專利名稱：細胞移植物的制備的制作方法
技術領域：
本發明關于一種供制備“異體細胞-制備-組織工程”移植物的方法及通過該方法所制備的產物。
背景技術：
間葉干細胞(MSCs)，亦稱為多能性基質細胞，此類細胞已知可自我再生并分化成各種不同的間葉及非間葉組織，并且于臨床應用上已成為前景可期的工具，例如成骨不全癥的細胞療法(Horwitz et al., Nat Med5，309-313，1999);軟骨及骨骼的組織工程(Caplan, Tissue Engll，1198-1211，2005);以及預防有害的心臟重塑及改善恢復率的心臟療法(Pittenger and Martin, Circ Res95,9-20, 2004)。使用源自單一健康的供給細胞的MSCs所制備的“現成”產品，在患有移植物對抗宿主疾病及克隆氏癥的病患中，已在兩個第III期研究中證實了其安全性(//www.clinicaltrails.gov/)。再者,對于急性心肌梗塞病患施予異體MSCs也被報導可改善射出率(EFs) (Hare JM, et al.，JAm Coll Cardiol.54 (24):2277_2286，2009)。因此，在治療患有心血管疾病的病患時，源自健康供給者的異體MSCs，可作為一“廣用的供給細胞”。人類、狒狒、及鼠類的MSCs的免疫抑制特性也在活體外及活體內被報導，其中對于具免疫力的狒狒，將異體MSCs應用于延長皮膚異體移植物的存活率(Bartholomew et al., ExpHematol.30 (I):42_48，2002)，以及對于人類應用于減緩移植物對抗宿主疾病(Le Blancet al., Lancet.363 (9419):1439_1441，2004)。然而，許多研究證實 MSCs 本質上并非免疫豁免的，且于具免疫力的MHC不匹配的接受者會對于異體MSCs產生排斥反應(Nauta etal，Bloodl08 (6):2114-2120,2006 ；Spaggiari et al.,Blood.107 (4):1484-1490，2006 ;Eliopoulos et al.，Bloodl06 (13):4057_4065，2005)。因此，使用 MSCs 進行異體移植仍充滿爭議性。

將MSCs于低氧環境下培養，稱作低氧MSCs。相較于培養于正常氧環境下(約為20-21%02)的MSCs(稱作正常氧的MSCs)，低氧MSCs會分泌更多的血管新生細胞激素及生長因子(Hung et al.,Stem Cells25(9):2363_2370，2007)，并且該源自低氧 MSCs 的條件培養基可被用于刺激傷口的治愈(Yew et al., Cell Transplant.,011)及骨折的治愈(Wangetal., J Tissue Eng Regen Med.,2011)。此外,Savant-Bhonsale及Smita揭露一種以低氧環境(介于約2.5%至約5%的氧氣(O2))促進神經干細胞(NSCs)生長的方法及組合物，該低氧環境較傳統細胞培養技術培養環境的含氧量低(US20070264712A1)。據Hung等人報導，MSCs于含0.05%至15%02的低密度及低氧環境下培養(較佳介于約1%至約7%的氧氣)，在此被稱為低氧及低密度的MSCs(10至4000MSCs/cm2)。相較于正常氧的MSCs，低氧及低密度的MSCs可降低復制性衰老、增加增生率及分化潛能(US20110129918A1)。再者，當將該低氧MSCs移植入免疫缺陷小鼠的顱蓋缺陷處，該等低氧MSCs可促進缺陷的修復。經移植后，低氧及低密度MSCs也可促進細胞的遷移及移植至遠程(Hung et al.,PLoS One.25):e416, 2007)。然而，對于如何解決排斥的問題仍尚未被提及。

發明內容
本發明關于一種通過將細胞培養于低氧或缺氧環境下降低異體細胞的排斥反應的新穎方法。在一方面，本發明提供一種適合移植至個體的細胞移植物，其為包含具有NK配體表達量減少的非天然生成的細胞。另一方面，本發明提供一種制備當移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應的細胞移植物的方法，其包含將至少一種自捐贈者分離的細胞培養于介于0%至約7%氧氣的低氧環境下。于本發明一優選具體實施例中，該低氧環境介于0%至約2.5%的氧氣。在本發明的一實施例中，該低氧環境為約1%的氧氣。另一方面，本發明也提供一種通過上述方法所制備的細胞移植物。根據本發明，所得細胞移植物仍保留早期干細胞特性、維持正常的核型、且經移植后不會形成腫瘤。


閱讀本發明時參考所附附圖以及具體實施方式
將可更加了解前述的內容。在附圖中所呈現的具體實施例為優選的示例，僅供說明本發明的目的。應該理解的是，本發明不受所述的具體實施例所局限。附圖:圖1A-圖1C提供正常氧(Nor)及低氧(Hyp)間葉干細胞(MSCs)的特性，其中源自B6(圖1A)及Balb/c (圖1B)的MSCs以表面標記物的表達現象特征化；及(圖1C)顯示源自兩種老鼠品系的MSCs對于成骨性細胞系的誘導(21天)、脂肪形成細胞系的誘導(21天)及軟骨細胞系的誘導(21天)的分化能力，該分析是分別以茜素紅S、油紅O、及愛爾新藍染色法分析(比例尺=50 μ m)。茜素紅S、油紅O、及愛爾新藍染色的定量分析分別于550nm、510nm波長以光學密度測量及陽性區域測量。圖2A-圖2B提供在異體的及自體的移植中，低氧MSCs對于改善肢干缺血的效用，其中將帶有左側股動脈阻斷的Balb/c小鼠以1.m.注射方式，在股薄肌中無注入(無細胞)或注入1父106正常氧8610^ (Nor B6 ;異體的)、低氧B6MSCs (Hyp B6 ;異體的)、正常氧Balb/c MSCs (Nor Balb/c ;自體的)、低氧 Balb/c MSCs (Hyp Balb/c ;自體的)、或 Balb/c小鼠胚胎的纖維母細胞(MEF Balb/c)。圖2A摘要在第28天所述動物的肢干狀況；以及圖2B顯示不同時間周期的血液灌流指針(**p〈0.0lvs.No cell, ##p<0.0lvs.Nor B6)。圖3A-圖3C提供低氧MSCs對于減少肌肉退化及纖維化，以及增加缺血肢干的血液灌流量的功效，其中圖3A顯示，通過HE染色所測量的肌肉損失區域的定量分析；圖3B顯示，通過梅生三色染色的肌肉纖維化區域的定量測量；以及圖3C顯示，以抗⑶31抗體進行的免疫組織化學法，測量第28天缺血性肢干樣本的⑶31+微管密度的定量分析(*p〈0.05及**p〈0.0lvs.No cell, #p<0.0 5 及 ##p<0.0lvs.Nor B6)。圖4A-圖4D顯示經移植后的28天，低氧MSCs存活情形，其中將帶有左側股動脈阻斷的Balb/c小鼠以1.m.注射方式,在股薄肌中無注入(Nocell)或注入IX IO6與BrdU結合的正常氧B6MSCs (Nor B6 ;異體的)、低氧B6MSCs (Hyp B6 ;異體的)、正常氧Balb/c MSCs(Nor Balb/c)、或低氧Balb/c MSCs (Hyp Balb/c ;自體的)；在28天后米收缺血性肢干的樣本，其中圖4A顯示使用抗BrdU抗體的免疫熒光染色；以及圖4B-4D分別顯示使用抗BrdU及⑶31 (圖4B)、α-平滑肌肌動蛋白(圖4C)、及肌間線蛋白(desmin)(圖4D)的雙重免疫熒光染色。圖5A-圖5F顯示低氧MSCs降低供NK活化及NK所媒介的裂解的配體表達，其中圖5A顯示以抗NKp46抗體分析第28天(左圖)及以抗DX5抗體分析第7天缺血性肢干樣本(右圖)的免疫熒光染色的統計結果，其中該缺血性肢干樣本是源自將小鼠注入106B6正常氧 MSCs (Nor B6)、B6 低氧(Hyp B6)、Balb/c 正常氧 MSCs (Nor Balb/c)、或 Balb/c 低氧MSCs (Hyp Balb/c) (**p<0.0lvs.Nor B6);圖 5B 顯示以抗 CD4、CD8、CD14、CD86、或 TCR α β抗體分析第7天缺血性肢干樣本的免疫熒光染色的統計結果，其中該缺血性肢干樣本是源自將小鼠注入106Β6正常氧MSCs (Nor Β6)、Β6低氧(Hyp Β6)、Balb/c正常氧MSCs (NorBalb/c)、或 Balb/c 低氧 MSCs (Hyp Balb/c) (**p<0.0lvs.Nor B6);圖 5C 顯示肢干狀況(上圖)及所指時間周期的血液灌流比率(下圖)，其中帶有阻斷的左側股動脈的Balb/c小鼠，在第28天經以106B6正常氧MSCs及左圖所指的抗體一同注入小鼠中，以及帶有阻斷的左側股動脈的B6小鼠，于第28天經以106Balb/c正常氧MSCs及右圖所指的抗體一同注入小鼠中；圖5D顯示于所指細胞中H60c相對于GAPDH (1(T4)、nectin-2相對于GAPDH (1(Γ4)、Pvr相對于GAPDH (1(Γ3)、及Rael相對于GAPDH (1(Γ4)的mRNA量的定量RT-PCR分析結果(**p<0.0lvs.Nor B6, ##p<0.0lvs.Nor Balb/c);以及圖 5E 顯示于 B6 及 Balb/c MSCs 中H60c、nectin-2、Pvr、及Rael的mRNA量的定量RT-PCR分析結果，其中該等細胞是以IO4/cm2密度培養并接觸低氧環境(1%02) 48小時(#ρ〈0.0lvs.0h);以及圖5F顯示經共同培養4小時后，NK細胞對于不同E:T比率的MSCs的細胞毒性活性，其中在將NK細胞與MSCs共同培養前，先將NK細胞擴增5天且未·與(左圖)或與(右圖)IL-2處理。圖6A-圖6F顯示正常氧的B6MSCs及抗NK配體抗體的抗體中和反應，以抑制NK媒介的裂解及改善其增強血液灌流的效果，以及恢復缺血性肢干的肌肉結構，其中圖6A顯示NK細胞的細胞毒性活性，其中先將其與IL-2培養擴增5天，再與不同E:T比率的MSCs —同培養4小時；圖6B及6C顯示將帶有左側股動脈阻斷的Balb/c小鼠，以1.m.注射方式，注入106B6正常氧的MSCs，該MSCs先與同型抗體或抗所指配體的抗體進行前處理30分鐘；其中圖6B提供于所指時間周期的血液灌流指針，以及圖6C提供通過H.E.及梅生三色染色的肌肉損失區域及肌肉纖維化區域的定量測量結果；圖6D-6F提供以抗NKp46 (D)、H2Kb
(E)抗體的免疫熒光的統計結果、及抗H2Kb及⑶31、H2Kb及a-SMA或H2Kb及肌間線蛋白
(F)的雙重免疫熒光的統計結果(所示為經免疫染色的細胞密度，*p〈0.05廣p〈0.0lvs.同型IgG)。圖7A-圖7C顯示人類MSCs培養于低氧環境下時，會降低人類NK配體的表達現象。在本發明中，將人類MSCs以5X103MSCs/cm2密度種入，并將一半的細胞分別于正常氧環境或暴露在低氧環境下(1%02)連續培養48小時。以定量RT-PCR分析兩個NK配體(PVR及 ULBP3)的 mRNA 量(**p〈0.0lvs.同型 Nor)。圖8A-E顯示相較于正常氧(Nor)MSCs，缺氧及低氧MSCs (0%、1%、2.5%、7%氧環境)于異體接受小鼠中會降低NK累積現象，其中圖8A顯示H60c相較于GAPDH(1(T4)的相對表達現象；圖8B顯示nectin-2相較于GAPDH (10_4)的相對表達現象；圖8C顯示Pvr相較于GAPDH (10_3)的相對表達現象；圖8D顯示PVR相較于GAPDH (10_2)的相對表達現象；及圖8E 顯示 ULBP3 相較于 GAPDH(1(Γ3)的相對表達現象(*ρ〈0.05，**p<0.0lvs.Nor B6)。
具體實施例方式除非另有定義，在說明書中所使用的所有技術性及科學性術語，對于本技術領域技術人員具有相同意義。除非文中有清楚指出，否則本文中所使用的“一”;“該”單數形式包含復數形式。因此，例如當提及“一樣本”時，對于所屬領域技術人員可推知包含復數個該等樣本及其同等物。本發明所使用的“間葉干細胞”或“MSCs”乙詞，也可稱作“多能性基質細胞”或“多能性干細胞”，是指該等干細胞可分化成各種不同的細胞類型，包含間葉組織的細胞及非間葉組織的細胞，像是成骨細胞(骨細胞)、軟骨細胞(軟骨細胞)、及脂肪細胞(脂肪細胞)。該間葉干細胞或MSCs可衍生自骨髓、或其它非骨髓組織，像是臍帶血、脂肪組織、成體的肌肉、臍帶或羊膜、脫落的嬰兒牙齒的牙髓等。在本發明中，該MSCs源自哺乳動物，優選為分離自人類。本文所使用的“低氧” 一詞是指一種低氧環境，其氧氣量低于周遭氧氣環境或低于傳統用于細胞培養技術的氧氣環境(約20%-21%氧氣)。在本發明的一具體實施例中，該“低氧環境”是低于7%氧氣，優選介于0%至約7%氧氣，更優選介于0%至約2.5%氧氣，以及進一步優選約為1%氧氣。此外，本文所使用的“缺氧”一詞是指一種完全將氧氣排除(0%02)的含氧環境系，其為一種低氧環境或少氧環境的極端環境。

本發明所使用的“正常氧”一詞是指周遭氧氣環境約為20%_21%氧氣，其傳統上常用于細胞培養技術中。本發明所使用的“個體” 一詞是指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包含但不限于靈長類、有蹄類、犬類及貓類。本發明意外地發現相較于培養于正常氧環境下(例如介于20%至20%)的MSCs，培養于低氧環境下的MSCs能表達相對較低的NK配體。更意外的是，此種細胞成功地在小鼠模式中修復了肢干缺血癥且未引發移植的排斥反應，其對于使用異體細胞于細胞或移植的治療方法所引起的長久以來的問題提供了一種具有潛力的解決方案。因此，本發明提供一種適合移植至個體的細胞移植物，其為包含具有NK配體表達量減少的非天然生成的細胞。此處所提供的細胞移植物移植至個體時可產生低排斥反應或不產生排斥反應。“自然殺手細胞”或“NK細胞”為一種對于先天免疫系統十分重要的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞的角色類似于脊椎動物中后天免疫反應的細胞毒性T細胞。NK細胞對于病毒感染的細胞提供快速反應，且對于腫瘤形成也有反應。免疫細胞典型地會偵測受感染細表面所呈現的MHC，并引起細胞激素的釋放以造成細胞裂解或細胞凋亡。NK細胞則有別于典型的免疫細胞，因其具有在無抗體或MHC存在下辨識受壓細胞的能力，而能提供較為快速的免疫反應。本文所使用的“NK配體” 一詞是指任何可與NK激活受體交互作用的分子或物質，且其一旦交互作用，即可引發細胞毒性及淋巴激因子的釋放。根據本發明，NK激活受體的例子為DNAMl及NKG2D。可與該受體交互作用并用于本發明的NK配體包括，但不限于，H60c、nectin-2PVR、ULBP3、其類似物及其組合。H60c是一種具有二個細胞外區域的MHC I類分子，且其為NKG2D受體的配體。Nectin-2或PVRL2 (脊髓灰質炎病毒受體相關分子_2)，又稱為⑶112 (分化群112)，是一種具有兩個Ig類C2型區域及一個Ig類V型區域的第I型單次跨膜醣蛋白。該蛋白為黏合連接(adherens junctions)的一種細胞膜成分。該蛋白也作為某些突變株的皰疹病毒和偽狂犬病毒的入口，且參與此類病毒在細胞間的傳播。PVR (或小鼠的Pvr)，又稱為⑶155 (分化群155)，是一種在免疫球蛋白超家族的人類第I型跨膜醣蛋白。由于其在靈長類中，參與細胞的脊髓灰質炎病毒的感染，故常稱為脊髓灰質炎病毒受體(Poliovirus Rec印tor，PVR)。CD155正常的細胞功能是在上皮細胞間建立細胞間的黏合連接。ULBP3,又稱為NKG2D配體3 (相對于NK細胞激活受體NKG2D)，是一種在人類中受壓力而引發的配體。根據本發明，“表達量減少”用于NK配體的表達時將包含下列情況:非天然生成的細胞所表達的標記(NK配體)少于天然生成的細胞或于傳統培養技術下培養的細胞所表達者。舉例而言，“表達量減少”可能指人體內一細胞或培養于正常環境下的細胞的表達量的80%,較佳為60%，還要更佳為50%，甚至更佳為20%。應可理解的是，該標記的表達可由任何本發明所屬技術領域中具有通常技藝者所知的任一技術而抑制。舉例而言，該表達可通過基因干擾或刪除而抑制或消除。在本發明的一具體實施例中，細胞被培養于低氧環境下(例如，介于0%至約7%氧氣)并于細胞密度達到一半或全滿時回復，使得其與正常氧量環境下(例如，含有20%至21%氧氣)培養的細胞相較，NK配體的表達量減少。在本發明優選的具體實施例中，該低氧環境為1%02。本發明中不可預 期地發現MSCs在任何密度下，無論是高密度或低密度皆可用于本發明的方法，此點與公開于US20110129918A1發明中所述的具可專利的特征在于低密度10至4000MSCs/cm2不同。本發明的一實例中采用50細胞/cm2密度。于另一實例中采用5X IO3 至 104 細胞/cm2。本發明的實例中證實，相較于異體正常氧的MSCs，異體低氧MSCs可改善在弱化的肢干缺血的治療效果，以及該效果與自體低氧MSCs效果相似。根據本發明的異體低氧MSCs于具免疫力的接受小鼠中，可透過抑制NK配體的表達，像是在NK細胞上與DNAMl及NKG2D有關的配體，以及降低NK補充的誘發及細胞毒性而增加移植能力。該細胞成長為CD31+的內皮細胞及a SMA+及desmin+肌肉細胞，因而促進血管新生及抑制肌肉纖維化，此意指本發明的低氧MSCs為本質上免疫豁免的,且可作為“廣用的供給細胞”用于治療心血管疾病。與造血干細胞(HSCs)或其它骨髓移植物相似，已知MSCs于異體接受者體內也會被NK所媒介的裂解反應所排斥；然而，本發明的低氧MSCs(其通過將MSCs培養于低氧環境中而得)可降低NK配體的表達，以及抑制NK細胞的補充及細胞毒性，因而可增強存活的能力以及增強移植入異體接受者的組織中的能力。在本發明中，用于細胞療法的本發明的異體低氧MSCs已在具免疫力動物模式中測試過(可作為臨床前研究)，結果顯示該異體低氧MSCs的治療潛力及免疫優點，像是用于治療嚴重的缺血性疾病。結果顯示本發明異體的缺氧MSCs仍保留早期干細胞特性，維持正常的核型，且經移植后將不會形成腫瘤。因此，根據本發明將MSCs培養于低氧環境中，可用于異體移植。因此，另一方面，本發明提供一種制備當移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應的細胞移植物的方法，其包含將至少一種自捐贈者分離的細胞培養于介于0%至15%氧氣的低氧環境中，優選為介于0%至約7%氧氣,進一步優選為介于0%至約2.5%氧氣。在本發明的一實例中，該低氧環境約為1%氧氣。可理解的是，根據本發明用于細胞移植物的至少一種細胞可依據目標移植位置而決定。適合用于本發明的細胞包含，例如，各種可自我更新及分化的干細胞。本發明的一優選具體實施例是使用間質干細胞(MSC)。根據本發明，至少基于下述的理由，低氧MSCs可作為其中一種用于治療性血管新生的細胞來源，以治療缺血性疾病:(I)相較于成體骨髓或周邊血液的內皮前驅細胞的有限數量，本發明的細胞可提供無限量的具功能的內皮及肌肉細胞以用于臨床應用中。再者，該內皮細胞或前驅細胞通常具有有限的增生能力，因此，要增殖至足以進行移植的細胞數量仍是一難題；相反的，本發明的低氧MSCs具有可延伸的自我再生活性，且可無限制地增殖。(2)相較于正常氧的MSCs，本發明的低氧MSCs于活體內顯示低免疫原性，且對于免疫排斥反應的感受性較低。因此，本發明的低氧MSCs及其衍生物適于異體移植。目前試驗證實于低氧環境增殖的MSCs可降低NK配體的表達現象，以及抑制NK細胞的補充及細胞毒性，因而促進存活能力及增強移植入異體接受者的組織中的能力。本發明還進一步提供通過上述方法所制備的細胞移植物。實例材料及方法 MSC單離、特征及培養MSCs是取自兩近交品系的小鼠:C57BL/6J(B6)及Balb/c。以頸椎脫臼法犧牲4-6周齡的公鼠。將股骨及脛骨移除，將所有結締組織清除干凈，并將其置于5mL添加有I X青霉素/鏈霉素的a-MEM中，并置于冰上。將所有的脛骨及股骨末端處剪斷以暴露出骨髓，將其插入準備好的離心管，并于400g離心I分鐘以收集骨髓。將沉淀物于3mL完全培養基(CM:添加16.6%胎牛血清(FBS)的a-MEM、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素)中重新懸浮，并以21號注射針，透過70-μ m的尼龍篩網進行過濾。將源自每一長骨的細胞置于IOcm培養皿中內含40mL CM。經24小時后，以磷酸緩沖生理食鹽水(PBS)移除無貼附的細胞，再加入IOmL的新鮮CM。經約2周培養后，附著細胞達到接近長滿狀況(第O代)，并以PBS清洗，接著以4mT,的0.25%膜蛋白酶/ImM乙二胺四乙酸(EDTA ；Invitrogen, Carlsbad, CA)于37° C作用2分鐘來分離細胞。接著將細胞以50cellS/cm2密度種入CM中進行增殖，并每10天進行繼代一次(第I至4代)。用于本研究的細胞為第2至4代。進行低氧培養時，將細胞培養于混合氣體中，該混合氣體是由94%凡、5%0)2及1%02所組成。為了維持低氧的混合氣體，使用帶有2個空氣傳感器的培養箱，一個測量CO2以及另一個測量O2 ;使用氮氣(N2)輸送系統以達到及維持氧氣濃度，該氮氣是由一液體的氮氣桶或含有純氮氣的桶生成。若氧氣百分比升至高于所需要的程度，則氮氣會自動地注入系統中以替換掉過多的氧氣。MSCs 的特征
為了分析細胞表面的典型的標記蛋白表達現象，以含有5mM EDTA的PBS收獲MSCs。將細胞與FITC共軛結合的抗鼠Sca-1、CDllb、CD31、CD34及CD45、與PE共軛結合的抗鼠CD29、CD44、及CD105作用。匹配的同型抗體作為控制組(Becton Dickinson, SanJose, CA)。準備10，000個被標記的細胞，以及使用FACScan流式細胞儀，及使用CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析。為了進行活體外的成骨細胞分化及脂肪細胞分化,將細胞以104/cm2密度種入，并以成骨細胞誘導培養基(0頂由添加10%FBS (Gibco)的a-MEM(Gibco, Carlsbad, CA)、ICT8M 地塞米松(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)、IOmM β -憐酸甘油(Sigma-Aldrich)及50 μ M抗壞血酯_2_磷酸鹽(Sigma-Aldrich)所組成),及脂肪細胞誘導培養基(AM由添加10%FBS的a -MEM、1(Γ7Μ地塞米松、50 μ M引朵美灑辛(Sigma-Aldrich)、0.45mM3-異丁基-1-甲基-黃嘿呤(Sigma-Aldrich)及 10 μ g/mL 膜島素(Sigma-Aldrich)所組成)分別進行誘導3周。待分化的型態特征出現后，將以OIM及AIM處理的細胞，分別以茜素紅S (ARS)及油紅O染色。為了將分化進行量化，分別將ARS及油紅O染劑萃取以進行于0D550nm及510nm的光學測量。為了進行活體外的軟骨細胞分化，將2.5X IO5細胞沉淀收集，并于軟骨細胞誘導培養基(CM由添加10_7M地塞米松的無血清a-MEM、l%(vol/vol)ITS、50 μ M抗壞血酯_2_磷酸鹽、ImM丙酮酸鈉、40 μ g/mL (wt/vol)脯氨酸及10ng/mL(wt/vol) TGF-β I (R&D systems, Minneapolis, MN)所組成)中連續培養 3 周。將以 CIM誘導的細胞進行愛爾新藍染色。缺血性肢干模式

動物研究計劃經陽明大學的動物中心委員會審閱及同意。在本試驗中使用6周齡的Balb/c公鼠。使用麻醉劑(xylazine)及麻醉劑(ketamine)進行常規的麻醉,從膝蓋朝向大腿內側造成一皮膚切口，接著將皮下脂肪組織移除以顯現其下位于靠近腹股溝近端的股動脈。接著將股動脈于股中段進行雙重打結，并摘除長度5_的股動脈。經切除后立即將在100 μ LPBS中的IO6培養增殖后的MSCs注入(1.m.)后肢的股薄肌中。肢干灌流的評估遂進行如先前研究所述的激光多普勒成像分析(Choi et al.,J Biol Chem.2004 ；279 (47)，49430-49438)。使用激光多普勒灌流成像(MoorInstruments, Devon, UK)以進行一連串非侵入性的新血管形成的生理評估。小鼠于治療后第0、3、7、14、21、及28天，通過一連串掃描以監測后肢的表面血流。分析該數字彩色編碼的影像以量化從膝關節至腳指間區域的血流量，計算平均灌流值。免疫組織化學法及免疫熒光法為了進行免疫組織化學法，將石蠟包埋的切片進行脫蠟，復水及通過將切片置于Declere作用溶液(Cell Marque, Austin, TX)中，并置于微波爐中20分鐘，以使抗原復性。以3%過氧化氫阻斷內生性過氧化酶活性。以PBS清洗以移除殘留的酵素活性，并以 UltraV Block (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA)作用 5 分鐘將非專一性染色阻斷。接著將切片以一級抗體(抗⑶31, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA)于4° C進行隔夜反應，以PBS大量沖洗，再以相對應的生物素化的二級抗體(VectorLaboratories,Burlingame,CA)在室溫反應15分鐘,接著以卵白素-過氧化酶(LSAB Kit ；Dako, Carpinteria, CA)處理,接著進行二氨基聯苯胺染色。以Mayer’s蘇木素進行對比染色。為了進行免疫熒光法，將切片以4%三聚甲醛固定，并以一級抗體進行反應，再以含有0.l%Triton X-1OO的PBS大量沖洗，再以相對應的DyLightTM488或DyLightTM594共軛結合的二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)作用，接著以DAPI進行對比染色。使用熒光顯微鏡觀察免疫熒光。定量RT-PCR使用TRIzol作用劑(Invitrogen)單離細胞的總RNA，并將2μ g的總RNA在20 μ L溶液中進行反轉錄，其中使用了 3 μ g的隨機引子及200U的Superscript IIIRT (Invitrogen)0于總體積為25 μ L溶液中進行增幅反應，該溶液中含有0.5 μ M的引子、12.5μ 的 LightCycler - FastStart DNAMaster SYBR green I (RocheIndianapolis, IN)及 10 μ L1:20 稀釋的 cDNA。以 LightCycler480 實時 PCR 系統進行 PCR反應。使用LightCycIer480軟件版本1.5.0 (Roche)進行每個mRNA表達現象的量化，并經常態性基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正規化。引子對的序列列于表I中。表1.用于定量PCR的引子對
權利要求
1.一種適合移植至個體的細胞移植物，其特征在于，包含具有NK配體表達量減少的非天然生成的細胞。
2.根據權利要求1所述的細胞移植物，其特征在于，當所述細胞移植物移植至個體時可引發低排斥反應或不引發排斥反應。
3.根據權利要求1所述的細胞移植物，其特征在于，所述NK配體是選自由H60c、nectin-2、PVR、ULBP3、其類似物及其組合所組成的群組中的一個。
4.根據權利要求1所述的細胞移植物，其特征在于，所述的細胞是培養于介于0%至7%氧氣的低氧環境下。
5.根據權利要求4所述的細胞移植物，其特征在于，所述低氧環境介于0%至2.5%。
6.根據權利要求5所述的細胞移植物，其特征在于，所述低氧環境為1%。
7.根據權利要求1所述的細胞移植物，其特征在于，所述異體細胞移植物。
8.根據權利要求1所述的細胞移植物，其特征在于，所述的細胞為間質干細胞(MSC)。
9.根據權利要求8所述的細胞移植物，其特征在于，所述的細胞保留早期干細胞特性、維持正常的核型、且于移植后不會形成腫瘤。
10.一種制備當移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應的細胞移植物的方法，其特征在于，包含將至少一種自捐贈者分離的細胞培養于介于0%至約7%氧氣的低氧環境下。
11.根據權利 要求10所述的方法，其特征在于，所述的細胞移植物為異體細胞移植物。
12.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的至少一種細胞為MSC。
13.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述低氧環境介于0%至約2.5%氧氣。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述低氧環境為約1%氧氣。
15.—種通過權利要求10-14中任一項所述的方法所制備的細胞移植物。
全文摘要
本發明關于一種適合供移植或細胞治療的細胞移植物及其供治療疾病的用途。具體而言，此處所提供的移植物能克服當移植至一病患時所伴隨的排斥反應，其對于使用異體細胞的情況由于有益。本發明還進一步提供一種通過在低氧或無氧環境下培養至少一種細胞而制備所述移植物的方法。
文檔編號C12N5/0775GK103194426SQ20121059180
公開日2013年7月10日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年1月5日
發明者洪士杰, 姚道禮, 黃緯華 申請人:臺北榮民總醫院