人參、落葉松提取物制備方法及其在化妝品方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種以人參、落葉松的提取物的提取工藝，具體說是從人參根中提取 精氨酸糖苷并配合長白落葉松木提取物的工藝和它們在化妝品方面的應用。
【背景技術】
[0002] 古來木材提取物就被用來制作美容化妝品，例如，檀香木、柏木、香樟木、安息香 樹脂等。檀香古來便深受歡迎，從印度到埃及、希臘、羅馬的貿易路線上，常見蓬車載滿著 檀香。檀香具有深厚木質香氣，通常用于香水和護膚霜，添加檀香精油的肥皂和沐浴露等 也是非常受歡迎的。檀香精油本身被作為一種香水或混合其他精油，是一些香水的關鍵成 分，在中國，檀香也有1000多年的使用歷史，從古代的皇帝，到今天的上流社會，對檀香都 有一種特別的獨愛。明代著名醫藥學家李時珍 [1]指出"檀香用于面生黑子，每夜以漿水洗 之令赤，磨汁涂之甚良"。但古代對于落葉松木材提取物在醫藥化妝品方面的應用較少。目 前世界各國對于森林資源也包括非木材資源的開發利用都給與足夠的重視。美國懷俄明州 弗拉維特普雷有限公司在中國申請專利（201280072960. 8) "在美容和衛生學產品中使用 木材提取物的方法"一文中指出應用落葉松木提取物，尤其是落葉松木材中含有的：抗氧化 劑二氫槲皮素（紫杉葉素）以及阿拉伯半乳聚糖用于口腔、皮膚和頭發護理等用途。這些 落葉松包括興安落葉松、西伯利亞落葉松等6種落葉松，但未包括長白落葉松。中國專利 (201310302501)"長白落葉松提取物的制備方法及醫藥用途"一文中闡述，利用從人工栽培 的長白落葉松采伐的廢棄樹根提取的提取物，其中主要含有二氫槲皮素應用于化妝品。二 氫槲皮素具有多種生物活性，經研究發現，二氫槲皮素具有抗腫瘤 [24]抗氧化[58]抗輻射[9] 抗病毒[1°'11]抗心血管系統疾病及改善毛細血管微循環、改善腦部血液循環、抗血小板凝聚 等作用 [12]，落葉松中二氫槲皮素對酪氨酸酶的抑制作用[13]。Kwon等自黃榆根分離得到花 旗松素-葡萄糖苷，并通過實驗表明其可以抑制iNOS (誘生型一氧化氮激酶）表達，具有抗 炎作用[14]。于慶海等[15]用大鼠腹腔肥大細胞釋放組胺的方法觀察了 8種黃酮類化合物 包括二氫槲皮素對化合物4 8 / 8 0和金霉素等誘導肥大細胞釋放組胺的作用，對黃酮類 化合物在肥大細胞組胺釋放及其在抗變態、抗過敏、抗炎等作用方面提供部分實驗數據與 解釋。
[0003] 長白山落葉松植被豐富，它伴生著一種傳奇的植物一人參。人參屬半陰性植物，所 以生長期內需自然遮陰，一般是天然針闊混交林，針葉樹種有紅松、落葉松、樟子松等，闊葉 樹種有椴樹、樺樹、柞樹、色樹、榆樹、水桃、黃柏、蠟樹、楸樹、楊樹等天然次生混交林，經過 數十年或幾百年的生長，形成了舉世聞名的瑰寶受到世人的青睞。
[0004] 人參具有幾千年的應用歷史，人參C.A.Meyer)系五加科 (Araliaceae)多年生草本植物一一人參的干燥根及根莖，人參是長白山最具開發潛力的 藥用植物資源之一。在古代，"百草之王"的人參也被稱為神草，在現代，人參已是中外聞 名、老幼皆可用的名貴中藥材。人參作為馳名世界的滋補性藥材，具有滋陰、補氣、生津、益 血、健胃、強心等作用，被譽為扶正固本、滋陰補生之極品。我國歷史上《神農本草經》和《本 草綱目》等許多部藥學名著記載，人參主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、祛除邪氣，利肝明 目、益智開心，長期服用可身輕延年。現代醫學研究表明，人參具有抗輻射防腫瘤、抗氧化防 衰老、耐缺氧增強記憶、調整生理機能和增強機體免疫力、抑制血小板聚集等多種生物學活 性。目前，在人參中發現的主要有效物質有人參皂苷、有機酸及酯類、多糖、氨基酸、腺苷、 L-焦谷氨酸、維生素類、微量元素等 [16]。
[0005] 化妝品（中華人民共和國衛生部.化妝品衛生規范[S].衛生部衛生法制與監督 司編印，2002.)是以涂抹、噴灑等方法直接作用于臉部、手部等人體表面部位，用來清潔皮 膚、消除身體的不良異味的日化產品，可起到護膚、美容和治療的效果。在化妝品中添加天 然植物活性成分，不用防腐劑以及其他的化學物質，已被化妝品使用者所接受，因而受到絕 大多數消費者的歡迎 [17]。因此，開發研究天然活性成分，并將其應用到化妝品中，是當前 和未來化妝品產業可持續發展的重要方向之一。
[0006] 人參皂苷是目前人參中研究最多的活性物質，其具有抗氧化、防紫外線、保 護皮膚等作用 [18]。眾多研究表明：人參皂苷Rb^ Rb2、Rc、Rd、Re、RgpRgpRh1對體內 自由基均有不同程度的清除作用。抗氧化活性較強的人參皂苷Rb1，能恢復經戶外紫外線 (UVB)照射而導致氧化受損的角質細胞，增加其抗氧化酶的活性，可拮抗皮膚老化、促進細 胞增殖，具有抗皮膚衰老的作用。但也有很多研究表明人參非皂苷類物質也是人參的主要 活性物質之一。如人參中的精氨酸糖苷（AFG)，是精氨酸與麥芽糖經過梅拉德反應所生成的 產物以紅參中的含量為最多 [19'2°]。該成分能夠促進機體微循環，具有降低血糖、抗肥胖及 增強免疫力等多項生理作用。AFG具有抗氧化、抑制酪氨酸酶的活性，對色素沉著亦有明顯 的防治效果 [21]。AFG具有抗炎、抗過敏、保濕、改善皮膚質地、減少皺紋、保護人體皮膚細胞 的功能。它可以促進皮膚I/IV型膠原蛋白產生和透明質酸生成，促進NO的產生，從而達到 延緩皮膚衰老的作用 [22]。SOD、CAT、GSH-Px和T-AOC等共同組成了機體活性氧防御系統， 機體防御系統的重要組成部分。總抗氧化能力體現了機體的防御能力，并與衰老相關性疾 病的發生息息相關，提高總抗氧化能力可有效治療或延緩衰老 [23]。谷胱甘肽含量是衡量 衰老的重要指標，其水平高低間接反應其肝臟衰老程度，丙二醛是脂質過氧化產物，也常作 為衰老測定指標。
[0007] 將長白落葉松和長白山人參經過現代科學的處理，進行有機的結合，將會有更加 明顯的作用。以含有90%二氫槲皮素的長白落葉松提取物和富含AFG人參提取物相配合， 進行關于護膚方面研究尚未見文獻報告；本專利將揭示人參AFG提取物的方法，并公開長 白落葉松木提取物配合紅參提取物在護膚方面的作用。

【發明內容】

[0008] 本發明公開了含有AFG的紅參水提取物的制備方法。本發明揭示了紅參水提取物 配合長白落葉松提取物具有提高衰老小鼠血清中超氧化物歧化酶（S0D)、皮膚中羥脯氨酸 (HYP)及肝臟中過氧化氫酶（CAT)和還原型谷胱甘肽（GSH)的水平。降低氧化應激損傷、保 護肝臟和提高皮膚彈性以及抗衰老的效果。揭示落葉松、人參提取物對二甲苯所致小鼠的 耳廓腫脹有顯著的抑制作用，并能使其恢復到正常水平。揭示紅參水提取物配合長白落葉 松提取物對2, 4-二硝基氯苯（DNCB)誘導小鼠遲發性超敏反應（DTH)具有消除作用。
[0009] 含有AFG的紅參水提取物的制備方法，其特征在于： 紅參粉末用高濃度乙醇萃取，離心，過濾，去除上清液，得沉淀，再用水溶解，過濾，去除 不溶部分，濾液乙醇沉淀，乙醇水溶液減壓回收乙醇，離心去除沉淀，上清液過陽離子交換 樹脂，用檸檬酸水溶液洗脫，收集各部洗脫液，合并富含AFG成分洗脫液，過400Da的中空纖 維濾膜，取濾膜截留部分，冷凍干燥即得富含AFG的紅參提取物。
[0010] 本發明揭示了落葉松、人參提取物具有提高皮膚中羥脯氨酸（HYP)含量水平，具有 抗皮膚衰老作用；本發明揭示了落葉松、人參提取物對2, 4-二硝基氯苯（DNCB)誘導小鼠遲 發性超敏反應（DTH)具有消除作用，說明人參落葉松提取物具有抗炎和抗過敏作用。
[0011] 因此，長白落葉松、紅參提取物在保護皮膚和美容方面有著可觀的開發和應用價 值。
[0012] 本發明的積極效果在于：通過本方法制備得到的紅參提取物，去除其中人參皂苷 和人參多糖類物質，主要含有AFG的紅參提取物仍然具有很強的生物活性；將富含AFG的紅 參提取物配合含90%二氫槲皮素的長白落葉松提取物，提高了皮膚的抗衰老、抗炎和抗過 敏作用。
[0013] 首次公開主要含有AFG的紅參水提取物的提取方法；揭示落葉松、人參提取物具 有提高皮膚中羥脯氨酸（HYP)含量水平，具有抗皮膚衰老作用；揭示落葉松、人參提取物對 2, 4-二硝基氯苯（DNCB)誘導小鼠遲發性超敏反應（DTH)具有消除作用，說明人參落葉松提 取物具有抗炎和抗過敏作用。
【附圖說明】
[0014] 圖I AFG標準品HPLC-ELSD色譜圖 圖2富含AFG紅參提取物HPLC-ELSD色譜圖 實驗例1落葉松、人參提取物對衰老小鼠血清、皮膚和肝臟指標的影響 谷胱甘肽含量是衡量衰老的重要指標，其水平高低間接反應其肝臟衰老程度，丙二醛 是脂質過氧化產物，也常作為衰老測定指標，其含量隨衰老程度增加而增加。D-半乳糖致小 鼠亞急性衰老模型方法的優化結果對ICR小鼠進行衰老處理，AFG灌胃處理，考察落葉松、 人參提取物的抗衰老能力。
[0015] 實驗材料 試驗樣品：由實施例4與實施例5方法所得落葉松、人參混合提取物；藥物試劑：D-半 乳糖(分析純，上海楷洋生物技術有限公司），氯化鈉(化學純，北京化工廠)，超氧化物歧化 酶（SOD)及微量還原型谷胱甘肽（GSH)試劑盒購于南京建成生物工程研究所； 儀器 SpectraMax Plus384連續光譜掃描式酶標儀(美國分子儀器公司），BP2IlD。
[0016] 實驗動物 SPF級ICR J小鼠80只，2月齡，購自吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心，許可證號 為SCXK-(吉）2014-0003。飼養條件為溫度23 ±2 °C，濕度55 ±5%，所用飼料為普通飼料。
[0017] 實驗方法 將70只雄性ICR小鼠隨機分為7組，每組10只，分別命名為空白組、模型組、陽性藥 組(尼莫同片)，紅參提取物單獨組、落葉松提取物單獨組、落葉松提取物和紅參提取物混合 組1和落葉松提取物和紅參提取物混合組2。整個給藥周期中除空白組外均每天皮下頸背 部注射D-半乳糖500mg/kg使其衰老，本實驗小鼠的給藥體積（mL)為小鼠體重（g)的0.0 l 倍，給藥周期8周。陽性藥組給藥16 mg/kg、紅參提取物組給藥50mg/kg、落葉松提取物組 給藥50mg/kg、落葉松提取物和紅參提取物混合組1和混合組2分別給藥50mg/kg。
[0018] 表1血清中SOD、皮膚中HYP及肝