專利名稱：基因治療方法
技術領域：
本發明涉及基因治療技術在傷口愈合和相關癥狀中的應用。更具體地講，本發明涉及編碼早期生長應答-1(Egr-1)轉錄因子的多聚核苷酸在治療傷口、傷口愈合和相關癥狀中的一個新的應用，如用于治療由局部缺血引起的皮膚潰瘍和與糖尿病、外周動脈閉塞病、深靜脈血栓癥、慢性靜脈功能不全和褥瘡相關的神經病，與如白內障、皮膚移植、燒傷、鱗癬相關的術后瘢痕，加速組織改型和再生；硬組織修復，如骨骼；軟組織修復，如腱、韌帶、肌肉，血管生成的加速，穿皮的經腔冠狀血管成形術之后的上皮再生成，左心室心臟肥大的抑制，血管內壁鈣化的調節和神經再生的調節。
進一步的應用可能包括纖維化癥狀的抑制，如肺部和肝臟纖維化，以及脫發的抑制。
本發明也涉及Egr-1的轉錄及其調節。
皮膚愈合包括廣范圍的細胞、分子、生理和生化事件。在愈合的過程中，細胞遷移到傷口部位，它們在該處增生并合成細胞外基質成分，以便重新構建十分類似于未受損傷的原始組織的組織。該活性由傷口邊緣細胞分泌的介體調節，如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)β和其它細胞因子。這些介體對于細胞的有利作用已經在體外和體內被證實(由Moulin綜述，Eur.J.Cell Biol.68；1-7,1995)，包括對糖尿病大鼠模型施用PDGF的益處(Brown等，J.Surg.Res.56；562-570,1994)。
在過去的五年里，許多生長因子已經顯示出在體外可以加速細胞增殖并在動物模型中可以加速傷口愈合。在傷口修復的領域中，TGFβ已經受到最大重視，因為它能促進細胞增殖、分化和基質產生。在動物模型中，局部或系統地施用TGFβ加速了皮膚傷口的修復(Ashcroft等，自然醫學，3；1209-1215,1997；Sporn和Roberts細胞生物學雜志119；1017-1021,1997；Beck等J.Clin.Invest.92；2841-2849,1993)。同樣地，PDGF已經被報道在局部缺血的組織和糖尿病動物內可以增強上皮再生成和血管的再形成(Uhl等Langenbecks Archiv fur Chirurgie-Supplement-Kongressband 114；705-708,1997及Dirks和Bloemers的綜述，分子生物學報道22；1-24,1996)。
轉錄因子Egr-1是超過30個基因的的潛在調節子，并在生長、發育和分化中擔任重要角色(Liu等的綜述Crit.Rev.Oncogenesis 7；101-125,1996；Khachigian和Collins Circ.Res.81；457-461,1997)。Egr-1是由血管內皮的損傷誘導的(如Khachigian等 科學；271,1427-1431,1996)，并且轉錄活化的目標是多個基因，包括表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子-A(PDGF-A)、堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)、誘導PDGF A、PDGF B、TGFβ、bFGF、尿纖維蛋白酶原活化因子(u-PA)、組織因子和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)。
調節血管內皮生長因子(VEGF)誘導的轉錄復合物是直接依賴于AP2而不是Egr-1(Gille等，EMBO J 16；750-759,1997)。然而，PDGF B直接增量調節VEGF的表達(Finkenzeller Oncogene 15；669-676,1997)。VEGF mRNA轉錄的增強是通過許多因子，包括PDGFB、bFGF、角質細胞生長因子(KGF)、EGF、腫瘤壞死因子(TNF)α和TGFβ1。VEGF已經可以促進瓣膜損傷的動脈內的上皮再生。在兔子中獲得的數據顯示出明顯的VEGF驅動的金屬支架鈍化抑制了支架內新血管內膜的形成，血栓阻塞的發生減少，假肢上皮再生的加速和血管收縮神經活性的提高(van Belle,E.等，Bichem.Biophys.Res.Comm.,235；311-316,1997；van Belle,E，等，J.Am.Coll.Cardiol.,29；1371-1379,1997；Asahara,T.，等，循環，94；3291-3302,1997)。在人類中進行VEGF促進上皮再生的初步研究的NIH批準在1996年獲得通過。另外，在頸動脈干道損傷的大鼠模型中，HGF也已經顯示出可以在瓣膜血管形成術之后促進上皮再生(Nakamura等，摘要1681，美國心臟相關會議；Dallas,1998)。在動物模型中，VEGF驅動的金屬支架的鈍化已經顯示出可以抑制新血管內膜的形成、加速上皮再生和提高血管收縮神經的活性(Asahara等，循環；94,3291-3302)。
VEGF表達已經在愈合傷口和牛皮癬皮膚中被報道，在兩種疾病中TGFα及其配體EGF受體(EGFr)被增量調節。EGF的表達誘導了Egr-1(Iwami等，Am.J.Physiol.270；H2100-2107,1996；Fang等，Calcified Tissue International 57；450-455,1995；J.Neuroscience Res.36；58-65,1993)。目前有軼事樣的證據，即Egr-1可能激活細胞間粘連分子(ICAM-1)在佛波酯激活的B-淋巴細胞內的表達(Maltzman等，分子細胞生物學16；2283-2294,1996)，并且可能由于一個Egr-1結合位點在TNFα啟動子上的存在，而激活TNFα的表達(Kramer等，Biochim.Biophys.Acta 1219；413-421,1994)。最后，Egr-1剔除小鼠為不育及促黃體生成激素(LH)缺陷型(Lee等，科學273；1219-1221,1996)，暗示著LH啟動子可能也是Egr-1活化的一個目標。
骨負重、機械拉伸和類似于造骨細胞的MC3T3E1細胞的液體流動誘導了Egr-1(Dolce等Archs.Oral Biol.41；1101-1118,1996；Ogata細胞生理學雜志170；27-34,1997)，同時伴隨著生長因子的活化。Egr-1的表達在發育小鼠的軟骨和骨中占主要地位(McMahon等，發育108；281-287)，并且已經涉及造骨細胞的生長和分化的調節(Chaudhary等，分子細胞生物化學156；69-77,1996)。Egr-1和與其緊密相關的鋅指轉錄因子Wilm’s腫瘤1(WT1)已經涉及破骨細胞生成(Kukita等，內分泌學138；4384-4389,1997)，而且前列腺環素E2(PGE2)和EGF均由Egr1誘導(Fang等鈣化組織國際57,450-455,1995；Fang等前列腺素、白三烯和必需的脂肪酸54；109-114,1996)。血管鈣化是一種類似于骨形成的活化調節的過程，其包括已知在骨代謝調節中很重要的細胞和因子(Dermer等綜述，Trends Cardiovasc.Med.4；45-49,1994)。造骨細胞生成和/或破骨細胞生成的調節劑可以調節血管壁鈣化的程度。
肥大刺激如血動力負荷和血管收縮素Ⅱ可以被用于驅動主要在一種肌細胞特異性啟動子的控制之下的顯性失活的Egr-1的產生，并且在治療心力衰竭中具有應用。
Egr-1是施萬細胞表達p75神經生長因子(NGF)受體所必需的(Nikam等分子細胞神經科學6；337-348,1995)。NGF誘導Egr-1的表達，同時伴隨著生長因子的活化(Kendall等，腦研究，分子腦研究.25；73-79,1994；Kujubu等，神經科學研究雜志36；58-65,1993)，目前已經發現在受傷的部位施用一種編碼轉錄因子Egr-1的多核苷酸，并隨后表達它，促進了愈合的加速。
因此，依據本發明的第一個方面，提供了一種包括編碼一種Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子在生產一種治療哺乳動物(包括人類)傷口的藥物中的應用。
為了避免任何懷疑，提及一種多聚核苷酸和任何提及一種多聚核酸分子是意義相同的。
依據本發明的第二個方面，提供了一種治療哺乳動物(包括人類)傷口的方法，該方法包括對該哺乳動物施用一種核酸分子，該分子包括一段編碼一種Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列。
依據第三個方面，本發明提供了一種用于治療傷口的核酸分子，其包括一段編碼一種Egr-1轉錄因子多肽或其一段生物活性片段的序列。
在第四個方面，本發明提供了一種藥劑組合物，其包括一種含有一段編碼Egr-1或其一段生物活性片段的序列的核酸分子及其一種或多種在藥理學上可接受的載體。
本發明因此涉及編碼Egr-1轉錄因子的多聚核苷酸在治療傷口中的治療用途。本發明也涉及一種Egr-1轉錄因子本身在治療傷口中的治療用途，如以下更詳細的描述。
本發明涉及來自任何來源或物種的Egr-1多肽和編碼Egr-1的核酸序列的應用。該蛋白序列在物種之間的是高度保守的，例如大鼠和小鼠之間有98％同源性。鼠Egr-1 DNA序列是已知的(細胞，53 37-43(1988))。其推測的氨基酸序列顯示出一段長的開放讀框，終止密碼子(TAA)在1858位上。所推測的氨基酸序列預測是具有533個氨基酸的多肽，分子量為56,596。來自其它物種的相應序列可以通過本領域已知的方法獲得，如通過使用基于或來源于鼠Egr-1序列的低聚核苷酸序列作為探針，篩選基因組或cDNA文庫。已知人類Egr-1位于5號染色體上，更準確地是在5q23-31(細胞53,37-43)。人類Egr-1cDNA的序列如核酸研究18第4283頁，1990中所描述。小鼠和人類的序列在核酸和蛋白水平上的相似性分別為87％和94％。
提及下文所描述的Egr-1多肽和多聚核苷酸對于任何來源的序列是普遍適用的，包括如細胞，53 37-43(1998)中所發表的鼠Egr-1 DNA和相應的氨基酸序列，以及如核酸研究18第4283頁，1990中所發表的人類序列，以及來自其它物種的序列。如以下將要描述的，術語Egr-1也包括Egr-1的變體、片段和類似物。最優選的，是使用人類的序列。
提供以下的說明性解釋以幫助對本說明書中所使用的特定術語的理解。所提供的解釋僅是作為一種方便，而不是本發明的限制。
“治療傷口”包括對與創傷、傷口愈合及其相關癥狀相關的癥狀的治療和促進、增強或加速組織愈合的治療，以及包括治療在糖尿病和外周動脈阻塞疾病中的肢體潰瘍、手術后疤痕、燒傷、牛皮癬，加速組織的重建和骨修復以及促進血管生成、經皮腔內冠狀動脈成形術后的上皮再生成，抑制左心室心臟肥大，調節血管壁鈣化，以及促進神經再生。其進一步包括抑制纖維化的癥狀，如肺部和肝臟纖維化，以及阻止脫發。
本說明書中所說的Egr-1的“生物活性片段”是一段具有Egr-1活性的片段，該活性包括本發明的傷口愈合性質。
“遺傳因子”通常是指一段含有編碼一種多肽的區域的多聚核苷酸，或是一段調節復制、轉錄或翻譯或其它對于該多肽在宿主細胞內體外因子表達很重要的過程的多聚核苷酸區域，或是一種包括一段編碼一種多肽的區域和一段與其操作性連接以調節表達的區域的多聚核苷酸。遺傳因子可以包括在一種作為染色體外因子復制的載體內；也就是，作為一種在物理上獨立于宿主細胞基因組的分子。它們可以包括在質粒內。遺傳元件也可以包括在一種宿主細胞基因組內；但不是處于它們的天然狀態，而是，在如分離、克隆的操作之后以一種純化的DNA的形式轉入到宿主細胞內或存在于一種載體上。
“宿主細胞”是一種已經被轉化或轉染的細胞，或者是可以被一段外源的多聚核苷酸序列轉化或轉染的細胞。
“同一性”，如本領域所公知的，是通過比較序列而確定的，兩種或更多種多肽序列之間或者是兩種或更多種多聚核苷酸序列之間的關系。在本領域中，同一性也表示多肽或多聚核苷酸序列之間的序列相關性，這種情況可以，通過比較這些序列的信息串進行確定。同一性可以容易地被計算(計算的分子生物學，Lesk,A.M.，編輯，牛津大學出版社，New York,1988；生物計算信息學和基因組計劃，Smith,D.W.，編輯，學術出版社，New York,1993；序列數據的計算機分析，第一部分，Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.編輯.，Humana Press,New Jersey,1994；分子生物學中的序列分析，vonHeinje,G.，學術出版社，1987；以及序列分析引物，Gribskov,M.和Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York,1991)。雖然存在許多用來測定兩種多聚核苷酸或兩種多肽序列之間的同一性的方法，但該術語是本領域技術人員熟知的(分子生物學中的序列分析，von Heinje,G.，學術出版社，1987；序列分析引物，Gribskov,M.和Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988))。普遍應用以確定序列之間的同一性的方法包括，但不局限于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所公布的方法。設計確定同一性的優選方法來給出所檢測序列之間的最大比較。確定同一性的方法在計算機程序中被編成法典。確定兩種序列之間同一性的優選計算機程序方法包括，但不局限于，GCG程序包(Devereux,J.，等，核酸研究12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN、和FASTA (Atschul,S.F.等，分子生物學雜志215:403(1990))。
“分離的”表示從其天然狀態“通過人手工”改變；即，如果其是以天然狀態發生時，其已經被改變或從其原始環境被除去，或二者都有。例如，一種天然存在的多聚核苷酸或一種以其天然狀態天然存在于一種生物有機體內的多肽不是“分離的”，但是從其天然狀態的共生物質中被分離出來的同樣的多聚核苷酸或多肽是“分離的”，如該術語在本說明書中被應用。作為分離的一部分或分離之后，這種多聚核苷酸可以與其它多聚核苷酸連接，如DNA，以進行突變，以形成融合蛋白，以及在某一宿主內進行擴增或表達。分離的多聚核苷酸，單獨的或與其它多聚核苷酸序列連接(如以載體的形式)，可以在培養物中或在整個有機體內被引入到宿主細胞內。在培養物或在整個有機體內被引入到宿主細胞內之后，這種DNA仍然是被分離的，如本說明書中所應用的術語，因為它們將不是其天然存在的形式或其環境不是天然存在的組合物，并且，在其中仍然是在本說明書中所用到的術語的含義范圍內的分離的多聚核苷酸或多肽。
“多聚核苷酸”一般是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾過的RNA或DNA或cDNA。因此，例如，本說明書中所用到的多聚核苷酸尤其是指，單或雙鏈DNA、單或雙鏈區域或單、雙和三鏈區域混合物的DNA、單和雙鏈RNA、以及單和雙鏈區域的混合物的RNA、含有DNA和RNA的雜交分子(其可以是單鏈，或更典型地，雙鏈、或三鏈、或單和雙鏈區域的混合物)。另外，本說明書中所用到的多聚核苷酸指包括RNA或DNA或RNA及DNA的三鏈區域。在這些區域中的鏈可以來自相同的分子或不同的分子。這些區域可以包括一種或更多分子的全部，但更典型地是僅包括部分這些分子中的某一個區域。三鏈區域中的一個分子常常是低聚核苷酸。如本說明書中所用到的，術語多聚核苷酸包括如以上所描述的含有一個或多個修飾過的堿基的DNA或RNA。因此，為了穩定或其它原因，其主鏈被修飾的DNA或RNA是“多聚核苷酸”，該術語特意應用在本說明書中。而且，包括以不普遍的堿基(如次黃苷)、或修飾過的堿基(如三苯甲基化的(tritylated)堿基)為兩個實例的DNA或RNA亦屬于本發明的術語多聚核苷酸。應該理解的是已經在DNA和RNA上進行了許多不同的修飾，以實現許多本領域人員所了解的有用的目的。本說明書中所用到的術語多聚核苷酸包括多聚核苷酸的化學、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細胞的DNA和RNA特性的化學形式，尤其包括簡單和復雜的細胞。多聚核苷酸包括短的多聚核苷酸，常常被稱作低聚核苷酸。
“多肽”，如本說明書中所提到的，包括如以下所描述的所有多肽。多肽的基本結構是熟知的，并且已經在無數教科書和其它本領域的出版物中被描述。在本文中，該術語在此處是指包括兩個或更多通過肽鍵以線性鏈狀相互連接的氨基酸的肽或蛋白。如此處所用到的，該術語指短鏈(其在本領域中也常常作例如肽、低聚肽段和低聚體)及較長的鏈(其在本領域通常被稱作蛋白質，其有多種類型)。應該理解的是多肽常常包括除了通常作為20種天然存在的氨基酸提及的20種氨基酸之外的氨基酸，這許多的氨基酸，包括末端氨基酸，可以在特定的多肽內被修飾，或者通過天然的過程，如加工和其它翻譯后的修飾，但也可以通過本領域熟知的化學修飾技術。即使是在多肽內天然發生的常見修飾也是太多，以至無法在本文中列盡，但是它們在基礎課本已被詳細描述并在專題論文中的描述更詳細，以及在大量的研究文獻中被描述，它們對于本領域熟練的人員是熟知的。
在可以存在于用于本發明的多肽內已知的修飾中有，列出少量說明性的，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價結合、血紅素部分的共價結合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結合、脂質或脂質衍生物的共價結合、phosphotidylinositol*的共價結合、交聯，環化、二硫鍵形成、去甲基作用、共價交聯的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI錨定的形成、羥基化、碘化作用、甲基化作用、豆蔻酰化、氧化、蛋白分解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒化作用、硫酸化、轉移RNA介導的氨基酸加入到蛋白中，如精氨酰化，和遍在蛋白化。這些修飾對于熟練人員是熟知的，并且已經在科學文獻中被詳細描述。幾種尤其普遍的修飾，例如糖基化、脂質附著、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化，在大多數基礎課本中被描述，例如，如蛋白-結構和分子特性，第二版，T.E.Creighton,W.H.Freeman和Company,New York(1993)。有許多有關該主題的詳細的綜述，例如，舉例來說，由Wold,F.提供，翻譯后的蛋白修飾觀點和展望，第1-12頁，在蛋白翻譯后的共價修飾中，B.C.Johnson編輯，學術出版社，New York(1983)；Seifter等，酶學方法182:626-646(1990)和Rattan等，蛋白合成翻譯后修飾和成熟，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)。應該理解的是，如所熟知的和以上所指出的，這些多肽并不總是完全線性化的。例如，多肽通常可以是由于翻譯后的事件，包括自然加工事件和由人操作帶來的不是自然發生的事件的結果。環狀的、分支的和分支環狀的多肽可以通過非翻譯自然過程合成，并通過完全合成的方法進行合成。修飾可以發生在多肽的任何位置，包括主肽鏈、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。事實上，通過共價修飾對多肽內氨基或羧基基團的封阻，或二者均被封阻，在天然存在和合成的多肽內是普遍的，并且同樣地，這些修飾可以存在于本發明的多肽內。例如，在大腸桿菌或其它細胞內產生的氨基末端殘基，在蛋白水解加工之前，幾乎常常將是N-甲酰甲硫氨酸。在該肽的翻譯后修飾的過程中，在NH2-末端的一個甲硫氨酸殘基可能被刪除。因此，本發明涉及本發明中的蛋白的含有甲硫氨酸及不含甲硫氨酸氨基末端變體的使用。發生在一段多肽內的修飾受其制備方法的影響。例如，對于通過在一個宿主內表達一個克隆基因制備的多肽，修飾的本性和程度，在很大程度上由宿主細胞的翻譯后修飾能力和存在于多肽氨基酸序列內的修飾信號來確定。例如，如眾所周知的，糖基化常常不在細菌宿主內發生，如，大腸桿菌。因此，當需要糖基化時，一段多肽需要在糖基化宿主內表達，通常是真核細胞。昆蟲細胞常常進行與哺乳動物細胞相同的翻譯后糖基化作用以及，由于這一原因，特別是昆蟲細胞表達體系已經被開發成有效地表達具有糖基化天然模式的哺乳動物蛋白。類似的考慮應用于其它修飾中，應該理解的是相同類型的修飾可以以相同或不同程度存在于一段給定的多肽內的幾個位點上。同樣，一段給定的多肽可以包括多種類型的修飾。通常，如本文中所用到的，術語多肽包含所有這些修飾，尤其是存在于通過在一種宿主細胞內表達一段多聚核苷酸來重組性合成的多肽內的修飾。
術語多聚核苷酸或多肽的“變體”，如本文中所用到的，是分別與一段參考多聚核苷酸或多肽不同的多聚核苷酸或多肽。在這一意義上的變體在本說明書中在下文和別處被更詳細地描述。(1)在核苷序列上與另一段參考多聚核苷酸不同的多聚核苷酸。通常，區別是局限性的，以便參考的核苷酸序列和變體在整體上是十分類似的，并且在許多區域上是相同的。如以下所提到的，在變體的核苷酸序列上的改變可以是沉默的。即是，它們可能不改變由多聚核苷酸編碼的氨基酸。當改變是局限于這種類型的沉默改變時，一種變體多聚核苷酸將編碼具有與參考相同氨基酸序列的多肽。同樣如以下所提到的，在變體多聚核苷酸的核苷酸序列上的變化可能改變由參考多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。這種核苷酸的改變可能導致由參考序列編碼的多肽內的氨基酸的替代、添加、刪除、融合和截短，如以下所討論的。(2)一段在氨基酸序列上不同于另一段參考序列的多肽。通常，區別是局限性的，以至參考和變體的序列在整體上是十分類似的，并在許多區域相同。一種變體和參考多肽可能通過一個或多個替代、添加、刪除、融合和截短而在氨基酸序列上不同，其能以任何組合存在。
“治療/療法”包括任何能夠有利于人類或非人類的動物的方法。治療可能是針對一種存在的癥狀或可能是預防性的(預防性治療)。
“包括/具有”包含任何包括一種特定的特征/特性的事物，以及任何具有該特征/特性的事物，但其也具有一個或多個附加的特征/特性。因此對于一段包括/具有一段給定序列的核酸/蛋白序列，該序列本身包括在內，也同樣是較長的序列。
“同系物”被用來包括一種特定的生物活性分子的任何變體，其具有該分子的一種或多種生物活性。
本發明涉及核酸分子的治療作用，該分子包括一段編碼一種Egr-1多肽的序列。本發明也涉及上述多聚核苷酸序列的編碼某一Egr-1生物活性片段的片段，或該多聚核苷酸序列的變體，其由于遺傳密碼的簡并性，編碼Egr-1的功能(也就是生物活性)片段的治療作用，也涉及由單個或多個堿基替代、添加和/或刪除修飾的、功能等同的等位基因變體和相關序列，其編碼具有Egr-1活性的多肽。
這些可以通過本領域技術人員已知的常規克隆操作獲得。
編碼Egr-1轉錄因子的多聚核苷酸能夠以DNA、cDNA或RNA的形式存在，如通過克隆獲得或通過化學合成技術產生的mRNA。該DNA可以是單或雙鏈。單鏈DNA可以是編碼或有義鏈，或者其可以是非編碼或反義鏈。為了治療的作用，該多聚核苷酸是以可以在被治療的患者的創傷部位表達的功能性Egr-1轉錄因子的形式存在。該多聚核苷酸也可以被用于體外生產Egr-1多肽以在本發明的進一步治療方面進行施用，如以下詳細描述。
本發明的編碼Egr-1轉錄因子多肽的多聚核苷酸可以包括，但不局限于，Egr-1多肽或其生物活性片段的編碼序列。因此，該多聚核苷酸可以同附加的、非編碼序列一起提供，該序列包括，例如但不局限于，非編碼的5’和3’序列，如轉錄、非翻譯的序列，其在轉錄(例如，包括終止信號)、核糖體結合、mRNA穩定因子中起作用，以及編碼附加的氨基酸的附加編碼序列，如提供附加功能的序列。本發明的多聚核苷酸也包括，但不局限于，包括Egr-1的一種結構基因和其天然相關的遺傳因子的多聚核苷酸。
與前述的一致，本說明書中所用到的術語“編碼一種多肽的多聚核苷酸”包括含有一段編碼Egr-1轉錄因子多肽的序列的多聚核苷酸。該術語包括含有一個單獨的編碼該多肽的連續區域或不連續區域(如，被整合的噬菌體或插入序列或編輯打斷)以及附加區域的多聚核苷酸，其也可能含有編碼和/或非編碼序列。
本發明進一步涉及本說明書中以上所描述的多聚核苷酸的變體，其編碼該多肽的片段、類似物和衍生物。該多聚核苷酸的變體可以是一種天然存在的變體，如天然存在的等位基因變體，或其可能是一種未知是天然存在的變體。該多聚核苷酸的這些非天然存在的變體可以通過突變技術構建，包括應用于多聚核苷酸、細胞或有機體中的技術。
在這一方面的變體中，是不同于上述的通過核苷酸替代、刪除或添加得到的多聚核苷酸的變體。這些替代、刪除或添加可以涉及一個或多個核苷酸。這些變體可能在編碼或非編碼區域或同時在這兩個區域改變。在編碼區域的改變可能產生保守或非保守的氨基酸替代、刪除或添加。
本發明中進一步優選的實施例是其全長與編碼一種具有Cell5337-43(1988)中列出的氨基酸序列(小鼠序列)的多聚核苷酸具有至少70％同一性的多聚核苷酸，更優選的是其全長與核酸研究18 4283,1990中的編碼人cDNA序列和與其(人序列)互補的多聚核苷酸具有至少70％同一性的多聚核苷酸，以及與這些多聚核苷酸互補的多聚核苷酸。可選地，最高度優選的是其所含有的一段區域的全長與一種編碼本發明中的多肽的多聚核苷酸具有至少80％同一性的多聚核苷酸。在這一點上，其全長與相同的多聚核苷酸具有至少90％同一性的多聚核苷酸是尤其優選的，在這些尤其優選的多聚核苷酸中，至少具有95％同一性的是特別優選的。此外，在具有至少95％的多聚核苷酸中至少具有97％的是高度優選的，在這些中間至少具有98％和至少具有99％是尤其高度優選的，至少具有99％的是更優選的。
此外，在這一點上優選的實施例是，其編碼的多肽在本質上保留與Cell 63 37-43(1988)中列出的鼠DNA序列所編碼的鼠Egr-1多肽(更優選的是由核酸研究18 4283,1990中列出的人序列所編碼的多肽)具有相同的生物功能或活性的多聚核苷酸。
本發明進一步涉及與本說明書中以上所描述的序列雜交的多聚核苷酸。在這一點上，本發明尤其涉及在嚴格條件下與本說明書中以上所描述的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。如本說明書中所用到的，術語“嚴格條件”是指如果在兩段序列在之間存在至少95％及優選的是至少97％的同一性，則將發生雜交。優選的，以這種方式與本發明中的序列雜交的序列所編碼的多肽具有Egr-1的生物活性。
這些多聚核苷酸所編碼的多肽可能是成熟的蛋白加上附加的氨基或羧基末端氨基酸。這些附加的序列可能起作用，尤其是如可能加長或縮短蛋白的半衰期，或可能簡化蛋白的加工以利于分析或生產。在體內條件下通常是，附加的氨基酸可能通過細胞內的酶從成熟蛋白上切除。
本發明中用于基因治療方面的多聚核苷酸可能單獨提供，或者作為某一載體的部分，如一種表達載體，其例子在本領域中是熟知的。
一種編碼Egr-1的多聚核苷酸可以用本發明中的方法通過基因治療發揮治療作用，其中該多聚核苷酸以其可以在原位指導Egr-1(或其一段生物活性片段)產生的形式被施用到創傷位置或其它需要愈合的組織。據信，Egr-1通過活化涉及傷口愈合的基因來促進傷口愈合，如VEGF、PDGF、EGF、TGFβ、堿性成纖維細胞生長因子、UPA和組織因子的基因。
優選的是在基因治療中，施用該多聚核苷酸以至其在被治療的患者體內表達，如以重組DNA分子的形式，該DNA分子包括如在一種表達載體內的一段編碼Egr-1的多聚核苷酸和與其操作性連接的一段控制表達的核酸序列，這種載體因此將含有適當的轉錄控制信號，包括可以表達編碼序列的啟動子區域，上述啟動子可以在被治療的患者體內發揮功能。因此對于人類基因治療來說，啟動子這一術語不僅包括對于指導RNA聚合酶到轉錄起始位點是必需的序列，而且包括，如果適當的話，還包括其它操作或控制序列包括增強子，優選的是來自一種人類基因的人類啟動子序列，或者是來自在人體內典型表達的基因，如來自人類巨細胞病毒(CMV)的啟動子。在已知的真核啟動子中，在這一點上合適的啟動子有CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒LTRs啟動子(如羅斯肉瘤病毒(“RSV”)的啟動子)、和金屬硫蛋白啟動子(如小鼠金屬硫蛋白-1啟動子)。
如以下更詳細的討論，可以使用天然Egr-1啟動子。本發明人已經發現已發表的人類Egr-1啟動子的序列是不正確的，并且已經提供了一個新的序列，其與上述已發表的序列存在多處不同。
可以提供克隆到可復制的質粒載體上的一段多聚核苷酸序列和轉錄操縱序列，該載體以商業上提供的載體為依據，如pBR322，或者可以通過熟知的、已發表的方法的常規應用從現有載體中構建。
該載體也可以包括轉錄控制信號，位于Egr-1編碼序列的3’端，也包括多腺苷酸化信號，在被治療的患者體內是可識別的，例如，舉例來說，來自病毒的相應序列如，用于人類治療的SV40病毒。其它轉錄操縱序列在本領域中是熟知的并可以被使用。
表達載體也可以包括選擇性標記，如抗生素抗性，其使載體可以繁殖。
能夠在原位合成Egr-1的表達載體可以通過物理方法直接引入到創傷位置。這些例子包括局部施用在合適的媒介物內“裸露的”核酸載體，如溶解在治療上可接受的賦形劑(如磷酸緩沖鹽(PBS))內，或通過物理的方法施用載體，如顆粒轟擊，也就是所知的“基因槍”技術，依照本領域已知的方法，如在US-5371015中所描述的，其中的惰性顆粒，如用載體包裹的金顆粒憑借在高壓下從一個發射裝置中發射，以足夠的速度被加速，使得它們可以在受傷位置(如皮膚細胞)穿透表面。(用本發明中的核酸分子包裹的顆粒在本發明的范圍內，同樣地，含有這些顆粒的設備也包括在本發明的范圍內。)其它直接將DNA施用到接受者體內的物理方法包括超聲、電刺激、電穿孔和微量接種。
尤其優選的是微量接種的傳遞模式，其是在原位將遺傳物質傳遞到患者體內的一種系統。該方法在美國專利編號5,697,901中描述。
用于本發明治療的編碼Egr-1的核酸序列也可以通過傳遞載體的方法施用。它們包括病毒傳遞載體，如本領域已知的腺病毒或逆轉錄酶病毒傳遞載體。
其它非病毒傳遞載體包括脂質傳遞載體，包括本領域已知的脂質體傳遞運載體。
一種編碼Egr-1的核酸序列也可以通過轉化宿主細胞的方式施用到受傷位置。這些細胞包括從患者體內收集到的細胞，該核酸序列被引入到其中是通過本領域已知的基因運載的方法，接著通過在培養基中生長該細胞并移植到該患者體內。
如以上所描述的表達構建物可以通過多種途徑應用于本發明中的治療上。因此，它們可以直接施用到患者的受傷部位，或者它們可以被用于制備重組的Egr-1轉錄因子，然后其本身可以如以下所更詳細討論地施用到受傷部位。本發明也涉及宿主細胞，用含有Egr-1多聚核苷酸或本發明中的多聚核苷酸或上文中所定義的遺傳因子的構建物對所述細胞進行遺傳工程改造，本發明也涉及這些載體和細胞在本發明的治療方法上的應用。這些構建物本身可以被用于本發明的治療方法中，或者它們可以被用于構建一種在本發明的治療方法上使用的Egr-1多肽，如以下更詳細的描述。
該載體可以是，如，一種質粒載體，一種單鏈或雙鏈噬菌體載體、一種單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體，依賴于該載體是否直接使用到受傷部位(也就是，用于在原位合成Egr-1)，或者可以被用于合成重組的Egr-1。本說明書中所公布的起始質粒是商業上提供的、公開提供的、或者可以通過熟知的、已公開的方法操作從現有的質粒構建。可用于本發明的許多質粒和其它克隆和表達載體是熟知的，并且對于本領域熟練的人員是很容易得到的。
通常，用于表達一種在本發明中使用的Egr-1多肽的載體包括順式操作調控區域，它與待表達的多聚核苷酸操作性連接，對在宿主內的表達有利。合適的反式作用因子由宿主提供、由一種互補的載體提供或者由將其引入到宿主內的載體本身提供。
在這一點上的特定實施例中，這些載體提供了特定的表達。為了產生重組的Egr-1，這種特定的表達可以是可誘導的表達、或者是僅在特定類型的細胞內表達、或者既可誘導又具細胞特異性。在可誘導的載體中尤其優選的是易于操縱的環境因子(如溫度或營養添加劑)誘導表達的載體。適用于本發明的這一方面的多種載體，包括用于原核和真核宿主的組成型和可誘導的表達載體，它們是熟知的并且是本領域的熟練人員常規使用的。
很多種表達載體可以被用于表達在本發明中使用的Egr-1。這些載體包括，尤其是，染色體、游離體和病毒衍生的載體，如來自細菌質粒、來自噬菌體、來自轉座子、來自酵母游離體、來自插入因子、來自酵母染色體因子、來自病毒(如桿狀病毒、乳頭多瘤空泡病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、家禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉錄病毒)的載體，以及來自組合的載體，如來自質粒和噬菌作遺傳因子的載體，如粘粒和噬菌粒，所有這些載體可以依據本發明的該方面用于表達。通常，任何適于在一種宿主內維持、繁殖或表達多聚核苷酸以便在宿主中表達一種多肽的載體在這一點上均可以被用于表達。
適當的DNA序列可以通過多種熟知和常規技術中的任何一種插入到載體內，如，例如，在Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所列出的技術。
表達載體內的核酸序列與合適的表達操縱序列(包括，例如，指導mRNA轉錄的啟動子)操作性連接。這些啟動子的代表包括，但不局限于，噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子，用于重組表達，及SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTRs啟動子用于原位表達。
通常，表達構建物將包含轉錄起始和終止的位點，以及，在轉錄區域，將包含用于翻譯的核糖體結合位點。由構建物表達的成熟轉錄產物的編碼部分將在開始包括翻譯起始AUG，并在被翻譯的多肽末端包括一個在合適位點的終止密碼子。
另外，該構建物可能包括調控及誘發表達的操縱區域。通常，依據許多常用的操作，這些區域將通過控制轉錄進行操作，尤其如轉錄因子，抑制結合位點和終止。
用于繁殖和表達的載體通常將包括選擇性標記和擴增區域，如，例如，在Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所列出的。
用于重組表達Egr-1的合適宿主的代表性的例子包括細菌細胞，如鏈球菌屬、葡萄球菌屬、大腸桿菌、鏈霉菌屬和枯草芽孢桿菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞和曲霉菌細胞；昆蟲細胞如果蠅屬S2和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。
以下載體，其為商業上可供的，通過舉例的方式提供。在載體中，用于細菌中優選的是pQE70、pQE60和pQE-9,Qiagen有售；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A,Stratagene有售；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5,Pharmacia有售，以及pBR322(ATCC 37017)。優選的真核載體中有pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1以及pSG,Stratagene有售；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL,Pharmacia有售。列舉這些可以被用于重組表達及用于原位表達載體，只是作為在多種商業上提供的載體的說明的，并且是本領域熟練的人員可以利用以依據本發明的該方面進行應用的熟知載體。應該了解的是其它適于，如，在某一宿主內引入、維持、繁殖或表達多聚核苷酸或多肽以用于本發明中的治療的質粒或載體可以在本發明的這一方面被利用。
用于本發明中這一方面的載體的例子包括表達載體，其中的Egr-1cDNA序列被插入到某一質粒內，藉此基因表達由人立即早期巨細胞病毒增強子-啟動子驅動(Foecking和Hofstefter，細胞，45,101-105,1986)。這些表達質粒可以包括SV40 RNA加工信號，如多聚腺苷酸化和終止信號。商業上提供的使用CMV啟動子的表達構建物有pCDM8、pcDNA1及其衍生物、pcDNA3及其衍生物(Invitrogen)。其它可供的且可以使用的表達載體有pSVK3和pSVL，其含有來自SV40(pSVK3)的SV40啟動子和mRNA剪接位點以及多聚腺苷酸化信號，以及SV40 VP1加工信號(PSVL；來自Pharmacia的載體)。
啟動子區域可以從任何理想的基因中選取，使用的載體含有一個缺乏啟動子區域的報告轉錄單元，如氯霉素乙酰基轉移酶(“CAT”)轉錄單元、限制性酶切位點的下游或用于引入一個候選的啟動子片段的位點；即，一段可以含有一個啟動子的片段。眾所周知，在cat基因上游的限制性酶切位點處將一段含有啟動子的片段引入載體會引起CAT活性的產生，其可以通過標準的CAT分析檢測。適于此目的的載體是熟知及容易得到的，如pKK232-8和pCM7。用于表達在本發明的治療中使用的多聚核苷酸的啟動子不僅包括熟知和容易獲得的啟動子，而且包括容易通過前述的技術(使用一種報告基因，用于原位表達)獲得的啟動子，這種啟動子在被治療的患者體內將如所希望地被識別。
在已知的原核啟動子中，適合表達本發明治療方法中的多聚核苷酸和多肽的啟動子有大腸桿菌1acl和1acZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、λPR啟動子、PL啟動子和trp啟動子。
重組的表達載體將包括，例如，復制的起點、一個啟動子(優選的是來自高度表達的基因，以指導下游結構序列的轉錄)、和一個選擇性標記以使得在載體進入之后可以分離含有載體的細胞。
用于本發明的治療中的多聚核苷酸，編碼本發明中的多肽的異源結構序列，通常可以采用常規的技術被插入到載體內，以與啟動子操作性連接來用于表達。該多聚核苷酸將被定位使得轉錄起始位點大約位于核糖體結合位點的5’端。該核糖體結合位點將位于起始將被表達的多肽翻譯的AUG的5’端。
通常，沒有其它的開放讀框是從起始密碼子(常常是AUG)開始的，它位于核糖體結合位點和起始密碼子的中間。而且，通常，在多肽的末尾將有一個翻譯終止密碼子，并且在構建物中將有一個多聚腺苷酸信號以用于真核宿主。適當地位于轉錄區域的3’末端的轉錄終止信號也可以包括在多聚核苷酸構建物內。
為了將所翻譯的蛋白分泌到內質網的內腔、壁膜間隙或到細胞外的環境中，可以在重組性合成時將適當的分泌信號結合到所表達的多肽內。這些信號可以是該多肽的內源，信號，或者它們可以是異源信號。
該多肽可以以修飾的方式表達，如融合蛋白，也可以不僅包括分泌信號還包括附加的異源功能區域。因此，例如，一段附加氨基酸的區域，尤其是帶電荷的氨基酸，可以被加到該多肽的N-或C-末端，以在純化或在后來的操作和貯存中提高在宿主細胞內的穩定性和持久性。而且，也可以在多肽中加上一段區域以利于純化。這些區域可以在多肽的最后制備之前被除去。尤其是在多肽中加入肽部分引起分泌和排除，以提高穩定性或便于純化，是本領域熟悉的常規技術。一種優選的融合蛋白包括一段來自免疫球蛋白的異源區域，其對于溶解和純化多肽是有利的。然后典型地是通過離心收集細胞，通過物理或化學的方法破碎，保留所得到的粗提物以進行進一步的純化。
用于蛋白表達的微生物細胞可以通過任何簡便的方法破碎，包括凍融循環、超聲、機械破碎、或使用細胞溶解劑，這些方法是本領域的熟練人員所熟知的。
哺乳動物表達載體可以包括一個復制起點、一個合適的啟動子和增強子、也包括任何必要的核糖體結合位點、多聚腺苷酸區域、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列、以及表達所必需的5’端側翼非轉錄序列。
為了制備用于本發明的Egr-1多肽，可以使用遺傳工程構建的宿主細胞。將一段多聚核苷酸引入到宿主細胞可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖調節的轉染、轉位、微量注射、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、刮削負荷(scrape loading)、轟擊引入、感染或其它方法。這些方法在許多標準的實驗室手冊中有描述，如Davis等，分子生物學基本方法，(1986)和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)。
成熟的蛋白可以在適當的啟動子的操縱下，在宿主細胞內表達，宿主細胞包括哺乳動物細胞(如CHO細胞)、酵母、細菌、或其它細胞。也可以采用無細胞翻譯系統來生產這些蛋白，使用來自本發明的DNA構建物的RNA。與原核和真核宿主一起使用的適當的克隆和表達載體報露于Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
該多肽可以通過熟知的方法從重組的細胞培養物中回收和純化，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優選的，采用高效液相層析進行純化。當多肽在分離和純化過程中被變性時，可以采用熟知的重折疊蛋白的技術以再生活性構象。
為了治療，編碼Egr-1的多聚核苷酸，如以重組載體的形式，可以通過本領域已知的技術純化，如通過Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)中所描述的柱層析的方法。
如以上所顯示的，Egr-1可以在受傷位點作為Egr-1編碼核酸進行施用，該核酸本身在受傷位點以基因治療的形式被轉錄并翻譯成Egr-1，或者該轉錄因子本身可以直接被施用。
因此，依據本發明的第五個方面，提供了Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段在生產一種用于治療哺乳動物(包括人類)傷口的藥物上的應用。
依據本發明的第六個方面，提供了一種治療哺乳動物(包括人類)傷口的方法，該方法包括對該哺乳動物施用治療上有效劑量的Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段。
在第七個方面，本發明提供了一種Egr-1轉錄因子或其生物活性片段的施用，將其應用于治療傷口及傷口愈合。
在第八個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包括Egr-1轉錄因子或其生物活性片段，及其一種或多種藥用載體。
如本說明書中所用到的，術語“Egr-1轉錄因子多肽”包括天然或重組產生的Egr-1轉錄因子，其天然的、合成的和生物活性多肽類似物或變體或衍生物，或其生物活性片段，以及上述片段的變體、衍生物和類似物。
包括Egr-1轉錄因子的生物活性片段的Egr-1轉錄因子蛋白產物可以通過本領域已知的常規技術產生和/或分離。
用于本發明中的治療的Egr-1及其上述的片段和衍生物可以通過工藝上已知的方法從天然來源中抽提。這些方法包括通過序列特異性的DNA親和層析進行純化，采用Briggs等，科學234,47-52,1986中所描述的方法，使用一種識別Egr-1的DNA結合低聚核苷酸。該多肽的制備也可以通過如以上所描述的本領域已知的重組DNA技術的方法，即，通過在宿主細胞內表達所描述的構建物。可選地，本發明中的多肽可以通過常規的肽合成儀合成產生。
本發明也涉及Egr-1的片段、類似物和衍生物的使用。術語“片段”、“衍生物”和“類似物”表示一種基本上保留與這種多肽一樣的生物功能或活性的多肽。因此，一種類似物包括一種前蛋白，其可以通過切除前蛋白部分被激活以形成活化的成熟多肽。
該多肽的片段、衍生物或類似物可以為(ⅰ)其中的一個或多個氨基酸殘基被一個保守的或非保守的氨基酸殘基(優選的是一個保守的氨基酸殘基)替代、并且這些替代的氨基酸殘基可能是或可能不是被遺傳密碼編碼的殘基的多肽，或者(ⅱ)其中的一個或多個氨基酸殘基含有一個取代基的多肽，或者(ⅲ)其中的成熟多肽與另一種化合物融合、如一種提高該多肽的半衰期的化合物(如聚乙二醇)的多肽，或者(ⅳ)其中附加的氨基酸被融合到成熟的多肽內、如一段前導或分泌序列或一段用于成熟多肽的純化的序列或一段前蛋白序列的多肽。從本說明書中的指導來看，這些片段、衍生物和類似物被認為是在本領域熟練的人員的知識范圍之內。
優選的變體是通過保守氨基酸的替代而與天然發生的Egr-1不同的變體。這些替代是在一段多肽序列內用具有類似性質的另一種氨基酸替代一種給定的氨基酸。典型地作為保守替代的是替代，在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中，一種換成另一種；羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的互換，酰胺殘基Asn和Gln之間的替換，堿性殘基Lys和Arg之間的互換，以及芳香殘基Phe、Tyr之間的替代。
在這一點上進一步尤其優選的是變體、類似物、衍生物和片段，以及該片段的變體、類似物和衍生物，具有該多肽的氨基酸序列，其中幾個，一些，5到10個，1到5個，1到3個，2個，1個或沒有氨基酸殘基被替代、刪除或添加，以任何方式組合。這其中尤其優選的是沉默替代、添加和刪除，其不改變本發明中的多肽的性質和活性。在這一點上也尤其優選的是保守的替換。
尤其優選的片段是生物活性片段，即保留親本多肽的傷口愈合特性的片段。
在本發明中有用的多肽和多聚核苷酸優選的是以分離的形式提供，并且優選的是被純化以具同質性。
用于本發明的Egr-1多肽包括Egr-1多肽以及與如細胞53 37-43(1988)中所列出的鼠多肽序列和與由人序列編碼的多肽具有至少70％同一性，優選的至少80％同一性以及更優選的至少90％以上的同一性，以及更加優選的是至少95％相似性(更優選的是至少99％同一性)的多肽，并且也包括這些多肽的部分，多肽的這些部分通常含有至少30個氨基酸，更優選的是至少50個氨基酸。
在本發明的治療中有用的多肽的片段或部分可以被用于通過肽合成構建相應的全長多肽；因此，這些片段可以作為中間物采用以構建全長的多肽。在本發明中有用的多聚核苷酸的片段或部分可以被用于合成在本發明中有用的全長多聚核苷酸。
本發明也涉及本說明書中以上所定義的Egr-1多肽的片段和變體的片段及其衍生物的應用。
在這一點上，一段片段是一段所具有的氨基酸序列與Egr-1多肽及其變體或衍生物的部分(而不是全部)氨基酸序列完全相同的多肽。
這些片段可以是“獨立式的”，也就是，不是其它氨基酸或多肽的部分或與其融合，或者它們可以包括在一段較大的多肽內，它們形成其中的一個部分或區域。當包括在一段較大的多肽內時，目前所討論的片段最優選的是形成一個單獨的連續區域。然而，幾個片段可能包含在一個單個的較大多肽內。例如，特定優選的實施例涉及本發明中一種多肽的一個片段，該片段包含在涉及用于在某一宿主內表達的前體多肽內，該多肽具有與該片段的氨基末端融合的異源前體和原體多肽以及一段與該片段的羧基末端融合的附加區域。因此，片段在本說明書中所特指的意義一方面是指，來源于本發明的一種多肽的一段融合多肽的部分或多個部分，或者是融合蛋白。
在本發明的這一方面也優選的是其結構和功能特性屬于在本發明的治療中有用的多肽的片段。在這一點上，本發明中優選的實施例是含有本發明中的多肽的以下片段α-螺旋和形成α-螺旋的區域、β-片層和形成β-片層的區域、轉角和形成轉角的區域、卷曲和形成卷曲的區域、親水區域、疏水區域、α兩性區域、β兩性區域、柔性區域、表面形成區域、底物結合區域、和本發明多肽的高抗原性指數區域，及這些片段的組合。
優選的區域是調節本發明中多肽的活性的區域。在這一點上最優選的是具有本發明中的多肽的化學、生物或其它活性的片段，包括具有類似的活性或提高的活性，或具有降低了的所不希望的活性的片段。進一步優選的多肽片段是包括或含有在某一哺乳動物(尤其是在人類)體內的抗原或免疫原決定簇的片段。
應該理解的是本發明也涉及，尤其是，編碼上述片段的多聚核苷酸、與編碼該片段的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸，尤其是在嚴格條件下雜交的多聚核苷酸，以及，如PCR引物，用于擴增編碼該片段的多聚核苷酸。在這一點上，優選的多聚核苷酸是與如以上所描述的優選的片段相應的多聚核苷酸。
本發明這一方面的進一步實施例包括其在生物學、預防學、臨床醫學或治療學上有用的變體、類似物或衍生物、或片段，包括變體、類似物和衍生物的片段及含有相同片段的組合物。生物活性變體、類似物和片段包括在本發明的范圍之內。
本發明也涉及含有以上所描述的多聚核苷酸或多肽的組合物。因此，本發明中的多聚核苷酸或多肽可以與治療上可接受的載體或多種載體結合使用。
這些載體可以包括，但不局限于，鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合。
多肽和多聚核苷酸在本發明中可以單獨或與其它的化合物(如治療化合物)結合使用。
這些藥用組合物能夠以任何有效、方便的方式有效地施用到靶傷口位點，包括，如，尤其是通過局部、靜脈內、肌肉內、鼻內或真皮內的途徑施用。通常，這些組分可以在原位應用于受傷或相關癥狀。
在治療中或作為一種預防藥物，該活性藥劑可以以一種可注射的組合物施用給患者，如作為一種無菌的水分散體，優選的是等滲的。
可選地，該組合物可以被配制用于局部使用，如以軟膏、乳膏、外用藥水、眼藥膏、滴眼藥、滴耳劑、嗽口水、浸漬的敷料和縫合及氣溶膠的形式，也可以含有適當的傳統添加劑，包括，如，防腐劑，輔助藥物滲入的溶劑，以及在軟膏和乳膏中的軟化劑。這種局部的制劑也可以含有適當的傳統載體，如乳膏或軟膏基質，及乙醇或油醇用于洗滌。這些載體可以組成制劑質量的大約1％至大約98％；更通常的是它們將構成制劑質量的80％。
為了施用到哺乳動物，尤其是人類，期望的是活性藥劑的日劑量水平從大約0.01毫克/千克到10毫克/千克，代表性地是大約1毫克/千克。內科醫生在任何情況下將確定最適于某患者的確切劑量，這將依據特定患者的年齡、體重和應答而不同。以上劑量是可模仿的平均情況。當然，存在個別病例中需要較高或較低的劑量范圍，這在本發明的范圍之內。
作為第九個方面，提供了一種含有Egr-1轉錄因子或含有編碼Egr-1的序列的核酸分子及其一種或多種治療上可接受的載體的藥劑組合物。
使用轉錄因子在加速傷口愈合上的治療優越性在于多個促進加速愈合的靶基因的活化。Egr-1在響應受傷中天然活化，并且增強該天然應答也是有利的。該治療是以DNA為基礎的，其提供了一種可靠且可再現的傳遞系統。
當一種Egr-1多聚核苷酸被用于本發明的治療方法中時，該多聚核苷酸可以作為一種表達構建物的部分使用，如以一種表達載體的形式。在這種方法中，該構建物被引入到受傷位點，Egr-1在該處原位產生。這些所使用的構建物可以是標準的載體和/或基因傳遞系統，如脂質體、受體調節的傳遞系統和病毒載體。
本發明適于傷口愈合的所有方面，包括在糖尿病和末梢動脈閉塞病中的四肢潰瘍、手術后疤痕、燒傷和牛皮癬。
如以上所描述的，本發明中的Egr-1多肽或核酸可以通過任何簡便的方法原位施用到組織損傷的位點，如通過局部施用。一種傳遞核酸產物的方法是使用基因槍技術，其中Egr-1分離的核酸分子，如，以cDNA的形式或在一個表達載體內，被固定在金顆粒上并直接射入受傷位點。因此，作為本發明的一個優選的方面，提供了一種含有編碼Egr-1的序列的核酸分子在基因槍內的使用，以用于治療傷口。而且，提供了一種適于基因槍治療的組合物，其包括一種編碼Egr-1轉錄因子的序列和金顆粒。
然而傳遞本發明中的核酸或多肽優選的是通過如美國5,697,901中所描述的微量接種的方法。
如以上所提到的，包括一段編碼Egr-1或其生物活性片段的序列的多聚核苷酸，可以在至少一部分天然Egr-1啟動子(優選的是人Egr-1啟動子)的控制之下。
鼠Egr-1啟動子已經被分離并測序(Morris，核酸研究，16:8835-3346)。潛在的調控序列包括在-26到-22位上的一段AAATA因子(一種“TATA”樣的類似物)；在-337到-333位上的一段CCAAT盒子；在-110到-91、-342到-324、-358到-339、-374到-355及-412到-393位上的五個血清應答因子(SRE)；在-610到-603及-867到-860位上的兩個Ap1位點；在-285到-280、-649到-644、-700到-695及-719到-714位上的四個Sp1位點；以及在-138到-131和-631到-624位上的兩個cAMP應答因子。Egr-1已經表現出與鼠Egr-1啟動子結合及減量調節其自身表達的轉錄。該啟動子的序列在附圖的圖9中列出。
關于人類Egr-1啟動子的調控了解較少。已經提供了一種可能的人類Egr-1序列。將mRNA起始位點視為+1，已經鑒定出上游序列的695個核苷酸。這段上游序列包括一個在-26到-22位的AAATA因子(一種“TATA”樣的類似物)，以及多個潛在的調控因子，包括-505到-499位和-647到-642位的兩個Sp1位點；在-134到-127位和-630到-623位的兩個環化AMP應答因子；在-108到-89、-344到-326、-359到-340、-376到-357和-410到-394位的五個血清應答因子；在-597到-589的一個Egr-1結合位點(EBS)以及在-609到-602位的一個十四烷酰佛波乙酯(TPA)應答因子(Ap1結合位點)。已知TPA結合位點是有功能的，因為TPA刺激質粒表達氯霉素乙酰基轉移酶基因。SRES3和4已經表現出調節Egr-1啟動子對切變應力的應答，并且可以將切變應力應答傳給SV40啟動子。從人啟動子因子中刪除EBS導致該啟動子切變應力應答的增強，由此支持了Egr-1在減量調節人啟動子活性中的作用。
本發明人也發現已發表的有關人Egr-1啟動子的序列是不正確的，并且提供了一種與上述已發表的序列具有多處區別的新的序列。這些序列的區別是無法提前預知的，并且至少其中有一部分被認為是功能上重要的。而且，本發明者們已經提供了一段完整的序列，然而所報道的人Egr-1啟動子序列包括多個缺口。
因此，包括編碼Egr-1或其一段生物活性片段的序列的核酸分子可以與一段核酸序列操作性連接，該序列a)具有一段含有圖7中所提供的GW SEQ序列的鏈；或者b)相對GW SEQ而言，具有包括一個或多個刪除、插入和/或替代的鏈，但是其不含有圖7中作為ON SEQ顯示的序列，以及其也不含有圖9中所顯示的序列；或者根據本發明的第十個方面，提供了一段核酸分子a)具有一段含有圖7中所提供的GW SEQ序列的鏈；或者b)相對GW SEQ而言，具有包括一個或多個刪除、插入和/或替代的鏈，但是其不含有圖7中作為ON SEQ顯示的序列，以及其也不含有圖9中所顯示的序列；或者c)具有與以上a)或b)中所描述的鏈雜交的鏈。
在以上a)、b)或c)范圍內的分子在此將被更詳細的描述a)一種具有圖7中所提供的GW SEQ序列的核酸分子可以發現圖7中所顯示的GW SEQ基因具有多個盒子區域。這些被認為是功能上重要的。不受理論的束縛，圖7中所顯示的多個盒子區域的可能的功能如以下所描述Sp1(兩個區域)Sp1表示一段結合轉錄因子Sp1及其同系物的序列。
cAMP RE(兩個區域)cAMP RE表示一段結合轉錄因子ATF及其同系物的序列。該過程由cAMP誘導，因此該序列稱成為cAMP應答因子。
TPA RETPA RE表示一段結合轉錄因子AP1及其同系物的序列。該過程是由，如，佛波酯TPA誘導，因此該序列被稱為一種TPA應答因子。
EBSEBS表示一段結合轉錄因子Egr-1及其同系物的序列。
SRE(SRE5、SRE4、SRE3、SRE2、SRE1)SRE表示一段提供了血清應答的序列(即血清應答因子)。以及相關的Ets(E26轉化特異性)結合位點血清應答因子結合轉錄因子，如SRF、ELK-1和/或F-ACT1，以及它們的同系物。
TATATATA盒子被認為是轉錄復合物的組合組裝所需要的，其包括多個轉錄起始所需要的轉錄因子。其不需要包括準確的“TATA”序列，因為其是一個共有序列，并且可以發生一定程度的變化。
GW SEQ具有多個與已發表的人Egr-1序列(此處指定為“ON SEQ”)相關的序列差別。此處該區別在關于圖7中所顯示的序列GW SEQ和ON SEQ的對齊中進行討論。
從圖7中可以看出，GW SEQ中有五個核苷酸相對于ON SEQ中相應位置上所提供的特定核苷酸有變化。這些可以被看作是與ON SEQ相關的替換。其中兩個存在于盒子內的區域。兩個替換是用一個T替換一個G以及用一個C替換一個G。它們分別存在于第一個cAMP RE盒子和SRE3盒子。
相對ON SEQ而言，GW SEQ也具有多個附加的核苷酸(即不是特定鑒定存在于ON SEQ內的核苷酸)。這些可以被認作是相對ON SEQ的插入。其中的四個存在于SRE5盒子內。(其中有三個是A的插入和一個C的插入。)
相對ON SEQ而言，GW SEQ具有一個刪除。是G的刪除。它不存在于盒子區域內。其位于第二個Sp1盒子和SRE5盒子之間。
在以上a)的范圍內的分子當然可能具有相對GW SEQ的附加的上游和/或下游序列。例如，可能提供一個或多個涉及其轉錄/翻譯或調控的區域。也可能提供一個編碼區域(優選的是編碼Egr-1或其一段生物活性片段)。附加區域在以后有更詳細的討論。
b)一段核酸分子，相對GW SEQ而言，其具有一段包括一個或多個刪除、插入和/或替換的鏈，但其不包括圖7中作為ON SEQ顯示的序列以及不包括圖9中所顯示的序列可以使得GW SEQ的分子的核苷酸序列發生改變，以提供其它仍然有用的分子。
這些變化在本發明的范圍之內。它們包括等位基因和非等位基因的變體。
在以上b)的范圍之內的變體優選的是通常包含一個或多個調控區域，這些區域具有的功能與GW SEQ中顯示的一個或多個盒子區域的功能相應(即使該功能是相對GW SEQ中所顯示的一個或多個盒子區域的增量調節或減量調節)。最優選的，這些分子將具有一個或多個與GW SEQ中所顯示的一個或多個盒子區域具有相同序列的區域。
在以上b)范圍內的理想的變體，是其與上述GW SEQ的全長或其部分在全部或部分上述GW SEQ基本上相同的序列。
如果某一變體具有一個或多個相應于圖7中所顯示的GW SEQ的一個或多個盒子區域的區域，則優選的是與上述盒子區域沒有區別或僅有少量這種區別(如，其通常優選的是與某一給定的盒子區域最多具有1、2或3個區別)。在盒子區域之外可能存在更多序列的變化。因此，至于不在圖7中的盒子內的區域，變體與GW SEQ中的相應部分可能具有相對低程度的序列同一性。事實上，一些變體可能不具有一個或多個相應于GW SEQ中上述盒子區域之外的一個或多個區域的區域。
本發明的第十個方面中的優選的核酸分子將包括一個或多個調控區域，這些區域在體內條件下可以改變Egr-1在哺乳動物(最優選的是在人類)體內的轉錄水平。因此，這些核酸分子可以被施用到哺乳動物以允許其表達在轉錄水平被調控的方式來提供Egr-1(因此這些核酸分子通常將包括一段編碼一種具有Egr-1活性的物質的區域)。
可以存在一個或多個血清應答因子(SRE)。理想的是它們中間的一個或多個將是切變應力應答因子(SSRE)。這些區域能對轉錄產生切變應力應答。
多個SSRE可能協同作用以促進切變應力應答。理想的是它們與一個或多個Ets位點相關或包括一個或多個Ets位點。然而，在一些情況下，有可能僅需要SSRE(優選的是與一個Ets位點一起)來提供一定程度的切變應力應答。
一種優選的SSRE在圖7中作為“GW SEQ”的SRE5顯示。本發明者們已經證明其是具有功能的，然而在ON SEQ中所顯示的SRE5序列是沒有功能的。SRE5本身，以及可以提供切變應力應答的SRE5變體在本發明的范圍之內。這些變體優選的是包括存在GW SEQ5中、與ONSEQ SRE5之間的至少一個核苷酸的區別。
其它優選的SSRE是圖7中的GW SEQ所顯示的SRE3和SRE4，以及它們的可以提供切變應力應答的變體。
最優選的，所有三個SRE3、SRE4和SRE5(或其可以提供切變應力應答的變體)均存在。
無論是否存在特定的SRE，本發明第十個方面中的一種核酸分子理想的是將包括一個TATA盒子(其不必需包含共有序列“TATA”)。該分子通常也包括一個CCAAT盒子(其不必需包含共有序列“CCAAT”)。
通常也將存在至少一個，優選的是兩個Sp1結合區域。Sp1結合區域可以是圖7所顯示的GW SEQ的Sp1結合序列的任一個或兩個。
可能存在一段cAMP應答區域。這些區域優選的是包括圖7中所顯示的具有關于GW SEQ的指定為cAMP RE的序列。最優選的是圖7中所顯示的GW SEQ的第一個cAMP RE。它們可以使得轉錄受cAMP調控。
可能存在一個Egr-1結合位點(EBS)。其被認為一旦Egr-1的水平超過了一個特定的界限，則起到減量調節Egr-1轉錄的重要作用。因此，Egr-1可以在切變應力刺激之后限制其自身的表達。如果一個EBS對于以這種方式限制Egr-1的水平是理想的，則其通常被包括在內。該EBS可能具有圖中作為EBS列出的7GW SEQ序列。可以對一種給定的EBS進行核酸的改變以提供它的變體。例如，所提供的變體可以提供與圖7GW SEQ中所顯示的EBS相比，對Egr-1的親和力降低。一種這樣的變體是如圖8中所顯示的EBS。在一些情況下，可能不存在一種功能的EB，因此通過Egr-1的調控可能完全消除(如可以制造一種EBS的完全刪除)。也可以對一種EBS進行核苷酸改變以提供對Egr-1的親和力提高。如果需要提高Egr-1表達的自我調控，這將是有用的。
c)一種所具有的鏈與以上a)或b)中所描述的鏈雜交的核酸分子可以與以上所討論的一種或多種核酸分子雜交的核酸分子也包括在本發明的第十個方面內。這些核酸分子在本說明書中作為“雜交”核酸分子提到。理想的是，本發明中的雜交分子全長具有至少10個核苷酸，優選的是全長具有至少25個、至少50個、至少100個、或至少200個核苷酸。
本發明中的雜交核酸分子的全長可能與以上a)或b)的范圍之內的核酸分子的互補核酸分子具有高度的序列同一性(如至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、或至少98％的同一性)，雖然這不是必需的。一段給定的單鏈核酸分子和另一段單鏈核酸分子之間的序列同一性程度越高，其越有可能在合適的條件下與另一種單鏈核酸分子的互補單鏈核酸分子雜交。
優選的雜交分子在中等或高度嚴格的條件下雜交。雜交條件的詳細討論在Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)的第1101-1110和1145-1161頁。一種可以使用的雜交條件的例子包括使用一種預洗溶液5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，并在55℃下使用5×SSV嘗試雜交過夜。然而，存在許多其它的可能條件。例如，其中一些列于WO98/45435中的表1(見尤其是在該表中的A-F下所列出的條件，次優選的是在G到L或M到R所列出的條件)，另外一種途徑是確定在給定的條件下具有一定長度的特定完美雙鏈(即沒有錯配)的Tm，然后在這些條件下與該雙鏈中的一條單鏈嘗試雜交，但是在充分低于Tm的溫度下進行，以使得一定范圍內的穩定雜交以可接受的速度形成，同時仍然需要適當程度的雜交特異性。這種雙鏈的Tm值能夠以經驗為主地進行確定，通過提供雙鏈及逐步升高溫度直至達到Tm值。該Tm值的確定也可以，如通過使用Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C部分)-(600/N)，其中N是鏈的長度(該公式對于Na+濃度為1M或較低、及多聚核苷酸長度為14到70是適當準確的，但當沒有滿足這些參數時，該公式較不準確)。對于全長大于200個核苷酸的核酸分子，在給定的條件下，雜交可以，如，在低于理想雜交(即沒有錯配)Tm15至20℃下進行。然而，由于長度降低，Tm值降低，直至有時在Tm-25℃下進行雜交是不方便的。因此與較短核酸分子的雜交常常在僅低于Tm5到10℃下進行。中等或高度嚴格條件通常將引起小部分的錯配。作為單憑經驗而做的方法，對于每1％的錯配，Tm值降低1-1.5℃。優選的，選擇雜交條件使得錯配小于25％，更優選的是使得錯配小于10％或小于5％。在雜交之后可以接著進行提高嚴格性的清洗。因此，開始的清洗可以在低嚴格下，但接著就要進行較高嚴格的清洗，直到達到雜交在其下進行的嚴格條件。
雜交條件的上述討論所提供的只是通常指導，但不具有局限性。因為熟練人員將能夠適當變化參數以提供合適的雜交條件，并且能夠考慮一些變化，如多聚核苷酸長度，堿基組成，雙鏈的性質(即DNA/DNA、RNA/RNA或DNA/RNA)，離子存在的類型，等等。
最優選的，本發明第十個方面的雜交核酸分子與具有圖7中所顯示的GW SEQ序列的DNA分子雜交，或者與圖7中所顯示的一個或多個盒子區域雜交。
例如，雜交核酸分子可以作為探針或引物使用。
探針可以被用于純化和/或鑒定核酸。它們可以用于診斷。例如，探針可以被用于確定某一患者是否在其基因組中具有可能影響Egr-1的轉錄或該轉錄的調控的缺陷。這些缺陷可能使患者具有患多種病癥的傾向，這可以使用本發明中的治療方法進行治療。例如，傷口愈合可以通過一個或多個SRE上的突變被損害。這些突變可以通過使用探針進行鑒定，這些探針與GW SEQ中所顯示的一個或多個SRE雜交的特異性程度高于與突變SRE雜交的特異性(或反之亦然)。
理想的是，本發明第十個方面的雜交分子與具有圖7中所顯示的GW SEQ序列或其一個或多個盒子區域的DNA分子之間的雜交，其嚴格性高于和具有圖7中所顯示的ON SEQ序列或其一個或多個盒子區域的DNA分子之間的雜交。例如，可以設計雜交分子對圖7中所顯示的GW SEQ的SRE3、SRE5和cAMP區域中的一個或多個具有高度的特異性(所有這些區域在序列上與ON SEQ中的相應區域存在區別)。
在本發明的第十個方面范圍之內的雜交核酸分子包括引物。引物在擴增核酸分子或其部分中是有用的，如通過PCR技術。
除了作為探針或引物有用之外，本發明第十個方面中的核酸分子可以用作反義分子來改變表達。該技術被用于反義治療。反義分子可以被用于，如通過阻止或降低轉錄水平來阻斷或降低Egr-1的表達。可選地，它們可以被用于通過結合調控Egr-1轉錄的調節子通常結合的區域，來阻止或降低該調節子對于Egr-1轉錄的調控。
重要的是需要注意用于本發明中的核酸分子不僅包括具有經典的DNA或RNA結構的分子，而且包括具有修飾(非磷酸二酯)的變體主鏈，如嗎啉衍生物和肽核酸(PNAs)，其含有一個以N-(2-氨基乙基)甘氨酸為基礎的擬肽主鏈(見NielSen,P.E.，生物物理和生物分子結構年鑒，24 167-83(1995))。具有修飾的主鏈的核酸變體相對于未修飾的核酸穩定性提高，并且當需要長時間的雜交時(如在反義治療時)，其是尤其有用的。
從以上的討論中，應該理解的是很大數量的核酸是在本發明的第十個方面的范圍之內的。除非本文另外指明，否則本發明第十個方面中的核酸分子可以因此具有一個或多個以下的特征1)它們可能是以DNA或RNA的形式存在(包括天然存在的DNA或RNA結構的變體，其具有非天然存在的堿基及/或非天然存在的主鏈)。
2)它們可能是單鏈或雙鏈(一段給定的鏈及其互補的鏈均包括在內，不論它們是否相聯)。
3)它們可能是以重組的形式提供，即共價結合到一段異源的5’和/或3’側翼序列以提供一種嵌合分子(如載體)，其不是天然存在的。
4)它們可能沒有與通常情況下天然存在的5’和/或3’側翼序列一起提供。
5)它們可能是以基本上單純的形式(如以分離的形式)提供。這可以通過，如使用探針來分離具有一種理想靶基因序列的克隆分子，或者通過使用化學合成的技術合成。因此，該核酸分子可能以基本上沒有污染蛋白和/或其它核酸分子的形式。
6)它們可能以有內含子(如，作為一段全長的基因)或沒有內含子形式提供。
本發明第十個方面的各種用途將在此處進行進一步的詳細的討論。
本發明第十個方面的核酸分子可能包含任何理想的編碼序列。如，一個或多個血清應答因子可以與一段編碼序列操作性連接，該編碼序列通常是不與這些因子連接的。例如如果需要對一種給定的、由通常不表現血清應答的編碼序列編碼的治療制劑提供血清應答，則其在傷口愈合中是有用的。
然而本發明第十個方面的核酸分子優選的是包括Egr-1或其生物活性片段的編碼序列。
所希望的是，本發明第十個方面的核酸分子包括一個啟動子區域，并且可以被用于通過允許Egr-1 mRNA的轉錄來提供Egr-1。然后其可以通過存在于宿主內的核糖體進行翻譯。因此，核酸分子可以被施用到某一患者(優選的是人類或其它哺乳動物)，使得在該患者體內可以合成附加的Egr-1，或者(次優選的)它們可以被用于制備Egr-1本身，然后可以將該Egr-1施用給該患者。
本發明第十個方面中用于施用到某一患者的核酸分子優選的是能夠以某種方式轉錄，以使得該轉錄可以被一種或多種在該患者體內調節Egr-1轉錄的因子調控。
例如，可以提供一種或多種SSRE(如以上所討論的)以提供具有切變應力應答的Egr-1的轉錄。當本發明第十個方面的核酸分子被施用到某一患者(而不是使用Egr-1本身)時，這是尤其有利的。當本發明第十個方面的核酸分子被用于體內治療傷口時，切變應力應答是有利的。這是由于在受傷位點的切變應力應答可以導致因子結合到SSRE上，這可以刺激Egr-1轉錄增強。所得到的Egr-1水平的提高可以加速傷口的愈合。
在某些情況下，可能需要降低切變應力應答水平。例如，可能需要通過這種方法降低傷口的治療速度(可能是為了減少疤痕)。另外，可能需要降低與切變應力應答相關的心血管問題的危險。
本發明的第十方面還可用于這里。它首次提供了與人Egr-1轉錄調控相關的五個人SREs的完整序列。可以對這些序列中的一種或多種進行突變，以便相對用圖7所示GW SEQ的一個或多個SREs可獲得的切變應力應答水平而言，降低該應答的水平。
在另一些情況下，可能需要通過在五個SRE中的一個或多個上提供突變來提高切變應力應答的水平，目的是提高與使用圖7GW SEQ中所顯示的SRE可得到的應答相關的切變應力應答的水平。這些突變可能如在加速傷口的愈合中是有用的。
本發明第十個方面的核酸分子可能以載體的形式存在，雖然這不是必要的。它們可能通過物理的方法施用到某一患者體內。這些方法包括局部施用在一種適當的媒介物內的“裸露的”核酸載體-如在治療上可接受的賦形劑的溶液中，如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。這些方法包括顆粒轟擊(這也即是已知的“基因槍”技術，在US-5371015中被描述)。在本說明書中，惰性顆粒，如用核酸包裹的金顆粒通過在高壓下從一種發射裝置中放出，以足夠的速度被加速，使得它們可以穿過受傷部位表面(如皮膚)(用本發明中的核酸分子包裹的顆粒在本發明的范圍之內，以及含有這些顆粒的裝置)。其它將DNA直接施用到某一受體體內的物理方法包括超聲、電穿孔、電穿孔和微量接種。尤其優選的是微量接種的傳遞模式。其描述在US-5697901中。
本發明第十個方面的核酸分子也可以通過特定的傳遞載體被施用。
可以使用任何適于基因治療的載體。基因治療方法的討論如，由Verna等，在自然389:239-242中所披露的。病毒及非病毒系統均可以使用。
以病毒為基礎的系統包括以逆轉錄酶病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相關的病毒、皰疹病毒和牛痘病毒為基礎的系統。
非病毒基系統包括直接施用以核酸和脂質體為基礎的系統。
本發明第十個方面的核酸序列甚至可以通過轉化宿主細胞的方式被施用。這些細胞包括從患者體內收集到的細胞。本發明中的核酸分子可以在體外被引入到這種細胞內，然后可以將該轉化的細胞返回到該患者體內。該核酸分子不需要被作為載體引入，因為可以引入非載體核酸分子。一些這樣的分子可以通過同源重組，整合到已經存在于宿主細胞內的核酸中。
本發明也包括可以用于提供多肽(如Egr-1)的表達系統。然后可以將這些多肽用于治療。
優選的表達載體是真核載體。然而也可以使用原核載體。合適的載體通常將包括一段與一個或多個調控序列操作性連接的編碼序列。優選地，該編碼序列編碼Egr-1。
許多不同的表達系統是已知的并且在，如Sambrook等(分子克隆，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中被討論。
從以上的討論中應該理解的是本發明第十個方面的核酸(其可能以載體的形式存在)可以在多種治療應用中被使用，以及可以使用這種核酸來產生多肽。因此本發明包括含有上述核酸或多肽的治療上可接受的組合物，該組合物與一種或多種治療上可接受的載體選擇性地組合。
這些載體可能包括，但不局限于鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它們的組合。
多肽和核酸在本發明中可以單獨或與其它物質(如治療物質)結合使用。例如，在特定環境下(如，需要使疤痕最小、阻止再狹窄(resteriosis)、調節血管壁鈣化和/或抑制細胞增殖(如在癌癥中))可以施用Egr-1抑制劑(如NAB1和/或NAB2)。當需要使用兩種或多種活性制劑時，其作為組合制劑進行同時、分別或連續使用。
本發明中的藥劑組合物可以以任何有效的方式施用，包括，如，尤其是通過局部、靜脈內、肌肉內、鼻內或皮下途徑使用。通常優選的是該組合物可以局部使用，如在受傷位點或其相關癥狀的位點上或其附近使用。然而可以采用系統性施用。
一種活性制劑可以作為一種注射性組合物(如作為一種無菌的水性分散體)施用到某一患者體內。其優選的是與某一受體的體液基本上等滲。
可選地，該組合物可以被配制用于局部使用，如以軟膏、乳膏、外用藥水、眼藥膏、滴眼藥、滴耳劑、嗽口水、浸漬敷料和縫合及氣溶膠的形式使用。其可以含有添加劑，包括，如防腐劑、輔助藥物滲透的溶劑、以及在軟膏和乳膏中的軟化劑。這種局部制劑也可以含有兼容性的載體，如乳膏或軟膏基質，以及用于外用藥水的乙醇或油醇。這些載體可以構成制劑質量的大約1％到大約98％。更通常的它們將構成制劑質量的80％。
最優選的，含有本發明中的核酸的藥劑組合物適于通過“基因槍”技術施用。因此，該核酸可以與能夠作為發射體使用的顆粒(如金顆粒)結合。
為了施用到哺乳動物，尤其是人類，希望的是一種活性制劑的日劑量水平將為從0.01毫克/千克到10毫克/千克，典型的是大約1毫克/千克。在實踐上，一個內科醫生將確定最適于某一患者的確切劑量，這一劑量可以依據特定患者的年齡、體重和狀況而有很大不同變。如果產生副作用，可以依據良好的臨床實踐降低劑量。
除了治療作用之外，本發明也可以被用于診斷。如以上所討論的，本發明提供了可以被用于診斷不同病癥的探針。它們可以作為診斷試劑盒的部分被提供，該試劑盒可能包括其它組分-如一種或多種清洗液體、檢測雜交的裝置、使用的指導，等。該探針可以用一種可檢測的標記進行標記(如，熒光標記或放射標記)。
本發明可以被用于篩選。例如，本發明第十個方面的核酸分子(如一種含有圖7所示GW SEQ或其部分的分子)可以被用于篩選與其結合的物質。可以對這些物質進行分析來看它們是否會影響Egr-1的轉錄。因此它們可能在以上所討論的設計治療藥物中是有用的。可選地，本發明第十個方面的核酸分子可以被用于篩選能夠阻斷另一種物質與該核酸分子結合的物質。如果另一種物質是Egr-1轉錄的調控子，阻斷上述結合的物質也能夠用于設計以上所討論的一種或多種治療的藥物。
本發明可以被用于研究，如在研究憑借什么來制造一個或多個與給定的核酸分子相關的改變時，本發明第十個方面的核酸分子可以作為一個起點。這可以被用作確定該分子的哪個部分在Egr-1的轉錄中是重要的，或者在調控這種轉錄中是重要的。如可以制造與圖7中所顯示的GW SEQ的一個或多個盒子區域相關的插入/刪除/替換，并且可以調整這些插入/刪除/替換的影響。可以制造變化來設法鑒定可以使Egr-1轉錄水平提高或降低的核酸分子。
本發明每個方面的優選的特征相互作為其它方面的必要的變用。本說明書中所提到的現有技術文件在法律準許的最大范圍內，結合在本說明書中。
下面將參考附圖僅以舉例形式對本發明進行描述，其中

圖1a和b表示VEGF的Egr-1表達；圖1c和d表示TGF-B1的Egr-l表達；圖1e和f表示PDGF A的Egr-1表達。
圖2a表示Egr-1對大鼠切除傷口收斂的影響；圖2b表示Egr-1 DNA轉染對愈合的大鼠切除傷口的組織學影響；圖2c表示Egr-1對大鼠切除傷口中膠原蛋白沉積的影響；圖2d表示使用vWF免疫染色得到的Egr-1對大鼠切除傷口中的血管生成形式的影響；圖3a表示使用Mirus TranslT(Cambridge Bioseciences)，將pGL3熒光素酶對照質粒轉染到血管生成共培養系統中的脂質∶DNA比例(v/w)的最優化。
圖3b表示Egr-1對血管生成的影響；圖4a表示使用western印跡分析得到的樣品對骨負荷*影響；圖4b表示在負荷之后對人TE85骨細胞內的Egr-1蛋白進行的western印跡分析；圖4c表示在負荷之后對TE85骨細胞產生的PDGF BB進行的ELISA分析；圖4d表示在將CMV-TGF-B1轉染到ROS細胞內之后對VEGF和TGF-B1的檢測；圖4e表示在將CMV-TGF-B1轉染MC3tE1細胞之后對VEGF和TGF-B1的檢測；圖5表示在異位骨形成的鼠模型中，Egr-1對其中堿性磷酸酶水平的影響；圖6a表示對用CMV Egr-1轉染的人平滑肌細胞的抗Egr-1抗體染色；圖6b表示對用CMV Egr-1DNA轉染的豬的平滑肌細胞的抗Egr-1抗體染色；圖6c表示通過Fugene將pGL3熒光素酶對照質粒對人SMC的最優轉染；圖6d表示通過Fugene將pGL3熒光素酶對照質粒對豬SMC的最優轉染；圖6e表示通過將CMV-Egr-1轉染到人SMC對VEGF產生/分泌的活化；圖6f表示通過將CMV-Egr-1轉染到人SMC對HGF產生/分泌的活化；圖6g表示通過將CMV-Egr-1轉染到人SMC對PDGF產生/分泌的活化；圖6h表示在受傷之前和之后Egr-1蛋白在血管壁內的免疫染色；圖7表示分別表示為GW SEQ和ON SEQ的兩段核酸序列的比較。ON SEQ是已發表的早期生長應答-1啟動子(Sakamoto等，癌基因6；867-871,1991),GW SEQ是本發明的一種序列，其含有多種如所顯示的堿基插入/刪除及替換(黑體下劃線)。
圖8表示圖7中所顯示的序列的一種變體，該變體在Egr-1結合位點(EBS)中具有一個修飾的EBS區域突變，如黑體下劃線所示。
圖9表示小鼠Egr-1基因中已發表的5’上游序列(Morris，核酸研究16:8835-8846)。該核苷酸從加帽位點=+1處開始編號。假定的TATA和CCAAT因子包括在盒子內。下劃線為潛在的調控因子，并在圖中標明。點下劃線表示用于引物延伸研究的29-聚體；圖10表示通過pFA-MEK1瞬時轉染活化SRE5。
實施例實施例1和2描述了基因槍傳遞與金顆粒復合的β-半乳糖苷酶和Egr-1表達質粒DNA，傳遞到嚙齒類的皮膚。
a)管道裝置的制備造管制備裝置設置在一個無菌的氣體層流櫥柜內，用70％的I.M.S擦洗并在櫥柜內風干。將從氮氣罐至管道制備裝置之間的氣體線性管道高壓滅菌，并加上一個Gelman同軸的0.2微米濾膜。將滅過菌的管道和制備裝置中的氣體入口通過一個luer鎖定連接器連接起來，并使氣體以0.2升/分鐘流過以使管道完全干燥。
將顆粒發送管道與制備裝置連接，并使氣體如以上流過以使管道內部完全干燥。在管道內任何殘留的濕氣都將導致金顆粒與管壁的不良或不均勻接觸，這可能會對任何實驗的結果產生不利影響。
b)DNA-金微載體顆粒的制備1.0微米的金顆粒購自Bio-Rad UK。稱量一份分裝的金顆粒(53毫克)裝入一個微量離心管中，加入100微升0.05M亞精胺并輕輕震蕩該管。
加入100微升含有100-120微克表達Egr-1或β-半乳糖苷酶的質粒DNA的DNA溶液，然后邊震蕩邊加入100微升1MCaCl2。將該混合物在室溫下靜置10分鐘，然后離心沉淀。去掉上清液并用無水乙醇將金顆粒洗三次。
最后將金顆粒重懸在含有0.1毫克/毫升聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的無水乙醇中。
估計DNA包裹到金微顆粒上的效率，然后釋放到水分散相中所有樣品(起始物質、DNA/金顆粒復合物形成之后的沉淀后上清液、以及洗脫的物質)均在“GeneQuant＂”(Pharmacia)內進行DNA分析。殘留的沉淀后DNA給出了未結合物質的估計，并認為結合起始物質的比例是包裹效率。
c)將DNA/微載體上清液裝入金傳送管道內然后使用注射器將在乙醇/PVP中的金顆粒上清液裝入傳送管道內，并允許上清液在管道內靜置3-5分鐘。在這段時間內，金顆粒沉淀在管道的內表面，使得乙醇可以通過注射器被除去。當乙醇被除去時，旋轉管道使金顆粒均勻分散在管道的內表面上。旋轉2-3分鐘之后，將氮氣以0.1升/分鐘的速度通過管道以除去殘留的乙醇并使金顆粒黏附。10分鐘之后，移去管道，使用(Bio-Rad UK)提供的切割器將其切成適當的長度，并將切割后的管道裝入基因槍內。
使用商業上可供的檢測Egr-1的抗體制劑(Santa Cruz)，采用常規的免疫組化確定Egr-1的表達和活性，并在1-7天內監測Egr-1靶基因產物(Santa Cruz或R&D系統)和表達。陰性對照是無效的DNA。
實施例1Egr-1DNA傳遞到未受傷的嚙齒類皮膚
1．1方法通過基因槍調節的顆粒傳送，將一種包括Egr-1cDNA、由人巨細胞病毒啟動子(hCMV；Houston等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,19；281-289,1999)驅動的表達質粒傳遞到未受傷小鼠的背部。金/DNA復合物的制備如以上所描述，使用基因槍的壓力為350psi，金顆粒的大小為1.6微米，每只動物發送0.5-1.0微克DNA。在發送DNA的0、1、2和6天之后宰殺動物，將其皮膚包埋在OCT內并在干冰/己烷中速凍。將切片制為0.7微米并通過免疫染色、使用抗VEGF、PDGF A、TGFβ和Egr-1的抗體檢測Egr-1靶生長因子。
1．2結果顯示出Egr-1活化VEGF(圖1a和1b)、TGFβ(圖1c和1d)、PDGFA(圖1e和1f)的免疫組化數據。結果表明VEGF蛋白在第1和第2天明顯被增量調節，在第6天下降，TGFβ在第6天增量調節但不在第1和第2天，以及PDGFA在Egr-1DNA傳遞2小時以后迅速增量調節(標為0天)。
1．3結論這些數據證明Egr-1在體內可以活化靶生長因子的表達，其中一些在本說明書中被描述。這些數據說明Egr-1活化生長因子發生在在時間上分開的時間段內。
在使用未受傷的嚙齒類皮膚已經確證了Egr-1靶基因的活化(實施例1)之后，則進行切除的大鼠傷口的Egr-1和β-半乳糖苷酶基因槍傳遞以鑒定Egr-1對傷口愈合速度的影響。
實施例2使用Egr-1轉錄因子以在嚙齒類中促進傷口修復2．1方法2．1．1質粒構建在本研究中使用的表達質粒是CMV啟動的β-半乳糖苷酶和CMV啟動的Egr-1(Houston等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol,19；281-289,1999)。質粒在大腸桿菌XL-2Blue MR中擴增，DNA使用Qiagen maxi試劑盒制備。
2．1．2顆粒調節的基因轉移將18只體重為250克的雄性Sprague Dawley大鼠在氧氣/氮氧化物為2∶1的混合氣體中，使用異氟烷麻醉。在大鼠背部的兩個轉染位點(距頭部8厘米，脊柱兩側各1.5厘米)的準備首先是剪去皮毛，然后用剃刀削凈。在各受傷位點進行兩次轉染，間隔8毫米，通過將Egr-1或β-半乳糖苷酶的質粒/金復合物以350 psi加速到皮膚內。每次轉染總的DNA量不少于1.7微克(平均每個傷口3.4微克)2．1．3切除傷口的愈合模式轉染后24小時麻醉動物，在轉染的準確位點用生檢刀制造兩個全層切除傷口(直徑8毫米)。受傷之后迅速用照相機/錄象設備記錄各傷口，并使動物從麻醉中蘇醒。在受傷的2、4和6天之后宰殺6只動物并同樣用相同的照相機/錄象設備記錄各傷口。記錄之后，切開傷口并收集以進行常規的組織學和免疫組織化學。
2．1．4愈合分析ⅰ)宏觀鑒定使用圖象分析確定受傷區域，愈合表現為初始受傷區域的百分率提高。采用一種成對的Mann-Whitney檢測來估計處理過的和對照組群之間區別的統計顯著性。
ⅱ)微觀鑒定組織學分析在解剖之后在每個時間點，將各傷口水平切開。一半放入4％多聚甲醛中24小時并加工，以便進行蠟固定組織學分析。使用薄片切片機從每個傷口切出5微米的薄片并用van Geison染色薄片。使用這一組織染色，鑒定傷口愈合的關鍵標記，包括上皮再形成和膠原蛋白含量，并在處理過的和對照薄片之間進行比較。
免疫細胞化學進行免疫細胞化學和圖象分析以將使用常規組織學所看到的區別量化。一旦在OCT中冷凍，則使用低溫恒溫器將各傷口的第二部分切成7微米的薄片。將來自各傷口的兩個薄片在冰凍的丙酮中固定，并進行主要是對膠原蛋白I和馮.威利布蘭德因子(von Willebrandfactor,vWF)的熒光免疫染色。免疫染色之后迅速將各薄片放在熒光顯微鏡下并用×25倍的放大記錄受傷面積。整合圖象并設定界限以使背景最小化。采用圖象分析測定染色的面積和強度并繪出曲線圖。使用一種Man-Whitney非參數檢測來估計處理過的和對照組之間區別的統計學顯著性。
2．2結果2．2．1Egr-1對大鼠切除傷口愈合的影響(ⅰ)傷口收斂在受傷6天以后，與對照(β-半乳糖苷酶)相比，相應于Egr-1轉染的直徑為8毫米的全層大鼠真皮切除傷口在邊緣收斂較快。統計學上顯著增強(p＜0.05)的收斂發生在受傷6天以后，其中Egr-1處理的傷口收斂后的面積小于對照7％(圖2a)。
(ⅱ)組織學分析在受傷4和6天以后，用van Gieson染色的傷口切片在傷口的組織學上表現出明顯的區別。在受傷2天以后，在Egr-1和β-半乳糖苷酶轉染的傷口之間存在很小的區別。兩種處理均在受傷位點顯示單核細胞，意味著早期炎性應答，伴隨著早期痂的形成，但沒有上皮再生成。在受傷的4天以后，上皮再生成仍然沒有開始，然而用Egr-1轉染的傷口與β-半乳糖苷酶相比在受傷位點具有更多的膠原蛋白。在受傷的6天以后，與β-半乳糖苷酶相比，用Egr-1處理的傷口具有更成熟的肉芽組織，在受傷位點表現出明顯更多的膠原蛋白，其程度達到在其中可以看到清晰的厚膠原蛋白纖維。與β-半乳糖苷酶中的0％相比，用Egr-1處理的上皮再生成完成了傷口的50％。在組織學上，用Egr-1處理的傷口與β-半乳糖苷酶相比，表現出愈合的加速(圖2b)。
(ⅲ)使用免疫組織化學和圖象分析對Egr-1在膠原蛋白沉積中的影響進行量化對用Egr-1或β-半乳糖苷酶處理的傷口的7微米低溫切片進行膠原蛋白I免疫染色，并使用圖象分析對染色進行量化。與Egr-1相比，用β-半乳糖苷酶處理的傷口在受傷2天以后具有明顯較多的膠原蛋白。在受傷的4和6天以后，Egr-1轉染的傷口比對照(β-半乳糖苷酶)具有更多的膠原蛋白沉積，這證明了使用常規的蠟固定組織學方法所看到的發現。Egr-1轉染提高了受傷4和6天以后膠原蛋白沉積的量(圖2c)。
(ⅳ)使用免疫組織化學和圖象分析對Egr-1在血管生成中的影響進行量化采用馮.威利布蘭德因子對傷口低溫切片進行免疫染色和圖象分析測定受傷位點處陽性染色的面積，來對血管生成進行量化。在受傷的2天以后，與對照(β-半乳糖苷酶)相比，Egr-1轉染的傷口具有明顯(p＜0.01)較多的新血管。在受傷的4和6天以后，Egr-1和β-半乳糖苷酶轉染的傷口具有類似水平的血管生成。表達Egr-1的DNA的轉染比對照早2天促進血管生成(圖2d)。
2．3結論Egr-1轉染大鼠切除傷口通過提高收斂、上皮再生成和膠原蛋白沉積的速度來加速愈合。Egr-1轉染也在受傷2天以后促進了血管生成。
實施例3使用Egr-1轉錄因子促進血管生成3．1方法將在hCMV啟動子控制之下的Egr-1(Houston等，Arterioseler.Thromb.Vase.Biol.,19；281-289,1999)轉染到被設計用于在體外測定血管生成的人細胞共培養系統內。血管生成試劑盒(TCSBiologicals)如商家指導所描述的進行使用，分別采用VEGF蛋白(2納克/毫升)和蘇拉明(20μM)作為血管生成的陽性和陰性對照。
采用pGL3對照熒光素酶(Promega)對共培養系統進行轉染的最優化，同時將1.0微克和0.5微克CMV-βgal作為正規化質粒用作轉染對照。采用兩種比例的脂質DNA(v/w)；2∶1和4∶1(圖3a)。在一個24孔的微量滴定板中，CMV Egr-1DNA以每孔0.5、1.0、1.5和2.5微克，各三孔，使用Mirus Transit試劑(Cambridge Biosciences)和DNA比例為2∶1進行轉染。向三組重復的孔中加入VEGF蛋白陽性對照和蘇拉明陰性對照。在共培養11天以后，通過對細胞進行內皮細胞標記PECAM-1的染色和使用BCIP/NBT底物顯象對血管生成進行確定。
記錄使用四種劑量的Egr-1表達質粒以及VEGF(陽性對照)和蘇拉明(陰性對照)的細管形成的典型圖象，并通過采用Ouantimet 600影像分析和相關軟件的圖象分析對其進行加工。
3．2結果在共培養11天以后，作為細管形成來描述的血管生成在光學顯微鏡下是可檢測得到的。同全孔的圖解一樣，使用圖象分析提供血管生成的得分，結果是以每單位面積的血管與處理比較進行描述的(圖3b)。
降低的細管形成(用蘇拉明(suramin)處理的細胞)和提高的細管形成(用VEGF蛋白處理的細胞)被顯示。Egr-1以相反的劑量依賴方式表現出促進增強的細管生成。
3．3結論在共培養系統中，Egr-1轉錄因子表達是血管由來的。這與實施例1中的數據相互支持，當通過基因槍傳遞到小鼠皮膚內時Egr-1表現出增量調節的生長因子表達(如VEGF)，也與實施例5中的數據相互支持，在例5中Egr-1轉染表現出提高VEGF在人血管平滑肌細胞中產生的數量。作為一種前血管生成刺激的Egr-1的反向劑量應答與實施例6中所獲得的結果一致，要指出的是Egr-1可能減量調節其自身的產生(Cao,X.等，J.Biol.Chem.,268,16949-16957,1993；Schwachtgen,J.-L.等，J.,Clin.Invest.,101,254-2549,1998)。
實施例4體外使用Egr-1轉錄因子促進骨發生4．1骨負荷和生長因子的鑒定4．1．1方法所使用的細胞為TE85，一種人骨肉瘤衍生的造骨細胞樣細胞系。胰酶化亞鋪滿的細胞層并重懸在含有10％胎牛血清(FCS)和1％盤尼西林-鏈霉素(PS)抗生素的DMEM中。將細胞懸液接種到負載底物上(18×18毫米正方形的組織培養-處理的塑料)。將細胞置過夜使之附著。一旦附著到負載底物上，則將細胞轉移到裝有含2％FCS和1％PS的DMEM的燒瓶內，在負荷刺激之前再培養24小時。
現圖4a中所描述的每個時間點有四套條件[1]負荷(以每秒3232微應變*進行200個循環的2000微應變*)。對照(無負荷)。陽性對照(100納克/毫升PMA處理1小時)。溶質對照。
對于細胞負荷，將細胞從標準的組織培養條件下無菌地轉移到負荷倉內。細胞在倉內負荷的持續時間為4分鐘。負荷之后，將細胞轉回到它們先前的培養條件下。對照處理的細胞以幾乎一樣的方式處理，除了不對倉內施加負荷。
通過兩種不同的方法分析結果。第一，在負荷實驗之后，通過Western印跡分析細胞團以鑒定Egr-1轉錄因子的存在(圖4b)。第二，通過ELISA分析組織培養基來鑒定所分泌的生長因子的存在(圖4c)。
4．1．2結論這些結果顯示在骨負荷的條件下，轉錄因子Egr-1在人骨肉瘤衍生的造骨細胞樣細胞中生成。
對人TE85細胞施加骨負荷刺激了生長因子的產生和分泌，其中的一個例子是PDGF B。
4．2將CMV TGF-BI轉染到MC3T3E1和ROS細胞，接著對細胞培養上清液進行人TGF-α1和小鼠VEGF的ELISA分析。
4．2．1材料(ⅰ)轉染小鼠造骨細胞(MC3T3E1)和大鼠骨肉瘤細胞(ROS17/2.8)被用于接種到6孔培養皿內。
MC3T3E1細胞在MEM-α、最低要求標準的培養基eagleα改進(Sigma)、10％胎牛血清(Life Teehnologies)、1％L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)、1％盤尼西林-鏈霉素(Life Teehnologies)中培養。
ROS細胞在F12 HAM、含谷氨酰胺、10％胎牛血清(LifeTeehnologies)、1％盤尼西林-鏈霉素(Life Teehnologies)的F-12HAM(Life Technologies)中生長。
細胞使用Fugene(Boehringer Mannheim)、用以上所描述的(Benn,S.I.等，J.Clin.Invest.,98；2894-2902,1996)CMVTGF-β1表達質粒進行轉染。轉染到細胞內如所描述的進行1)準備一個6孔培養皿，每孔2×105個細胞，放置過夜，直至達到5-70％鋪滿。
2)第二天，在6只eppendorf管中各加入94微升無血清培養基(SFM)和6微升Fugene，在室溫下放置5分鐘。
3)這6只分開的管中，其中兩只不加DNA，然而在剩下4只管中加入4微克CMV-TGF-β1 DNA。
4)將步驟2)中的Fugene/SFM混合物逐滴加入步驟3)中的管內，將管輕彈幾次，然后在室溫下孵育15分鐘。
5)將Fugene/SFM/DNA轉染混合物逐滴加入它們各自的孔內，同時旋轉6孔培養皿，將培養皿在37℃孵育48小時。
6)分裝細胞培養上清液并貯存于-20℃。
對MC3-T3E1細胞和ROS細胞進行以上操作。
通過ELISA(R&D系統)，使用一種基于鏈霉親和素-HRP的顏色檢測系統，檢測到了TGF-β1和VEGF在細胞培養上清液中的存在。
4．2．2結果在轉染CMV TGF-β1之后，TGF-β1和VEGF的產生和檢測在ROS細胞(圖3)和MC3T3E1細胞(圖4)中被表示。這些數據表明一種Egr-1靶基因，在本實施例中是TGF-β1已經活化了VEGF的產生。
4．3結論Egr-1的表達和Egr-1靶基因的活化可能協同增強活化VEGF。
實施例5在體內使用Egr-1轉錄因子促進骨生成5．1大鼠異位的骨形成在嚙齒類中皮下移植可能的骨誘導化合物，代表了在目前使用中最廣泛研究的生物分析系統(Wozney,J.M.，細胞分子生物學，131-167,1993)。一種載體基質的使用增強了骨誘導應答的可再現性和敏感性。在該分析系統中(Reddi,A.H.等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA,69；1601-1605,1972；Sampath,T.K.,ibid,78；7599-7603,1981)，該載體基質是來自大鼠長骨的骨干部分，其已被研磨成特定大小的顆粒，接著除去礦物質和通過胍抽提去除生物活性。所剩下的載體主要由不具有骨誘導能力的骨膠原蛋白組成。然后通過用酒精沉淀、對水透析或凍干法將待分析的化合物或物質沉淀在該基質上。然后將該基質組合物植入大鼠的皮下組織持續許多天(在本實驗中是12天)。然后對植入物進行組織學和生物化學的分析，分析它們誘導骨形成的能力(Sampath，T.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6591-6595,1983；Sampath,T.K.等，ibid,84；7109-7113,1987；Wang,E.ibid,85；9484-9488；Wang,E.等，ibid,87；2220-2224；Sampath,T.K.等，J.Cell Biol.,98；2192-2197,1984)。
5．1．1實驗方法；隨機分配所準備的20只雄性Sprague Dawley大鼠(42-49天齡，體重170-220克)，在氟烷麻醉下將兩種移植物穿過背、胸*植入皮下。這些移植物包括四種處理中的一種；*陰性對照-僅載體(去除礦物質的胍抽提的骨基質DGBM)*CMV Egr 1 DNA；500微克在載體DGBM上*CMV Egr 1 DNA；500微克加上重組的骨發生蛋白(BMP)4；5微克在載體DGBM上，(BMP4因其趨化影響而被使用)*重組BMP4蛋白5微克在載體DGBM上插入的當天記為第0天，在操作的12天以后使用一種計劃1中提出的方法宰殺所有的大鼠，去除植入物，清洗軟組織并等分成兩份。將一半放于10％福爾馬林中以進行組織學檢測，將另一半冷凍并貯存在-20攝氏度。該樣品在以后用于分析鈣含量和堿性磷酸酶活性。
5．1．2去礦物質的大鼠骨骼的制備；除去成年Sprague Dawley大鼠的腿節、脛節和肱部的骨干，剝去軟組織并用標準鹽溶液沖洗骨髓腔。然后將骨在100毫升氯仿∶甲醇(2∶1)中攪動10分鐘脫脂。該步驟在干燥箱內風干之前重復一次。然后將骨干在液氮中冷凍并在一臺CRC micromill上磨成粉末。將所得到的粉末篩濾以留下大小嚴格為75-425微米的顆粒，然后在0.5M*HCl中連續攪拌3小時以去礦物質。接著將該混合物以19,0000rpm(Kontron CentriksTl24，轉頭A8.24)、在15攝氏度下離心30分鐘。將沉淀重懸在100毫升水中，攪拌1小時并離心。重復該步驟。然后將沉淀重懸在100毫升乙醇中，攪拌1小時并離心。乙醇蒸發消失，將樣品重懸在4M鹽酸胍/50mM Tris,pH7.4中并攪拌過夜。然后進行進一步的離心，沉淀重懸在50毫升水中，攪拌1小時并離心。該步驟再重復兩次。然后將樣品在干燥箱內干燥過夜。DNA通過機械混合和凍干法加入到骨上。
5．2組織學檢測在初始的福爾馬林固定之后，將樣品包埋在甲基丙烯酸甲酯中，切成1微米的薄片并用馮科薩斯(Von Kossa)和甲苯胺藍染色。然后讓不了解檢測物質的病理學家顧問對來自各植入的三個非毗鄰的切片進行評估并平均得分。
采用一種用于軟骨和骨的標準評分系統；+/-試驗性鑒定骨或軟骨1．＞10％各切片新軟骨或骨2．＞25％各切片新軟骨或骨3．＞50％各切片新軟骨或骨4．＞75％各切片新軟骨或骨5．＞80％各切片新軟骨或骨5．3生化檢測將組織在2毫升冰浴的0.25M蔗糖-3mM NaHCO3中勻漿。將勻漿物在12,000g、12攝氏度離心15分鐘，收集上清液用于酶切分析。使用比色分析，用對硝基苯磷酸鹽(PNP)作為底物，測定堿性磷酸酶的活性。在檢測樣品與PNP在37攝氏度孵育之后，在一臺標準的微滴定培養皿讀出器上，確定405nm處的光密度。
5．4結果結果如圖5所示。將每只大鼠中的兩個植入位點的數據彼此獨立地進行分析。提供了中值和四分位差(IQR)，這是由于數據的數值小及傾斜分布。在以上的變數中已經進行了Kruskal Wallis試驗，發現堿性磷酸酶的水平彼此明顯不同。
僅在一個組(CMV Egr-1 DNA/BMP)中，五個植入位點中的一個植入是骨形成陽性的。采用12天這個單一的時間點進行分析的初始實驗，其被選擇以給出早期的預測結果。在這一時間點上，堿性磷酸酶的活性水平在CMV Egr-1 DNA和CMV Egr-1 DNA/BMP4組群中相對于對照明顯提高。這種堿性磷酸酶活性的臨時升高(作為骨形成的先兆)典型地是通過物質如BMP看出的，BMP在10-15天時刺激骨形成上升到頂峰，以后則下降。這代表的是在內生軟骨瘤的骨化早期所看到的上升。到目前為止，在所檢測的樣品中沒有表現出鈣含量的明顯區別，雖然已經在CMV-Egr-1/BMP4組的許多組織學樣品中觀察到早期鈣化。這可以解釋為是在生檢的時標內鈣化僅僅是剛開始。
5.5結論Egr-1提高了異位骨形成的嚙齒類模型中堿性磷酸酶的水平，并且可能促進局部的骨形成。
實施例6在體外經皮腔內冠狀動脈成形術之后，使用Egr-1轉錄因子以促進上皮再生成6．1方法解凍人或豬的血管平滑肌細胞(SMC；Clonetics)，保存在培養基中并依據商家的指導對其進行傳代直至不遲于第4代。用一種含有從CMV啟動子表達的Egr-1 cDNA的表達質粒轉染SMC(Houston等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,19；218-289,1999)。在用熒光素酶報告載體pGL3對照(Promega)或Mirus Transit(Cambridge Biosciences)對SMC進行優化之后，使用Fugene(Boehringer Mannheim)將Egr-1表達DNA轉染到SMC中，兩種轉染程序均使用β-半乳糖苷酶作為正規化質粒用于轉染對照。
6．2結果CMV Egr-1 DNA被轉染到人SMC中，并通過使用一種多克隆抗體(Santa Cruz)的免疫組織化學和過氧化物酶檢測對Egr-1蛋白進行檢測(Sigma and Vector Laboratories)。CMV Egr-1 DNA轉染的人SMC(右手畫面)或假轉染(左手畫面)如圖6a中所示，CMV Egr-1 DNA轉染的豬SMC(右手畫面)或假轉染(左手畫面)如圖6b中所示。Egr-1蛋白的表達因棕褐色變而可檢測得到。使用Fugene 6(進行進一步的體外定性，圖6c)和Mirus Transit(進行后來的體內研究，圖6d)使DNA轉染達到最優化。在這些數據中，常規使用4微克CMV Egr-1DNA用于生長因子活化，采用的脂質∶DNA的比例為3∶1。在體內基因傳遞實驗中也采用脂質∶DNA的比例為3∶1。
6．3結論在CMV Egr-1 DNA轉染之后，Egr-1蛋白在SMC中表達。Egr-1的轉染提高了SMC來源的PDGF、HGF和VEGF的產生/分泌。
實施例7EGR-1啟動子序列跨越-674至+12位核苷酸的人Egr-1啟動子片段的合成是通過PCR，其反應物包括0.5微克人胎盤基因組DNA作為模板，0.4mMdATP、dCTP、dGTP和dTTP,25皮摩爾正向引物(5’-GGC CAC GCG TCGTCG GTT CGC TCT CAC GGT CCC-3’,Mlu 1限制性酶切位點下劃線)，25皮摩爾反向引物5’-GCA GCT CGA GGC TGG ATC TCT CGC GACTCC-3’(Xho1位點下劃線)以及Vent DNA聚合酶(NEB)。將PCR片段用Mlu1和Xho1酶切，瓊脂糖凝膠純化并將其克隆到載體pGL3基礎(Promega)的多克隆位點上的Mlu1和Xho1位點之間。
現在已經得到了全序列，使所發表的序列中的“缺口”被填滿。這如圖7所示，其中由本發明者們得到的完整序列(GW SEQ)與以前所發表的序列(0N SEQ)進行比較。該啟動子序列是有功能的，并且已經在內皮細胞上的切變應力研究中被研究。
在已發表的人Egr-1啟動子序列和我們所描述的序列(圖8)之間的一個重要的區別，位于兩個以前未被認識的SRE上。雖然所發表的SRE5和SRE1序列不結合血清應答因子(SRF)，也沒有功能(NurrishSJ,Treisman R,Mol Cell Biol 1995,15(8):4076-85)，但我們發現它們與SRE共有序列(圖7)一致。
我們已經集中于SRE5。新的SRE5及其相關的Ets轉錄因子結合位點作為一種雙鏈低聚核苷酸被合成，并插入到SV40最小啟動子載體(pSV40)上游的NheⅠ位點。
SRE5具有序列；AGGCTGCGACCCGGAAATGCCATATAAGGAGCAGGAAGGATCCCCCCGCCGGCGACGCTGGGCCTTTACGGTATATTCCTCGTCCTTCCTAGGGGGGCGGCCGA2個Ets位點是黑體，SRE下被劃線。突出的AG是被用于克隆到pGLE啟動子的部分填滿的Nhe位點。
將所得到的報告質粒pSVSRE5與pFA-dbd質粒(編碼Gal4 DNA結合區域(dbd)的構建物)或pFA-MEK1(編碼Gal4 DNA結合區域(dbd)和MAP激酶激酶*MEK1的激酶區域的一種融合蛋白的構建物)一起暫時轉染到HeLa細胞中。Gal4-MEK1融合蛋白是組成性地活化的，并使Elk1和SRF磷酸化，與SRE5結合。
圖10中所顯示的結果表明所分離的SRE5序列在MEK1存在下被活化3倍，而SV40啟動子僅表現出極微的活化。
結果顯示出新的SRE5是有功能的。
權利要求
1．一種含有一段編碼Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子在生產一種用于治療哺乳動物，包括人類傷口的藥物中的應用。
2．依據權利要求1中所述的應用，其中的Egr-1是人的Egr-1。
3．依據權利要求1或權利要求2中所述的應用，其中包括上述編碼一Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子與一段控制表達的核酸序列操作性連接。
4．依據權利要求3中所述的應用，其中控制表達的核酸序列a)具有一條含有圖7中所提供的GW SEQ序列的鏈；或者b)具有一條含有相對于GW SEQ有一個或多個刪除、插入和/或替換的鏈，但其不含有圖7中所顯示的0N SEQ序列以及其也不含有圖9中所顯示的序列。
5．依據以上任何一項權利要求中所述的應用，其中的核酸分子是通過物理方法被施用到哺乳動物中的。
6．依據權利要求5中所述的應用，其中的核酸分子是通過顆粒轟擊的方法施用到哺乳動物中的。
7．依據權利要求6中所述的應用，其中的核酸分子是固定在金顆粒上的。
8．依據權利要求5中所述的應用，其中的核酸分子是通過微量接種(microseed)進行施用的。
9．依據以上任何一項權利要求中所述的應用，其中的核酸分子是在一種載體上。
10．依據權利要求9中所述的應用，其中的核酸分子是在一種細胞內。
11．一種包括一段編碼一種用于治療傷口的Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子。
12．一種包括一種含有一段編碼Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子以及它的一種或多種治療上可接受的載體的藥劑組合物。
13．一種治療哺乳動物包括人類傷口的方法，該方法包括對該哺乳動物施用一種包括一段編碼Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子。
14．一種Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段在生產一種用于治療哺乳動物(包括人類)傷口的藥物中的應用。
15．依據權利要求14中所述的應用，其中的Egr-1或其生物活性片段是天然地、合成地或重組產生的。
16．依據權利要求14或15中所述的應用，其中的Egr-1是人的Egr-1。
17．一種用于治療傷口的Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段。
18．一種治療哺乳動物包括人類傷口的方法，該方法包括對該哺乳動物施用治療上有效劑量的一種Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子。
19.一種包括Egr-1轉錄因子多肽或其生物活性片段以及一種或多種治療上可接受的載體的藥劑組合物。
20．一種核酸分子，其a)具有一條含有圖7中所提供的GW SEQ序列的鏈；或者b)具有一條含有相對于GW SEQ有一個或多個刪除、插入和/或替換的鏈，但其不含有圖7中作為0N SEQ顯示的序列以及其也不含有圖9中所顯示的序列；或者c)具有一條與以上a)或b)中所描述的鏈雜交的鏈。
21．依據權利要求20中所述的核酸分子，其中該分子包括一個或多個血清應答因子(SRE)。
22．依據權利要求21中所述的核酸分子，包括圖7的GW SEQ中標作SRE5的序列或它的一種功能變體。
23．依據權利要求22中所述的核酸分子，其中上述變體相對于圖7中所顯示的ON SEQ SRE5，在GW SEQ SRE5中至少有一個核苷酸的區別。
24．依據以上權利要求20到23任何一項中所述的核酸分子，其包括圖7中作為SRE3和SRE4顯示的血清應答因子或其功能變體。
25．依據以上權利要求20到24任何一項中所述的核酸分子，其包括一個TATA盒子。
26．依據權利要求25中所述的核酸分子，其中的TATA盒子包括序列AAATA。
27．依據權利要求20到26任何一項中所述的核酸分子，其包括一個Egr-1結合位點(EBS)。
28．依據權利要求27中所述的核酸分子，其中的Egr-1結合位點具有圖7 GW SEQ中標為EBS的序列或具有上述序列的一種變體。
29．依據權利要求20到28任何一中所述的核酸分子，其中上述變體相對于圖7 GW SEQ中標為EBS的序列，對Egr-1的親和力降低。
30．依據權利要求29中所述的核酸分子，其中上述變體包括圖2中所顯示的EBS序列。
31．依據權利要求20到26任何一項中所述的核酸分子，其不具有一Egr-1結合位點。
32．依據權利要求20到31任何一項中所述的核酸分子，其包括一段可以結合Sp1的序列。
33．依據權利要求32中所述的核酸分子，其包括兩段可以結合Sp1的序列。
34．依據權利要求32或權利要求33中所述的核酸分子，其包括圖7中所顯示的GW SEQ的一個Sp1結合位點或兩個均包括。
35．依據權利要求20到34任何一項中所述的核酸分子，其包括一個cAMP應答因子。
36．依據權利要求35中所述的核酸分子，其包括至少一個圖7GWSEQ中標為cAMP RE的cAMP應答因子。
37．依據權利要求35或權利要求36中所述的核酸分子，其包括圖7 GW SEQ中顯示的第一個cAMP RE。
38．一種包括圖7中顯示的GW SEQ的所有盒子序列的核酸分子，可選擇性地除EBS序列之外。
39．一種包括圖7中所顯示GW SEQ分子的一種變體的核酸分子，該變體相對于圖7中顯示的GW SEQ分子，能夠使得Egr-1的轉錄水平升高。
40．一種包括圖7中所顯示GW SEQ分子的一種變體的核酸分子，該變體相對于圖7中顯示的GW SEQ分子，能夠使得Egr-1的轉錄水平降低。
41．依據權利要求20到40任何一項中所述的核酸分子，其包括一段編碼Egr-1的序列。
42．一種包括依據權利要求20到41任何一項中所述的分子的核酸載體。
43.一種包括依據權利要求20到41任何一項中所述的核酸分子或依據權利要求42中所述的載體的細胞。
44．一種治療患者的方法，包括對該患者施用依據權利要求20到41任何一項中所述的核酸分子、依據權利要求42中所述的載體、或依據權利要求43中所述的細胞。
45．一種治療患者的方法，包括對該患者施用使用依據權利要求20到41任何一項中所述的核酸分子、使用依據權利要求42中所述的載體、或使用依據權利要求43中所述的細胞產生的Egr-1。
46．依據權利要求44或45中所述的方法，其中的治療是對傷口的治療(包括傷口愈合和相關癥狀及治療，其促進、增強或加速組織的愈合，并包括治療糖尿病和末梢動脈閉塞病中的肢體潰瘍、手術后疤痕、燒傷、牛皮癬，加速組織重塑和骨修復，及在經皮腔內冠狀動脈成形術之后促進血管生成、上皮再生成)。
47．依據權利要求44到46任何一項中所述的方法，其中的核酸分子或Egr-1被施用到傷口上或傷口附近。
48．一種診斷的方法，包括使用依據權利要求20到40任何一條中所述的核酸分子作為探針以確定是否存在遺傳缺陷。
49．一種篩選的方法，包括使用依據權利要求20到40任何一條中所述的核酸分子，通過結合研究以鑒定潛在的治療基因。
50．一種鑒定一種能夠上或減量調節Egr-1轉錄的制劑的方法，包括提供一種相對于依據權利要求20到40任何一項中所述的核酸分子(如相對于一種包括圖7中所顯示的SW SEQ分子)具有一個或多個核苷酸變化的核酸分子，并確定上述變化是否會影響Egr-1的轉錄水平。
51．一種通過依據權利要求49或權利要求50所述的方法鑒定的制劑。
52．一種藥劑組合物，其包括一種治療上可接受的載體和依據權利要求20到41任何一項中所述的核酸分子、依據權利要求42中所述的載體、或依據權利要求43中所述的細胞。
53．一種藥劑組合物，其包括一種治療上可接受的載體和使用依據權利要求20到41任何一項中所述的核酸分子、依據權利要求42中所述的載體、或依據權利要求43中所述的細胞產生的Egr-1。
全文摘要
本發明涉及一種Egr－1轉錄因子多肽、或它的一段生物活性片段、以及編碼這種多肽的核酸分子在生產一種用于治療哺乳動物(包括人類)傷口的藥物中的應用。另外,本發明也涉及一段序列,該序列被認為包括涉及轉錄因子Egr－1在人體內的轉錄及其調控的重要區域。該序列可以被用于設計可以被用于傷口的治療以及其它治療的合適的核酸分子和載體。
文檔編號A61K35/76GK1311822SQ9980928
公開日2001年9月5日 申請日期1999年6月2日 優先權日1998年6月2日
發明者M·布拉多克, C·J·坎貝爾, J·L·施瓦赫特根 申請人:葛蘭素集團有限公司