一種基于磁性氧化石墨烯原位凝膠的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，特別是一種基于磁性氧化石墨烯原位凝膠的制備方法及 其應用。
【背景技術】
[0002] 氧化石墨稀（Graphene oxide, G0)為單層的氧化石墨，因其具有大量的Sp2碳 原子，比表面積大，所以通過JT-JT共軛、靜電作用等非共價鍵作用能有效地將化學藥物、 DNA、RNA等固定在氧化石墨烯上。GO擁有良好的生物相容性及跨膜能力因而被作為藥物載 體廣泛用于醫藥領域。但其在生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中迅速聚沉，使其不能直接應用于 醫藥生物領域，已知對其進行功能化修飾可降低毒性，因此氧化石墨烯的表面修飾是十分 必要的。聚乙稀亞胺（Polyethylene imine，PEI)是一種生物相容性較好的水溶性高分子 材料，帶有較強的正電荷，對細胞膜具有較強的吸附能力。PEI化學反應活性非常高，已被廣 泛應用于基因藥物和化學藥物轉運系統。
[0003] 原位凝膠是智能水凝膠的一種，它能夠感知周圍環境溫度的變化并作出響應，主 要表現為體積的變化。在用于藥物緩控釋中時可以通過改變溫敏水凝膠的溫度使其產生相 應的體積變化進而控制藥物釋放。而磁性納米材料的發展則為在體外控制溫敏水凝膠的溫 度提供了可行的方法。磁納米靶向性腫瘤熱療技術是一種新興的腫瘤熱療方法。與傳統腫 瘤治療方式相比，磁納米靶向性腫瘤熱療具有靶向性好、溫控性強的優點，而且磁介質導入 后可重復多次進行治療，治療過程為無創或微創。通常所用的磁性材料有鐵、鐵氧化物和 鈷、鎳及其混合氧化物等。磁性納米粒子粒徑小，具有磁導向性，生物相容性和生物降解性 良好，可在外加磁場的作用下定向移動到目標位置，同時也便于分離。利用這些特性，磁性 納米粒子可應用于藥物載體、疾病診斷、磁靶向熱療、細胞分離純化、磁性轉染等方面。磁性 納米載體己廣泛用于腫瘤的診斷與治療、藥物載體及生物樣品的分離與純化等方面，被認 為是最有潛力的材料之一。
[0004] 目前，將磁性氧化石墨烯表面接枝一種高分子水溶性聚合物-聚乙烯亞胺，并制 備成一種原位凝膠，以及其作為磁性熱療介質和藥物轉運載體在制備治療腫瘤藥物中的應 用還未見有報道。

【發明內容】

[0005] 針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種基于磁性氧 化石墨烯原位凝膠的制備方法及其應用，可有效解決磁性氧化石墨烯原位凝膠作為磁性熱 療介質和藥物轉運載體在腫瘤治療中的應用。
[0006] 本發明解決的技術方案是：基于磁性氧化石墨烯的原位凝膠作為藥物載體系統是 由負載藥物的磁性氧化石墨烯和殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉凝膠混合制成，負載藥物的磁性 氧化石墨烯和殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉凝膠的體積比為1-3:1，一種磁性氧化石墨烯-聚乙 烯亞胺聚合物，它是在原始的氧化石墨烯負載上鐵氧化物的基礎上，利用縮合反應，將氧化 石墨烯表面連接上反應活性較強的大分子聚合物聚乙烯亞胺，生成水溶性磁性載體，最終 將此載體與殼聚糖原位凝膠混合，制備成一種磁性氧化石墨烯原位凝膠，具體由以下步驟 實現：
[0007] 1)制備磁性氧化石墨烯：稱取氧化石墨烯（GO) 20_40mg溶于乙二醇與二乙二醇混 合溶液20-40ml中，攪拌均勻，乙二醇與二乙二醇的體積比為1:19,再超聲30min，然后在磁 力攪拌下，依次加入醋酸鈉200-450mg、六水合氯化鐵（FeCl 3 ·6Η20) 100-300mg，形成均勻黃 色的懸浮液，將懸浮液置于反應釜中，200°C反應10h，再3000r/min將懸浮液離心5min，得 沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇100-300ml、超純水100-450ml離心洗滌10-20次后，將沉淀 物真空干燥12-48h，即得磁性氧化石墨烯（GO-IONP);
[0008] 2)制備聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯（G0-I0NP-PEI):稱取磁性氧化石墨烯 (GO-IONP) 20-40mg溶于ρΗ7· 4的磷酸鹽緩沖液（PBS) 20-40ml中，攪拌，超聲30min，使之分 散均勻；依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC .HCl) 100-200mg、 N-羥基丁二酰亞胺（NHS)50-117mg、分子量10K的聚乙烯亞胺（PEI) 100-400mg，攪拌72h， 用0. 22 ym微孔濾膜抽濾，得濾餅，濾餅用超純水200-500ml反復洗滌10次，40-60°C真空 干燥12-48h，即得聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯（G0-I0NP-PEI);
[0009] 3)制備負載鹽酸阿霉素的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯：
[0010] 稱取聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯（G0-I0NP-PEI) 5-20mg溶于超純水 5-20ml中，再加入抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素10-40mg，超聲2-4h，即得負載鹽酸阿霉素的聚乙 烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯（G0-I0NP-PEI/D0X);
[0011] 4)制備CS/β -GP凝膠溶液：稱取脫乙酰度90 %、分子量50K的殼聚糖 (CS)50-170mg溶于0· lmol/L HCl 2-20ml中，磁力攪拌至澄清，配制成A液；將β-甘油磷 酸鈉 （β -GP) 200-700mg溶于超純水0. 5-2ml中，配制成B液，將B液滴加至冰浴攪拌中的 A液中，冰浴攪拌lOmin，即得CS/ β -GP凝膠溶液；
[0012] 5)制備凝膠溶液：室溫下，將負載鹽酸阿霉素的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨 烯按體積比1-3:1滴加入CS/β-GP凝膠溶液，并攪拌均勻，即得負載鹽酸阿霉素的磁性氧 化石墨烯殼聚糖凝膠溶液。
[0013] 本發明的磁性氧化石墨烯原位凝膠作為磁熱介質進行磁熱治療體內淺表腫瘤，當 交變磁場加熱程度無法達到熱療要求時，可通過調節磁場頻率、電流、運行時間的方法改善 磁熱升溫范圍進行腫瘤的治療。采用瘤內注射的方法給藥，可以將更多的藥物分布在腫瘤 組織中，與正常組織相比，它可以將藥物轉運載體長時間地保留在腫瘤組織中，當使用交變 磁場時能夠控制腫瘤組織中溫敏原位凝膠的溫度并使其裝載的藥物在腫瘤部位濃度提高。 本發明的原料來源豐富，成本低，質量好，靶向性強，使用效果好，是腫瘤治療藥物上的一大 創新。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0015] 本發明在具體實施中，可由以下實施例給出。
[0016] 實施例1
[0017] 本發明方法在具體實施中，由以下步驟實現：
[0018] 1)制備磁性氧化石墨烯：稱取氧化石墨烯20mg溶于乙二醇與二乙二醇混合溶液 20ml中，攪拌均勻，乙二醇與二乙二醇的體積比為1:19,再超聲30min，然后在磁力攪拌下， 依次加入醋酸鈉300mg、六水合氯化鐵108mg，形成均勾黃色的懸浮液，將懸浮液置于反應 釜中，200°C反應10h，再3000r/min將懸浮液離心5min，得沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇 200ml、超純水300ml離心洗滌20次后，將沉淀物真空干燥12h，即得磁性氧化石墨烯；
[0019] 2)制備聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯：稱取磁性氧化石墨烯30mg溶于pH7. 4 的磷酸鹽緩沖液30ml中，攪拌，超聲30min，使之分散均勻；依次加入1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽120mg、N-羥基丁二酰亞胺70mg、分子量IOK的聚乙烯亞胺 200mg，攪拌72h，用0. 22 μ m微孔濾膜抽濾，得濾餅，濾餅用超純水300ml反復洗滌10次， 60°C真空干燥24h，即得聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯；
[0020] 3)制備負載鹽酸阿霉素的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯：稱取聚乙烯亞胺 修飾的磁性氧化石墨烯5mg溶于超純水5ml中，再加入抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素10mg，超聲 3h，即得負載鹽酸阿霉素的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯；
[0021] 4)制備CS/ β -GP凝膠溶液：稱取脫乙酰度90 %、分子量50K的殼聚糖85mg溶于 0· lmol/L HCl 4. 5ml中，磁力攪拌至澄清，配制成A液；將β -甘油磷酸鈉250mg溶于超純 水Iml中，配制成B液，將B液滴加至冰浴攪拌中的A液中，冰浴攪拌lOmin，即得CS/ β -GP 凝膠溶液；
[0022] 5)制備凝膠溶液：室溫下，將負載鹽酸阿霉素的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨 烯按體積比1:1滴加入CS/ β -GP凝膠溶液，并攪拌均勻，即得負載鹽酸阿霉素的磁性氧化 石墨烯殼聚糖凝膠溶液。
[0023] 實施例2
[0024] 本發明方法在具體實施中，由以下步驟實現：
[0025] 1)制備磁性氧化石墨烯：稱取氧化石墨烯30mg溶于乙二醇與二乙二醇混合溶液 30ml中，攪拌均勻，乙二醇與二乙二醇的體積比為1:19,再超聲30min，然后在磁力攪拌下， 依次加入醋酸鈉450mg、六水合氯化鐵300mg，形成均勾黃色的懸浮液，將懸浮液置于反應 釜中，200°C反應10h，再3000r/min將懸浮液離心5min，得沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇 300ml、超純水450ml離心洗滌20次后，將沉淀物真空干燥12h，即得磁性氧化石墨烯；
[0026] 2)制備聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯：稱取磁性氧化石墨烯40mg溶于pH7. 4 的磷酸鹽緩沖液40ml中，攪拌，超聲30min，使之分散均勻；依次加入1-乙基-(3-二甲基 氨