專利名稱：脂質體劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的脂質體劑(liposomal agents)，尤其涉及可非腸道施用的脂質體劑，它具有用于結合大環螯合劑基團的膜，其中所述大環螯合劑基團攜帶具有診斷或治療作用的金屬離子。這種脂質體劑可用于治療中或者作為造影增強劑，用于診斷成像形式如MRI，閃爍照相法，X-線和CT中。
在醫學成像方法中使用診斷劑是人們公認的。
通常，在MRI中，造影劑通過表現順磁、鐵磁、亞鐵磁或超順磁形為的物質，例如螯合的順磁金屬離子(如Gd或Dy)或氧化鐵微粒(nanoparticle)產生其造影增強作用，由于這些物質可引起其分布到的身體區域中MR信號強度的增強或減弱，因而影響這些區域中成像核的特征性馳豫時間。
在X-線和CT中，造影劑由于具有改變分布到的身體區域X-線透射特性的能力而產生作用并且這也是使用螯合重金屬離子的結果，該螯合重金屬離子具有較大的X-線截面，因而已推薦作為X-線造影劑。
在閃爍照相法中，顯像劑為放射性核素，例如，螯合的放射性金屬離子，通常為γ發射體。
就治療而言，螯合的金屬物種-放射性核素或本身具有治療作用的金屬，如治療糖尿病的釩的應用也是已知的。
盡管在治療學和診斷學上，有用的金屬螯合物早已應用于醫學中，但仍需要具有改善的生物分布和生物消除模式的、金屬螯合物為基礎的藥劑。當非腸道施用時，簡單的水溶性、低分子量金屬螯合物，如MRI造影劑GdDTPA和GdDTPA-BMA全部分布到細胞外液(ECF)中而沒有任何特定部位的專一性并且通過腎小球濾過，迅速通過腎臟排泄。所推薦的其它造影劑，用于它們的顆粒性和親脂性，能通過網狀內皮系統(RES)或肝臟的肝細胞迅速從血液中吸收并因此適用于作為肝膽造影劑。
一種開發血池劑(blood pool agent)，即在血管腔內停留時間長，足以增加顯像時間的藥劑的方法是使用分子量在腎閾以上的水溶性聚螯合物大分子。另一種致力于開發定位劑的方法是將螯合物，例如單螯合物，低聚螯合物或多聚螯合物偶聯到某部位指定分子上，通常為大分子。因此，例如，將釓螯合物偶聯到白蛋白和免疫球蛋白上。然而，該方法有幾點不足。每個大結構上需要大量螯合的金屬離子。如果大量螯合物偶聯到某指定部位的分子上，那么它的部位專一性可能降低。通過控制制備方法來獲得可再現的金屬載量，均一產物和高度靶專一性是困難的并且該方法成本高。該造影劑的排泄和代謝途徑是復雜的并且尚未完全弄清楚。為了探索通過RES消除而產生的全部可能存在的代謝物所需要的科學研究和證明是廣泛的。因此，到目前為止，在臨床試驗中尚沒有大分子釓為基礎的造影劑是不奇怪的。
由于RES能迅速吸收注射顆粒，因此已廣泛推薦使用脂質體造影劑。
本文所使用的術語“脂質體”是指具有一層或多層由兩親分子(例如脂質)形成的包封膜的顆粒并且尤其指具有雙層膜和包封的水性核心的顆粒，它是部位專一性釋放診斷和治療劑的通用載體。它們可選擇性地用于靶專一性器官，如肝臟、脾、肺、淋巴系統和骨髓，或者，它們可滯留在脈管系統中。
可選擇脂質體劑的組成和大小來控制其生物分布并且由于可使用天然存在的磷脂作為成膜分子的主體，使得脂質體劑代謝和代謝物消除時所產生的問題遠遠少于大分子試劑所產生的問題。
通常，脂質體劑可分成兩類第一類是利用脂質體將所需要的治療或診斷劑，裹在中心水性腔內；和第二類是通過將所需要的實體所包含的疏水性“錨”基摻入膜中來將該需要的實體限定在脂質體膜上。兩種類型都被推薦用作顯像劑。
本發明涉及將金屬螯合物部分限定在脂質體膜上的脂質體劑。
通常，先前推薦的膜限定螯合物包括線型螯合劑基團，如DTPA，帶有一個或兩個用于連接親脂性錨基的螯合官能團，其實例包括二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(PE)Karlik等人的DTPA-酐螯合劑(見Mag.Res.Med.1956-66(1991))，Hnatowich等人的DTPA-二硬脂酰胺(見J.Nucl.Med.22810-814(1981))，Tilcock等人的DTPA-硬脂酰酯(見Mag.Res.Med.2744-51(1992))和Unger等人的各種攜帶螯合劑的雙親脂基(見WO-92/21017)。
除了攜帶雙親脂錨基的線型螯合劑外，Unger(同上)也建議使用在環上相對的兩個氮原子上攜帶親脂基的N4大環螯合劑。所描述的制備雙錨定螯合物的合成途徑產生非1，7-二酰胺類的產物混合物。制備1，7-二取代同分異構體的合成途徑要復雜得多。例如，由Dumont描述的方法(Tetrahedron Lett.35(22)，3707)。此外，螯合效率受到十分不利的影響。由于脂質體是通過RES從身體中清除并因此而暴露于肝細胞內的酸性環境中，所以，高度穩定的配合物必須避免長期保留釓。我們發現，通過使用與具有僅與環上一個原子連接的親脂性錨基的大環螯合劑部分連接的膜可以使金屬消除最佳化。
因此我們發現，通過使用與大環螯合劑部分連接的膜可以使金屬的利用和消除最佳化，其中，所述大環螯合劑部分具有僅與環上一個原子連接的親脂性錨基，優選地，在脂質體形成后，通過可生物降解鍵，將大環螯合劑和錨基彼此偶聯。
因此，一方面，本發明提供脂質體劑，它包含具有連接在其膜上、螯合的、診斷或治療上有用的金屬離子的脂質體，結合所述金屬離子的螯合劑具有大環螯合劑部分和與其環上一個原子連接的親脂性膜締合部分。
另一方面，本發明也提供包含脂質體膜形成化合物和造影增強化合物的組合物，其中后者中包含大環螯合劑部分和與其環上一個原子連接的親脂性膜締合部分；由此可生產脂質體組合物。
本發明尤其重要的是提供使造影增強組分從肝臟的消除作用加強的脂質體組合物。最終，脂質體通過RES識別，通過吞噬作用吸收到細胞中并沉積在肝臟中。螯合物從肝臟中消除的機理尚不清楚。水不溶性疏水物質，如GdDTPA-SA無期限地保留在肝臟中。大多數水溶性配合物從肝臟消除的半衰期為6-8天。然而，我們發現，在造影劑結構中摻入某些部分能加速從肝臟消除。例如，帶有苯環的釓螯合物與簡單的脂族配合物相比，前者改善了從肝臟的消除。通過在苯環上存在一個或多個可離子化的基團(如羧酸根或磺酸根)可實現消除的更進一步改善。可以將消除增強基團以錨定基(anchoring group)，連接基的形式或作為錨定基或連接基的生物降解產物的形式引入造影劑結構中。
在造影增強化合物中的大環螯合物部分最好是親水性的，并且當在脂質體中時，可以帶靜電荷或不帶。結果，螯合物部分將定位在脂質層或脂質體膜層的外面。盡管本發明允許螯合物定位在脂質體膜的外面或在水性脂質體核心腔內，但特別優選螯合物部分優先選擇性地、主要地或基本上全部定位在脂質體的外面。這尤其適用于所螯合的物種是作為正的、T1-MR造影劑的情況。
另一方面，本發明提供制備本發明脂質體造影劑的方法，所述方法包括下列步驟之一(a)將包含水性載體介質、脂質體膜形成化合物和可任選地金屬化的具有連接在一個大環環原子上的疏水性膜締合基的大環螯合劑化合物的組合物轉變為脂質體組合物并且如果需要，在此之后，將所述螯合劑化合物金屬化；和(b)將可任選地金屬化的大環螯合劑化合物偶聯到具有引入到脂質體的脂質體膜內的疏水性部分的錨化合物上并且如果需要，在此之后，將所述螯合劑化合物金屬化。
可通過下面進一步討論的常規方法來實現脂質體的形成和螯合劑的金屬化并且也可以通過常規的偶聯反應，利用適當地官能化，和活化(如果需要)的螯合劑和錨化合物，可任選地與雙官能連接劑一起來實現螯合劑錨的偶聯。
本發明脂質體造影劑組合物可用于診斷成像方法中，因此，另一方面，本發明也提供產生人或非人、優選哺乳動物身體增強的圖像的方法，它包括將造影劑非腸道給予到所述動物身體中，特別是給予到全身脈管系統中和至少在所述動物身體的部分部位產生圖像，其改善包括所給予的所述造影劑為本發明脂質體劑。
再進一方面，本發明也提供利用大環螯合劑或螯合物或其鹽來生產用于診斷成像的本發明脂質體造影劑。
由于已公知，可生產生物可耐受性脂質體，并且由于在體內，本發明脂質體造影劑將僅生物降解成脂質體組分(膜和成核物質)和造影增強物質或其代謝物，設計具有容易鑒定的代謝物并且其生物分布和生物消除也容易研究的脂質體劑比設計大分子脂質體劑更簡單和更直接。
因此，本發明脂質體劑中的螯合劑為雙官能團物質，它具有螯合部分和通過鍵或連接基部分連接在其上的膜錨定部分。其有利之處是，連接基部分將結合可生物降解的鍵，使得低分子量的螯合物分子可以在脂質體降解前或降解后，從脂質體中釋放出來，以便于促進其生物消除。為了實現該目的，尤其優選螯合物部分，任選地與其連接基部分降解后殘余物一起為水溶性的。
這種錨-可生物降解的連接基-大環螯合劑化合物，其鹽和螯合物本身是新的并且構成本發明的另一方面。
特別優選連接基部分至少部分產生于將大環螯合劑偶聯到親脂性錨分子上的反應中。因此，盡管可在脂質體形成前制備親脂性錨-大環螯合物，但特別優選通過將大環螯合劑，或者更優選通過將金屬化的大環螯合劑偶聯到已結合入脂質體膜中的分子上就地來制備這樣的化合物。
因此，特別優選的一類螯合劑分子為通式(I)的那些An-L-Ch(R)n(I)其中An為疏水性膜締合基團，L為連接到Ch的環原子上并且可在可生物降解鍵處斷開的連接基部分，并且Ch為攜帶或未攜帶一個或多個親水性或部位指定基團R的大環螯合劑部分(即，n為0或正整數)。
在另一實施方案中，螯合劑是兩親性化合物，如PCT/GB95/00833(在此附上所申請正文的復本并將其內容參考結合入本文中)中所述，即式(II)化合物(R)nCh-L′-Ar-(AH)q(II)其中(R)nCh為上述定義的親水性大環螯合劑部分，L′為連接到Ch的環原子上的氧取代或氧未取代的C2-25亞烷基連接基部分，其中至少一個CH2部分被氧雜、氮雜或硫雜基置換并且可任選地被生物可降解基團M間隔開，Ar為任選地由另一個芳環取代的芳環或者為帶有稠合在其上的另一個芳環的芳環，q為正整數，優選1或2，并且各AH為質子酸基(protic acid group)，例如，碳、硫或磷的含氧酸。
適宜的螯合劑部分Ch(R)n為下式基團
其中p為3、4、5或6，優選4；各m為2、3或4，優2；各R1為氫原子，親水性基團，或部位指定基團；
并且各X為R1基或金屬配位基，但連接到R1基上的一個碳或氮原子提供與連接基部分連接的鍵。
優選的配位基的實例包括由羧基、磷酸根或硫酸根基取代的，并且可任選地由一個或多個R1基進一步取代的C1-3線型烷基。特別優選的是羧甲基和膦酰基甲基。
優選的親水性基團包括羥基化的和/或烷氧基化的烷基，例如，羥甲基，2-羥乙基，3-羥丙基，2，3-二羥丙基和2-羥基乙氧基乙基。
在本文所提到的螯合部分和連接基部分中，除另有說明外，烷基或亞烷基部分最好包含1-6個碳原子。
因此，優選的螯合劑部分包含下式基團
(其中各m為2、3或4，優選2；各R2為氫或烷基，所述烷基至少由一個羥基、烷氧基、氨基、氧、羧基、磺酸、溴代酰基、異硫氰酸酯或定位基團取代和可任選地被飽和或不飽和的碳環或雜環取代或者結合入飽和或不飽和的碳環或雜環；和各Z為CO2H、PO3H、CPN(R2)2或者R2基，至少有2個并且最好是3個全部為COOH或PO3H基；并且一個R2基為與連接基部分連接的鍵)。
特別優選的螯合劑基團包括DO3A和DOTA基，例如
或
(其中，各Z為COOH或PO3H，優選COOH并且各R2為氫或親水基，例如C1-4單或多羥基烷基)。
特別優選，螯合劑基團為簡單的下式DO3A基
和DO3A單酰胺，如WO95/24225和PCT/GB95/00833中所述。
用于將螯合劑部分限定在脂質體膜上的疏水性“錨”基可以是任何能夠發揮該作用的疏水性基團。
通常，它包含一個或多個，例如1、2、3或4個，但優選1或2個親脂鏈，或者單環或多環的，飽和或不飽和的基團，后者可以是取代的或未取代的，其取代基為直鏈或支鏈，不飽和或飽和的C1-12烷基，氟原子或碳、硫或磷的含氧酸基或其酯或酰胺，例如C1-20烷基酯或烷基酰胺，其中烷基可任選地為不飽和的或氟化的。當上述式(II)螯合劑中的單鏈錨基在脂質體中時，它可以折疊，顯現出在膜表面上的(R)nCh和Ar(AH)q基，其中折疊的連接基L′作為膜締合錨。
適宜的環狀基團的實例包括苯基，聯苯基，萘基，5-7元含O，N或S的雜芳基，甾基等。適宜的直鏈疏水基的實例包括C12-18飽和的，不飽和的或氟化的，例如全氟化的烷基。
很多適宜的錨定基是文獻中已知的。例如見Kinsky，BiochimBiophys Acta 769543(1984)，Kung，Biochim Biophys Acta862435(1986)，Gregoriades，Biochem Soc.Trans.17128(1989)，Wessig，Biochim Biophys Acta 100354(1989)，Dancy，J.Immunol122638(1979)，Carroll，J.Med.Chem 291821(1986)，Unger，WO92/21017和Herslf，WO91/21384。
優選的可以該方式用作錨定基的磷脂實例包括磷脂酰乙醇胺(PE)的C4-14α，ω-烷烴-二羧酸酰胺，例如帶有二油酰基、二棕櫚酰基或其它兩個脂肪酸鏈的PE(如N-琥珀酰、N-谷氨酰基和N-十二碳烯基-PE)和膽固醇的酰胺。
在本發明的優選實施方案中，脂質體形成后，將錨基偶聯到螯合劑部分。為了實現該目的，使用能夠結合入脂質體膜中并將官能團(用于直接或間接與螯合劑連接)留在膜外面的錨化合物。
這樣的化合物宜包括在錨基和螯合劑連接基之間的間隔基部分，該部分尤其宜為兩親性的。該化合物的實例包括下式II-V化合物
Ar′-O-Y-Z1(III)
(其中各R3獨立地為C12-18飽和的，不飽和的或全氟化的烷基；w為0或1；各X1獨立地為鍵，氧或硫原子或NH基；r為0，1，2或3；
s為0或1；X2為鍵，氧或硫原子或NH或-OPO3H-基；Y為(CH2)t，(CH2CH2O)t，(CH2)tX1-Ar′-X1(CH2)t或(NHCH2CO)t基；各t為整數0-12；各Ar′為苯基，聯苯基，萘基或5-7元含O、N或S的雜芳基，并可任選地被COOH，SO3H，PO3H，PO2H或COOR3基取代；Z1為CO2H，NH2，COO-琥珀酰亞胺，馬來酰亞胺，硫醇，COCH2R4，Ar′NCS，Ar′N3，Ar′NCO或CHO基；和R4為OTs，OMs，I，Br或Cl基)。
在錨螯合物軛合物(chelate conjugates)中的連接基可以是具有連接疏水性錨基(一個或多個)作用的帶有螯合基團的任何基團，它藏入脂質體膜中，螯合基部分在膜外。根據生產攜帶螯合物的脂質體的方式，連接基可以含或可以不含產生錨化合物螯合物化合物軛合物的基團，然而，情況通常是這樣。類似地，它們可以或可以不，但最好包含親水性，或更優選兩親性部分，該部分將螯合基與膜表面隔開。此外，連接基最好包含可生物降解的官能團，它可分開并釋放螯合物分子(本文所使用的術語分子包括帶電和不帶電的種類)，促進其生物消除，或者，也許在治療過程中，促進治療金屬在治療部位的釋放。
適宜的，可生物降解的官能團的實例包括酯、氨基甲酸酯、雙酯和二硫鍵。雙酯鍵，即式-O-CO-O-CH2-O-CO-O-鍵，其中的一個或兩個末端氧可以省略并且其中的亞甲基可被取代，特別適于作可生物降解鍵。
因此，連接基部分宜包含直鏈或支鏈C2-20亞烷基鏈，它可以或可以不由N，O，S和P原子或由飽和或不飽和的碳環或雜環終止或間隔并且可任選地被氧或氟原子或由羥基、胺、烷氧基、亞氨基、烷基或芳基取代，所述烷氧基、亞氨基、烷基或芳基本身可任選地被羥基、胺或C1-5烷氧基取代。
如果連接基與錨或螯合物部分的環上雜原子連接，那么連接基的末端原子通常為碳。就DO3A和類DOTA的N4C12大環而言，在錨螯合物偶聯反應中，最好通過環上氮，例如，通過N-羧甲基或環上NH基連接，盡管不優選，但也可以通過環上碳連接，例如，利用C-芳烷基取代的螯合物，如Meares等人推薦的那些螯合物(見Bioconjugate Chem.3563(1992))。
用于這樣的偶聯反應的螯合物分子最好攜帶反應側鏈(優選在環氮上連接)，該側鏈攜帶反應基如羧基，硫醇，NCS或胺基。攜帶該基團的鏈宜為C1-20亞烷基，它可任選地被芳基或被N、O或S原子間隔并且可任選地被氧、烷基或氟取代，例如-CONHCH2CH2NH2，CONHCH2CH2NHCO(CH2)3COOH。諸如這些之類的基團可很容易地在DOTA或DO3A N-羧甲基或-NH-部位形成。
就上述式(II)螯合劑而言，優選的連接基結構L′的實例包括(CH2)dO，其中Ar為雙環時d為1-15，而Ar為單環時d為6-15，優選的Ar(AH)q基包括4-羧基苯基和3，5-二羧基苯基。特別優選的式(II)螯合劑包括下列物質
*氧與Ar連接當然，被螯合劑部分螯合的金屬的選擇依賴于所需要的本發明脂質體劑的最終用途，但通常選自順磁，重金屬或放射性金屬本身或多原子簇(polyatomic clusters)。
除了錨螯合物分子外，脂質體劑通常應包括脂質體膜形成化合物，即脂質并且尤其為磷脂，以及構成脂質體核心及其外環境，通常為水性介質的物質。
脂質體本身為具有脂質層包圍的中央空間的球形泡囊。本發明尤其涉及分別具有單一脂質雙層或多脂質雙層包圍的水性核心的單層脂質體或多層脂質體。
當脂質，特別是磷脂在水性介質中分散時，脂質體自發地形成并且可通過常規技術生產本發明脂質體劑的脂質體結構。在WO92/21017(Unger)和Papahadjopolous在Ann Rep.Med.Chem.14250-260(1979)中提到了這些常規技術，包括反相蒸發，冰凍-熔化，洗滌滲析，均化作用，聲處理，微乳化作用和當干燥的脂質膜水合時自發形成。本發明可使用多層脂質體或者可以通過已知的方法，將多層脂質體轉化為層數低的脂質體或單層脂質體。也可以直接制備單層脂質體。
典型地，脂質體制劑大小不均勻并且可通過已知的方法，例如擠壓，冰凍-熔化，機械碎裂，均化作用和聲處理，將本發明所用的脂質體制成所需直徑的大小。本發明所使用的脂質體最好為20-5000nm直徑的單層或多層脂質體。
可將脂質體冷凍干燥來增加貯存期限并且可通過在使用前與水性緩沖劑一起劇烈振搖，將冷凍干燥的脂質體重新配制。脂質體制劑中可包含在冷凍干燥方法中，用于穩定脂質體物質的試劑。
小于200nm的脂質體可在制成后，通過在0.2μm的濾器上過濾來滅菌。
典型地，用作脂質體膜形成分子的脂質方磷脂或氫化的磷脂如天然或合成的磷脂酰膽堿(卵磷脂)(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸(PS)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰肌醇(PI)，鞘磷脂，心磷脂，磷脂酸(PA)，脂肪酸，神經節苷脂，葡糖脂(glucolipids)，糖脂，單、二或三甘油酯，神經酰胺或腦苷脂類，例如在WO-92/21017中描述的那些脂質體膜形成化合物。
成膜脂質也可以包括可聚合的脂質，例如，含甲基丙烯酸酯的脂類，含硫醇和二硫化物的脂類，含二烯酸酯的脂類，含苯乙烯基的脂類和含diacetylanic的脂類，如Johnston在Liposome Technology Vol。I，Gregoriades Ed.，pages 123-129(1983)和Singh在PhospholipidHandbook，Cevc Ed.，Dekker，pages 233-291(1993)及其參考文獻中所描述的那些脂類。在脂質體構成中應用可聚合的脂類提供了一條增加脂質體穩定性的途徑。
例如，脂質體膜中也可以含有甾族化合物和其它混入其中的化合物來影響脂質體的生物分布。適宜的甾族化合物包括例如膽固醇，膽固醇衍生物，膽甾烷，膽酸，和膽汁酸，但優選膽固醇。
包含甾族化合物可以改變脂質體膜的流動性并且這影響生物分布。因此，轉變溫度越高的脂類導致其血液半衰期越長，并且包含膽固醇導致其剛性更大和可滲透雙層更少。可以觀察到，加入膽固醇可降低RES-攝入。
通過使用具有生物分布調節功能的側基(pendant)的磷脂衍生物，通過使用具有與脂質體膜相關聯的疏水性“錨”部分的生物分布調節劑或通過將生物分布調節劑與存在于脂質體膜上的錨分子(如上關于螯合限定中所述)偶聯，可以結合生物分布調節劑。
特別優選的生物分布調節劑包括在體內減少蛋白質與脂質體的結合并因此延長血中脂質體半衰期的化合物，特別是兩親性聚合物。在這點上，聚亞烷基氧基聚合物，如聚乙二醇(PEG)和神經節苷脂，如Gm1是有效的。
摻入相對于脂質體膜形成物質重量1-10％的PEG-PE衍生物明顯地延長血半衰期。
由全氟化的磷脂制備的脂質體(見Santaella，FEBS Letters 336481-484(1993)和Angew，Chem.Int.Ed.Eng.30567-568(1991))也可以延長血半衰期。
通過摻入其上結合了對腫瘤相關性抗原、卵磷脂或肽具有特異性的單克隆抗體或抗體片斷的脂質可以獲得對特定器官或組織的靶向活性。
脂質體生物分布也明顯地依賴于表面電荷，并且本發明脂質體最好可包含相對于脂質體膜形成物質重量1-10％的帶負電荷的磷脂，如磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸和磷脂酰肌醇。
如上所述，可通過幾種方法將所螯合的金屬限定在脂質體上，例如(i).通過將限定在預先形成的脂質體表面上的螯合基金屬化；(ii).通過將螯合物部分偶聯到預先形成的脂質體的錨分子上；(iii).通過使用包括螯合物錨分子在內的脂質混合物來形成脂質體。
三種方法均為本發明的內容。這些方法由于避免了疏水性螯合物的合成和純化(見方法(iii))和由于避免了不想要的、金屬與脂質體之間較弱的(體內容易逆轉)結合(見方法(i))，簡化了制備膜結合劑的步驟。
如上所述，優選地，通過將金屬化的螯合物分子偶聯到預先制備好的脂質體中的錨分子上來制備本發明脂質體。在該方法中，螯合物僅結合到脂質體膜的外部。用衍生化的螯合物制備的脂質體具有結合到膜內和膜外的配合基。膜的水滲透性或大量水通過膜的擴散速率將決定內部順磁離子的馳豫性(relaxivity)。就結合緊且穩定的脂質體來說，其內部釓的馳豫性可能很低。因此，當螯合基僅僅限定在脂質體外部時，金屬的利用率是最佳的，即脂質體中每個金屬離子均具有高馳豫性。
螯合物僅僅連接到脂質體的外部對于結合放射性核素，特別是α-發射體來說也是有利的，因為脂質體膜不必被α-射線穿透。
因此，可通過常規方法，由磷脂混合物來制備脂質體，其中所述磷脂混合物包含錨化合物，即具有限定到反應官能團上的疏水性錨部分的化合物，所述反應官能團提供與螯合物部分結合的結合點。然后，可通過已知方法，將脂質體制成需要直徑的大小。然后，將反應官能團偶聯到螯合物上可相容的官能團上，并且例如，通過凝膠滲透色譜法，滲析或超濾作用，可以很容易地除掉未反應的低分子量試劑。
錨化合物的含量宜為脂質體膜形成化合物總重量的5-50％，優選10-30％。事實上，螯合物在外部直接與反應基團偶聯的偶聯率可能非常高，例如大約90％。
錨化合物上的反應基可以僅為在脂質體膜脂質上的伯胺，它可以與螯合物分子的非配位羧基反應。通常，大多數公知的將螯合物偶聯到大分子如蛋白質上的方法可用于將螯合物連接到脂質體上。然而，表面化學將受到脂質體穩定性的限制，因此需要監測反應混合物的pH和重量克分子滲透壓濃度。通過下列圖解來舉例說明偶聯方法的幾個實例
作為將螯合物偶聯到脂質體錨基上的另一種方法，可以在脂質體形成前，將錨基偶聯到螯合物上。在水溶液中，將螯合劑金屬化，然后通過常規方法，使用混合溶劑，將螯合物偶聯到錨分子上。然后，利用包括螯合物錨分子在內的脂質混合物來制備脂質體。這避免了當將螯合物在脂質體表面就地金屬化時可能發生的金屬離子與脂質體非特異性結合的問題，以及在脂質體形成前，將水不溶性螯合劑金屬化時帶來的溶解性問題。在脂質體形成過程中，金屬離子也可以作為保護基來保護可能存在的活性螯合基。
為了制備本發明造影劑組合物，在生理上可耐受的液體載體，例如水溶液中制備脂質體，其中，所述液體載體中可包含一種或多種添加劑，如pH調節劑，螯合劑，抗氧化劑，張力調節劑，冷凍保護劑，其它的造影劑等。
適宜的，調節pH的組分的實例包括生理上可耐受的酸，堿和緩沖劑，如乙酸，枸櫞酸，富馬酸，鹽酸，蘋果酸，磷酸，硫酸或酒石酸，氨，碳酸銨，二乙醇胺，二異丙醇胺，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，硼酸鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，三乙醇胺(trolamine)，磷酸銨，硼酸，枸櫞酸，乳酸，偏磷酸鉀，磷酸二氫鉀，醋酸鈉，磷酸二氫鈉，枸櫞酸鈉，乳酸鈉，磷酸鈉，Tris和N-甲基葡糖胺。
適宜的螯合劑的實例包括EDTA，DTPA，DTPA-BMA及其鹽和配合物，尤其是鈣，鈉或葡甲胺鹽，例如乙二胺四乙酸二鈉，乙二胺四乙酸，EDTA鈣。
適宜的抗氧化劑的實例包括抗壞血酸，抗壞血酸棕櫚酸酯，半胱氨酸，一硫代甘油，叔丁對甲氧酚，二叔丁對甲酚，連二磷酸，棓酸丙酯，硫酸氫鈉，甲醛合次硫酸鈉，偏硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，二氧化硫或生育酚。
適宜的張力調節劑的實例包括氯化鈉，葡萄糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇和右旋糖。優選地將這些張力調節劑用于使制劑與血液等滲或接近等滲。
適宜的抗菌劑的實例包括氯芐烷銨，苯甲醇，氯丁醇，間甲酚，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯和timerosal。
適宜的冷凍保護劑，即在冷凍干燥和再配制過程中發揮輔助作用的試劑包括氯化鈉，山梨糖醇，甘露糖醇，葡萄糖和聚乙二醇。
如上所述，液體載體可包含第二種造影劑。這使得第二種造影劑被包裹在脂質體內部水性環境中。在外部水性環境中的造影劑可以被除掉或者也可以不被除掉。這可用來制備雙重造影劑〔例如，在WO89/09625中的描述〕。例如，T2*敏感劑(susceptability agent)，如可溶性鏑配合物如DyDTPA-BMA可包裹在脂質體中，而T1馳豫劑，例如釓配合物如GdDO3A結合到膜的外面。第二種造影劑包括例如水溶性MRI、X-線、閃爍照相和光顯像劑。
其它可包裹在脂質體內的造影劑的其它實例包括重金屬簇及其螯合物，如WO91/14460和WO92/17215中所述。該脂質體例如可用作X線造影劑，特別是(Ct)2L3簇(其中Ct為金屬簇，例如W3或W4簇，并且L為配位體)。
選擇本發明脂質體造影劑中所螯合的金屬以提供在所選擇的成像方式中所需要的造影劑。就MRI和磁成像而言，這通常涉及馳豫時間(即T1，T2或T2*)調節中心如順磁金屬離子和多原子簇離子的螯合作用。
就X線成像和CT成像而言，通常所螯合的金屬為原子序數為37或更高的，高原子序數(因此使得X線截面大)金屬離子，或多原子簇離子。
就光成像而言，金屬螯合物部分為具有特征性吸收或發射峰的發色團或熒光團。就SPECT，PET和閃爍照像而言，需要螯合適宜的金屬離子放射性發射體。
因此，在MRI領域，本發明尤其包含結合造影增強劑的多種配合物的脂質體造影劑，其中所述造影增強劑結合到脂質體膜的雙層上。造影增強劑可以是任何磁性金屬離子，金屬離子簇或微晶。這尤其包括原子序數為21-29，42，44或57-71的離子或簇離子。典型地，正MRI造影劑可包含金屬離子Eu(III)，Gd(III)，Dy(III)，Ho(III)，Cr(III)，Fe(III)，或Mn(II)。典型地，負造影劑包含Tb(III)，Sm(III)，和尤其是Dy(III)離子，放射性同位素和脂質體的結合可用于閃爍照相成像或作為治療劑。特別優選的放射性同位素如下99mTc，51Cr，201Tl，67Ga，68Ga，111In，168Yb，140La，90Y，88Y，153Sm，156Ho，165Dy，64Cu，97Ru，103Ru，186Re，188Re，203pb，211Bi，212Bi，213Bi，214Bi。根據所要求的治療或診斷應用來決定金屬離子的選擇。
就X線而言，通常螯合非放射性重金屬離子。本發明包括使用原子序數大于37的金屬離子，特別是原子序數大于50的金屬離子。特別優選多核的金屬離子簇，如WO91/14460中所述。
就作為光顯像劑的應用而言，本發明的造影劑最好應該包含在近IR(670-1300nm)，優選在1300nm附近具有吸收或發射作用的吸收或熒光部分。消光系數應該盡可能地大，優選大于或等于105cm-1M-1。
就能夠產生回聲的，即能夠作為超聲造影劑的本發明脂質體造影劑來說，優選具有層之間分離的、二或低聚層狀結構。包含具有可離子化基團(如羧酸根)鏈的脂質，其同心磷脂雙層間的距離應該相對大些。這應該增加脂質體的聲反射作用。為了該目的，本發明包括摻入脂質衍生物。
或者，可使用全氟化的脂質作為脂質體的組分。為了增加脂質體的血共嗚時間，使用全氟化脂質可增強脂質體的聲學特性。
如上所述，可能的疏水性錨，即造影增強劑中的膜締合部分可包含磷脂，長的烷基鏈或包含多個長的烷基鏈的分子，它包括脂肪酸的酯或酰胺，甾族化合物，芳基或多芳基。當沉積在肝臟中時，錨定基可用于促進造影增強部分(例如螯合物)的消除。通過保持整個分子疏水性和親水性的平衡，例如通過在造影增強部分中包含可離子化的基團如羧酸，膦酸或磺酸，可控制消除。在該方法中，可模似容易從肝臟中排泄掉的、生物學相關化合物的結構。或者，疏水性錨可包含可聚合的基團，使得通過將疏水性錨與囊泡的主體脂質聚合，能夠形成更穩定的脂質體。
在造影增強劑中造影增強部分與膜締合部分之間的連接基可以是相對不易發生生物降解的基團(如烷基，芳基或醚基)或者可以是可水解的基團，例如包括羧酸或碳酸酯，二硫化物，縮醛，縮酮或硫酯，氨基甲酸酯，酰胺，內酰胺，硫脲或脲基團。連接部分可包含發揮鏈作用的間隔基，如飽和和不飽和的烷基鏈和/或環狀結構，如脂環族，芳族，多芳族和雜環基。為了使造影劑的偶聯功效和馳豫性最佳，可改變間隔基的長度和柔韌性。連接基可以是疏水性的，其結果是它包埋于脂質雙層中，或者是親水性的，其結果是它延伸到水性介質中，因此，連接基在控制造影增強部分代謝和消除途徑中可發揮重要作用。
可選擇脂質體的組成和大小以便于控制脂質體劑的生物分布。例如，通過摻入具有帶電極性首基的脂質，可制備帶正或負表面電荷的脂質體。當通過靜脈施用時，表面電荷影響脂質體劑的生物分布〔見Paphadjopolous Biochim.Biophys.Acta.1103185-197(1992)〕-RES吸收帶負電荷的脂質體比吸收中性或帶正電荷的脂質體更快，而帶正電或負電荷的脂質體在肺中的蓄積程度比中性脂質體大。
此外，脂質體的直徑影響其生物分布和藥物動力學。小脂質體的循環時間比大脂質體的長。枯氏(Kupffer)細胞攝入大脂質體的速度快，而肝細胞攝入小脂質體的速度快。注射后，非常大的脂質體(＞100μm)被捕獲在肺中。
脂質膜的親水性也影響脂質體的循環時間。將親水性或兩親性聚合物如聚乙二醇軛合到膜表面，由于減小了巨噬細胞的吞噬細胞速率，使得循環時間增加到8000％。
通過將配位體，碳水化合物，抗原，蛋白質，氨基酸，低聚肽，酶，激素，抗體和抗體片斷結合到脂質體的外表面，可獲得具有靶向活性的脂質體。一旦識別受體部位，脂質體結合到靶細胞上〔見Jones，Adv.DrugDeliv.13215-250(1994)，US-A-4603044，J.Med.Chem.，291821-1826(1986)，Ann.N.Y.Acad.Sci.，689427-43(1993)，Liposomes Technology，Gregoriadis，ed.vol.II，(1983)，及其參考文獻〕。本發明也提供將多部位定向靶試劑，優選相對低分子量部分如肽或抗體片斷連接到脂質體外表面。
本發明造影劑可以在使用特定成像技術時，以足夠產生所需造影效果的量給予待成像病人。為了獲得充分的造影增強作用，通常以每公斤病人體重給予0.001-5.0mmol螯合的成像金屬離子劑量是有效的。就大多數MRI應用而言，優選的成像金屬離子劑量范圍為0.001-1.2，例如0.01-0.5mmol/kg體重，而就X線應用而言，為了獲得X線衰減，通常0.5-1.5mmol/kg的劑量是有效的。就大多數X線應用而言，優選的劑量為0.8-1.2mmol鑭系元素或重金屬/kg體重。
就X線應用而言，為了獲大光子能量范圍，在該范圍，本發明造影劑是最有效的，可使用均聚螯合物混合物形式或雜聚螯合物形式的兩個或更多個螯合金屬。
本發明脂質體劑提供對先有技術的幾點改善。
就血池成像(其中血滯留時間比ECF劑的長得多)和肝成像(其中螯合物通過細胞攝入并且暴露于溶酶體的酸性環境中)來說，金屬交換速率是非常重要的。本發明應用大環螯合劑基團是重要的，因為它增強了配合物的穩定性。此外，螯合物部分，如DO3A-Gd(III)可以是中性的或選擇性帶電，并且這在控制生物分布中可能是有利的，因為脂質體的表面電荷決定其體內命運。
將預先金屬化的螯合物結合到按照制備本發明脂質體優選方法預先制備的脂質體上，可以很容易地將未結合的螯合物從脂質體上除掉并使其再循環，并且由于已將金屬離子結合到螯合物上，這樣阻止了金屬離子與脂質體或軛合的尋靶劑(conjugated targeting agents)的非特異性結合。
本發明造影劑可以特別有效地消除螯合的金屬。先有技術沒有滿足這個要求。在小鼠體內研究膠囊劑和膜結合劑中放射性螯合物的消除。本文實施例13具有比膠囊包封的GdDO3A配合物更好的消除半衰期(3.2天與6天)。
本發明另一方面的內容在于利用可生物降解連接基產生定時釋放螯合部分的機制。這特別適用于治療劑，即所螯合的金屬具有治療作用的藥劑。這樣的治療劑而不是診斷劑或造影劑也構成本發明部分。
本文所提到的全部出版物均引入本文供參考。
參考下列非限定性實施例進一步描述本發明。
在實施例中，通過將脂質體樣品消化，再進行ICP分析來測定釓濃度。通過將樣品消化再采用鉬酸鹽，用分光光度計測定磷酸鹽濃度來測定脂質的濃度。利用具有兩層適宜的Poretics聚碳酸酯膜的Lipex擠出機擠出脂質體。利用Malvern Zetasizer 4，通過激光光散射測定脂質體的大小分布。
從Avanti Polar Lipids獲得所用的磷脂。將它們貯存在氬環境下的冰箱中。從Aldrich獲得膽甾醇并且從Sigma獲得膽甾醇半琥珀酸酯。從Aldrich獲得1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)并貯存在冰箱中。按照Torchilin的方法制備二棕櫚酰PE-戊二酰〔見Phospholipid Handbook，Marcel Dekker，Inc.，G.Cevc編輯，第8章〕，按照Carroll的方法制備6-(膽甾烯基)-7-氧雜庚-1-醇〔見J.Med，Chem.，291821，1986〕并且按照Koswer的方法制備膽甾醇-O-甲苯磺酸酯〔見JACS，78，4347-4355(1956)〕。實施例11，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-10-甲氧基羰基-甲基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷將1，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷氫溴酸鹽(25.0g，42mmol)混合在乙腈中并用TMG(70ml)處理。一次加入溴乙酸甲酯(6.5g，42mmol)并將混合物回流3小時。在室溫下再攪拌18小時后，通過旋轉蒸發除掉溶劑和過量的TMG。將殘渣溶解在CHCl3中，用水洗滌并干燥(Na2SO4)。將溶劑蒸發掉，得到標題產物，為灰白色油狀物(23g，95％)。1H NMR(CDCl3)1.4(s，27H)，2.8(s，16H)，3.2(s，6H)，3.4(s，2H)，3.6(s，3H)。實施例21，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-10-(N-(2-氨基乙基)-酰氨基-甲基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷將實施例1的甲酯(23.0g，40mmol)溶解在甲醇(500mL)中并用乙二胺(200mL)處理。將混合物在室溫下攪拌3天。通過旋轉蒸發除掉溶劑和過量的乙二胺，并將殘渣溶解在氯仿中，用水洗滌，并干燥(Na2SO4)。將溶劑蒸發掉，得到標題產物，為粘稠油狀物(18g，75％)。1H NMR(CDCl3)δ1.4(s，27H)，2.5-3.0(m，20H)，3.3(m，8H)，6.0(br s，1H)。實施例31，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷〔AE-D03A〕通過在室溫下與純TFA(200ml)反應3小時，將實施例2的酯(10.0g，16mmol)脫保護。除掉TFA后，將殘渣溶解在1M NaOH中并裝載在離子交換柱〔AG 1×8(OH-)，200mL〕上。用水洗滌柱子并用1.5M HOAc洗脫產物。將含標題產物的流分濃縮，得到7.0g(93％)白色固體。1H NMR(D2O)δ2.9-3.6(br mult.)元素分析C18H34N6O7HOAc計算值C，47.14；H，8.11；N，16.49。實測值C，47.40；H，7.98；N，16.48。實施例41，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷釓(III)〔GdAE-DO3A〕將實施例3化合物(1.0g，2.38mmol)溶解在水(37ml)中。通過加入1M NaOH將pH調至5。分次加入醋酸釓(III)直至金屬略過量(通過二甲酚橙判斷)。在加入醋酸釓過程中，保持pH在5-6。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。加入配位體(50mg)并不斷攪拌直至二甲酚橙試驗顯陰性。真空除掉水。將殘渣在Sephadex G-10上層析，除掉無機鹽。用MS(FAB)分析流分MH+＝602。實施例51，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N-半琥珀酰胺將在吡啶(20ml)中的實施例3化合物(6.1g，13.6mmol)加熱直至完全溶解。加入琥珀酸酐(1.5g，15mmol)，并將混合物加熱1小時。將溶液冷卻并加入丙酮來沉淀產物。用丙酮充分洗滌白色固體并真空干燥，得到5.0g標題產物(67％)。實施例61，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N-半琥珀酰胺釓(III)(A)將實施例5化合物(1.9g，3mmol)溶解在水(30ml)中。用1N NaOH將pH調至5.0。滴加氯化釓(III)(～1.4/10mL)的水溶液直至金屬略過量并保持幾小時。再加入釓(50mg)并將反應混合物攪拌直至二甲酚橙試驗顯陰性。蒸發除掉水，并用乙醇將殘渣洗滌幾次。通過反相(C18)制備HPLC，用2％甲醇/水作為流動相來純化標題產物。
(B)也可以通過另一種方法來制備標題化合物將在DMSO(10ml)中的實施例3化合物(240mg，0.4mmol)在80℃下加熱直至完全溶解。加入琥珀酸酐(40mg，0.4mmol)并將混合物加熱6小時。冷卻至室溫后，加入丙酮來沉淀標題產物。用丙酮洗滌白色粉末并真空干燥。MS(FAB)MH+683.2，MNa+705.1。實施例713-膽甾烯基-3，6，9，12-四氧雜-十二烷-1-醇將膽甾醇甲苯磺酸酯(2.0g，3.7mmol)和四乙二醇(6.42ml，37mmol)溶解在二噁烷(100mL)中并在70℃下加熱6小時。將溶劑蒸發掉，并將殘渣溶解在甲苯中，用水充分洗滌。將有機層干燥(Na2SO4)，并濃縮為油狀物。通過在短的二氧化硅柱上層析，用0-20％甲醇/氯仿梯度洗脫來純化粗品，得到1.0g(49％)標題產物，為灰白色油狀物。實施例813-膽甾烯基-3，6，9，12-四氧雜-十二烷-1-酸通過滴加至略過量的Jones試劑，將在丙酮(20mL)中的實施例7化合物(0.5g)氧化。用異丙醇處理反應混合物并通過硅膠塞過濾。通過TLC和NMR鑒定該標題產物粗品是純的。實施例9GdDO3A-硬脂酰胺將實施例3化合物(100mg，1.6mmol)溶解在DMSO(10mL)中并用硬脂酰氯(51mg，1.6mmol)處理。將反應混合物在60℃下加熱2小時，并在室溫下攪拌過夜。加入水(50mL)并將產物提取到氯仿(3×100mL)中。將提取液干燥并濃縮，得到標題產物，為白色固體。MS(FAB)868.5MH+。實施例10GdAE-D03A膽甾烯基氨基甲酸酯將實施例3化合物(300mg，0.8mmol)溶解在DMSO(20mL)中并用膽甾醇氯甲酸酯(225mg，0.5mmol)處理，將反應混合物在80℃下加熱5小時。將混合物在室溫下放置直至析出無色結晶。MS(FAB)MH+1014.5，MNa+1036.5。實施例11LaD03A-琥珀酰基-PE將LaD03A-琥珀酰胺(130mg，0.2mmol)溶解在DMSO(3ml)中。加入二環己基碳化二亞胺(39mg，0.2mmol)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(22mg，0.2mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，并加入PE(130mg，0.2mmol)的氯仿(20ml)液。6小時后，將反應混合物過濾，用水洗滌，干燥并蒸發，得到標題化合物。TLC(65 CHCl3/25 MeOH/4H2O/1甲酸)Rf＝0.2。MS(FAB)MH+1400.7，MNa+14227。實施例12GdAE-D03A-戊二酰基-PE用N-羥基琥珀酰亞胺(25mg，0.21mmol)和二環己基碳化二亞胺(50mg，20.25mmol)來處理氯仿(5mL)中的Egg PE-戊二酰(100mg，0.11mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜并過濾除掉脲。加入在甲醇(1ml)中的實施例4化合物(100mg，0.16mmol)和1mL三乙胺。將反應混合物在室溫下攪拌6小時，并蒸發至干。將殘渣溶解在氯仿(10ml)中并放到透析囊中。將反應物用醋酸鈉緩沖液(1L，50mM，pH 5.5，12小時)，Tris緩沖液(1L，pH 8，50mM，5小時)和去離子水(1L，5小時)透析。通過加入甲醇，將在氯仿層中形成的少量沉淀溶解。將溶液干燥(Na2SO4)并蒸發，得到標題產物，為白色蠟樣固體(150mg，89％)。TLC(65 CHCl3/25 MeOH/4 H2O/1甲酸)Rf＝0.2。MS(FAB)MNa+1459。實施例13在真空下，將Egg PC(52μmol)和Egg PE-戊二酰(48μmol)在氯仿中的混合物蒸發為薄膜。將該脂質混合物溶解在乙醚(3ml)中并用23mL緩沖劑(25mM MES，100mM NaCl)處理。通過聲處理混合物得到乳濁液。將乙醚蒸發掉形成凝膠。通過渦流旋轉并蒸發掉殘存的溶劑來破壞凝膠。再加入1mL緩沖液并繼續蒸發直至除掉全部痕量的溶劑。在室溫和快速攪拌下，用GdAE-D03A(140mg)和EDAC(130mg)將脂質體處理過夜。通過使產物通過Sephadex G-75柱(1×8英寸)，除掉未反應的試劑，將脂質體通過兩個100nm的膜擠出三次。分析最終混合物，得到[Gd]＝1.14mM，[P]＝5.04mM。根據P/Gd比，得到47.1％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。實施例14利用合成實施例13時所描述的方法。使用Egg PC(20μmol)和二油酰基PE-琥珀酰(17μmol)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.56mM，[P]＝3.8mM。根據P/Gd比，得到30％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。實施例15利用合成實施例13時所描述的方法。使用Egg PC(10μmol)和二油酰基PE-十二烷酰(8μmol)。將脂質體擠出(3×200nm，3×50nm)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.66mM，[P]＝3.49mM。根據P/Gd比，得到43％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝17±2(mMsec)-1。實施例16利用制備實施例13時所使用的方法和Egg PC(56μmol)和EggPE(53μmol)的混合物。在室溫和快速攪拌下，用EDAC(100mg)和GdAE-D03A-琥珀酰胺(80mg)將脂質體處理過夜。除掉未反應的試劑后，將脂質體擠出(3×200nm和3×50nm)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.39mM，[P]＝5.87mM。根據P/Gd比，得到14％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝27±2(mMsec)-1。實施例17按照制備實施例13時所使用的方法，從Egg PC(13μmol)和膽甾醇半琥珀酸酯(16μmol)來制備脂質體。用EDAC(25mg)和GdAE-D03A(25mg)來處理脂質體。除掉未反應的試劑后，將脂質體擠出(3×200nm和3×50nm)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.26mM，[P]＝2.93mM。根據P/Gd比，得到7.2％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝21±2(mMsec)-1。實施例18按照制備實施例13時所描述的方法，從Egg PC(80μmol)和6-(膽甾烯基)-7-氧雜庚-1-醇(80μmol)來制備脂質體。用EDAC(70mg)和GdAE-D03A(40mg)來處理脂質體。除掉未反應的試劑后，將脂質體擠出(3×200nm和3×50nm)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.39mM，[P]＝3.34mM。根據P/Gd比，得到11％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝19±2(mMsec)-1。實施例19按照制備實施例13時所描述的方法，從Egg PC(68μmol)，EggPE-戊二酰(55μmol)和Brain PS(6μmol)來制備脂質體。用GdAE-D03A(40mg)和EDAC(75mg)來處理脂質體。除掉未反應的試劑后，將脂質體擠出(3×200nm和3×100nm)。分析最終混合物，得到[Gd]＝0.51mM，[P]＝4.15mM。根據P/Gd比，得到29％的PE-戊二酰。馳豫性(水，20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。實施例20按照合成實施例13時所描述的方法，從膽甾醇半癸二酸酯(130μmol)和Egg PC(130μmol)來制備脂質體。用GdAE-D03A(120mg)和EDAC(120mg)來處理脂質體。通過凝膠層析除掉未反應的試劑并將脂質體擠出。實施例21將實施例10化合物(71mg，6μmol)加到在氯仿中的二油酰PC(15mg，20μmol)中。將溶劑真空蒸發。將殘渣溶解在乙醚(1ml)中。加入水(1ml)，并將混合物進行聲處理直至形成乳濁液。將乙醚真空緩慢蒸發。形成粘稠的凝膠。再加入水(1ml)并將凝膠渦流攪拌直至凝膠破壞形成囊。將產物擠出(3×200nm和3×50nm)。實施例22將實施例12化合物(25mg，17.4μmol)和Egg PC(13.7，18μmol)溶解在氯仿(3ml)中。將溶液真空蒸發至干。將殘渣溶解在乙醚(3ml)中并過濾。加入MES緩沖劑(3ml)并將混合物聲處理直至形成乳濁液。真空蒸發并不時地渦流攪拌除掉乙醚。實施例23將實施例9化合物(50μmol)和氫化Egg PC(150μmol)溶解在氯仿(10ml)和甲醇(2ml)的混合物中。在75℃下蒸發掉溶劑。在75℃振搖下，將殘余薄膜在MES緩沖液中水合。冰凍-熔化四次后，在75℃下，將脂質體擠出(3×100nm)。實施例24藥物動力學在開始研究前數日，將導管插入大鼠頸靜脈中。在注射樣品前抽取300μl血樣并放到含肝素的已稱重試管中。在0時注射試驗化合物。在24小時內，經過一定的時間間隔抽取血樣(300μl)。在第7天將動物處死，摘出肝，脾和腎臟。用硝酸和過氧化氫來消化血和器官樣品并通過ICP來分析釓濃度(μg/g)。實施例 7天后器官中的滯留量產物 劑量μgGd/kg t1/2min. 肝％ 脾％ 腎％13831 98 9.9 1.30.713 1190 111 7.4 0.60.619 1764 69 24.0 11.80.520 1310 58 34.8 8.90.8實施例25生物分布用153Gd標記(2-氨基乙基)-D03A。如實施例13，將螯合物偶聯到1∶1 Egg PC/Egg戊二酰脂質體(100nm)上。將放射性標記的脂質體注射到小鼠的尾靜脈中。每個時間點使用三只小鼠。在第1天，第3天和第7天計數血、肝、脾、腎和皮膚樣品。計算各器官中存留的注射劑量的百分數并列表如下。肝臟的消除半衰期為3.2天。
器官滯留量(％注射劑量)1天 3天 7天血 0.60 0.540.51肝18.22 9.914.88脾 0.86 0.790.69腎 1.03 0.740.64皮膚 1.68 1.190.80實施例26GdDOTA-DOBA的合成(i)對(10-溴癸氧基)苯甲酸甲酯的合成將1，10-二溴癸烷(18.01g，60mmol)，對羥基苯甲酸甲酯(9.12g，60mmol)和K2CO3(8.28g，60mmol)在丙酮(90mL)中的混合物回流攪拌20小時。將白色固體濾出并用丙酮洗滌。將濾液和洗滌液合并，并濃縮成白色固體。通過在硅膠柱上層析，用己烷/氯仿溶劑梯度洗脫，從中分離出所需產物(10.8g，48.4％)。1H NMR(CDCl3，δ)7.95(d)，6.88(d)，3.98(t)，3.85(s)，3.39(t)，1.80(m)，1.52(m)，1.42(m)和1.29(m)。FABMS371(MH+)。
(ii)對(10-N-鄰苯二甲酰亞氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合成在60℃和氮環境下，將對(10-溴癸氧基)苯甲酸甲酯(10.44g，28.12mmol)和鄰苯二甲酰亞胺鉀(5.47g，29.53mmol)在無水DMF(175ml)中的混合物攪拌14小時。真空除掉溶劑并將殘渣溶解在CHCl3中，用水(4×15ml)洗滌。合并洗滌液并用CHCl3(100ml)提取一次。用MgSO4干燥合并的有機層并將溶液濃縮，得到粗品并通過在硅膠上層析，用己烷/氯仿溶劑梯度洗脫來純化(11.8g，96％)。1H NMR(CDCl3，δ)7.95(d)，7.81(m)，7.68(m)，6.86(d)，3.97(t)，3.85(s)，3.64(t)，1.76(m)，1.65(m)，1.54(m)，1.42(m)，1.29(m)。FABMS438(MH+)。
(iii)對(10-氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合成在65℃下，將對(10-N-鄰苯二甲酰亞氨基癸氧基)苯甲酸甲酯(8.52g，19.48mmol)溶解在甲醇(75ml)中。加入肼的一水合物(1mL，20.62mmol)并將溶液在氮環境下回流22小時。將溶液冷卻至室溫并將沉淀過濾。將溶液濃縮并將殘渣與沉淀物合并，用氯仿(500ml)處理。將溶液用水洗滌并將洗滌液用氯仿(2×100ml)提取。將合并的有機層用MgSO4干燥并濃縮，得到產物(5.62g，97％)。1H NMR(CDCl3，δ)7.95(d)，6.88(d)，3.97(t)，3.86(s)，2.64(t)，1.78(m)，1.53(m)，1.43(m)，1.28(m)。
(iv)對(10-氯乙酰氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合成將上述(iii)得到的粗產物(5.62g，18.84mmol)和三乙胺(2.6ml，18.7mmol)溶解在氯仿(90ml)中并在冰浴中冷卻。在攪拌下滴加氯乙酰氯(1.5ml)的氯仿(40ml)溶液。加完后，將溶液在冰浴中攪拌15分鐘并溫熱至室溫，攪拌20小時。將溶液用水(4×80ml)洗滌。干燥(MgSO4)并濃縮，得到產物(6.71g，93％)該產物不必進一步純化即可使用。1H NMR(CDCl3，δ)7.95(d)，6.87(d)，6.54(s，br)，4.01(d)，3.96(t)，3.86(s)，3.28(q)，1.76(m)，1.55(m)，1.45(m)，1.29(m)。13C NMR(CDCl3，δ)130.71，130.66，121.52，113.23，75.37，67.33，50.95，41.85，39.04，28.56，28.53，28.47，28.43，28.33，28.25，25.94，25.11。
(v)10-(對甲氧基羰基-苯氧基癸基氨基甲酰基甲基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三叔丁基醋酸酯的合成將D03A-三叔丁基酯(9.31g，15.63mmol)和三乙胺溶解在DMF(90ml)中并向溶液中加入上述(iv)得到的氯乙酰胺(6.0g，15.63mmol)，將該溶液在60℃和氮環境下加熱19小時。真空除掉溶劑并將殘渣溶解在氯仿(200ml)中。將溶液用水(3×100ml)洗滌，經MgSO4干燥并濃縮，得到粗產物(10.97g)，為油狀物。
(D03A＝1，4，7-三羧甲基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷)。實施例27-31利用下列反應流程，制備D03A-D0BA(實施例26化合物)類似物
(其中R11為鹵素，例如Br；X11為CH2或O；并且d為正整數)。
實施例27-31化合物的合成在所有情況下均是直接的并且可重復。實施例序號-L′-Ar(AH)q縮寫名稱27 間羧基苯氧基-(CH2)10D03A-DOmBA28 鄰羧基苯氧基-(CH2)10D03A-D0oBA29 3，5-二羧基苯氧基-(CH2)10D03A-D0IA30 對羧基苯氧基-(CH2)6D03A-HOBA31 對羧基苯氧基-(CH2)8D03A-OOBA實施例32具有膜結合Gd D03A-DOBA的脂質體在總重量克分子滲透壓濃度為282mOs的175mM葡萄糖，100mM蔗糖介質中，利用90mol％卵磷脂酰膽堿和10mol％Gd DO3A-DOBA來制備110nm大小的脂質體。
T1馳豫性17mM-1s-1Gd濃度 7.87mM脂質濃度65.9mM以0.03mmol/kg劑量靜脈注射后的血半衰期(大鼠)20-90分鐘組織滯留量(以注射劑量的百分數表示)時間 肝 腎 脾30m 53.22 1.870.741h27.95 0.340.913h7.310.260.851d4.270.341.607d1.850.360.61類似地，制備攜帶實施例27-31螯合劑的釓螯合物的脂質體。實施例33雙重造影劑如實施例32，利用Gd DO3A-DOBA作為膜締合螯合物，卵磷脂酰膽堿作為成膜脂質和葡萄糖/蔗糖水溶液來制備200nm大小的脂質體，以Dy/Gd比為2的比率將溶解的Dy DTPA-BMA摻入脂質體中，得到雙重造影劑。
T1馳豫性＝14.6mM-1s-1T2*馳豫性＝16.6mM-1s-權利要求
1.包含脂質體的脂質體劑，所述脂質體膜上結合了具有診斷或治療作用的、螯合的金屬離子，結合所述金屬離子的螯合劑具有大環螯合劑部分和連接到其一個環上原子上的親脂性膜締合部分。
2.權利要求1的脂質體劑，其中所述螯合劑為式(I)An-L-Ch(R)n(I)其中An為疏水性膜締合基團，L為連接到Ch的環上原子上的連接基部分并且可在可生物降解鍵處斷開，Ch為可任選地攜帶一個或多個親水性或定位基團R的大環螯合劑部分，并且n為0或正整數。
3.權利要求2的脂質體劑，其中所述螯合劑An包含膽甾烯基或磷脂酰基。
4.權利要求1的脂質體劑，其中所述螯合劑為兩親性式(II)化合物(HA)qAr-L′-Ch(R)n(II)其中Ch(R)n如權利要求2中的定義，L′為連接到Ch的環上原子上的可任選地被氧取代的C2-25亞烷基連接基部分并且其中至少有一個CH2部分被氧雜、氮雜或硫雜基置換并且該部分可任選地被可生物降解基M間隔開，Ar為任選地被另一個芳環取代或具有稠合在其上的另一個芳環的芳環，q為正整數并且各AH為質子酸基。
5.權利要求4的脂質體劑，其中在所述式(II)螯合劑中，q為1或2，Ar為苯基并且L′為氧與Ar連接的C6-C15亞烷氧基。
6.權利要求1-5之任一項的脂質體劑，其中在所述螯合劑中Ch(R)n為下式基團(XN(CHR1)m)p其中p為3、4、5或6，各m為2、3或4，各R1為氫原子，親水基或定位基，并且各X為R1基或金屬配位基，但連接R1基的一個碳或氮提供與連接基部分連接的鍵。
7.權利要求6的脂質體劑，其中在所述螯合劑中，Ch(R)n為DO3A或DOTA基。
8.權利要求1-7之任一項的脂質體劑，其中所述螯合劑選自AE-DO3A-膽甾烯基氨基甲酸酯，DO3A-琥珀酰基-PE，DO3A-戊二酰基-PE，DO3A-DOBA，DO3A-DOmBA，DO3A-DO0BA，DO3A-DOIA，DO3A-HOBA，DO3A-OOBA和AE-DO3A-十二碳烯基-PE。
9.權利要求1-8之任一項的脂質體劑，其中所述脂質體包含磷脂或氫化磷脂脂質體膜形成物質。
10.權利要求1-9之任一項的脂質體劑，其中所述金屬離子為順磁金屬離子。
11.權利要求1-10之任一項的脂質體劑，它包含另一具有診斷或治療作用的金屬離子的螯合物。
12.權利要求11的脂質體劑，其中所述另一螯合物存在于脂質體核心中。
13.權利要求12的脂質體劑，它包含所述螯合劑的釓螯合物和作為所述另一螯合物的、水溶性的親水性鏑螯合物。
14.權利要求11的脂質體劑，其中所述另一螯合物為重金屬簇的螯合物。
15.組合物，它包含脂質體膜形成化合物和造影增強化合物，后者包含大環螯合劑部分和連接到其一個環上原子上的親脂性膜締合部分，通過該組合物可制備脂質體組合物。
16.制備權利要求1所述脂質體劑的方法，所述方法包括下列步驟之一(a)將包含水性載體介質、脂質體膜形成化合物和具有連接在一個大環環原子上的疏水性膜締合基團的可任選地被金屬化的大環螯合劑化合物的組合物，轉化為脂質體組合物并且如果需要，其后，將所述螯合劑化合物金屬化；和(b)將金屬化或未金屬化的大環螯合劑化合物偶聯到具有摻入脂質體膜內的疏水部分的錨化合物上并且如果需要，其后，將所述螯合劑化合物金屬化。
17.大環螯合劑或其螯合物或其鹽在生產診斷成像用權利要求1的脂質體造影劑方面的用途。
18.在產生人或非人體增強圖像的方法中，包括經非腸道途徑給予所述動物體造影有效量的造影劑和產生至少部分所述動物體的圖像，其改進包括給予權利要求1的脂質體劑作為所述造影劑。
全文摘要
本發明提供脂質體劑，它包含脂質體，該脂質體膜上結合了具有診斷或治療作用的螯合的金屬離子，結合所述金屬離子的螯合劑具有大環螯合劑部分和連接到其一個環上原子上的親脂性膜締合部分。
文檔編號A61K49/06GK1168636SQ9519653
公開日1997年12月24日 申請日期1995年10月9日 優先權日1994年10月10日
發明者M·加列提, J·瓦雷德雷詹, A·D·沃特森 申請人:尼科梅德薩洛塔有限公司