一種多細胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復合系統及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種多細胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復合系統及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 生長因子（Growth factor, GF)是一類對細胞增殖、分化、遷移和基因表達具有促 進或抑制作用的蛋白類物質，在細胞分裂、基質合成和組織分化等方面發揮重要的調節作 用，是組織工程技術中不可或缺的組成部分，對損傷組織的修復具有重要的作用。研究表 明許多生長因子參與了關節軟骨的修復過程，主要包括膜島素樣生長因子（insulin-1化e growth factor, IGF)家族、轉化生長因子（Transforming Growth Factor, TGF)超家族 等。膜島素樣生長因子-l(insulin-l;Lke growth factor- I，IGF- I )能夠促進軟骨 細胞增殖、再分化，保持軟骨細胞的特異表型并抑制程序性調亡，同時促進軟骨基質合成代 謝，抑制軟骨基質的降解，是體內調節軟骨蛋白聚糖合成最重要的生長因子。在軟骨細胞體 外培養中，IGF- I能夠增加蛋白聚糖的合成，使軟骨蛋白聚糖的合成量達到與體內相當的 水平。有研究表明IGF- I能夠誘導體外培養的ADSCs分化為軟骨細胞。轉化生長因子B (transforming growth factor-B, TGF-B )家族主要包括 TGF-B1，TGF-B2, TGF-B3。現已 證實，TGF-13能夠促進細胞增殖、調節細胞分化、促進細胞外基質合成，并可誘導間充質細胞 向軟骨細胞分化。適量的TGF-13可W促進軟骨細胞的分裂增殖，修復缺損。其中TGF-133的 誘導成軟骨作用比TGF-131和TGF-132強，在軟骨損傷修復中起重要作用。
[0003] 當種子細胞被植入軟骨待修復部位后，由于身體的日常活動及體內損傷組織部位 血液、關節液的流動，使得種子細胞及細胞因子無法長期有效的聚集、增殖，從而嚴重影響 了缺損軟骨的正常修復速度和程度。Barbash等對體外培養的BMSCs向梗死屯、肌的遷移歸 巢研究表明，在各時間段梗死屯、臟對MSCs的攝取率都低于1%，使得干細胞歸巢的療效大大 降低。因此，如何促進和提高干細胞歸巢率已成為干細胞治療疾病的關鍵。干細胞歸巢是 指自體或外源性干細胞在多種因素的作用下趨向性遷移并定植到祀向組織參與組織修復 的過程。目前的移植方式主要包括經靜脈、經動脈和患處局部移植。近年來，隨著干細胞 治療學的興起，對于干細胞歸巢的研究迅速升溫。化evenot等研究發現，基質細胞衍生因 子-1 (Stromal ceU-derived factor-l, SDF-1)的局部釋放能夠啟動干細胞歸巢并促進 歸巢效率。SDF-1又被稱為"歸巢趨化因子"，在激活干細胞歸巢方面具有重要的作用。干 細胞能夠感知體內局部SDF-1濃度的提高，并隨之趨向性遷移和聚集，從而啟動損傷組織 的修復和再生。目前認為SDF-1的該種特性是體內組織自動修復的基本機制。
[0004] 關節軟骨是一種非均質、具有粘彈性并充滿液體的可滲透性物質，近年來，作為一 種能夠引導細胞吸附及分化的支架材料，溫敏型水凝膠在軟骨組織工程中的應用引起了研 究者們極大的興趣。溫敏型水凝膠的諸多特性都適合用于軟骨修復，如；微創可注射性，無 毒性，良好的生物相容性，高含水量和高親水性。并且在注射入體內后能夠在體溫下快速的 原位轉變為凝膠狀，從而使種子細胞能停留在損傷部位。
[0005] 干細胞向軟骨細胞分化及軟骨細胞的增殖、代謝是由多種細胞因子協同作用、相 互影響從而發揮作用的。因此單一細胞因子的應用效果有限，多種細胞因子聯合使用能夠 實現更好的修復效果。

【發明內容】

[0006] 為了解決上述的技術問題，本發明的第一個目的是提供一種多細胞因子序貫緩釋 微球-水凝膠復合系統，該復合系統將SDF-1及分別包裹了 IGF-1和TGF-133的PLGA緩釋 微球一起整合到PLGA-PEG-PLGA溫敏型水凝膠中，使之能夠續貫及持續緩釋3種生長因子， 并聚集干細胞于軟骨損傷部位，W提高關節軟骨損傷的修復效果。本發明的另外一個目的 是提供上述的多細胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復合系統的制備方法。
[0007] 為了實現上述的第一個目的，本發明采用了 W下的技術方案： 一種多細胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復合系統，該復合系統按重量份計包括W下的 組分： IGF-1 PLGA 微球 0.2~2 份 TGF-133 PLGA 微球 0. 2~2 份 SDF-1 0. 001~0. 01 份 PLGA-PEG-PLGA 1~10 份。
[000引作為優選，該復合系統按重量份計包括W下的組分： IGF-1 PLGA 微球 0.5~1.5 份 TGF-133 PLGA 微球 0. 5~1. 5 份 SDF-1 0. 001~0. 01 份 PLGA-PEG-PLGA 1~10 份。
[0009] 作為優選，所述的IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含量為0. 01~0. 5%，TGF-133 PLGA 微球中rh TGF-133的含量為0. 01~0. 5〇/〇。
[0010] 作為優選，所述的IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含量為0. 1~0. 3%，TGF-133 PLGA 微球中rh TGF-133的含量為0. 1~0. 3〇/〇。
[0011] 作為優選，所述的PLGA-PEG-PLGA中PLGA與陽G的質量比為3 ;1~2 ;1。
[0012] 為了實現上述的第二個目的，本發明采用了 W下的技術方案： 一種制備上述的的多細胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復合系統的方法，其特征在于該 方法；用去離子水配置質量分數為15~30%的PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶液，稱取適量IGF-1 PLGA微球和TGF-133PLGA微球加入水凝膠溶液中，再加入適量SDF-1凍干粉，整個過程在冰 面上操作，并持續緩慢攬拌。
[001引作為優選，所述的多細胞因子IGF-1 PLGA微球的制備方法如下： 1) 把Img rhIGF-1凍干粉溶于100 y 1去離子水中，調配為濃度為lOmg/ml的水溶液， 作為內層水相，即化相； 2) 取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲燒中，作為油相，即0相； 3) 將化相加入0相中，冰浴下用超聲細胞粉碎機超聲乳化Imin后，形成初乳液化/0 ; 4) 持續攬拌下將化/0初乳液緩慢勻速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v) 的PVA水溶液中，PVA水溶液即外層水相W2,冰浴下3000巧m勻速磁力攬拌lOmin，形成Wl/ 0/W2雙層復乳液； 4)然后常溫下5(K)巧m勻速磁力攬拌化，除去有機溶劑后固化，然后沖洗過濾， 10000巧111離屯、lOmin，得到IGF-1 PLGA微球，-20°C保存備用。
[0014] 作為優選，所述的TGF-133 PLGA微球的制備方法如下； 1) 把Img rh TGF-133凍干粉溶于100 y 1去離子水中，調配為濃度為lOmg/ml的水溶 液，作為內層水相，即化相； 2) 取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲燒中，作為油相，即0相； 3) 將化相加入0相中，冰浴下用超聲細胞粉碎機超聲乳化Imin后，形成初乳液化/0 ; 4) 持續攬拌下將化/0初乳液緩慢勻速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v) 的PVA水溶液中，PVA水溶液即外層水相W2,冰浴下3000巧m勻速磁力攬拌lOmin，形成Wl/ 0/W2雙層復乳液； 5) 然后常溫下5(K)巧m勻速磁力攬拌化，除去有機溶劑后固化；然后沖洗過濾， 10000巧m離屯、lOmin，得到TGF-133 PLGA微球，-20°C保存備用。
[0015] 作為優選，所述的PLGA-PEG-PLGA水凝膠的制備方法如下； 1) 按化LA:GA:PEG=6:1:3的比例稱取一定量的化LA、GA和陽G1500放入烘箱中干燥 化后混勻加入到真空聚合反應瓶中，室溫放置化冷卻，再加入催化劑異辛酸亞錫（0. 02%, W/W)，反復通氮、抽真空，脫除痕量水分和氧氣，抽真空封管，加熱到150°C反應lOh，得到 PLGA-PEG共聚物； 2) 將聚合物溶解于二氯甲燒中，己醇沉淀析出，得到純化的聚合物，真空干燥至恒重得 到粘稠透明產物，置于-20°C保存備用。
[0016] 本發明由于采用了上述的技術方案，將SDF-1及分別包裹了 IGF-1和TGF-133的 PLGA緩釋微球一起整合到PLGA-PEG-PLGA溫敏型水凝膠中，使之能夠續貫及持續緩釋3種 生長因子，并聚集干細胞于軟骨損傷部位，W提高關節軟骨損傷的修復效果。
【附圖說明】
[0017] 圖1為復合體中IGF-1，TGF-133和SDF-1的體外累積釋放度圖。
[0018] 圖2~圖3為PLGA微球透射電鏡圖；PLGA微球呈圓球狀，形態良好。
[0019] 圖4~圖5為PLGA微球掃描電鏡圖；PLGA微球呈圓球狀，形態良好，直徑大小為 50-80化，表面較光滑，可見輕微起伏。
[0020] 圖6為PLGA-PEG-PLGA水凝膠掃描電鏡圖。
[002U 圖 7 為 IGF-1 PLGA 微球 / TGF-133 PLGA 微球 /SDF-1/PLGA-PEG-PLGA 水凝膠復合 體掃描電鏡圖。
[0022] 圖8為水凝膠復合體膠凝化性能圖；左為膠凝化水凝膠，右為液態水凝膠。
[0023] 圖9為水凝膠復合體膠凝化性能圖；左為膠凝化水凝膠，右為液態水凝膠。
[0024] 圖10為水凝膠復合體膠凝化性能圖；圖中為膠凝化水凝膠。
【具體實施方式】
[002引實施例1.載IGF-1 PLGA微球的制備 采用W/0/W乳化-溶劑揮發法制備載IGF-1 PLGA微球，具體過程為：把Img rhIGF-1 凍干粉溶于100 y 1去離子水中，調配為濃度為lOmg/ml的水溶液，作為內層水相（W1相）。 取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲燒中，作為油相（0相）。將化相加入 0相中，冰浴下用超聲細胞粉碎機超聲乳化Imin后，形成初乳液化/0。持續攬拌下將W1/0 初乳液緩慢勻速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v)的PVA水溶液中（外層水相 W2)，冰浴下3000巧m勻速磁力攬拌lOmin，形成化/0/W2雙層復乳液。然后常溫下50化pm 勻速磁力攬拌化，除去有機溶劑后固化。然后沖洗過濾，10000巧m離屯、lOmin，得到IGF-1 PLGA微球，-20°C保存備用。
[0026] 實施例2.載TGF-133 PLGA微球的制備 采用W/0/W乳化-溶劑揮發法制備載TGF-133 PLGA微球，具體過程為：把Img rh TGF-133 凍干粉溶于100 y 1去離子水中，調配為濃度為lOmg/ml的水溶液，作為內層水相（W1相）。 取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲燒中，作為油相（0相）。將化相加入 0相中，冰浴下用超聲細胞粉碎機超聲乳化Imin后，形成初乳液化/0。持續攬拌下將W1/0 初乳液緩慢勻速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v)的PVA水溶液中（外層水相 W2)，冰浴下3000巧m勻速磁力攬拌lOmin，形成化/0/W2雙層復乳液。然后常溫下5(K)巧m 勻速磁力攬拌化，除去有