專利名稱：摻入口腔微生物區系的外源性乳酸菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及摻入口腔微生物區系用以預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的外源性乳酸菌(lactic bacteria)。
在舌和頰粘膜上，天然的定居微生物區系包括選自鏈球菌屬(Streptococcus)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、類桿菌屬(Bacteroides)和嗜血桿菌屬(Haemophilus)的微生物。在牙齒上，鏈球菌屬、乳酸桿菌屬(Lactobacilli)和放線菌屬(Actynomyces)占優勢，但也可發現各種革蘭氏陽性和陰性球菌和桿菌。
例如，Frandsen等證實血鏈球菌在頰粘膜上占優勢但其初期棲息地卻是牙表面，格氏鏈球菌在牙齦上成熟的菌斑中生長，口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌在初始牙菌斑中生長(Oral Microbiol.Immunol.,6,129-133,1991)。屬于鏈球菌突變體族的菌株定居在牙齒上(大鼠鏈球菌、汗毛鏈球菌、野生鏈球菌、獼猴鏈球菌、變異鏈球菌(S.mutants)、鼠鏈球菌、表兄鏈球菌(S.sorbrinus))。屬于米氏鏈球菌族的菌株在牙膿腫中占優勢(咽峽炎鏈球菌(S.anginosus)、咽峽炎鏈球菌(S.constellatus)、中間鏈球菌；Bentley等，Iht.J.System.Bacter.1991,41,487-494；Wood等，乳酸菌的種類，Blackie Academic和Professional,Chapman & Hall,W.H.編輯，1995)。
這些微生物多數是無害的共生體，但已將其中的許多認為是一些十分少見的疾病的病原體(Hill,M.J.和Marsh,P.D.編輯HumanMicrobial Ecology,1990,CRC出版社，Boca Raton Florida,USA)。
所述牙菌斑是一層在牙齒表面形成的膜，由在胞外多糖和唾液產物的基質中在細菌細胞組成。牙齒萌出之后，立刻就被一層無定形的唾液覆蓋，所獲得的釉質膜(the acquired enamel pellicle)(ACE)厚約1.3μm并且不會被正常的刷牙除去。牙齒上細菌的沉積緊隨AEP形成之后而菌斑在8-12小時后由于多層結構而變得明顯。第一層含有通過特異性粘附素-受體的識別而主要貼附于牙齒的細菌(最早的定居細菌)；它為通過相似的特異性結合或通過簡單的并列而相互粘附的第二層定居細菌奠定了基礎。菌斑的粘聚通過三個機理得到基本的保證在細菌外層上唾液薄膜的存在、不同細菌種間的特殊的共聚集和由細菌合成的葡聚糖以及將其繼續包埋于菌斑基質中(Skopek等，Oral Microbiol.Immunol.,9,19-24,1994；Kolenbrander等，Math.Enzymol.,253,385-397,1995；Hiroi等，FEMS Microbiol Lett.,96,193-198,1992；Gibbons等，Infect.Immun.,52,555-561,1986)。
在發酵過程中由口腔細菌產生的有機酸直接導致齲齒。這些酸侵蝕牙齒的堅硬組織，導致釋出離子如鈣、磷酸鹽、碳酸鹽、鎂、氟化物、鈉。當口腔內的pH再次升到中性附近時，唾液被鈣飽和并因此可避免其從牙齒游離釋出。
在口腔內發現的所有食物殘渣中，由于口腔細菌的直接發酵作用，碳水化合物顯示出最高的促進齲齒作用。
所有微生物發酵的糖都是生齲的潛在因素，但是牙冠和牙根齲齒的主要病原體卻是突變的鏈球菌，因為它們是強酸產生菌；還涉及高度耐酸的乳酸桿菌。在人類中，變異鏈球菌和表兄鏈球菌是主要的生齲菌株，并且生活于牙齒上而不在整個牙列中建群。事實上已證實從磨牙到前牙其數量的逐漸減少(Lindquist等，Dent.Res.,69,1160-1166,1990)。因此在人類鄰接的菌斑中，變異鏈球菌和表兄鏈球菌優先建群于接觸區頂端的最容易生齲齒的部位(Ahmady等，Caries Res.,27,135-139,1993)。與變異鏈球菌相比，在磨牙部位還發現更占優勢的表兄鏈球菌(Lindquist等，Caries.Res.,25,146-152,1991)。
已證實變異鏈球菌和表兄鏈球菌主要通過特異性粘附素-受體貼附于牙表膜(the pellicle of teeth)上。Gibbons等證實變異鏈球菌攜有與所述表膜中的唾液成分結合的粘附素，而表兄鏈球菌細胞具有與所述表面中的葡聚糖結合的粘附素(Infect.Immun.,52,555-561,1986)。
暫居微生物區系包括可在口腔偶然出現、但卻不能建立永久性定居(即便重復口服給予這些細菌)的外源性細菌。所有的食用細菌而且特別產乳酸菌可成為這種暫居微生物區系的一部分。尚未證實這些外源性乳酸菌能夠直接粘附于牙表膜。然而外源性乳酸菌的重復給予可導致在整個口腔表面，例如舌、頰粘膜、牙齦、口唇、面頰部、腭、底部以及牙齒的口腔內定居。這種定居是通過與定居的微生物區系的細菌的特異結合(共聚集現象)、或包埋通過在定居細菌產生的多糖基質中、或通過粘附于唾液蛋白(特別是糖蛋白)的粘附引起的。
已有報道干酪鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus casei rhamnosus)GG(ATCC53103)定居在口腔中，最可能定居在頰粘膜上皮上。該菌株也粘附于腸道上皮(US5032399,Gorbach等；Micr.Ecol.In Health andDis.,7,295-298,1994)。與此相比，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)不粘附于牙齒。
日本專利第4021633號(Cyconmedix KK)也報道嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)定居在口腔中，最可能定居在頰粘膜上皮上。已知許多嗜酸乳桿菌也粘附于腸道上皮上(EP577904；EP199535；Perdigon等；Medicina,46,751-754,1986；Perdigon等；Immunology,63,17-23,1988)。
外源性細菌也可產生抑制口腔內定居的微生物區系的生長的因子。例如，EP759469(Sociétédes Produits Nestlé)描述應用變異微球菌(Micrococcus varians)產生的細菌素抑制口腔病原菌表兄鏈球菌、血鏈球菌、變異鏈球菌和粘放線菌的生長。
已應用某些策略將口腔內的定居微生物區系生長減小到最低限度，即給予不引起齲齒的定居微生物區系的共生細菌如唾液鏈球菌和/或粘滑口腔球菌(Stomatococcus mucilaginosus)，和/或重復給予外源性乳酸菌如干酪乳桿菌、發酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌(L bulgaricus)和唾液鏈球菌(Tanzer等，Iefect.and Immunity,48,44-50,1985；WO92/14475)。
細菌素的應用也是已提出用于減少齲齒的研究策略之一。這些分子作為未來的抗齲藥和調節口腔內建群的重要因子頗具吸引力。應用某些細菌素的抗齲潛力得益于它們對與牙菌斑有關的變異鏈球菌和細菌的有效廣譜抗菌活性，以及其被認為對從類是安全的細菌天然存在性(Colgate的US5368845，和Smithkline Beecham的WO94/12150)。
應用乳衍生物保持口腔健康也是使人感興趣的。事實上，US5427769(Nestec S.A.)描述了另一可選擇的方法，其中預防齲齒是通過使牙齒與含有足夠量的微膠粒酪蛋白(micellar casein)的食用組合物接觸以抑制表兄鏈球菌的定居。EP748591(Sociétédes ProduitsNestléS.A.)也報道了氟化微膠粒酪蛋白或其微膠粒亞單位在治療齲齒或菌斑中的應用。US4992420(Nestec S.A.)描述了將乳衍生的K-酪蛋白-糖巨肽(kappa-caseino-glycomacro peptide)用于口腔治療以消滅牙菌斑和齲齒。
從未證實不是口腔定居微生物區系的組成部分的乳酸菌確實能夠直接粘附于牙表膜。因此，這些乳酸菌通過定居牙表膜將產生抗定居微生物區系包括口腔病原菌生長的抑制活性。
另一個目的是以下這樣的乳酸菌的應用經遺傳學改造以促進其通過粘附因子而可粘附于牙表膜和/或經遺傳學改造使其更弱酸化，導致口腔內的pH大約為5.5-7的乳酸菌。
另一個目的應用不是口腔定居微生物區系組成部分的乳酸菌制備用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物，其中所述乳酸菌選自-可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的酸化乳酸菌；-低度酸化的并經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜的非粘附性乳酸菌；-經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的非粘附性酸化乳酸菌。
另一個目的是提供包含以下乳酸菌的口腔保健組合物該乳酸菌不是定居微生物區系組成部分，它低度酸化的而且能夠直接粘附于牙表膜。
另一個目的是提供包含以下組分的口腔保健組合物(1)至少一種這樣的乳酸菌不是口腔定居微生物區系組成部分、能夠直接粘附于牙表膜而且使口腔pH高于5.5的乳酸菌；和(2)任何形式的酪蛋白糖巨肽、微膠粒酪蛋白、氟化微膠粒酪蛋白、粗制凝乳酶處理的乳或細菌素(renneted milk or bacteriocin)。
另一個目的是提供包含至少一種選自以下的乳酸菌菌株的口腔保健組合物菌株CNCMI-1984、CNCMI-1985、CNCMI-1986、CNCMI-1987和LMG P18997。
另一個目的是提供包含至少一種選自以下的乳酸菌的口腔保健組合物經遺傳學改造以促進其通過粘附因子粘附于牙表膜和/或經遺傳學改造而更低酸化并使口腔內pH大約為5.5-7的乳酸菌。
另一個目的是提供包含選自以下的乳酸菌的口腔保健組合物-可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的酸化乳酸菌；-低度酸化并經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜的非粘附性乳酸菌；-經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的非粘附性酸化乳酸菌。
最后的再一個方面，本發明提供篩選能粘附于牙齒的乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟(1)制備識別能粘附于牙齒的乳酸菌菌株的特異性表面蛋白質的單克隆抗體，(2)應用能夠粘附于牙齒的菌株的單克隆抗體，篩選任何乳酸菌菌株。發明詳述在下面的描述中，將所述的口腔限定為人或動物如寵物的口腔，包括口粘膜(牙齦、唇、頰、腭和口腔底)、舌和牙(包括人造結構)。
所述口腔定居微生物區系包括生活口腔內的所有天然微生物，因為它們可在口腔表面建立永久性定居。所述口腔定居微生物區系也包括生長于牙的堅硬組織和軟組織之間的交界區(牙齒-牙齦結合部)的細菌，盡管認為在健康的口腔內不存在牙齦溝和牙周袋(periodontalpocket)。這種微生物區系包括選自以下的微生物鏈球菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、乳桿菌屬、棒桿菌屬(Corynebacterium)、放線菌屬、蛛菌屬(Aracnia)、羅氏菌屬(Rothia)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)、優桿菌屬(Eubacterium)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)/布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、艾肯氏菌屬(Eikenella)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophga)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、西蒙斯氏菌屬(Simonsiella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃林氏菌屬(Wolinella)/月形單胞菌屬(Selenomonas)、支原菌屬(Mycoplasma)、念珠菌屬(Candida)、螺旋體屬(Spirochaetes)、原生動物門。
暫居微生物區系包括可偶而在口腔內出現、但不建立永久定居的外源性細菌。這種暫居微生物區系可包括所有的食用微生物如雙歧桿菌類(嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長雙歧桿菌)；乳球菌類(乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)(乳鏈球菌)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)(酪鏈球菌)和Lactococcus lactis subsp.lactic biovar diacetylactis)；鏈球菌類(嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳鏈球菌(Lactococcus lactis)、酪鏈球菌(S.lactis cremoris)和乳酸乳球菌雙乙酰亞種(S.lactisdiacetylactis))；乳桿菌類(德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、香腸乳桿菌、消化乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、德氏乳桿菌乳亞種、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、發酵乳桿菌和包括約氏乳桿菌的嗜酸菌群；參見Fujisawa等，Int.J.Syst.Bact.,42,487-491,1992)；片球菌類(戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌和嗜鹽片球菌)；腸球菌類；葡萄球菌類(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)；微球菌類(變異微球菌)；屬于德巴利酵母屬(Debaromyces)、念珠菌屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、球擬酵母屬(Torulopsis)和酵母屬(Saccharomyces)的酵母菌；以及屬于曲霉屬(Aspergillus)、酒曲菌屬(Rhizopus)、白霉屬(Mucor)和青霉屬(Penicillium)的霉菌。
與本發明的第一個目的是應用乳酸菌制備用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物，其中所述乳酸菌不是口腔內的定居微生物區系的組成部分，而且它低度酸化并且能夠直接粘附于牙表膜。
根據本發明的乳酸菌是低度酸化的且其能直接粘附于牙表膜，因此用這些乳酸菌制備的組合物是用于排除牙齒的病原菌或預防它們的粘附。根據本發明的乳酸菌是“低度酸化的”，這意味著它們比病原菌株的酸性低。因此，它們使口腔的pH大約為5.5-7。它們最好是乳源性的。
根據本發明的乳酸菌通過特異性或非特異性的相互作用和/或粘附因子粘附于牙表膜。所述特異性粘附因子是蛋白質或多糖。
至少一種乳酸菌是選自嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種和Lactococcus lactis subsp.lactic biovar diacetylactis并且特別選自菌株CNCMI-1984、CNCMI-1985、CNCMI-1986、CNCMI-1987和LMGP-18997。
所選定的這些菌株屬于可粘附于牙表膜、其最佳生長溫度大約為37℃(為口腔溫度)的乳酸菌菌株。此外它們能夠發酵葡萄糖和蔗糖并且不合成葡聚糖，葡聚糖是生齲菌株的致病性因素。
根據本發明的另一個目的是考慮對乳酸菌進行遺傳學改造以使其通過粘附因子粘附于牙表膜。對于已經粘附于牙表膜的乳酸菌，這種改造的目的是使所述菌株更牢地粘附于牙的表面。同樣，任何非粘附性乳酸菌(不是乳桿菌)可經遺傳學改造而可粘附于牙表膜。
例如，可通過插入基因X17390、X14490或X53657(GenBank注冊號)而實現乳酸菌進行這樣的改造。這些基因在變異鏈球菌中表達介導粘附于唾液糖蛋白的抗原Ⅰ/Ⅱ。
根據本發明，對乳酸菌進行遺傳學改造以使其成為低度酸化菌也是可能的。對于已經是低度酸化的乳酸菌，這種改造的目的是通過降低其乳酸的產生而增強所述效應。
許多方法并優選根據下述文件中所述方案之一可實現這種改造Boumerdassi等，Appl.Environ.Microbiol.,63,2293-2299,1997；Platteeuw等，Appl.Environ.Microbiol.,61,3967-3971,1995；Ito等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,58,1569-1573,1994。
根據本發明，至少將一種經遺傳學改造或未經改造的乳酸菌以“有效量”用于制備預防或治療人類或動物如寵物的齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物。所述有效量最好在104到109cfu/g之間。
也可以至少一種乳酸菌結合使用乳衍生物，例如乳或發酵乳或乳衍生物(如選自任何形式的酪蛋白-糖巨肽、微膠粒酪蛋白、氟化微膠粒酪蛋白、粗制凝乳酶處理的乳或細菌素)。所選定菌株的生化特性發酵模式用api 50 CH bioMerieux條帶測試法(bioMérieux SA,69280 Marcy-l’Etoile，法國)對49種單糖進行測試，結果見表1。酸化曲線按下述條件在37℃下確定酸化曲線-表兄鏈球菌OMZ 176:FUM蔗糖1％和FUM葡萄糖1％-嗜熱鏈球菌CNCM I-1985:Belliker蔗糖1％和Belliker葡萄糖1％接種始終是5％；每20分鐘記錄一次pH。
在蔗糖發酵中，嗜熱鏈球菌CNCM I-1985將pH降低至4.5，而表兄鏈球菌OMZ 176將pH降低至4。表1．乳酸乳球菌CNCM I-1987、乳酸乳球菌CNCM I-1986、嗜熱鏈球菌CNCM I-1984、嗜熱鏈球菌CNCMI-1985和嗜熱鏈球菌LMGP-18997的糖發酵。
+,++,+++,++++表示在3、6、24或48小時后開始發酵。
本發明的第二個主要目的與含有乳酸菌的口腔保健組合物有關，該乳酸菌不是口腔內的定居微生物區系的組成部分，它是低度酸化的并能直接粘附于牙表膜。
這類組合物特別用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染。
所述乳酸菌菌株選自嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種、Lactococcus lactis subsp.lactic biovar diacetylactis并優選選自菌株CNCMI-1984、CNCMI-1985、LMG P-18997、CNCMI-1986和CNCMI-1987。
在這類用于口腔保健的組合物中，乳酸菌菌株可如上述一樣經過遺傳學改造。
所述乳酸菌菌株可包含于例如食品、寵物食品、美容或藥用組合物中。
因此，這類組合物優選為例如牙膏、漱口液、口香糖、噴霧劑、飲料、糖果、嬰兒配方、冰淇淋、冷凍甜食、甜沙拉調味品(sweet saladdressing)、奶制品、乳酪、夸克(quark)、酸乳、酸化奶、咖啡稀奶油或攪打起泡的稀奶油(whipped cream)。
在這類組合物中，例如可只含有乳酸菌菌株或使其與乳衍生物結合以獲取協同作用的制劑。因此，這類口腔保健組合物含有-非口腔內定居微生物區系組成部分、能直接粘附于牙表膜的乳酸菌。
-任何形式的乳糖肽(lactic glycopeptide)、粗制凝乳酶處理的乳或細菌素。
所述乳糖肽優選為酪蛋白-糖巨肽(CGMP)，也可加入氟化或非氟化的微膠粒酪蛋白(可按專利EP 0 604 802和EP 0 748 591所述獲得)或粗制凝乳酶處理的乳。加入酪蛋白-糖巨肽的最小量優選為約0.1％。另外還證實該酪蛋白-糖巨肽不能妨礙所述乳酸菌粘附于牙表膜(圖2和圖3)。
也可加入至少一種細菌素制備協同作用的組合物，所述細菌素具有抗口腔革蘭氏陽性菌活性。假使這樣，則所述口腔保健組合物可含有占組合物重量的0.00001到50％，優選0.00001到15％的純細菌素。所述細菌素優選為variacin(EP 0 759 469)。
為防止組合物降解，也可包含油溶性的抗氧化劑。合適的抗氧化劑包括“生育酚”、丁基-羥茴香醚(BHA)、丁基-羥甲苯(BHT)和棕櫚酸抗壞血酸酯。所述油溶性抗氧化劑可以占組合物重量的0.005％到0.5％，優選0.005％到0.01％的量存在。
在本發明牙粉組合物中應用的合適的摩擦劑包括碳酸鈣、鋁硅酸鈣、氧化鋁、水合氧化鋁、正磷酸鋅、塑膠顆粒和二氧化硅，其中二氧化硅是優選的摩擦劑。
根據本發明的組合物將具備口腔可接受的pH并且在此pH下所述乳酸菌的活性未遭損害。該pH可在3.0-9.5的范圍內，優選在3.5-6.5的范圍內。
可用常規方法制備這類組合物，該方法包括將所述成分以適當的成比例的量混合在一起，最后如果需要，將pH調至需要值。
根據本發明的最后一個方面是關于篩選能粘附于牙齒的乳酸菌的方法。該方法包括下述步驟(1)制備能特異性識別可粘附于牙齒的乳酸菌菌株的表面蛋白質的單克隆抗體，和(2)通過應用能粘附于牙齒的菌株的單克隆抗體，篩選任何乳酸菌菌株。
在鄰近生長的其它菌株中，可將該單克隆抗體用作工具以檢測所述乳酸菌菌株。
本發明并不局限于本文所述的具體的實施方案的范圍內。事實上除本文所述的那些之外，本領域技術人員可根據前面的描述和附圖清楚明白對本發明進行的各種修改。這些修改屬于所述權利要求范圍。本文引用了多種公開出版物，其公開內容以理解本發明必須的程度整體引用結合到本文中。除非另有說明，按照Sambrook等(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,U.S.A.,1989)的教科書進行細菌細胞的DNA操作、克隆和轉化。在描述實施例之前，先簡述所用的質粒、菌株和多種培養基以及產生單克隆抗體的方法。
1998年3月3日，根據布達佩斯條約將菌株嗜熱鏈球菌S118(NCC 1529)、S123(NCC 1561)、乳酸乳球菌乳亞種29(NCC 2211)、L.lactis subsp.lactic biovar diacetylactis 69(NCC 2225)保藏于法國國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes,25 reu du docteur Roux,75724 Paris,France)(分別是CNCM I-1984、CNCM I-1985、CNCM I-1986和CNCM I-1987)。1999年7月5日，根據布達佩斯條約將菌株嗜熱鏈球菌BF11116(CNBL 1177)保藏于比利時微生物協調保藏中心(Belgian CoordinatedCollection of Micro-organismes,K.L.Ledeganckstraat 35,B-9000 Gent,Belgium)(LMG P-18997)。關于獲得這些保藏物的所有限制在首次公開本申請或要求本申請優先權利益的另一申請后立即失效。
附圖-

圖1a、1b和1c分別代表表兄鏈球菌OMZ 176、乳酸乳球菌NCC 2211和嗜熱鏈球菌NCC 1561的粘附飽和曲線。-圖2代表結合細胞數對逐漸增加量的CGMP作圖獲取的三種菌株的曲線。-圖3代表結合細胞數對數量逐漸增加的As-CGMP作圖獲得的三種菌株的曲線。
實施例1菌株和培養條件篩選100多種菌株(屬于Nestléculture collection)粘附于唾液-包被的羥基磷灰石珠的能力，特別是下述23種菌株嗜熱鏈球菌YS4(NCC 2284)、嗜熱鏈球菌Sfi6(NCC 1971)、嗜熱鏈球菌Sfi13(NCC2008)、嗜熱鏈球菌Sfi21(NCC 2038)、嗜熱鏈球菌Sfi39(NCC 2130)、嗜熱鏈球菌Sfi42(NCC 2145)、嗜熱鏈球菌Sfi47(NCC 2172)、嗜熱鏈球菌S118(NCC 1529)、嗜熱鏈球菌S119(NCC 1536)、嗜熱鏈球菌S122(NCC 1554)、嗜熱鏈球菌S123(NCC 1561)、嗜熱鏈球菌S126(NCC 1587)、乳酸乳球菌乳脂亞種15(NCC 92)、乳酸乳球菌乳脂亞種25(NCC 1932)、乳酸乳球菌乳脂亞種136(NCC 2419)、L.lactissubsp.diacetylactis 8(NCC 1970)、L.lactis subsp.diacetylactis 28(NCC2057)、L.lactis subsp.diacetulactis 69(NCC 2225)、Lactococcus lactissubsp.lactic biovar diacetylactis 80(NCC 2272)、乳酸乳球菌乳亞種29(NCC 2211)、乳酸乳球菌乳亞種50(NCC 2224)、乳酸乳球菌乳亞種54(NCC 2228)、S.macedonicus 216(NCC 2484)。
5種口腔菌株表兄鏈球菌OMZ 176、口腔鏈球菌OMZ 607、A.naeslundii OMZ 745、V.dispar OMZ 493和F.nucleatum OMZ 596獲自Institute für Orale Mikrobiologie und Allgemeine Immunologie,University of Zürich，并將其在厭氧條件、38℃下培養于FUM培養基(GasPackSystem,BBL)中。
將所有菌株在-20℃下保存于甘油中并于使用前將它們預培養于其特殊的最適溫度下14小時；表兄鏈球菌OMZ 176生長于FUM培養基中(Gmür等)，而乳球菌和鏈球菌生長于M17(Difco)中，但是嗜熱鏈球菌NCC1529、S119、S122、NCC1561和S126生長于Belliker(通過將20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、2.5g明膠、5g葡萄糖、5g蔗糖、5g乳糖、4g氯化鈉、0.5g維生素C、10g牛肉提取物溶于11水中而制備)中。
平板計數將表兄鏈球菌OMZ 176培養于Mitis-Salivarius瓊脂(Difco)中、將嗜熱鏈球菌NCC1529、S119、S122、NCC1561、BF11116和S126培養于Belliker瓊脂(通過向Bellliker液體中加入15g Bacto瓊脂(Difco)而制備)中，其余乳酸菌菌株培養于M17瓊脂(Oxoid)中。實施例2單克隆抗體的制備將單克隆抗體用作工具在5種口腔菌株中檢測乳酸乳球菌乳亞種NCC2211，該5種菌株一起生長于S-HA盤上并形成模擬牙菌斑的生物膜。因此，對這些菌株測試所述單克隆抗體以證實它們之間無交叉反應。
為此，按照Granato等“抗-乳乳球蛋白的小鼠單克隆IgE抗體在胃腸道變態反應中的研究”(Clin.Exp.Immunol.,63,703-710,1986)所述制備該單克隆抗體。實施例3粘附性乳酸菌的篩選對唾液-包被的羥基磷灰石珠(S-HA)的粘附為了在乳酸菌乳品菌株中篩選能粘附于唾液-包被的羥基磷灰石珠(S-HA)上的乳酸菌菌株，應用經過稍許修改的Neeser等以前描述的方法用150μl體積洗滌珠子并用Benzethonium hydroxide(Sigma)代替Hyamine hydroxide。
簡要地說，除了嗜熱鏈球菌NCC1529、S119、S122、NCC 1561和S126生長于Belliker中之外，將所有菌株生長于FUM中至對數生長期末。表兄鏈球菌OMZ 176、乳酸乳球菌乳亞種NCC 2211、50和54、嗜熱鏈球菌NCC1529、S119、S122、NCC1561和S126生長于37℃，其它乳球菌生長于30℃而其它鏈球菌生長于42℃。
將獲自實驗室志愿者并按以前所述(Neeser等，1994)制備的澄清唾液70μl包被5mg羥基磷灰石珠(BDH Chemicals Ltd,Poole,England)。將唾液包被珠在4℃下過夜，然后洗滌(第一次用蒸餾水而以后用HEPES緩沖液)，最后用100μl代謝標記的細菌懸浮物(已將細菌培養于其附加有10μCi/ml14C乙酸的培養基中)接種。在37℃下45分鐘內發生粘附，然后將未結合的細菌洗滌除去并在LKB閃爍計數儀(Rackbeta 1219型)直接計數粘附的細胞。
粘附百分率以結合到所述珠子上的放射活性相對于加入每孔的總放射活性表示。所有的檢測作三個復孔。表2報告了從幾株篩選的菌株和表兄鏈球菌OMZ 176(參比菌株)獲得的粘附于唾液-包被的羥基磷灰石珠的百分率。
表2從篩選的幾株菌株中獲得的粘附于唾液-包被的羥基磷灰石珠的百分率。
嗜熱鏈球菌NCC1529(CNCM I-1984)、嗜熱鏈球菌NCC1561(CNCM I-1985)、乳酸乳球菌乳亞種NCC2211(CNCM I-1986)(在下文中為乳酸乳球菌NCC2211)以及乳酸乳球菌雙乙酰亞種NCC2225(CNCMI-1987)四種菌株顯示的值與表兄鏈球菌OMZ 176的接近。
由于乳酸乳球菌NCC2211和嗜熱鏈球菌NCC1561在37℃即口腔內溫度下生長良好，因此將它們選作更有希望的侯選者，而乳酸乳球菌雙乙酰亞種NCC2225的最適生長溫度是30℃。特別是乳酸乳球菌NCC2211不能在蔗糖中生長，但它能發酵較寬范圍的糖，而且，其它口腔菌株能通過它們的轉化酶提供葡萄糖。粘附飽和曲線檢測結合的菌落形成單位與接種到該孔中的菌落形成單位的曲線以證實珠子可獲得的飽和度。從獲得的曲線的彎曲點(bending point)直接畫出50％飽和度。測定表兄鏈球菌OMZ 176、乳酸乳球菌NCC2211和嗜熱鏈球菌NCC1561的粘附飽和曲線。將它們示于圖1中。
對于所述三種菌株，接種在孔中以獲得50％珠子飽和度的菌落形成單位數和相應的結合菌落形成單位的數可根據該曲線的彎曲點直接推斷出，并在表3中給出其結果。
表3接種到每孔以獲得50％珠子飽和度的菌落形成單位數。
實施例4酪蛋白糖巨肽的作用研究CGMP對乳酸乳球菌NCC2211和嗜熱鏈球菌NCC1561的粘附的影響以證實應用CGMP促進該兩種菌株之一成為相對于致病性菌株(即表兄鏈球菌OMZ 176)的優勢菌株的可能性。酪蛋白-糖肽(CGMP)及其去唾液酸衍生物(As-CGMP)獲自Nestec S.A.,Lausanne(關于其制備參見Neeser等，1994)。
通過將含有不同濃度的CGMP或As-CGMP的細菌懸浮液(相當于前面計算的50％珠子飽和度的菌落形成單位/m1)100μl接種到所述孔中，然后按照常規進行粘附檢測，研究粘附于S-HA珠子上的劑量-反應作用。測試的濃度范圍為0.05-3mg/ml。所述細菌培養先前的培養是在沒有CGMP或As-CGMP存在下進行的。
圖2為結合細胞數對數量逐漸增加的CGMP作圖獲得的三種菌株的曲線，接種細胞數量相當于前面計算的每種菌株的50％珠子飽和度的細菌細胞數。在表兄鏈球菌OMZ 176觀察到的強抑制作用證實了以前由Neeser等(1994)和Schüpbach等(J.Dent.Res.,75,1779-1788,1996)獲得的結果。
如圖2所證實的一樣，0.25mg/ml CGMP對表兄鏈球菌OMZ 176產生50％的粘附抑制，而對嗜熱鏈球菌NCC1561則必需高于2mg/ml才具有相同抑制效果。CGMP能稍許增強乳酸乳球菌NCC2211的粘附。
與CGMP一樣，去唾液酸衍生物抑制表兄鏈球菌OMZ 176的粘附；僅需0.05 mg/ml就導致粘附百分率降低50％。As-CGMP不影響乳酸乳球菌NCC2211的粘附，然而稍許促進嗜熱鏈球菌NCC1561的粘附(圖3)。
這種牙膏用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染。
然后攪打所述混合物，冷卻至4℃，貯存于4℃，使其冷卻至體積膨脹95℃(chilled to a degree of expansion of 95℃ by volume)。
表4
實施例7酸乳將51 MRS培養基在121℃下滅菌15分鐘，隨后接種5％體積、含有大約109菌落形成單位/ml的嗜熱鏈球菌菌株CNCM I-1984、CNCM I-1985或LMG P-18997中的至少一種的活性培養物。在41℃下培養8小時后，獲得的起子培養物含有4.5.108菌落形成單位/ml。
將含有10％干性物質(其中加入了0.1％的酵母提取物)的51復制脫脂乳在121℃下滅菌15分鐘，然后接種2％體積含有大約109細胞/ml的商用增稠的嗜熱鏈球菌的活性培養物。于41℃培養4小時后，獲得的起子培養物含有4.5.108細胞/ml。
用2％(體積)的至少一種菌株CNCM I-1984、CNCM I-1985或LMG P-18997的起子培養物和3％(體積)增稠的嗜熱鏈球菌起子培養物接種一批全乳，該全乳含有3.7％脂肪并用2.5％脫脂奶粉強化，然后于90℃用巴氏法滅菌30分鐘。將該接種的乳攪拌、注入到發酵罐中并在41℃下培養4小時。
獲得的酸奶具有良好的堅實而平滑的口感(texture)并將其用于口腔保健。
Balast化合物0.5％調味品1％實施例9寵物食品組合物通過制備由玉米、玉米麩質的雞肉和魚肉(comgluten chicken andfish meal)、鹽、維生素和礦物質組成的飼料混合物獲得用于口腔保健的寵物食品。將該飼料混合物送入預處理器(preconditioner)并使其濕潤。然后將離開預處理器的潮濕飼料送入擠壓機-蒸煮機(extruder-cooker)并使其成凝膠狀。從擠壓機將凝膠基質壓入模中并擠壓成形。將該擠壓品切成適合給狗喂飼的片狀，在約110℃下干燥大約20分鐘并冷卻成具有約0.6水分活性的顆粒飼料。
用3種包被混合物噴灑顆粒飼料。每種包被混合物含有嗜熱鏈球菌CNCM I-1984、CNCM I-1985或LMG P-18997菌株中的至少一種的活性培養物，但是其中一種包被混合物應用氫化大豆脂作為包被底物、一種包被混合物應用水作為包被底物而一種包被混合物應用蛋白消化產物作為包被底物。該顆粒飼料含有大約104到109菌落形成單位/g的所述菌株。
權利要求
1．用于制備用以預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物的乳酸菌的用途，其中所述乳酸菌不是口腔內定居微生物區系的組成部分，而且它低度酸化并能夠直接粘附于牙表膜。
2．根據權利要求1的用途，其中所述組合物用于替換牙齒的致病菌或防止其粘附。
3．根據權利要求1或2的用途，其中所述乳酸菌的酸化比致病性菌株低，從而使口腔pH約5.5-7。
4．根據任何前述權利要求的用途，其中所述乳酸菌是乳源性的。
5．根據任何前述權利要求的用途，其中至少一種乳酸菌選自嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種和Lactococcus lactis subsp.lactic biovardiacetylactis。
6．根據任何前述權利要求的用途，其中至少一種乳酸菌選自菌株CNCMI-1984、CNCM I-1985、CNCMI-1986、CNCMI-1987和LMGP-18997。
7．根據任何前述權利要求的用途，其中所述乳酸菌通過粘附因子粘附于牙表膜。
8．根據任何前述權利要求的用途，其中所述乳酸菌已經過遺傳學改造以增強其對牙表膜的粘附和/或經遺傳學改造以使其酸化更弱。
9．用于制備用以預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物的乳酸菌的用途，所述乳酸菌不是口腔內定居微生物區系的組成部分，其中所述乳酸菌選自-可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的酸化乳酸菌；-低度酸化并經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜的非粘附性乳酸菌；-經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的非粘附性酸化乳酸菌。
10．根據權利要求8和9的用途，其中所述乳酸菌經遺傳學改造因而可通過粘附因子粘附于牙表膜并使口腔pH約5.5-7。
11．根據任何前述權利要求的用途，其中所述組合物是含有用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的有效量乳酸菌的食用組合物。
12．根據任何前述權利要求的用途，其中所述組合物含有至少104-109cfu/g的乳酸菌。
13．根據任何前述權利要求的用途，其中所述乳酸菌與乳、發酵乳、乳衍生物或細菌素聯合應用。
14．根據權利要求13的用途，其中所述乳衍生物選自任何形式的酪蛋白-糖巨肽、微膠粒酪蛋白、氟化微膠粒酪蛋白或粗制凝乳酶處理的乳。
15．含有乳酸菌的口腔保健組合物，其中所述乳酸菌不是口腔內定居微生物區系的組成部分，而且它低度酸化并能夠直接粘附于牙表膜。
16．根據權利要求15的口腔保健組合物，其中所述乳酸菌已經過遺傳學改造以增強其對牙表膜的粘附和/或經遺傳學改造使其成為更弱酸化的乳酸菌。
17．根據權利要求15或16的口腔保健組合物，其中所述乳酸菌選自-可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的酸化乳酸菌；-低度酸化并經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜的非粘附性乳酸菌；-經遺傳學改造因而可粘附于牙表膜并經遺傳學改造因而是低度酸化的非粘附性酸化乳酸菌。
18．根據任何前述權利要求的口腔保健組合物，其中所述乳酸菌已經過遺傳學改造因而可通過粘附因子粘附于牙表膜并使口腔pH約5.5-7。
19．根據任何前述權利要求的口腔保健組合物，它含有用于預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的有效量乳酸菌。
20．根據任何前述權利要求的口腔保健組合物，它含有至少104-109cfu/g的乳酸菌。
21．一種口腔保健組合物，它含有(1)一種乳酸菌，該乳酸菌為不是口腔內定居微生物區系的組成部分，它能直接粘附于牙表膜并使口腔pH約5.5-7；(2)任何形式的酪蛋白-糖巨肽、微膠粒酪蛋白、氟化微膠粒酪蛋白或粗制凝乳酶處理的乳或細菌素。
22．根據任何前述權利要求的口腔保健組合物，它含有至少一種選自嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種和Lactococcus lactis subsp.lacticbiovar diacetylactis的乳酸菌菌株。
23．根據任何前述權利要求的口腔保健組合物，它含有至少一種選自CNCMI-1984、CNCMI-1985、CNCMI-1986、CNCMI-1987和LMG P-18997的乳酸菌菌株。
24．用于篩選能粘附于牙齒的乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟(1)制備能特異性識別可粘附于牙齒的乳酸菌菌株的表面蛋白質的單克隆抗體，和(2)通過應用能粘附于牙齒的菌株的單克隆抗體，篩選任何乳酸菌菌株。
全文摘要
用于制備預防或治療齲齒、牙菌斑和牙周感染的組合物的乳酸菌以及用其制備的組合物的用途,其中所述乳酸菌不是口腔內定居微生物區系的組成部分,而且它低度酸化并能夠直接粘附于牙表膜。
文檔編號A61K8/99GK1312704SQ99809496
公開日2001年9月12日 申請日期1999年7月26日 優先權日1998年8月12日
發明者J·R·尼斯爾, B·古根黑姆, E·M·科梅利, F·斯廷格勒, P·S·科康賽利 申請人:雀巢制品公司