專利名稱：癌胚抗原基因工程抗體CL-3-scFv的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程產品。本產品能夠與癌胚抗原特異結合，識別大腸癌和胃癌組織中的腫瘤細胞，是一種胃腸道惡性腫瘤的輔助診斷試劑，并可以作為消化道腫瘤的識別因子與放射性核素或藥物偶聯以制備靶向藥物，用于腫瘤的生物治療。
當前，癌癥仍然是危害人類生命的頭號殺手，因此，腫瘤的治療是人們關心的重要課題。近年發展起來的腫瘤生物治療是繼腫瘤化療、放療和手術治療之后的第四大療法。以單克隆抗體為載體的腫瘤靶向治療是腫瘤生物治療的重要組成部分。其作用機理在于腫瘤細胞具有區別與正常細胞的腫瘤特異性抗原和腫瘤相關性抗原。癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen，簡稱CEA)是一種腫瘤相關抗原，其化學本質是一種酸性糖蛋白，分子量為160-200 kDa。這種酸性糖蛋白是胚胎發育早期胎兒腸、肝、胰等組織中的正常成分。在胚胎后期逐漸減少，出生后血清中水平極低。當腫瘤發生時，癌細胞又重新合成該抗原，并表達于腫瘤細胞表面。CEA最初在結腸癌和直腸癌組織中檢出，后來發現在內胚層來源的其他惡性腫瘤(如食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等)中也存在。CEA作為多種惡性腫瘤細胞表面的重要標志物已廣泛地應用于腫瘤的基礎研究和臨床診斷與治療。
國內外有關抗CEA的單克隆抗體及其偶聯物在腫瘤診斷和治療方面的應用報道很多。其中抗體CL-3與131I偶聯物在結腸癌體內定位診斷方面顯示出很高的特異性和敏感性，并能夠抑制結腸癌的生長，緩解腫瘤病人的癥狀。但是反復用藥后出現的人體抗鼠抗體反應以及單克隆抗體的分子量較大，不易進入實體瘤組織等問題限制了他的應用。
針對上述缺欠，本發明采用了分子生物學方法構建、克隆并表達了抗CEA基因工程單鏈抗體。創新之一在于抗體分子量小。它是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過一個小分子肽連接而成的單鏈抗體可變區片段(singlechain Fv fragment，簡稱scFv)。分子量約25kDa，是其親代單克隆抗體分子量的六分之一。與親代單克隆抗體相比，CL-3-scFv的優越性主要表現在免疫原性較小，不易引起人體免疫排斥反應；．滲透性好，能有效地穿透致密的腫瘤屏障，有利于實體瘤的診斷和治療；．由于抗體CL-3-scFv不合Fc片段，避免與含Fc受體的細胞發生非特異反應，因此在體內成像定位檢查時，本底低，圖像清晰；．抗體CL-3-scFv不需要糖基化，有利于用原核系統大批量生產；．抗體CL-3-scFv與毒素基因重組，產生的重組免疫毒素能夠克服傳統單抗與毒素化學偶聯物的不穩定性，為腫瘤生物治療提供新型靶向藥物。
創新之二其抗體制備技術與雜交瘤技術比較，具有以下優越性．省去了細胞融合及免疫人和動物這些耗時費力的步驟；．直接獲得并保存抗體基因，避免了雜交瘤反復凍存后基因丟失問題；．通過抗體基因改造，提高抗體的親和力，改善抗體的效應功能；．能夠研制人源抗體；．噬菌體篩選抗體方法效率高，操作簡便、經濟、適用于快速大規模地生產。
創新之三有關CEA單克隆抗體的研制已有報道，而CEA單鏈基因工程抗體國內外未見報道。
本發明的具體技術方案是首先從分泌抗CEA單克隆抗體的鼠雜交瘤細胞中分離、純化mRNA，反轉錄成cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，通過PCR技術分別擴增出重鏈可變區基因(VH)和輕鏈可變區基因(VL)。通過一段編碼(Gly4Ser)3的DNA序列把VH和VL連接起來，構成VH-Linker-VL融合基因。為了將該基因插入帶有Sfi 1和Not 1酶切位點的表達載體中，我們通過PCR在scFv基因片段兩端分別加上含有Sfi 1和Not 1酶切位點。經過內切酶Sfi 1和Not 1消化PCR擴增產物并回收，繼而與含Sfi 1和Not 1雙酶切的表達載體pCANTAB5E連接，轉化大腸桿菌TGl感受態細胞。
由于單鏈抗體可變區基因插入噬菌體外殼蛋白93p基因中，與93p基因形成融合基因。因此單鏈抗體和外殼蛋白93p以融合蛋白的形式表達于噬菌體的表面。用免疫親和篩選法，以人結腸癌CEA為抗原，從重組噬菌體抗體文庫中進行篩選。把那些與CEA結合的重組抗體噬菌體分離出來，用于感染TGl。通過培養擴增使這些CEA重組噬菌體抗體得到富集。經過3輪免疫親和-感染-擴增-再篩選過程，最終獲得CEA特異性重組噬菌體抗體。這種抗體可用于腫瘤的體外免疫診斷。
為了獲得能夠用于腫瘤治療的可溶性單鏈抗體，我們選用表達載體中單鏈抗體基因與93p基因之間有一個琥鉑(amber)終止密碼子。在大腸桿TGl細胞中含有supE基因，可通讀amber密碼子，產生scFv-93p融合蛋白。而在HB2151細胞中不含supE基因，因此翻譯在amber終止密碼子處停止，產生scFv蛋白并不斷地將其轉運到胞周質中，逐漸滲漏到培養液中，從而獲得可溶性單鏈抗體。
為了方便地檢測單鏈抗體，本發明選用了pCANTAB5E表達載體。在scFv基因的3‘端連接一個編碼小分子肽E-Tag的基因。因此表達出來的單鏈抗體能用抗E-Tag的抗體檢測。經過ELISA篩選，獲得6株CEA單鏈抗體。隨機選出兩株進行DNA序列分析，結果表明二者都是由693核甘酸組成，其序列完全一致。我們將其命名為CL-3-scFv。Western Blot結果顯示CL-3-scFv具有與親代單克隆抗體相同的特異性。它能夠識別大腸癌和胃癌組織中的腫瘤細胞，而不與正常胃腸道組織起反應。
為了大量生產抗體CL-3-scFv，本發明把抗體CL-3-scFv基因分別克隆到表達載體pJW2和pET5a上，構建成抗體重組質粒pJW2-CL-3-scFv和pET5a-CL-3-scFv高效表達載體。分別轉化大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)。在用42℃(pJW2-CL-3-scFv)或1mM IPTG(pET5a-CL-3-scFv)誘導下，表達抗體量為總蛋白量的35％。經過包涵體蛋白的純化及復性，通過MonoQ及Q Sepharose FF離子交換層析純化抗體，最后獲得純度大于90％的單鏈抗體。
實施例(1)細胞培養及鑒定分泌CL-3抗體的雜交瘤細胞培養于含15％牛血清的完全RPMI1640培養基中。培養箱含5％CO2的混合氣體，濕度為98％。用ELISA方法鑒定培養上清中單抗的特異性和滴度。
(2)mRNA的分離與純化用快速制備、純化mRNA試劑盒(Promega)從大約2 X 107個雜交瘤細胞中提取并純化mRNA。
(3)制備cDNA以純化的mRNA為模板，反轉錄合成cDNA。
(4)擴增抗體可變區基因用PCR方法以cDNA為模板，在PCR反應體系中分別加入一套輕鏈或重鏈可變區引物，10×PCR緩沖液5μl，dNTP終濃度為2.5mM，混勻后經100℃變性5min，加入2單位Taq DNA聚合酶。總反應體積為50μl。混勻后加礦物油。進行30個循環反應，每個循環的條件是94℃變性30s，55℃退火90s，72℃延伸90s，反應進行到最后一個循環后在72℃中保溫10min。反應結束后，分別從重、輕鏈可變區PCR反應體系中取出3μl走1.5％瓊脂糖凝膠電泳，其余部分用SephaglesTMBandprep Kit回收。
(5)單鏈抗體基因的組裝及擴增回收的VH和VL基因片段與連接引物在等摩爾或接近等摩爾濃度條件下，加入2.5mM dNTP和5單位Taq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液2.5μl,25mM MgCl22.5μl，反應體積為25μl，用液體石蠟油封閉后進行7個退火循環，每個循環的反應條件為94℃變性30秒，64℃退火4分鐘。
以scFv基因為模板，在上述反應體積中，加入一對5’端含Sfi I,3’端含Not Ⅰ酶切位點的引物，進行30個PCR循環，每個循環的條件是94℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘，最后一次循環后在72℃保溫10分鐘。從scFv基因PCR擴增反應體系中取出3μl走1.2％瓊脂糖凝膠電泳，其余部分用上述回收試劑盒回收。
(6)單鏈抗體基因庫的建立回收后的scFv基因分別經過內切酶SfiⅠ和Not Ⅰ消化后并與Sfi Ⅰ/Not Ⅰ雙酶切的質粒pCAMTNB5E連接，轉化大腸桿菌TGl感受態細胞。在培養液2×YT-G(1.7％Bacto-trypone,1％Bacto-yeast extract,0.5％ NaCl,2％葡萄糖)中培養轉化菌。小部分(約1/10體積)轉化菌以13％甘油保存于-70℃。
(7)重組噬菌體抗體的表達及免疫親和篩選剩余的轉化菌用10ml2×YT-G稀釋，并在37℃培養至0D600值為0.5。然后加氨芐青霉素至終濃度為100μg/ml,M13K07至終濃度為2×109pfu/ml,37℃培養1小時，離心。菌體沉淀重懸于10ml 2×YT-AK(含100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×YT)培養液中，于37℃培養過夜，離心收集含有重組噬菌體的上清。
將含有重組噬菌體的上清與包被在培養皿上的CEA抗原一起于37℃孵育1小時。用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗平皿20次，PBS洗平皿20次。加100mM三乙胺1ml洗脫結合在平皿上的重組噬菌體抗體，立即用1MTris-HCl,pH 9中和并收集洗脫下來的重組噬菌體。重復上述感染-擴增-篩選過程2輪。
(8)重組噬菌體抗體的制備與鑒定取第三輪洗脫下來的重組噬菌體抗體100μl和對數生長期的TGl細胞200μl，混勻后于37℃搖床培養30分鐘，將感染細胞用2×YT做倍比稀釋(1∶10,1∶100,1∶1000)后，涂布在SOBAG(2％Bacto-trypone,0.5％Bacto-yeast extract,0.05％NaCl,10mMMgCl2,2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素，1.5％Bacto-Agar)固體培養基上于30℃培養過夜。從平板上隨機挑72個單菌落，分別接種到100μl 2×YT-AG(含100μg/ml氨芐青霉素，2％葡萄糖的2×YT)培養液中，30℃培養過夜。次日分別取20μl過夜菌轉接到新的1.5mlEppendorf離心管中，含200μl2×YT-AG和5×108pfu/ml M13K07。37℃培養2小時，離心，用200μl 2×YT-AK(含氨芐青霉素和卡那霉素)培養液分別懸浮每個離心管中的沉淀細胞，于37℃培養過夜。離心并收集上清。
用抗原CEA包被96孔酶聯板，包被液為0.05M Na2CO3(pH9.6)，抗原濃度為10μg/ml，每孔加包被液100μl,4℃過夜。加封閉液(1.5％BSA溶于PBS中)，于室溫封閉1小時。把100μl重組噬菌體抗體上清與封閉液等體積混合，室溫放置10分鐘后加入到包被的酶聯板上，37℃溫育1小時。以M13噬菌體為陰性對照，1％BSA、2×YT、PBS為空白對照，以CL-3單克隆抗體為陽性對照，用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。加100μl抗M13噬菌體并用辣根過氧化物酶標記的IgG-HRP(1∶5000)，陽性對照孔加100μl羊抗鼠IgG-HRP，37℃反應1小時，用PBST洗板3次，PBS洗板3次。加底物OPD-H2O2100μl，室溫作用20分鐘，加50μl 2M H2SO4終止反應，在490nm處檢測每孔的光吸收值。從中選擇幾株活性較高的克隆，設平行孔重復上述結果，最后確定一株活性最強的陽性克隆，命名為CL-3-scFv。(9)陽性克隆重組質粒的鑒定及其DNA序列分析提取CL-3-scFv重組質粒，分別用SfiⅠ和NotⅠ限制性內切酶消化。酶切產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析。用T7 DNA SequenceTMKit測定該重組質粒上scFv基因的DNA序列。結果表明CL-3-scFv基因是由693個核甘酸組成，其序列如下ATG GCC CAG GTC CAG CTG CAG GAG TCA GGG TAT ACT TTC ACA ACC TAT GGA ATG AGCTGG GTG AAA CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACC TACTCT GGA GTG CCA ACA TAT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAAACC TCT GTC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG TCAACA TAT TTC TGT GCA AGA TAT GCC TTC GGC TCT TGG TAC TTC GAT GTC AGG GGC CAAGGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGCGGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA ATG GCT TCT TTG GCT GTG TCTCTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT ACT TAT GCCGTT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATCTAT ACT GCA TCC AAG CAA GGG TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCTGGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT GCT GCA ATG TATTTC TGT CAA CAA AGT AAG GAG GTT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTG GAAATA AAA CGG
(10)可溶性單鏈抗體的制備及鑒定用鑒定的重組質粒轉化大腸桿菌HB2151。挑4個單菌落于2ml 2×YT-AG培養液中培養過夜。離心，用含1mMIPTG的2×YT培養液2ml懸浮沉淀細胞，于30℃誘導培養20小時。離心，分別收集上清。加等體積丙酮，混勻，于4℃冰箱靜置4小時。離心，除去上清，于空氣中干燥30分鐘。加50μl PBS溶解沉淀物。
取15μl沉淀物經12％的SDS-PAGE電泳后，用電轉法將凝膠上的蛋白物質轉移到硝酸纖維素濾膜上，再用抗E-Tag抗體(Phamacia)檢測可溶性單鏈抗體。Western Blot實驗證明該可溶性scFv抗體片段的分子量約為26kDa左右(圖6)。他是由231個氨基酸組成。根據DNA序列推導出的氨基酸序列如下MAQVQLQESGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSVSTAYLQINNLKNEDTSTYFCARYAFGSWYFDVRGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPMASLAVSLGQRATISCRASESVDTYAVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYTASKQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKR(11)可溶性單鏈抗體的免疫活性鑒定在冰上，往200ml上清中逐漸加入58.2克硫酸銨使其終濃度達50％，并用磁力攪拌器不斷攪拌4小時。離心，棄上清，沉淀溶于2ml PBS緩沖液中。
ELISA以抗原CEA包被40孔酶聯板，包被液為0.05 M Na2CO3(pH9.6)，抗原濃度為10μg/ml，每孔加包被液100μl,4℃過夜。加封閉液1％BSA，溶于PBS緩沖液中)，于室溫封閉1小時。設平行孔，用封閉液稀釋濃縮的免疫上清(1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,…)，每孔加100μl稀釋的免疫上清。以1％BSA、2×YT為陰性對照，PBS為空白對照，以CL-3單克隆抗體為陽性對照，37℃溫育1小時，用PBST和PBS洗板各3次。加1∶2000稀釋的抗E-Tag抗體100μl。陽性對照加100μl稀釋液，37℃溫育1小時，用PBST和PBS洗板各3次。加1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 100μl,37℃溫育1小時。用PBST和PBS洗板各3次。加底物OPD-H2O2100μl，室溫作用20分鐘，加50μl 2M H2SO4終止反應，在A490處測每孔的OD490值并分析結果。
Western Blot以人結腸癌CEA為抗原，用不同的濃度的抗原稀釋液2μl點在硝酸纖維素濾膜上，以BSA為陰性對照，PBS緩沖液為空白對照。在空氣中干燥20分鐘后，加5％ 脫脂奶粉/PBS，于4℃封閉過夜。將膜分別與免疫上清中的CL-3-scFV或CL-3單克隆抗體反應，于室溫平緩搖動2小時。用PBS緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。分別加入1∶300稀釋的抗E-Tag抗體10ml或1∶500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 10ml，于室溫平緩搖動1小時。再用無磷酸鹽緩沖液(150mM Tris-HCl pH7.4,50m M NaCl)洗膜10分鐘。加10ml底物(0.01M Tris-HCl pH7.4,0.03％CoCl2,6mg二氨基聯苯，15μl H2O2)，于室溫平緩搖動2-3分鐘，用蒸餾水漂洗，加20ml PBS緩沖液保存于4℃。Dot Blot結果表明CL-3-scFv能夠特異結合CEA的活性，且與陽性對照CL-3單克隆抗體的活性近似。說明該可溶性抗體片段具有與親代單克隆抗體相同的親和力和特異性。
(12)CL-3-scFv高效表達載體的構建為了大量生產CL-3-scFv，我們把抗體CL-3-scFv基因分別克隆到表達載體pJW2和pET5a上，構建成重組質粒pJW2-CL-3-scFv和重組質粒pET5a-CL-3-scFv高效表達載體。分別轉化大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)。在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養基上隨機挑單菌落，于1000ml LB培養基中30℃培養至OD600=0.6時，分別用42℃(pJW2-CL-3-scFv)或1mM IPTG(pET5a-CL-3-scFv)誘導培養5小時。離心，收集細胞。
(13)包涵體蛋白的提取[5]及復性[6]菌體重懸于20ml蒸餾水中，超聲破菌。離心12000xg,4℃,30min。棄上清，沉淀既為包涵體。用50mM TE洗滌一遍后，于-20℃保存。
用8M尿素(含10mM DTT)溶解包涵體，置室溫2小時后，離心12000xg,4℃,20min，棄沉淀。上清逐滴加入復性液(0.1 M TE,0.5 M L-精氨酸，1mM GSSG,0.2mM GSH,pH 8.4)使蛋白的終濃度約為30μg/ml。靜置10℃，48小時以上。
(14)抗體CL-3-scFv的純化用PEG濃縮復性的抗體。以MonoQ及QSepharose FF離子交換層析純化抗體。用20mM TE平衡柱子(2.6×20cm)。上樣用20mM TE洗脫，流速60ml/h。待穿過峰后，以20mMTE，0.3M NaCl洗脫，收集目的峰。用SDS-PAGE和Western Blot鑒定抗體，獲得單鏈抗體的純度大于90％。
權利要求
1．一種用于胃腸道惡性腫瘤輔助診斷試劑和治療的新型生物制劑，其特征在于是用構建的抗體可變區融合基因所表達的一種能識別大腸癌和胃癌組織中腫瘤細胞的單鏈抗體。
2．根據權利要求1所述的單鏈抗體基因，其特征在于單鏈抗體基是由693個核苷酸組成，其序列是ATG GCC CAG GTC CAG CTG CAG GAG TCA GGG TAT ACT TTC ACA ACC TAT GGA ATG AGCTGG GTG AAA CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACC TACTCT GGA GTG CCA ACA TAT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAAACC TCT GTC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG TCAACA TAT TTC TGT GCA AGA TAT GCC TTC GGC TCT TGG TAC TTC GAT GTC AGG GGC CAAGGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGCGGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA ATG GCT TCT TTG GCT GTG TCTCTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT ACT TAT GCCGTT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATCTAT ACT GCA TCC AAG CAA GGG TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCTGGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT GCT GCA ATG TATTTC TGT CAA CAA AGT AAG GAG GTT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTG GAAATA AAA CGG
3．根據權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于單鏈抗體是由231個氨基酸組成，其序列是MAQVQLQESGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSVSTAYLQINNLKNEDTSTYFCARYAFGSWYFDVRGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPMASLAVSLGQRATISCRASESVDTYAVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYTASKQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKR
4．根據權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體能夠與癌胚抗原特異結合，而不與正常的胃腸道組織起反應，可以作為一種敏感的特異制劑用于與癌胚抗原有關的多種腫瘤的免疫診斷和治療。
全文摘要
本發明是一種生物工程產品,是用構建的抗體可變區融合基因所表達的一種能夠識別大腸癌和胃癌組織中腫瘤細胞的單鏈抗體。它能夠用于胃腸道惡性腫瘤的輔助診斷和生物治療,能夠在原核系統中表達,表達量占菌體總蛋白的35%以上,有利于大批量生產,能夠與毒素基因重組形成重組免疫毒素,為腫瘤生物治療提供新型靶向藥物。
文檔編號A61P35/00GK1223145SQ9712192
公開日1999年7月21日 申請日期1997年11月19日 優先權日1997年11月19日
發明者閻錫蘊, 田波 申請人:中國科學院微生物研究所