苯甲酰多羥基環己烯在制備藥物組合物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥學領域，涉及苯甲酰多羥基環己烯在制備藥物組合物中的用途，具 體涉及在制備抗外泵耐藥金葡菌協同作用的藥物組合物中的用途；尤其是苯甲酰多羥基環 己烯在制備對外泵型耐氟喹諾酮類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 耐甲氧西林金黃葡萄球菌（Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus，MRSA)為醫院內最常見的傳染病菌之一。如今，MRSA對所有內酰胺類抗生素如青霉 素等藥物都具有耐藥性，而且對大環內酯類，氟喹諾酮類，四環素類等抗生素也都產生了耐 藥性，這使得它的感染變得更加難以治療。目前，可用于治療MRSA的抗生素只有萬古霉素， 然而不幸的是，2002年在美國已經出現了完全抗萬古霉素MRSA菌株。近年來，我國由于抗 生素廣泛的使用，甚至是濫用，特別是在萬古霉素成為多家醫院常規抗生素類用藥之后，這 一形勢變得愈加嚴峻。除了通過采取限制濫用抗生素的相關措施以減緩耐藥MRSA增長的 速度外，同時必須加速研發新的抗耐藥MRSA藥物，以防現有的抗菌藥物無法起作用時，出 現細菌的大規模爆發。
[0003] 細菌耐藥性（DrugResistance)的產生具有多種原因，其中細菌對藥物產生外排 作用而導致的外泵（efflux)耐藥性是最重要的耐藥性機制之一。根據世界衛生組織的報 告，具有多藥耐藥外排泵的細菌引起的感染已經占到了院內感染的60%。
[0004] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有多種耐藥機制，除了具有染色體為40kb的耐 藥基因（mecA)通過編碼甲氧西林接合蛋白（PenicilinBindingProtein，PBP)產生 對(6-內酰胺類抗生素的耐藥性之外，還對多種類型抗生素產生耐藥性。對氟喹諾酮類 (fluoroquinolones)通過過度表達NorA[1]外泵蛋白產生耐藥性。細菌細胞通過外排泵 將普遍使用的絕大多數抗生素泵出細胞外，使細胞內的抗生素濃度降低而無法起到抗菌作 用。
[0005] 諾氟沙星是一種氟喹諾酮類抗生素，1986年開始被用于臨床[2]。因它對革蘭氏陽 性菌及革蘭氏陰性菌，尤其是金黃色葡萄球菌，具有較強的抑制作用而廣泛用于尿道、呼吸 道等的抗感染治療 [3]。也正因為諾氟沙星在臨床及畜牧業的廣泛應用，細菌對其產生了嚴 重耐藥性，從而限制了諾氟沙星的應用[4]。產生耐藥性的機制多樣，其中之一便是細菌外排 泵 [2,5]。因此，選擇具有NorA外泵基因的MRSA細菌株作為外泵抑制劑的篩選靶標是尋找具 有外泵抑制作用的抗耐藥金葡菌抗生素增敏劑的一種重要途徑。
[0006] 本申請的發明人，擬通過使用天然成分EllipeiopsolB和Zeylenol分別與諾氟沙 星配伍成組合藥物，使降低諾氟沙星的最低抑菌濃度，對諾氟沙星產生抗耐藥金葡菌的增 效作用。
[0007] 于本發明相關的現有技術有：
[0008] [1]Guay, GG, etal. The Tet(K)Gene of plasmid PT181 of Staphylococcus aureus encodes an efflux protein that contains 14 transmenbrane helices. Plasmid. 1993, 30 (2) : 163-166.
[0009] [2]BeardenDT,DanzigerLH.Mechanismofactionofandresistanceto quinolones.Pharmacotherapy2001, 21:40-61.
[0010] [3]Holmes,B,etal.Norfloxacin.Drugs. 1985, 30 (6) :482-513.
[0011] [4]MarkhamPN,NeyfakhAA.Inhibitionofthemultidrugtransporter NorAInStaphylococcusaureuspreventsemergenceofnorfloxacinresistance. AntimicrobialAgentsChemotheropy. 1996,40(11):2673-2674.
[0012] [5]HooperDC.Emergingmechanismsoffluoroquinoloneresistance.Emerging InfectiousDiseases. 2001, 7:337 - 341.。

【發明內容】

[0013] 本發明目的是提供苯甲酰多羥基環己烯在制備藥物組合物中的用途，具體涉及在 制備抗外泵耐藥金葡菌協同作用的藥物組合物中的用途；尤其是苯甲酰多羥基環己烯在制 備對外泵型耐氟喹諾酮類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)藥物中的用途。
[0014] 本發明的組合物中增效成分為具有苯甲酰基多基取代環己烯類化學結構，根據結 構中羥基和苯甲酰基構型取向不同，具有四個異構體；
[0015]
[0017] 本發明通過下述分離，鑒定方法確認化合物
[0018] 胡椒屬植物萎葉（Piperspp.)紫玉盤屬植物（Uvariaspp.)分別用95%乙醇提 取物的氯仿萃取部位進行硅膠柱層析分，純化后所得化合物加入氘代氯仿溶解進行核磁共 振和質譜結構測試。
[0019] 本發明中代表化合物為EllipeiopsolB和Zeylenol，分子式為C21H2tlO7，分子量為 384。
[0020]
[0021] 本發明經實驗表明，所述的苯甲酰多羥基環己烯化合物對外泵耐藥金葡菌具有協 同抗菌作用。所述的苯甲酰多羥基環己烯化合物本身沒有抑制細菌生長作用，但與抗生素 諾氟沙星配伍時，其針對細菌外排泵（efflux)耐藥機制，進行含有NorA基因的耐氟喹諾酮 類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌實驗耐藥菌SAl199B的實驗，結果顯示，化合物Zeylenol和 EllipeiopsolB能使諾氟沙星的最低抑菌濃度值分別降低4倍和16倍。
[0022] 本發明中，采用多氧取代環己烯類天然化合物Ellipeiopsol B和Zeylenol與抗 生素諾氟沙星不同濃度下進行對耐氟喹諾酮金葡菌SA1199菌株單獨抑菌實驗，及兩者形 成不同配比的組合物進行抑菌試驗，結果顯示兩個化合物對諾氟沙星皆以協同作用方式產 生抑菌增效作用，Zeylenol效果與陽性藥利血平相同，而Ellipeiopsol B效果更佳，協同 增效作用是利血平的4倍，協同增效作用非常明顯；用溴化乙錠為熒光標記物進行外排泵 抑制試驗，結果顯示化合物Zeylenol抑制外排效果明顯，抑制作用與實驗陽性對照物氰氯 苯腙水平相當。
[0023] 本發明中，實驗菌SAl199B為對氟諾喹酮類抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌，抗生 素諾氟沙星對它最低抑制濃度為（MIC)值為64iig/mL;耐藥機制為細菌過度表達NorA多 藥耐藥外泵蛋白形成外排泵（effluxpump)機制，降低了抗生素在細菌細胞內的藥物濃度； 對于耐藥菌株SAl199B，諾氟沙星的MIC值為64iig/mL，上述兩個化合物對此菌株的MIC均 大于128iig/mL，但化合物EllipeiopsolB和Zeylenol分別與諾氟沙星配伍時，能使諾氟 沙星對菌株SAl199B的MIC值分別降至4和16iig/mL，分別降低了 16和4倍；Zeylenol協 同增效作用與文獻報道利血平效果相同，EllipeiopsolB效果是文獻報道利血平的4倍，所 述兩個化合物均具有明顯的協同抗菌活性。
[0024] 本發明實驗包括步驟：
[0025] 1?細菌培養及檢測
[0026]細菌培養在細胞培養室超凈臺中操作，在96孔板中進行細菌培養，米勒-亨頓肉 湯（Mueller-HintonBrooth,MHB)為培養基。取化合物樣品及抗生素諾氟沙星各適量，以 DMSO溶解配置成一定濃度的兩種母液，以肉湯稀釋。不加藥物作為陰性對照。接種細菌96 孔板于37°C的培養箱中培養18-24小時，加入MTT，觀察結果，以細菌完全不生長時所需藥 物的最低濃度為藥物對此菌種的MIC值，以MTT溶液3-[4, 5-二甲基噻唑基-2]-2, 5-二苯 基四唑藍溴化物（Sigma)，用于檢測細菌的生長，MTT由黃色變成藍色則指示有細菌生長；
[0027] 2.協同作用方法試驗化合物對抗生素的增效作用
[0028] 在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進行化合物與抗生素協同作用抗菌試 驗；
[0029] 取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素