用于組織移植物去細胞化的方法
【專利說明】用于組織移植物去細胞化的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請US 61/794，012的權利，所述申請案全文以引證的方式并入本文中。
【背景技術】
[0003]生物醫學工程在開發可用于幫助愈合的組織的過程中面臨許多挑戰。例如，“替代”組織應促進組織再生。在這種情況下，所述新組織必須與受體組織相容以便相鄰細胞接受替代物。重要地是，替代組織應克服(或避免)通常由于向生物系統添加“外來物”而引起的免疫反應。
[0004]而且，替代組織應展示它所替代的組織的特性和功能。例如，替代組織應展示與原始組織類似的機械特性和結構特性，或至少不干擾原生環境。替代組織可作為支架和/或保持生物學特性以促進細胞再生。最后，替代組織不應刺激疤痕形成，疤痕形成會限制組織再生或抑制深層組織的天然功能。
[0005]組織工程學的一個特別具有挑戰性的實施例是制造可用于幫助切斷的神經再生的神經移植物。在直接神經修復過程中，當切斷的神經末端再接合(沒有間置移植物)時，軸突會試圖從近端神經向遠端神經重新生長。由于這個原因，在神經損傷之后，遠端神經經受被稱為華勒氏變性(Wallerian degenerat1n)的過程，其涉及神經單元(nerveelement)(包括非功能性遠端軸突及其髓鞘)的崩解和清除。部分地因為此過程，軸突碎片和髓磷脂碎片長期被認為具有減少神經再生的生長抑制作用并且可能是軸突生長的機械屏障。
[0006]大量證據表明當華勒氏變性過程被推遲時神經再生變慢了。因此，人們已普遍接受神經單元的清除改善了遠端神經的軸突生長。這個假定已被外推到神經移植并且使人相信為了促進軸突生長，也必須將細胞碎片從神經移植物移除。移除剩余的細胞物質也被認為是使組織中的病原體減到最少以及除去可能導致移植物免疫排斥的免疫原性物質所必需。因此，用于神經移植物的處理方法通常包括嚴格的去細胞化技術，甚至代價為破壞支持再生過程的細胞外基質(ECM)結構和神經移植物的完整性。
[0007]神經損傷常常導致用于直接修復的干凈末端(clean ends)的損失或由神經組織損傷而造成缺口。在該情況下，神經修復要求間置移植物來橋接缺失處并恢復神經連續性。
[0008]例如，美國專利號為7，402, 319的專利(該專利全文并入本文中)描述了一種無細胞的神經同種異體移植物，其可以恢復神經連續性并且在合適環境下可以促使神經再生。這類神經移植物經將神經組織浸泡于含有硫代甜菜堿和陰離子表面活性洗滌劑(例如曲拉通(Triton)X-200)的若干系列溶液中而獲得，所述系列溶液用于使神經組織脫去細胞。
[0009]Hudson等人申請了一種含有曲拉通X-200?、硫代甜菜堿-16和硫代甜菜堿-10的用于大鼠神經的去細胞化技術，并報告了極高的提取水平。(Hudson Tff, Liu SY, SchmidtCE.Tissue Eng.10:1346-58，2004)。然而，嚙齒動物神經含有單個神經束(簇)且嚙齒動物神經的外神經鞘與較大動物的神經的相似性較小。較大動物(例如兔、人)的大部分神經具有嵌入于膠原性內在神經外膜(圍繞神經束的結締組織)的多個神經束。人神經的鞘和束內結構是可擴張的，且對神經完整性和滲透性(包括影響組織提取的特性)具有明顯影響。因此，當應用于來自較大動物的神經時，關于嚙齒動物神經的去細胞化和提取的知識是所期望的提取的最佳提示。
[0010]總而言之，對改善組織替代物(特別是在神經組織環境中)仍有需要。經改善的組織替代物應維持它所替代的組織的原生結構和生物活性特征，包括例如層粘連蛋白活性，并且能夠在必要時結合生物活性化合物或分子以促進快速再生，并刺激組織修復和無疤痕的再生，疤痕可減低組織可動性和完整性。
[0011]發明簡述
[0012]本發明提供了用于制備組織移植物的新穎方法和組合物，所述組織移植物保持原生結構和完整性以及改善再生所需的生物學特性。
[0013]本發明的組織移植物提供了一種天然替代組織或可通過簡單制備步驟獲得的移植物。本發明的方法特定地破壞免疫原性細胞組分而不會顯著改變天然細胞外結構。有利地，組織保持促進移植物中細胞再生的生物學特性。原生細胞外基質(ECM)的結構被保持，具體地說，在神經移植的情況下，基膜和神經內膜/內皮細胞層保持天然和通常的原始結構。
[0014]因此，在一個實施例中，本發明提供了一種神經移植物，其支持軸突再生、引導軸突朝向遠端神經末端并且免疫耐受。無細胞神經移植物可以是例如，同系移植物、自體移植物、同種異體移植物或異種移植物。
[0015]在一個實施例中，本發明提供了一種制備組織替代物的方法，所述方法包括以下步驟:在沒有任何離子型洗滌劑的情況下(包括任何陰離子洗滌劑)，在包含至少一種兩性洗滌劑的溶液中洗滌替代組織，然后在緩沖鹽的系列溶液中洗滌替代組織以除去多余的兩性洗滌劑。這個方法比當前技術的方法更簡單更便宜，且得到具有更好的處理特性和更好的促進再生特性的替代組織。
[0016]在一個特定實施例中，根據本發明使用的兩性洗滌劑是硫代甜菜堿-1O(SB-1O)和/或硫代甜菜堿-16 (SB-16)。
[0017]本發明還提供一種去細胞化替代組織。在一個實施例中，替代組織可以形成為縫合處、管、片、膜或支架的一部分，以遞送到受體。優選地，替代組織保留了在移植到受體之后促進再生和/或不引起免疫反應的生物組分。
[0018]在另一個實施例中，本發明提供了用于組織替代的試劑盒，其包含去細胞化替代組織。該試劑盒還可包括一或多種用于使本發明的替代組織再懸浮的溶液，例如藥理學可接受的緩沖無菌生理鹽水溶液。此外，所述試劑盒還可包括一小瓶具有細胞或其他活性劑的溶液，其可被加入以促進組織再生(例如，施萬細胞(Schwann cell)和/或細胞因子)。所述試劑盒可進一步包括說明書或小冊子，給用戶提供所述無細胞替代組織的詳細說明。
[0019]在一個特定實施例中，本發明提供了一種移植物，其支持軸突再生、引導軸突朝向遠端神經末端并且免疫耐受。在一個實施例中，所述移植物是神經移植物。移植物可在去細胞化之前被冷凍，然后儲存并擱置以冷凍使用。另一個實施例是用于不要求冷凍保藏的特別應用而制備神經移植物；在那種情況下，可使溫度降低或升高，這取決于使用前儲存移植物的溶液，例如包括一或多種防腐劑和/或抗微生物劑。
[0020]在一個實施例中，支持再生的移植物還可包括幫助抑制受體對移植物植入的免疫反應的一或多種物質。例如，本發明的移植物可包括佛波酯佛波醇豆蔻乙酸酯(phorbolester phorbol myristate acetate,PMA)以在⑶4+T細胞介導的免疫反應減少的情況下促進移植物植入。
【附圖說明】
[0021]圖1蘇木紫和曙紅染色的兔神經組織(對照物；圖Α)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0022]圖2Hoescht染色的兔神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0023]圖3S-100免疫染色的兔神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0024]圖4蘇丹黑染色的兔神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0025]圖5NAP-4神經絲染色的兔神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0026]圖6層粘連蛋白免疫染色的兔神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3 ;圖C)。
[0027]圖7蘇木紫和曙紅染色的人神經組織(對照物；圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2 ;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3 ;圖C)。
[0028]圖8Hoescht染