是聚苯乙烯與酰胺基團交聯的樹脂。
8.權利要求3所述的制備方法，其中，上柱和解吸的速度為1-3倍柱體積/小時。
9.權利要求2-8中任一項所述的制備方法，其中，所用原料為脫脂豆粕。
10.權利要求2-8中任一項所述的制備方法，以大豆或豆胚為原料，先用常規方法脫脂。
全文摘要
本發明涉及一種基本上由黃豆苷、黃豆苷原、染料木素和染料木因組成的大豆異黃酮產品及從大豆或大豆產品中分離制備這種異黃酮產品的方法,本發明產品中基于上述四種主要成分的純度為50%以上,其制備方法包括用甲醇溶液提取原料制成提取液、使用絮凝劑對該提取液進行絮凝澄清及用極性大孔吸附樹脂純化處理該澄清后的提取液,該方法具有生產成本降低,工藝簡單,產品有效成分含量高,質量穩定的優點,為工業化生產提供了可能。
文檔編號C07D311/36GK1349987SQ0013000
公開日2002年5月22日 申請日期2000年10月20日 優先權日2000年10月20日
發明者孫梅君, 史長穎, 駱煉, 錢英燕 申請人:中國食品發酵工業研究所