高度半乳糖基化的抗her2抗體及其用圖
【專利說明】高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其用途
[0001] 相關申請
[0002] 本申請根據35U.S.C§ 119(e)要求2013年2月13日提交的標題為"高度半乳糖 基化的抗HER2抗體及其用途"的美國臨時申請系列號61/764, 488的權益，其全部公開通過 提述并入本文。 發明領域
[0003] 本發明部分涉及抗HER2抗體領域。
[0004] 發明背景
[0005]HER2 (人上皮生長因子受體2)，也稱為HER2/neu或ErbB2,是上皮生長因子受體 家族的成員。HER2是一種質膜結合受體酪氨酸激酶，其可以與自身和上皮生長因子受體家 族的其它成員（HER1，HER2，HER3和HER4)二聚化。二聚化繼而導致多種細胞內途徑的活 化。HER2是一種癌基因，其在多種癌癥中過表達，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和子宮癌。癌癥 ("HER2+"癌癥）中的HER2過表達與不良預后相關。
[0006] HER2是結合HER2/neu受體胞外段的域IV的單克隆抗體曲妥珠單抗 (trastuzumab) (Herceptin)的革巴標。曲妥珠單抗由FDA在1998年批準并已經用于治療 HER2+乳腺癌和HER2+胃癌。然而，在大量患有HER2+癌癥的患者中，曲妥珠單抗并不是治 療有效的。另外，使用曲妥珠單抗治療與心功能障礙和另外不想要的副作用相關。因此，需 要具有改進的治療特性的抗HER2抗體。
[0007] 發明簡述
[0008] 在一個方面，本公開涉及高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其組合物。在一個方 面，本公開涉及具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗體群體，及其組合物。在一個方面，本公 開涉及產生和使用高度半乳糖基化的抗HER2抗體和具有高半乳糖基化水平的抗HER2抗體 群體的方法。在一些實施方案中，所述抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
[0009] 在一個方面，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體為高度半乳糖基化的。在一 些實施方案中，所述抗體為高度巖藻糖基化的。在一些實施方案中，所述抗體包含單半乳糖 基化的N-聚糖。在一些實施方案中，所述抗體包含雙半乳糖基化的N-聚糖。在一些實施方 案中，所述抗體的重鏈包含SEQIDN0:1，而所述抗體的輕鏈包含SEQIDN0:2。在一些實 施方案中，所述抗體是曲妥珠單抗。在一些實施方案中，所述抗體在非人哺乳動物的乳腺上 皮細胞中產生。在一些實施方案中，所述抗體在轉基因非人哺乳動物中產生。在一些實施 方案中，所述非人哺乳動物是山羊、綿羊、野牛（bison)、駱駝、母牛（cow)、豬、兔、水牛、馬、 大鼠、小鼠或羊駝（llama)。在一些實施方案中，所述非人哺乳動物是山羊。
[0010] 在一個方面，本公開提供本文公開的任意抗體的組合物，其中所述組合物進一步 包含乳。在一些實施方案中，所述組合物進一步包含藥學上可接受的載體。
[0011] 在一個方面，本公開提供組合物，其包含抗體群體，其中所述抗體是抗HER2抗體， 而其中所述群體中抗體的半乳糖基化水平至少為50%。在一些實施方案中，所述群體中抗 體的半乳糖基化水平至少為60%。在一些實施方案中，所述群體中抗體的半乳糖基化水平 至少為70%。在一些實施方案中，所述群體中抗體的巖藻糖基化水平至少為50%。在一些 實施方案中，所述群體中抗體的巖藻糖基化水平至少為60%。在本文提供的任意組合物的 一些實施方案中，所述群體包含抗體，其包含單半乳糖基化的N-聚糖。在本文提供的任意 組合物的一些實施方案中，所述群體包含抗體，其包含雙半乳糖基化的N-聚糖。在本文提 供的任意組合物的一些實施方案中，所述群體中抗體的半乳糖基化水平與群體中抗體的巖 藻糖基化水平的比率在1. 〇和1. 4之間。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，群 體中至少25 %的抗體包含雙半乳糖基化的N-聚糖，而群體中至少25%的抗體包含單半乳 糖基化的N-聚糖。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，所述抗體的重鏈包含SEQ IDNO: 1，而抗體的輕鏈包含SEQIDNO:2。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中， 所述抗體是曲妥珠單抗。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，所述抗體在非人哺 乳動物的乳腺上皮細胞中產生。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，所述抗體在 轉基因非人哺乳動物中產生。在一些實施方案中，所述非人哺乳動物是山羊、綿羊、野牛、 駱駝、母牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或羊駝。在一些實施方案中，所述非人哺乳動物是山 羊。在一些實施方案中，所述組合物進一步包含乳。在一些實施方案中，所述組合物進一步 包含藥學上可接受的載體。
[0012] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體群體比較時，所述抗體群體具有增加的補體依賴性細胞毒性（CDC)活性水平。
[0013] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體群體比較時，所述抗體群體具有增加的抗體依賴性細胞性細胞毒性（ADCC)活性水平。
[0014] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體群體比較時，所述抗體群體具有增加的抑制受試者中HER2活性的能力。
[0015] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體群體比較時，所述抗體群體具有增加的結合HER2的能力。
[0016] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體群體比較時，所述抗體群體具有增加的抑制HER2二聚化的能力。
[0017] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，所述不在乳腺上皮細胞中產生的抗 體在細胞培養物中產生。
[0018] 在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與在乳腺上皮細胞中產生的抗體 的半乳糖基化水平比較時，所述不在乳腺上皮細胞中產生的抗體的半乳糖基化水平為50% 或更低。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與在乳腺上皮細胞中產生的抗體 的半乳糖基化水平比較時，所述不在乳腺上皮細胞中產生的抗體的半乳糖基化水平為30% 或更低。在本文提供的任意組合物的一些實施方案中，當與在乳腺上皮細胞中產生的抗體 的半乳糖基化水平比較時，所述不在乳腺上皮細胞中產生的抗體的半乳糖基化水平為10% 或更低。
[0019] 在一個方面，本公開提供用于產生抗體群體的方法，其包含：在非人哺乳動物的乳 腺上皮細胞中表達抗體群體，使得抗體群體產生，其中所述抗體是抗HER2抗體，其中所述 群體中的抗體的半乳糖基化水平為至少50%。在一些實施方案中，所述乳腺上皮細胞在培 養物中并使用包含編碼所述抗體的序列的核酸轉染。在一些實施方案中，所述乳腺上皮細 胞在非人哺乳動物中，所述動物經工程化來在其乳腺中表達包含編碼所述抗體的序列的核 酸。在一些實施方案中，所述核酸包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:4.在一些實施方案中， 所述乳腺上皮細胞是山羊、綿羊、野牛、駱盤、母牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或羊駝乳腺 上皮細胞。在一些實施方案中，所述乳腺上皮細胞是山羊乳腺上皮細胞。
[0020] 在一個方面，本公開提供乳腺上皮細胞，其產生本文公開的抗體、抗體群體，或組 合物中的任一種。
[0021] 在一個方面，本公開提供轉基因非人哺乳動物，其包含本文公開的任意乳腺上皮 細胞。
[0022] 在一個方面，本公開提供方法，其包含將本文公開的抗體、抗體群體，或組合物中 的任一種施用到有此需要的受試者。在一些實施方案中，所述受試者患有癌癥。在一些實 施方案中，所述癌癥為HER2+癌癥。在一些實施方案中，所述HER2+癌癥為乳腺癌、卵巢癌、 胃癌或子宮癌。
[0023] 在一個方面，本公開提供單克隆抗HER2抗體組合物，其包含在Fc糖基化位點 (Asn297,EU編號）上具有聚糖結構的單克隆抗HER2抗體，其中所述聚糖結構具有多于 60%的半乳糖含量。
[0024] 附圖簡述
[0025] 首先描述附圖。應當理解附圖為示例性的而對于啟用本發明不是必需的。
[0026] 圖1A和圖1B示出了來自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗體群體的 N-聚糖的代表性寡糖標簽（signature)。
[0027] 圖2示出了在泌乳的第7天，來自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗體群 體的N-聚糖的寡糖標簽。
[0028] 圖3示出了在泌乳的第15天，來自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗體 群體的N-聚糖的寡糖標簽。
[0029] 圖4示出了在泌乳的第30天，來自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗體 群體的N-聚糖的寡糖標簽。
[0030] 圖5示出了在泌乳的不同天數，來自山羊#1的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗體 群體的N-聚糖寡糖的百分比的匯總。
[0031]圖6示出了在首次泌乳的第7天，來自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗 體群體的N-聚糖的寡糖標簽。
[0032]圖7示出了在首次泌乳的第7天，來自山羊#2的高度半乳糖基化的曲妥珠單抗抗 體群體的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0033] 圖8示出了在首次泌乳的第15、49、84、112天，來自山羊#2的高度半乳糖基化的 曲妥珠單抗抗體群體的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0034] 圖9示出了來自泌乳第7天的山羊#3和泌乳第3/4天的山羊#4的高度半乳糖基 化的曲妥珠單抗群體的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0035] 圖10示出了來自泌乳第3天的山羊#5和泌乳第5、6和7天的山羊#6的高度半 乳糖基化的曲妥珠單抗群體的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0036] 圖11示出了在第二次泌乳的第8、15和29天，來自山羊#2的高度半乳糖基化的 曲妥珠單抗群體的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0037] 圖12示出了商業的Herceptiii? /曲妥珠單抗的N-聚糖寡糖百分比的匯總。
[0038] 圖13示出了比較首次泌乳（NL1)或第二次泌乳（NL2)的不同天數時由山羊#2產 生的曲妥珠單抗的唾液酸和甘露糖修飾以及主要形式的匯總。
[0039] 圖14示出了山羊#1-6中產生的曲妥珠單抗的唾液酸和甘露糖修飾以及主要形式 的匯總。
[0040] 圖15示出了轉基因產生的曲妥珠單抗結合已知表達HER2的SK-BR-3細胞。
[0041] 圖16示出了與商業的:/曲妥珠單抗相比，轉基因產生的曲妥珠單抗 具有相似的對SK-BR-3細胞的結合親和力。
[0042] 圖17示出了轉基因產生的曲妥珠單抗與NK細胞上表達的⑶16相互作用。
[0043] 圖18示出了與商業的Herceptin?/曲妥珠單抗相比，轉基因產生的曲妥珠單抗 具有增強的抗體依賴性細胞性細胞毒性（ADCC)。
[0044] 圖19示出了轉基因產生的曲妥珠單抗抗體減少了BT-474細胞的增殖。
[0045] 發明詳述
[0046] 在一個方面，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體是高度半乳糖基化的。抗 HER2抗體結合HER2,并且抗HER2抗體已用作以HER2過表達為特征的多種癌癥（HER2+癌 癥）的治療劑。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
[0047] 在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括包含SEQIDNO: 1的 重鏈。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括包含SEQIDN0 :2的輕 鏈。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括包含SEQIDNO: 1的重鏈 和包含SEQIDNO:2的輕鏈。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括 由SEQIDNO: 1組成的重鏈。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括 由SEQIDN0 :2組成的輕鏈。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括 由SEQIDN0 :1組成的重鏈和由SEQIDN0 :2組成的輕鏈。在一些實施方案中，所述高度 半乳糖基化的抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
[0050] 應當進一步理解在一些實施方案中，本公開也包括基于曲妥珠單抗序列但包括突 變的抗體，所述突變給所述抗體提供與生物利用度、穩定性等相關的額外的有益的所需特 性。
[0051] 在一個方面，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體是高度半乳糖基化的。在一 些實施方案中，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體是高度巖藻糖基化的。在一些實施 方案中，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體是高度半乳糖基化和高度巖藻糖基化的。 在一些實施方案中，本公開提供抗HER2抗體，其中所述抗體是高度半乳糖基化和高度巖藻 糖基化的。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體包含一個或多個單半乳糖基化 的N聚糖。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體包含雙半乳糖基化的N聚糖。
[0052] 在一個方面，本公開提供單克隆抗HER2抗體組合物，其包含在Fc糖基化位點（Asn 297,EU編號）上具有聚糖結構的單克隆抗體，其中所述聚糖結構具有多于60%的半乳糖 含量。在一個實施方案中，所述抗HER2單克隆抗體是純化的。當提及免疫球蛋白重鏈恒 定區中的殘基時，通常使用"EU編號系統"或"EU索引"（例如，Kabatetal.，Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest, 5thed. ,PublicHealthService,National InstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)中報道的EU索引，通過提述明確并入本文）。 抗體中典型的糖基化殘基位置是根據EU編號系統在位置297處的天冬酰胺（〃Asn297〃）。
[0053] 應當理解本文公開的任意抗HER2單克隆抗體可以是部分或完全純化的。
[0054] 抗體可以在Fc區重鏈中的Fc-γ糖基化位點（Asn297)使用N-聚糖糖基化。通 常來說，抗體包括兩條重鏈，因此每個抗體可以具有兩個Fc-γΝ-聚糖。在Fc-γ糖基 化位點已觀察到了多種糖基化模式，而在該位點發現的寡糖包括半乳糖、N-乙酰葡糖胺 (GlcNac)、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神經氨酸（NeuAc或NANA)、N-羥乙酰神經氨酸（NGNA)和 巖藻糖。在Fc-γ糖基化位點發現的N-聚糖通常具有共同的核心結構，其由第一個N-乙 酰葡糖胺（GlcNAc)的不分支的鏈（其附接到抗體的天冬酰胺），附接到第一個GlcNac的 第二個GlcNAc和附接到第二個GlcNac的第一個甘露糖組成。另外兩個甘露糖附接到 GlcNAc-GlcNAc-甘露糖鏈的第一個甘露糖以完成核心結構并提供兩條"臂"用于額外的糖 基化。另外，巖藻糖殘基可以附接到N-連接的第一個GlcNAc。
[0055] 雙臂核心結構也稱為"觸角"。在血漿抗體中發現的N-聚糖基序的"臂"的最常見 糖基化類型是復合類型的，例如，由多于一種類型單糖組成。在通向該聚糖基序的生物合成 途徑中，幾種GlcNAc轉移酶將GlcNAc殘基附接到聚糖核心的甘露糖，其可以由半乳糖、唾 液酸和巖藻糖殘基進一步延伸。這種糖基化基序稱為"復合"結構。
[0056] 在N-聚糖核心結構的"臂"上發現的第二種糖基化基序是"高甘露糖"基序，其特 征為另外的甘露糖（作為分支或不分支鏈附接）。
[0057] 第三種糖基化基序是雜合結構的，其中一條臂是甘露糖取代而另一條臂是復合 的。
[0058] "半乳糖基化的"抗體，用于本文指代在其一個N-聚糖中具有至少一個半乳糖單 糖的任意抗體。半乳糖基化的抗體包括兩個N-聚糖在N-聚糖基序的每一條臂上各具有復 合類型基序的抗體，兩個N-聚糖在N-聚糖基序的僅一條臂上具有復合類型基序的抗體，具 有一個在N-聚糖的每一條臂上具有一個復合類型基序的N聚糖的抗體，以及具有一個在 N-聚糖基序的僅一條臂上具有復合類型基序的N聚糖的抗體。包括至少一個半乳糖單糖的 抗體包括具有如G1(-個半乳糖），G1F(-個半乳糖，一個巖藻糖），G2(兩個半乳糖）和 G2F(兩個半乳糖，一個巖藻糖）等N-聚糖的抗體。另外，包括至少一個半乳糖單糖的N-聚 糖可以是唾液酸化的或不是唾液酸化的。應當進一步理解所述N-聚糖還可以在復合聚糖 基序的一條或多條臂中含有另外的半乳糖殘基，如α-半乳糖，潛在產生具有四個半乳糖 部分的Ν-聚糖。
[0059] "高度半乳糖基化的"抗體用于本文指代在N-聚糖基序中包括至少兩個半乳糖單 糖的抗體。高度半乳糖基化的抗體包括兩個N-聚糖的每一個在N-聚糖基序的每一條臂上 具有復合類型基序的抗體，兩個N-聚糖在N-聚糖基序的僅一條臂上具有復合類型基序的 抗體，以及具有一個在N-聚糖的每一條臂上具有復合類型基序的N-聚糖的抗體。因此，高 度半乳糖基化的抗體包括其中兩個N-聚糖每一個在聚糖基序（例如，G1或GIF)中包括一 個半乳糖的抗體，包括至少一個在聚糖基序（例如，G2或G2F)中具有兩個半乳糖的N-聚糖 的抗體，以及在聚糖基序中具有3或4個半乳糖的抗體（例如，⑴一個具有G1聚糖基序 的N-聚糖和一個具有G2或G2F聚糖基序的N-聚糖，或（ii)兩個具有G2或G2F的N-聚 糖）。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體在聚糖基序中包括至少三個半乳糖單 糖。在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體在聚糖基序中包括至少四個半乳糖單 糖。
[0060]N-聚糖的糖基化模式可以通過本領域已知的多種方法確定。例如，分析蛋白上的 碳水化合物的方法已描述于美國專利申請US2006/0057638和US2006/0127950。分析蛋 白上的碳水化合物的方法通過提述并入本文。
[0061] 在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體在非人哺乳動物的乳腺細胞中產 生。在一些實施方案中，所述抗體在轉基因非人哺乳動物中產生。在一些實施方案中，所述 非人哺乳動物是山羊、綿羊、野牛、駱駝、母牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或羊駝。在一些實 施方案中，所述非人哺乳動物是山羊。
[0062] 在一些實施方案中，所述高度半乳糖基化的抗體在非人哺乳動物的除乳腺上皮細 胞外的細胞中產生。在一些實施方案中，所述抗體在非人哺乳動物的除乳腺上皮細胞外的 細胞中產生，并在產生后經修飾來增加N-聚糖上半乳糖基團的數量（例如通過酶的作用， 如轉移酶）。
[0063] 在一個方面，本公開提供組合物，其包含高度半乳糖基化的抗體。在一些實施方案 中，所述包含高度半乳糖基化的抗體的組合物進一步包括乳。在一些實施方案中，所述包含 高度半乳糖基化的抗體的組合物進一步包含藥學上可接受的載體。
[0064] 在一個方面，本公開提供包含單克隆抗-HER2抗體組合物，其在Fc糖基化位點 (Asn297,EU編號）上具有聚糖結構，其中所述單克隆抗體的聚糖結構具有多于60%的半 乳糖含量。在一些實施方案中，所述包含單克隆抗-HER2的抗體組合物的組合物進一步包 含乳。在一些實施方案中，所述包含單克隆抗-HER2的抗體組合物的組合物進一步包含藥 學上可接受的載體。
[0065] 抗體群體
[0066] 在一個方面，本公開提供包含抗體群體的組合物，其中所述抗體是抗-HER2抗體， 并且其中所述群體中抗體的半乳糖基化水平為至少50%。在一些實施方案中，所述群體中 抗體的半乳糖基化水平為至少60%。在一些實施方案中，所述群體中抗體的半乳糖基化水 平為至少70%。在一些實施方案中，所述群體中抗體的巖藻糖基化水平為至少50%。在一 些實施方案中，所述群體中抗體的巖藻糖基化水平為至少60 %。在一些實施方案中，所述 群體包含包括單半乳糖基化的N-聚糖的抗體。在一些實施方案中，所述群體包含包括雙半 乳糖基化的N-聚糖的抗體。在一些實施方案中，所述群體中抗體的半乳糖基化的水平與所 述群體中抗體的巖藻糖基化水平的比率為1. 〇和1. 4之間。在一些實施方案中，群體中至 少25 %的抗體包含雙半乳糖基化的N-聚糖，而群體中至少25 %的抗體包含單半乳糖基化 的N-聚糖。
[0067] 在一些實施方案中，所述具有高水平半乳糖基化