用于制備唾液酸衍生物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于制備唾液酸衍生物的方法，其特征在于在一個反應器中將從N-乙 酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制備CMP-N-乙酰神經氨酸(CMP-NeuAc)的過程和包含結合唾液酸與 包含半乳糖的衍生物如乳糖等的唾液酸(神經氨酸)衍生物制備過程一起進行。
【背景技術】
[0002] 糖（自然界中最為廣泛和大量存在的一種生物分子)是參與細胞內識別和信號轉 導的最常見的分子。當通過核酸活化時，大部分糖組成單元可加至苷元。核苷酸-糖具有單 糖的活化形式，并用作糖基轉移酶轉糖基反應的供體。然而，該轉糖基作用仍具有糖基轉移 酶反應性弱、活化多糖組成單元使用受限等問題。
[0003] 近來，由于針對糖鏈結構和功能的研究已快速開展，包含低聚糖、糖脂、糖蛋白等， 具有生理學活性的糖鏈作為藥物或功能材料的用途開發已積極開展。其中，在末端包含N-乙酰神經氨酸(NeuAc)的含唾液酸糖鏈是具有細胞粘附重要功能或用作病毒感染受體等的 糖鏈。
[0004] 含唾液酸糖鏈通常通過唾液酸轉移酶的催化合成。唾液酸轉移酶是使用CMP-N-乙 酰神經氨酸作為糖供體，將唾液酸轉移至受體例如糖鏈等的酶。然而，事實上，用作糖供體 的CMP-N-乙酰神經氨酸是顯著昂貴的且對應于試劑級的僅少量供有。
[0005] 作為制備CMP-N-乙酰神經氨酸的方法，使用5'-三磷酸胞苷(CTP)和N-乙酰神經氨 酸(NeuAc)作為底物并通過CMP-N-乙酰神經氨酸合成酶的合成方法是已知的。然而，因為 CTP和NeuAc為昂貴原料，所以通過直接使用原料而合成的CMP-N-乙酰神經氨酸也是昂貴 的。
[0006] 作為制備CMP-N-乙酰神經氨酸(CMP-NeuAc)的方法，以下方法已被報道：（1)使用 N-乙酰神經氨酸裂解酶或N-乙酰神經氨酸合成酶由N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)制備CMP-NeuAc的方法（J.Am.Chem· Soc.，110:6481，1988; J.Am.Chem. Soc.，110:7159,1988;日本專 利申請公開號Hei 10-4961)，（2)通過在堿性條件下將N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)轉化為N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，并往其中加入N-乙酰神經氨酸裂解酶或N-乙酰神經氨酸合成 酶而制備N-乙酰神經氨酸（NeuAc )的方法（日本專利申請公開號Hei 5-21 1884; Biotechnol · Bioeng.，66: 2，1999 ;Enzyme Microb · Technol ·，20，1997)，（3)使用N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)2-差向異構酶將GlcNAc催化轉化為ManNAc，并使用N-乙酰神經氨酸裂解酶或 N-乙酰神經氨酸合成酶以由N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制備NeuAc的方法(W0 95/26399;日 本專利申請公開號Hei3-180190;日本專利申請公開號)，（4)使用大腸桿菌和 酵母細胞合成CMP-N-乙酰神經氨酸的方法等。
[0007] 然而，所述方法（1)具有N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)為昂貴原料的問題，且所述 方法(2)具有從Gl cNAc和N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)的混合物純化ManNAc的過程極度復 雜的問題，即便N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc)為廉價原料。此外，因為方法（3)中使用的 GlcNAc2-差向異構酶需要ATP(三磷酸腺苷），所以方法(3)具有需要加入昂貴的ATP或使用 微生物從ATP前體腺嘌呤產生ATP的問題。方法(4)具有就過程而言，大腸桿菌(E.coli)和酵 母細胞的使用復雜的問題。
[0008] 韓國專利申請公開號10-公開了用于制備CMP-N-乙酰神經氨酸的以 下方法:通過將5'-單磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸鹽(丙酮酸鈉)和酵母加至 引入了包含編碼N-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶的基因和編碼N-乙酰神經氨酸醛縮酶的基因 的共表達載體的轉化株以由此合成神經氨酸，并進一步加入CMP-N-乙酰神經氨酸合成酶， 或將5'-單磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸鹽和酵母加至引入了包含編碼N-乙酰 神經氨酸醛縮酶的基因和編碼CMP-N-乙酰神經氨酸合成酶的基因的共表達載體的轉化株。 然而，該方法具有以下問題:CMP-N-乙酰神經氨酸的制備中需要進行各種步驟，且由用作底 物的5 單磷酸胞苷(CMP)至5 三磷酸胞苷(CTP)的轉化率低。
[0009] 糖蛋白和糖脂中包含唾液酸化低聚糖和巖藻糖的多糖在生物過程中以不同方式 發揮著顯著重要的作用。
[0010] 然而，用于結合唾液酸與生物學活性物質衍生物的常規已知反應具有以下缺陷： 唾液酸化酸衍生物是使用昂貴的CMP-N-乙酰神經氨酸作為起始原料而由唾液酸轉移酶制 備，且制備效率也低。此外，使用N-乙酰-D-葡糖胺作為起始原料制備唾液酸衍生物的技術 具有唾液酸衍生物制備效率低的缺陷，因為唾液酸轉移酶的活性范圍和活性減小（Kim， Dae-Hee，Sun Moon graduate School of Science doctoral dissertation，2011)〇
[0011] 因此，本發明人努力嘗試開發一種以高效率和低成本制備生物學活性物質的唾液 酸衍生物的方法，發現當使用N-乙酰-D-葡糖胺和5 單磷酸胞苷(CMP)作為起始原料制備 CMP-N-乙酰神經氨酸的步驟和由所制CMP-N-乙酰神經氨酸制備結合唾液酸的生物學活性 物質衍生物的步驟在單一反應器中進行并使用唾液酸轉移酶突變體時，能夠回收昂貴原料 5'_單磷酸胞苷(CMP)，并能夠以高收率制備生物學活性物質的唾液酸衍生物，并完成了本 發明。
[0012] 公開內容
[0013] 技術問題
[0014] 本發明的一個目標是提供一種以高收率和低成本制備唾液酸衍生物的方法。
[0015] 為實現所述目標，本發明提供了一種用于制備唾液酸衍生物的方法，其包括：（a) 通過加入包含5'-單磷酸胞苷（CMP)、乙酰磷酸、核苷三磷酸（NTP)、N-乙酰-D-葡糖胺 (GlcNAc)、丙酮酸鈉和半乳糖殘基的化合物作為底物，并在單一反應器中與包含5'-單磷酸 胞苷激酶(CMK )、乙酸激酶(ACK )、CMP-N-乙酰神經氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶:NEU )、N-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶(GlcNAc-2-差向異構酶:ΝΑΝΕ)、N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NeuAc 醛縮酶，NAN)和唾液酸轉移酶的反應溶液反應以制備包含唾液酸乳糖或半乳糖殘基的化合 物的唾液酸衍生物；以及(b)獲得根據步驟(a)制備的包含唾液酸乳糖或半乳糖殘基的化合 物的所制唾液酸衍生物。
[0016] 由以下詳細說明以及隨附的權利要求將可明了本發明的其它特征以及示例性實 施方式。
【附圖說明】
[0017] 圖1顯示了根據本發明的示例性實施方式通過一鍋反應(one-pot reaction)(整 合批式)制備2，3-唾液酸乳糖和2，6-唾液酸乳糖的合成方法。
[0018]圖2顯示了α-2，3-唾液酸轉移酶突變體的2，6唾液酸轉移副反應確認；圖2(a)顯示 了ρΗ4.5至6.0的結果，且圖2(b)顯示了ρΗ6.5至7.0的結果。
[0019]圖3顯示了通過LC(圖3Α)和質量（圖3Β)確認的通過本發明一鍋反應合成的2,3_唾 液酸乳糖的結果。
[0020] 圖4顯示了通過LC (圖4Α)和質量（圖4Β)確認的通過本發明一鍋反應合成的2，6-唾 液酸乳糖的結果。
[0021] 圖5顯示了通過本發明一鍋反應制備唾液酸半乳糖的合成方法。
[0022]圖6顯示了通過TLC (圖5Α)和質量（圖5Β)確認的通過本發明一鍋反應合成的唾液 酸半乳糖的結果。
[0023]圖7顯示了與乳糖偶聯的接頭的唾液酸衍生物的合成方法。
[0024]圖8顯示了通過TLC和質量確認的通過本發明一鍋反應合成的結合乳糖的接頭的 氨基己基接頭2，3-唾液酸乳糖的結果。
[0025]圖9顯示了黃酮類CSH-I-54的包含半乳糖殘基的衍生物的唾液酸衍生物的合成方 法。
[0026] 圖10顯示了通過LC和質量確認的通過本發明一鍋反應合成的2，3_唾液酸乳糖_ CSH-I-54的結果。
[0027] 圖11顯示了免疫抑制劑他克莫司的半乳糖衍生物的唾液酸衍生物的合成方法。 [0028]圖12顯示了通過LC(圖12a)和質量（圖12b)確認的通過本發明一鍋反應合成的2， 3-唾液酸乳糖-他克莫司的結果。
[0029] 圖13顯示了抗癌劑紫杉醇的半乳糖衍生物的唾液酸衍生物的合成方法。
[0030] 圖14顯示了通過LC(圖14a)和質量（圖14b)確認的通過本發明一鍋反應合成的2， 3-唾液酸乳糖-紫杉醇的結果。
[0031 ]圖15顯示了抗生素萬古霉素的半乳糖衍生物的唾液酸衍生物的合成方法。
[0032] 圖16a顯示了通過LC確認的通過本發明一鍋反應合成的2，3_唾液酸乳糖-萬古霉 素的結果。
[0033] 圖16b顯示了通過質量確認的通過本發明一鍋反應合成的2,3-唾液酸乳糖-萬古 霉素的結果。
[0034]最佳方式
[0035]在未以其他方式定義的情況下，本說明書中使用的所有技術和科學術語與本發明 所屬技術領域技術人員所通常理解的含義具有相同含義。一般而言，本說明書中使用的術 語是技術領域中熟知并通常使用的。
[0036]本發明提供了一種用于制備唾液酸衍生物的方法，其包括：（a)通過加入包含5'-單磷酸胞苷(CMP)、乙酰磷酸、核苷三磷酸(NTP)、N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)、丙酮酸鈉和半 乳糖殘基的化合物作為底物，并在單一反應器中與包含5'_單磷酸胞苷激酶(CMK)、乙酸激 酶(ACK )、CMP-N-乙酰神經氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶:NEU )、N-乙酰葡糖胺-2-差向異構 酶(G1 cNAc-2-差向異構酶:NANE)、N-乙酰神經氨酸醛縮酶(NeuAc醛縮酶，NAN)和唾液酸轉 移酶的反應溶液反應以制備包含唾液酸乳糖或半乳糖殘基的化合物的唾液酸衍生物；以及 (b)獲得根據步驟(a)制備的包含唾液酸乳糖或半乳糖殘基的化合物的所制唾液酸衍生物。
[0037] 根據本發明的用于制備唾液酸衍生物的方法，昂貴底物5'-單磷酸胞苷(CMP)可被 回收且唾液酸衍生物可通過在一個反應器中將從N-乙酰-D-葡糖胺制備CMP-N-乙酰神經氨 酸的步驟和結合唾液酸與包含半乳糖的衍生物的唾液酸(神經氨酸)衍生物制備步驟一起 進行而以尚效率被制備。
[0038] 用于制備唾液酸衍生物的常規方法是使用CMP-N-乙酰神經氨酸作為起始原料，通 過唾液酸轉移酶使唾液酸與包含乳糖或半乳糖的衍生物結合的方法。然而，由于CMP-N-乙 酰神經氨酸是顯著昂貴的物質，因此唾液酸衍生物的制備中消耗了大量成本。
[0039]為解決所述問題，本發明人開發了一種以高收率制備CMP-N-乙酰神經氨酸的方 法，該方法使用5'-單磷酸胞苷(CMP)和痕量NTP，以及各種底物和酶，并利用來源于脆弱擬 桿菌NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343)的新型N-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶 (韓國專利號0888513)。
[0040]當CMP-N-乙酰神經氨酸和乳糖與唾液酸轉移酶反應時，唾液酸轉移至乳糖，從而 制備唾液酸乳糖和5'-單磷酸胞苷(CMP)。在制備唾液酸乳糖的常規方法中，使用5'-單磷酸 胞苷(CMP)作為底物制備CMP-N-乙酰神經氨酸的過程和轉移唾液酸的過程分別在不同反應 器中進行，因此制備的5'-單磷酸胞苷(CMP)不能被回收。
[0041 ] 在本發明中，由于從5'-單磷酸胞苷(CMP)制備CMP-N-乙酰神經氨酸的過程和通過 唾液酸轉移酶在包含CMP-N-乙酰神經氨酸和半乳糖等的衍生物如乳糖中制備唾液酸衍生 物和5'-單磷酸胞苷(CMP)的過程是在相同反應器中進行，因此通過唾液酸轉移反應制備的 5 單磷酸胞苷(CMP)可在制備CMP-N-乙酰神經氨酸的過程中被回收。
[0042]圖1顯示了根據本發明的示例性實施方式在單一反應器中制備2,3_唾液酸乳糖和 2，6-唾液酸乳糖的合成方法。
[0043]在本發明的示例性實施方式中，在體外通過一鍋反應從N-乙酰葡糖胺(GlcNAc