專利名稱：β－D－吡喃半乳糖基－D－木糖在制備用于測定腸乳糖酶的組合物和溶液中的應用及其 ...的制作方法
發明的技術范圍導致乳糖消化能力不足，或者甚至完全喪失消化乳糖的能力的腸乳糖酶缺乏或活性低下，雖然對于成年人是一種常見的綜合癥，但是作為先天性的代謝障礙則是罕見的。大部分哺乳動物，從斷奶時開始，都存在乳糖酶活性急劇降低的情況。對于其祖先在長時間過程中，主要依靠消耗乳或乳制品生活的人，這種降低不常見。另一方面，對于正在哺育的嬰兒，腸乳糖酶缺乏或活性低下的情況則十分常見。
本發明屬于腸乳糖酶活性無血測定領域。
背景技術：
測定腸乳糖酶活性對兒科學和胃腸病學都有重要意義，該測定可以在對受試者給藥后通過分離粘液樣品直接進行，或者可以通過測定血中葡萄糖濃度或呼出的氫含量而間接進行。
直接測定具有需要建立復雜和昂貴的方法的缺點，因為它需要特殊的儀器，并需要非常專業化的技術人員對必須交付后續分析的樣品進行提取，且不說它對受試者不是沒有危險而令人難以接受。
間接測定法具有與血液相關的技術的優點，該技術除了復雜和可能產生誤差外，在對樣品進行分析之前，還需要專業人員對血液進行提取，產生誤差是由于存在受試者攝取的其它食物消化而產生的葡萄糖，以及可能己被遷移的內源性葡萄糖。
測定腸乳糖酶的其它方法基于如下事實特異性的二糖，由于它們對乳糖酶有親和性，易作為乳糖酶的底物，被該酶作用轉化成特異性單糖，此單糖易被腸吸收，并從尿中消除。
因此，在西班牙專利ES-P-478590和ES-P-482073中公開的方法是基于“體內”的測定法，通過口服給予3-O-甲基乳糖酶，分析尿中3-O-甲基-D-葡萄糖，但是，該方法存在如下缺點，即它需要采用色譜技術檢測尿中3-O-甲基-D-葡萄糖，這意味著需要復雜和昂貴的設備及分析儀器。
另一方面，在西班牙專利ES-P-9001680中公開了式(I)的二糖4-O-β-吡喃半乳糖基(galactopyranosyl)-D-木糖的制備，用于檢測腸乳糖酶活性。
該二糖被口服給藥后，在腸道內作為腸乳糖酶的底物，被分解成木糖和半乳糖，木糖被吸收，并通過尿消除，在此可以通過簡單的比色法直接對它進行測定。盡管西班牙專利ES-P-9001680的二糖與乳糖有十分相似的結構，但是其本身仍有缺點，即它對乳糖酶有更高的親和性。這指的是，僅有一部分被消化的4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖被基于乳糖酶的酶活性水解，因而，未分解的木糖和半乳糖部分將隨排泄物被消除。這意味著，在作出如下結論時有相當大的誤差范圍受試尿樣中木糖含量低或甚至不存在木糖，可能是由于乳糖活性不足或喪失，同時由于此二糖對乳糖酶缺乏親和性，因而水解不充分。為了消除所述誤差范圍，必須讓受試者消化相當量的二糖，但這又可能導致腸道問題如腹瀉，和受試者相應的不適。
西班牙專利ES-P-9001680還公開了制備4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的方法，主要包括從芐基-β-D-吡喃木糖苷的合成步驟，隨后的操作程序是進行選擇性保護反應、糖基化作用和去保護。不論是反應階段的數目，在糖基化反應中應用昂貴的反應試劑如silvertriflate，還是在純化中間產物和最后產物中應用層析柱，都造成了高成本，使按產業規模實施該生產方法有困難。
另一方面，Gorin等在“通過獨特擲孢酵母合成β-吡喃半乳糖基一和β-吡喃葡萄糖基二糖”，Can.J.Chem.42(1964)2307-2319中公開了借助純實驗方法合成許多二糖，其中有2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖和3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖。在此出版物中得出了如下結論由半乳糖基轉移生成的產品，在使用不同接受體的情況下，大多數是來源于仲羥基而不是伯羥基的取代作用，同接受體反應的最低限度的結構要求，似乎是與取代羥基相鄰的羥基。但是，在此出版物中沒有公開合成的二糖的任何用途。
發明描述為了克服前述技術狀況的缺點，本發明的目的是利用β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，特別是通式(II)的2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖
和通式(III)的3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖
制備用于能無血并可靠地測定腸乳糖酶的組合物和溶液。
另一方面，本發明的另一目的是，借助于比這類型二糖的常規制備方法更簡便的方法，制備其應用為本發明所保護的β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，以及其它β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖的方法。
這種β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，即其應用為本發明所保護的2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖和3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，比在這種類型測定中常規使用的二糖，對乳糖酶具有更高的親和性，鑒于這二種化合物比以前使用的化合物，如4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖，與乳糖在結構上更少相似的事實，這種結果是令人吃驚的，通過分子中分別與配糖鍵相鄰的不同羥基，可從結構上把它們與4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖區分開。
式(II)和(III)的二糖可以包含在其本身常規的組合物和溶液中，它們可以單獨或結合存在，或者甚至可以與一定量的常規式(I)二糖，和/或少量乳糖混合。這種組合物和溶液可能含有其本身常規的，藥劑學可接受的至少一種選自如下種類的添加成分穩定劑、保護劑、增味劑、乳糖、凝膠劑(gelifiants)、助溶劑(fluxants)和防腐劑。這種溶液可以是其本身常規的水，水溶液或鹽溶液。
已經觀察到，即使使用三個二糖(I)、(II)和(III)的混合物，通過存在于尿中被清除的木糖對腸乳糖酶活性的測定，其結果也比僅用二糖(I)給藥進行的測定明顯提高，這清除地顯示了本發明固有的驚人效果。
本發明的制備方法可以包括制備包括前述二糖I、II和III的β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，并包含如下步驟使D-木糖和底物β-D-吡喃半乳糖苷，按照如下反應式，在存在β-半乳糖苷酶的情況下反應
β-D-吡喃半乳糖苷D-木糖β.-D-半乳糖苷酸----------→ I+II+IIID-木糖的濃度超過β-D-吡喃半乳糖苷濃度的2至20倍，在緩沖至pH5.0-9.0的水介質中，在溫度4-37℃下，當借助于薄層層析或以活性碳柱檢測到已達到生成二糖的最大產量時(通常在4-8小時之后)，通過在100℃加熱使β-半乳糖苷酶失活，并通過在以選定的水或水/醇配制的稀釋填料裝填的柱中過濾，分離出生成的二糖，這樣，得到了二糖(I)、(II)和(III)的混合物，它們既可以以三種二糖混合物的形式包含在組合物或溶液中，也可在用相應的方法分離出二糖(II)或(III)中的一種之后，再與二糖(I)形成混合物，或者還可以單獨地包含在組合物或溶液中。
在制備方法的一個實施方案中，所用的β-D-吡喃半乳糖苷是-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷，而在另一個實施方案中是乳糖。
另一方面，β-吡喃半乳糖苷酶可以是例如大腸桿菌，其被SpanishCompany SIGMA-ALDRICH QUIMICA，S.A商品化。
本制備方法可以在存在可與水混溶的共溶劑的情況下進行，所述共溶劑如乙腈，二甲基甲酰胺，或二甲亞砜。
用于分離二糖的過濾柱可以用SephadexTMG-10或BiogelTMP-2裝填，也可以用活性碳裝填。
二糖II和III還可以通過其它常規的方法得到，如Gorin等在“通過獨特擲孢酵母合成β-吡喃半乳糖基一和β-吡喃葡萄糖基二糖”，Can.J.Chem.42(1964)2307-2319中公開的方法。
附圖
簡述如實施例中所述，此唯一的附圖顯示在大鼠生長過程中，a)β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖(I)、(II)和(II)的混合物在體內的水解，以尿中被消除的木糖百分數表示，b)腸乳糖酶活性(nm/min/mg蛋白質)。
本發明的實施方案下面的實施例將對本發明的有關方面進行示例性的說明，但并非是對本發明的限制。實施例14-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖(二糖I)，2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖(二糖II)和3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖(二糖III)的混合物的制備。
將SIGMA大腸桿菌β-半乳糖苷酶(1.5mg，560U)加入在緩沖液(0.05M KH2PO4，1mM MgCl2，5mM巰基乙醇，265ml，pH7.0)中配制的ó-硝基苯基β-吡喃半乳糖苷(4g，50mM)的木糖(20g，500mM)溶液中，此混合物在25℃溫育5小時45分鐘。此后，將混合物在100℃加熱10分鐘，再使之濃縮，并將此所得的殘余物入活性碳柱中，用水-乙醇1∶0→85∶15的梯度洗脫。首先是單糖木糖和半乳糖被洗脫出，然后是二糖I，II和III的混合物，得到2g二糖混合物(相當于等當量起始ó-硝基苯基β-吡喃半乳糖苷的50％)，I∶II∶III比率分別為8.6∶1.4∶1.0。
對于二糖I，II和III含有的不同官能團，其中一些可以被各自獨立地區分，這些官能團可通過RNM對它們進行鑒定。以Variam XL-300分光計測定的二糖I組分的1H-RMN光譜(300MH2，D2O)，同以前制備的產品相同。
為了對二糖II和III中所形成鍵的化學部位作明確的鑒別和測定，將該化合物的濃縮組分乙酰化，并通過半制備性HPLC(正常相柱SiO2，己烷-醋酸乙酯1∶1，以折射率檢測)將生成的產物分離。接著，對每一個生成的衍生物測定其1H RMN光譜(300MHz，CDL3)2-O-β-D-吡喃半乳糖基-ó-D-吡喃木糖的乙酰化衍生物。
2-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃木糖的乙酰化衍生物。
3-O-β-D-吡喃半乳糖基-ó-D-吡喃木糖的乙酰化衍生物。
3-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃木糖的乙酰化衍生物。
從層析柱中得到的二糖I，II和III的比率可通過氣相色譜法測定，所用色譜儀裝備有火焰離子化檢測器和毛細管柱SE-54(固定相5％聯苯和95％二甲基聚硅氧烷(polysyloxane)，長度15m，內徑0.15mm，厚度μm)。在此分析中，使用了1mL/min的氮氣流。使用的溫度程序是起始溫度160℃，起始時間2分鐘，溫度增加5℃/min，最終溫度250℃。使樣品通過如下步驟的三甲基硅化處理后再進行分析將等分試樣(10μl)在100℃加熱10分鐘，然后加入含有作為內部參照物芐基β-吡喃木糖苷(10mM)的吡啶(25μl)，以及N-三甲基硅咪唑(N-trimethyl sylimidazol)(25μl)，在60℃繼續加熱30分鐘。由不同二糖產生的峰保留時間為如下-芐基β-吡喃木糖苷(內部參照物)12.04min，-二糖I 20.35和20.50min，-二糖II18.46和19.50min，-三糖III 18.30min實施例2體外水解作用的動力學測定按照A.Rivera-Sagredo，F.J.-Canada，O.Nieto，J.Jimenez-Barbero和M.Martin-Lomas，Eur.J.Biochem.，209(1992)415-422的方法，用綿羊腸乳糖酶，在pH6.0將二糖I，II和II，以及乳糖水解，得到如下有關米氏常數(Km)和最大反應速率(Vmax)的結果
二糖 Km(mM) Vmax(％)乳糖 11.0 100二糖I340.0 20二糖II 14.020二糖III 4.0 70可以看出，二糖II和III的米氏常數都比二糖I的米氏常數低，二糖III的Km甚至比乳糖的更低，明顯表明二糖II和III對乳糖酶具有非常大的親和性。實施例3口服二糖I，II和III的混合物后尿中木糖的清除。
將按實施例1的方法制備的二糖I，II和III的混合物(比例分別為8.6∶1.4∶1.0)用于檢測腸乳糖酶的活性。為此，使用了來自同一窩的一組Spraque-Dawley 12天齡的幼鼠17只，先與母鼠隔離，禁食6小時。此后，通過經腹部膀胱壓迫法，對每只動物收集基礎尿液，并立即用灌胃針頭，對每只動物給予在0.3ml蒸餾水中稀釋的二糖混合物18.2mg。從此時開始，連續收集尿液5小時，借助于基于fluoroglucinol反應的比色分析法，在尿液中測定被清除的木糖，并用基礎尿液作目標。收集尿液之后，立即活殺其中3只動物，對其腸粘膜內的乳糖酶活性進行直接測定。為此，先將小腸段吸干，洗凈，借助玻璃研磨器作勻漿收集粘液，用分光光度法測定勻漿中乳糖酶的活性。余留下的動物被送回母鼠，在此后15，18，21，24和30天齡，用這些動物在同樣的條件下重復上述實驗測定，直到整窩動物被用完。實驗結果的平均值顯示在附圖中，其中顯示了在大鼠生長過程中二糖I，II和III的混合物在體內的水解作用，以及腸乳糖酶的活性。為此目的，以被清除的木糖(％)(曲線a)，以及乳糖酶活性(nM/min/mg蛋白質)(曲線b)，對鼠齡(天)作圖。這些試驗結果表明1)檢測到存在于尿中的木糖，它們來自于通過腸乳糖酶的作用，對所施用的二糖的水解，2)尿中木糖的清除進程起始于口服，是與腸乳糖酶活性的已知生理學變化過程平行發展的，此酶活性在個體發育的整個過程中逐漸降低。該試驗表明，本方法對“體內”腸乳糖酶活性的測定是有用的，以診斷為目的以無血檢驗方式進行的，用于測定該酶活性的本方法，對懷疑存在該酶缺乏的幼小個體是特別適用的。實施例4將一組同窩的15天齡Sprague-Dawley幼鼠，在30℃的代謝盒內禁食4小時。對每只動物給予溶于0.5ml蒸餾水的二糖I18.2g。通過腹部壓迫膀胱，收集動物5小時內的尿液。用分光光度法測定這段時間內尿中清除的木糖。木糖清除的結果是21％，也就是說，比給予I，II和III混合物15天時得到的結果的一半還小。
通過將來自本實施例的數據與實施例3的數據進行比較，顯然，二糖II和III在“體內”的親和性是如此之高，以致當此三種二糖被混合給予，并且其中二糖I占優勢時，它們仍可使二糖I的最低的親和性得到補償。
權利要求
1.β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖在制備用于測定腸乳糖酶的組合物和溶液中的應用，其特征在于該β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖具有分別與其分子中配糖鍵相鄰的幾個羥基基團。
2.權利要求1的應用，其特征在于β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖選自2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖和它們的混合物。
3.權利要求1或2的應用，其特征在于組合物中含有藥劑學可接受量的至少一種選自如下種類的添加劑穩定劑、保護劑、增味劑、乳糖、凝膠劑、助溶劑和防腐劑。
4.權利要求1或2中任一權項的應用，其特征在于所述溶液是水溶液。
5.權利要求4的應用，其特征在于所述溶液是鹽水。
6.權利要求1、2、4或5中任一權項的應用，其特征在于所述溶液含有藥劑學可接受量的至少一種選自如下種類的添加劑穩定劑、保護劑、增味劑、乳糖和防腐劑。
7.制備β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖的酶促反應方法，這些二糖中含有至少一種具有分別與其分子中配糖鍵相鄰的幾個羥基的β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，該方法的特征在于它包括a)在緩沖至pH5.0-9.0的水介質中，在溫度4-37℃下，使D-木糖和β-D-吡喃半乳糖苷底物，在存在β-半乳糖苷酶的條件下反應，使D-木糖/β-D-吡喃半乳糖苷底物的濃度比為2-20∶1；b)當根據薄層層析法檢測到反應已達到二糖生成的最大產量時，通過在100℃加熱使β-半乳糖苷酶失活；c)通過在填充柱中過濾，分離出生成的二糖，所用的稀釋劑選自水以及水和醇的混合物。
8.權利要求7的方法，其特征在于β-D-吡喃半乳糖苷底物是ó-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。
9.權利要求7的方法，其特征在于β-D-吡喃半乳糖苷底物是乳糖。
10.權利要求7的方法，其特征在于β-半乳糖苷酶是大腸桿菌的β-D-半乳糖苷酶。
11.權利要求7的方法，其特征在于它是在存在至少一種可與水混溶的共溶劑的條件下進行的。
12.權利要求11的方法，其特征在于所述共溶劑至少選自乙腈、二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，以及它們的混合物。
13.權利要求7的方法，其特征在于被填充的柱子是以Sephadex G-10和βiogel P-2中的一種填充的。
14.權利要求7的方法，其特征在于被填充的柱子是以活性碳填充的。
15.權利要求7或10的方法，其特征在于所形成的二糖是2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖，3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖和4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖的混合物。
16.權利要求10的方法，其特征在于從所形成的二糖中，至少分離出2-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖和3-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-木糖的一種。
全文摘要
本文公開了用O－β－D－吡喃半乳糖基－D－木糖,特別是2－O－β－D－吡喃半乳糖基－D－木糖和3－O－β－D－吡喃半乳糖基－D－木糖,在制備用于測定腸乳糖酶的組合物和溶液的應用,此二糖對乳糖酶具有基本上更高的親和性。本文還公開了生產O－β－D－吡喃半乳糖基－D－木糖的方法,包括:在緩沖至pH5.0—9.0的水介質中,在溫度4—37℃下,使D－木糖和β－D－吡喃半乳糖基底物在存在β－半乳糖苷酶的條件下反應;當通過薄層層析法檢測到反應已達到生成二糖的最大產量時,通過在100℃加熱使β－半乳糖苷酶失活,并通過在填充柱中過濾,分離出生成的二糖,所用的稀釋劑選自水和水/醇。
文檔編號C07H3/04GK1177984SQ96192398
公開日1998年4月1日 申請日期1996年11月8日 優先權日1995年11月8日
發明者J·J·阿朗戈雷耶斯, F·J·卡那達維思內, A·費爾那德茨－馬約拉拉斯阿爾瓦雷茨, R·羅佩茨阿爾－瓦雷茨, M·馬爾丁羅馬斯, D·維拉魯瓦托雷格羅扎 申請人:康斯喬最高科學研究公司, 尤尼弗西德特奧通諾馬公司