一種基于熔解曲線分析的口腔致病菌多重pcr檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種對于五種口腔常見致病菌牙齦卟啉單胞菌、幽門螺旋桿菌、具核梭桿菌、變形鏈球菌、金黃色葡萄球菌多重PCR快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]人體口腔微生物群是一個極其復雜的生態系統，包括病毒，真菌，原生動物和細菌，其中以細菌數量多的，統計表明，每毫升唾液中約有I億個細菌，整個口腔中的細菌種類超過600種，目前認為牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌之一，入血后黏附和侵入動脈血管壁所引起的局部炎癥反應，被認為是加速心血管疾病(card1vasculardisease, CVD)動脈粥樣硬化發生發展的重要原因之一；幽門螺旋桿菌作為人體口臭的重要原因，該菌與人體的胃炎、消化性潰瘍及胃癌等疾病有密切聯系；具核梭桿菌是口腔共生菌，但它有潛力致病，有時會引起牙周病，該菌也可能轉移到腸道中，且其在腸道中的豐度與誘發性結直腸癌相關。變形鏈球菌的過度生長容易引發牙髓炎、尖周炎、牙周炎，其患者也可因菌血癥而并發腦栓塞或者細菌性心內膜炎，金黃色葡萄球菌是口腔外感染一種主要致病菌，能夠引起包括誤吸性肺炎、感染性心內膜炎等口腔外感染疾病。
[0003]細菌的分離和培養是針對上述五種口腔致病菌最為傳統的檢測及鑒定方法，這種方法存在明顯的缺陷，不僅培養條件和操作復雜，檢測周期長，且特異性敏感性都受到很大的限制；隨著分子診斷技術的發展，為人們提供多種特異、靈敏和快速的微生物檢測方法，例如基于蛋白質水平發展起來酶聯免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)和蛋白質印跡法(Western Blot，WB)，針對特定微生物制備特異抗體，從而實現對微生物的高效靈敏檢測，該方法較傳統方法有一定的提高，但是存在較高的假陽性率風險，臨床效果不佳；隨著近年來PCR診斷技術的進步和成熟，PCR應用于微生物定性和定量檢測領域越來越受到臨床研究的重視，在傳統PCR系統中，針對特異靶序列設計的寡核苷酸引物進而擴增特異產物并且結合應用于凝膠鑒定、測序分析，或者與限制性酶切技術或者RAPD技術結合可以對特定微生物進行準確、靈敏的鑒定分析，但該類型PCR不僅操作復雜，而且需要對PCR產物進行開管操作，容易引發污染，造成假陽性現象，而且這些類型PCR僅限于單次反應鑒定單個特異靶序列，并且如果需要實現多種口腔致病菌的檢測則需要浪費大量的試劑和時間。

【發明內容】

[0004]為解決上述現有技術操作復雜、檢測周期長、特異性靈敏性受限、假陽性出現率高、需開管操作、易引發污染、檢測效率低、成本高等問題，本發明采用如下技術方案:
本發明提供一種基于熔解曲線分析的口腔致病菌多重PCR檢測方法，其特征在于:采用多重PCR同時擴增口腔致病菌中的牙齦卟啉單胞菌、幽門螺旋桿菌、具核梭桿菌、變形鏈球菌、金黃色葡萄球菌的特異靶序列，再通過改良Taqman探針熔解曲線分析鑒定，實現對于五種口腔常見致病菌多重檢測，具體包括以下三個步驟: 。I)在需要檢測五種口腔致病菌特異靶序列的區域分別設計并制備五條改良的Taqman探針；
2)在每一個設計好的改良Taqman探針外圍分別設計一對引物，包括一條上游引物和下游引物，用該對引物對特異靶序列進行單重單色或多重多色實時熒光定量PCR擴增反應；
3)實時熒光PCR擴增反應后進行熔解曲線分析，根據改良Taqman探針熔點的變化來判斷待檢測核酸序列是否存在以上五種口腔致病菌及其類型。
[0005]作為對本發明的改進，在步驟2)中，所述PCR擴增的單重單色反應體系為單重單色PCR反應緩沖液，所述單重單色PCR反應緩沖液成分如下:
MgcI2I — 10 mM
dNTP0.05 — 1.5 mM
引物混合物0.05 — 2 μ M
探針混合物0.05 — 2 μ M
Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 模板 DNAI — 20 ul
總體積10_100 ul ο
[0006]作為對本發明的進一步改進，在步驟2)中，所述PCR擴增的多重多色反應體系為多重多色PCR反應緩沖液，所述多重多色PCR反應緩沖液成分如下:
MgcI2I — 10 mM
dNTP0.05 — 1.5 mM
引物混合物0.05 — 2 μ M
Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 探針混合物0.05 — 2 μ M
模板 DNAI — 20 ul
總體積10_100 ul ο
[0007]作為對本發明的進一步改進，所述引物混合物成分如下:
牙銀卟啉單胞菌的上游引物為5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙銀卟啉單胞菌的下游引物為5’ -tttggcttccgttctattgg-3’
幽門螺旋桿菌的上游引物為5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’
幽門螺旋桿菌的下游引物為5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭桿菌的上游引物為5’ -ccagctggcattcccttt-3’
具核梭桿菌的下游引物為5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’
變形鏈球菌的上游引物為5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’
變形鏈球菌的下游引物為5’ -tggtggcacagaactaagca-3’
金黃色葡萄球菌的上游引物為5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’
金黃色葡萄球菌的下游引物為5’ -agagccttgctgtgggatta-3’，
所述引物混合物中，每一個引物其5’端均增加一段共同的核酸序列CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，其作用在于提高PCR的靈敏度，特異性，減少引物二聚體的產生(Brownie J , et al.Nucleic acids research, 1997, 25(16): 3235-3241.)。更為重要的是提高PCR體系的退火溫度使其高于寡核苷酸探針Tm值，導致該探針在PCR退火過程探針不易于結合于靶序列，不易被Taq Polymerase切割，保證期在熔解曲線分析中具有足量探針參與反應。
[0008]作為對本發明的進一步改進，所述探針混合物成分如下:
牙銀卩卜啉單胞菌的探針為5’ -catcaccacataccacagatg-3’
幽門螺旋桿菌的探針為5’ -ctgcaacgtgaccattagcag-3’
具核梭桿菌的探針為 5’ -aaaatagcatactttacatattcatttt-3’
變形鏈球菌的探針為5’ -ttggaagagcacgtccaa-3’
金黃色葡萄球菌的探針為5’ -cactttagaattagtg-3’。
[0009]作為對本發明的進一步改進，所述改良Taqman探針是一種在低溫狀態下會形成頸環結構的熒光探針，長度為16-28個堿基，除環上的序列與靶互補外，其臂上堿基也與靶互補。
[0010]作為對本發明的進一步改進，所述改良Taqman探針在5’末端標記焚光基團或淬滅基團，在沒有與把序列雜交時，改良Taqman探針自身形成頸環結構，使熒光基團和淬滅基團相互靠近，熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收，在與把序列雜交時，改良Taqman探針頸環結構解離，使熒光基團和淬滅基團被分離，熒光基團發出的熒光不能被淬滅基團吸收。
[0011]作為對本發明的進一步改進，所述熒光基團包括目前各種常用的熒光標記物，但不限于這些熒光標記物，如 ALEX-350，FAM, VIC, TET，CAL Gold 540，JOE, HEX，CAL FluorOrange 560，TAMRA, CAL Fluor Red 590，ROX, CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL FluorRed 635，Quasar670, CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705 等。
[0012]作為對本發明的進一步改進，所述淬滅基團包括目前各種常用的各種淬滅劑，但不限于這些淬滅劑，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE等。
[0013]本發明的有益效果在于:(I)寡核苷酸探針熔解曲線分析可以在實時熒光PCR擴增反應后直接進行，無需開管操作，也可以在普通PCR進行擴增后轉移到實時熒光PCR儀進行分析；(2)寡核苷酸探針熔解曲線分析屬于非消耗性的檢測，在分析結束后，樣本保持PCR后的狀態，并且可以多次重復分析；(3)寡核苷酸熔解曲線克服在同一熒光通道僅能對其中一種口腔致病菌分析和檢測的限制，根據改良的Taqman探針可以通過熔點的變化可在同一熒光通道來區分多種口腔致病菌特異靶序列；(4)在引物設計上其5端采用一段通用的寡核苷酸序列，其目的在于增加PCR的特異性外，還可以提高PCR體系的退火溫度使其高于寡核苷酸探針Tm值，導致該探針在PCR退火過程探針不易于結合于靶序列，不易被Taq Polymerase切割，保證期在恪解曲線分析中具有足量探針參與反應，另一方面采用Fast Taq Polymerase，該酶被獨特的雙鏈DNA結合蛋白融合修飾，使其具有快速反應的特點使其5’端-3’端外切酶活性變弱，保證期在熔解曲線分析中具有足量探針參與反應。