專利名稱：包含胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物或其分離物的皮膚再生用成分及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種包含胚胎干細胞來源內皮祖細胞(embryonic stem cell derived endothelial progenitor cells)培養分泌物或者其分離物(fractions)的皮膚再生用成分及其用途，更為詳細說明是將人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞的培養液中所分離的生物蛋白適用于創傷、燒創傷或皮膚整形，由此通過皮膚再生進行治療的同時用作皺紋改善或皮膚老化防止用功能性化妝品的技術。
背景技術：
現在的創傷愈合(wound healing)以及燒創傷愈合(burn wound healing)大部分采用治療劑用藥用紗布(dressing gauze)或利用人工植皮的治療方法。在治療劑用藥用紗布的情形下，雖然在由合成及天然高分子所構成的紗布吸收創傷治愈用有效因子而在有效因子的傳遞和降低感染危險方面存在有利的一面，但未同時進行持續的藥用紗布的交換的情形下反而會增加感染的危險性，在交換紗布時有可能再次刺激創傷部位。在進行大的燒傷或外科手術時所適用的人工皮膚是由合成高分子和天然高分子所構成，使用了大致位于上層的硅是用于防止體液的蒸發消失，下層是由膠原或硫酸軟骨素所構成而引發新的血管和結合組織的再生，將構成皮膚各層的細胞提取后在試管內擴張后接種到以適當的合成高分子或天然高分子等所構成的人工皮膚支架，從而誘導組織的形成后再次移植到患者身上的方法。但是在從利用人工植皮的治療方法對創傷恢復效果來看，但現狀是由于合成及天然高分子的生體適合程度而不能得出一定的結果，特別是培養皮膚的情形下在表皮細胞的穩定性供給方面有困難，由于細胞內免疫相關成分而存在免疫抑制反應的危險，對創傷部位的生著過程中存在表皮、真皮之間結合不穩定的致命缺點。正常創傷的恢復是經過受傷后的凝固期、炎癥期、細胞遷移期、組織再生期等過程來實現，由于在炎癥期大量分泌的EGF、FGF、VEGF、PDGF、TGF等多種細胞因子的影響而伴隨發生新生血管作用、膠原合成、成纖維細胞的遷移等作用。這些所有過程最終使得局部創傷部位所分泌的各種細胞因子促進新血管的新生， 通過新生的血管搬運創傷恢復所必需的各種成長因子、炎癥細胞、基質細胞及皮膚祖細胞等，且促進組織碎片的去除及肉芽組織等的形成而主導著整個創傷修復。利用間充質干細胞來源分泌物的創傷治療效果如前所述。M等利用骨髓干細胞來源內皮祖細胞的在缺血性疾病所引起的創傷治療中驗證了其效果(St印hen Μ. Bauer, Lee J. Goldstein, Richard J. Bauer, Haiying Chen, Mary Putt, ScD, and Omaida C. Velazquez,The bone marrow-derived endothelial progenitorcell response is impaired in delayed wound healing from ischemia.Journal of vascular surgery (2006)43(1) =134-41), Liwen Chen等人利用成體干細胞即骨髓來源間充質干細胞分泌物來驗證了創傷治療的效果(Liwen Chen, Edward Ε. Tredget, Philip Y. G. Wu, Yaojiong Wu,Paracrine Factors of Mesenchymal Stem Cells Recruit Macrophages and
3Endothelial Lineage Cells and Enhance Wound Healing(2008)PLoS ONE. Apr 2 ；3 (4) el886)。但是，從一般骨髓或臍帶血等的成體取得干細胞的收率極低，可進行隔代培養的期間也比其他細胞株短，從而在獲得大量的細胞培養分泌物方面存在多種困難。上述問題可通過具有無限大的增殖能和分化能的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞來進行創傷治療劑的開發。人體胚胎干細胞是具有可無限進行自我再生能力 (self-renewality)、在特定環境下可分化為構成人體的三胚胎細胞(內胚胎、中胚胎、外胚胎)的多能(pluripotency)的細胞(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA,Swiergiel JJ,Marshall VS,Jones JM,Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282 :1145-1147)，伴隨著使其誘導分化為血管細胞、神經細胞、肌肉細胞、脾臟細胞等的研究的發表，人體胚胎干細胞被認為對疑難病治療有很大可能性、在多個領域具有重要作用的細胞。但是人體胚胎干細胞在分化期間，在組織學上容易發生其內胚胎、中胚胎、外胚胎來源組織彼此混合而形成一種腫瘤即畸胎瘤 (teratoma)，如果僅分離出所需的細胞需要高度的技術。因此迫切需要開發出更加安全、可批量生產、費用低廉的創傷治療劑。另外，具有這樣的皮膚再生功能的培養分泌物或及其構成因子之間的組合，使得皺紋改善或皮膚老化防止用的新化妝品的利用變得可能。

發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在于提供一種在利用胚胎干細胞來源內皮祖細胞的同時無畸胎瘤(teratoma)危險性、安全及皮膚再生效果卓越的治療成分及治療方法。并且，本發明的另一目的在于提供一種可通過皮膚再生而用作皺紋改善或皮膚老化防止用化妝品的成分。為了上述目的，本發明的發明人為了開發利用人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞分泌物濃縮液的創傷及火創傷治療劑而進行多種研究，其結果發現將人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養/增殖而獲得大量培養分泌物，并將該分泌物濃縮后適用于創傷及燒創傷動物模型時，與現在廣泛用于創傷治療的hGH(human growth hormone)相比時可在更短時間內更為有效地減小創傷部位的大小。并且，對人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液處置組進行組織學分析發現，發生與培養液處置組相比更大量的膠原層，與此同時進一步促進了再上皮化，基于此完成了本發明。本發明提供一種以胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物或其分離物作為有效成分的皮膚再生用成分。上述胚胎干細胞包含人體胚胎干細胞。優選為對上述培養分泌物或其分離物進行高濃度濃縮，更優選為濃縮50倍以上。上述成分具有皮膚再生效果，從而優選用于創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形治療。并且，上述成分可用于利用皮膚再生的皺紋改善或皮膚老化防止用功能性化妝品。并且，本發明還提供作為有效成分而包含上皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF) 1，250-1，250, 000pg/ml、堿性成纖維細胞生長因子 _2 (Basic fibroblastgrowth factor, FGF-2) ；35_35，000pg/ml、血小板衍生生長因子-AA(Platelet-derived growth factor-AA， PDGF-AA)650-650，000pg/ml、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)400-400，OOOpg/ml 的皮膚再生用成分。并且，上述成分可用于通過皮膚再生的皺紋改善或皮膚老化防止用功能性化妝品。上述成分可進一步包含從Flt-3配體(Flt-3 Ligand) 4-4，000pg/ml、白細胞介素-1 α (Interleukin-1 α，IL-1 α ) 2-2, 000pg/ml、白細胞介素 _1 β (Interleukin-1 β， IL-I β )2-2, 000pg/ml、白細胞介素-17 anterleukin-17，IL_17)0. 2_200pg/ml、血小板來源生長因子-BB (PDGF-BB) 2-2，000pg/ml、分泌因子(Rantes，CCL5) 2-2，000pg/ml 所構成的組中選擇的一個以上的蛋白質成分。并且，上述成分可進一步包括從人神經趨化因子(Fractalkine) 160-160，OOOpg/ ml、白血球增殖促進因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 75-75，000pg/ml、白細胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6) 400-400，000pg/ml、白細胞介素-8 (Interleukin-8, IL-8) 19，000-19，000，000pg/ml、白細胞介素-9 (Interleukin-9, IL-9) 34-34，000pg/ml、趨化因子 IP-10 (Chemokine IP-10) 45-45，000pg/ml、單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)6-6，OOOpg/ml 所構成的組中選擇的一個以上蛋白質成分。并且，本發明還提供利用上述皮膚再生用成分的治療方法。這樣的治療方法包括如下步驟(a)培養胚胎干細胞來源內皮祖細胞的階段；(b)去除內皮祖細胞，從而準備培養分泌物或其分離物的階段；(c)將上述培養分泌物或其分離物適用于哺乳動物皮膚的階段。上述治療方法優選為進一步包括將培養分泌物或其分離物濃縮50倍以上的階段。在上述階段(a)，為進一步有效獲得人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物， 優選為在培養皿涂布膠原后進行培養，作為培養液優選使用EGM-2MV培養液進行培養，但根據需要利用DMEM培養液、M199培養液或它們的混合培養液等公知的培養液，細胞增殖可通過隔代培養來進行，在隔代培養的各階段選擇所需的培養液進行培養。并且，為了所獲得培養分泌物的高濃度濃縮，優選為利用使用TFF膜(TFF membrane)的濃縮系統來僅濃縮IOKDa以上的物質來獲得濃縮液，但根據需要可利用3KDa、 5KDa或全部物質的濃縮液。并且，為了在上述階段(b)中適用胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液，在創傷部位布置硅環，之后在該硅環內部適用胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液。作為上述胚胎干細胞可利用人體胚胎干細胞，因為人體胚胎干細胞具有無限增殖性，從而可通隔代培養進行持續培養，通過凍結干燥等公知方法提供為可流通的成分。上述濃縮液是利用TFT膜(TFF membrane)濃縮的高濃度濃縮液，可添加保存劑、穩定化劑等，從而提供為可流通的商品。本發明的皮膚再生用成分及利用該皮膚再生用成分的創傷及燒創傷治療方法，將具有無線自我增殖能力的人體胚胎干細胞用作細胞供給源，不僅大大減小細胞供給的局限性，還僅將非細胞本身移植的培養分泌物用作治療劑，從而沒有畸胎瘤形成等的危險性。并且，包含本發明皮膚再生用成分的化妝品成分可改善皺紋或防止皮膚老化，可使得皮膚富有彈性。特別是，在觀察適用本發明的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液后效果，與人體生長荷爾蒙(hGH)等的比較組相比創傷部位大小可在短時間內減小，形成很多膠原層，從而更有效地促進再上皮化。并且，根據本發明的治療方法，在利用所適用的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液中所包含的血管形成促進及創傷治愈因子時，使得動物體內所存在的創傷治愈因子(成長因子、炎癥細胞、基質細胞及內皮祖細胞等)向創傷部位的移動更為容易，從而進行更為有效的創傷治療。因此，根據本發明的創傷治療方法，由于在細胞供給方面沒有限制而可獲得大量的培養分泌物，與現有利用人體生長荷爾蒙(hGH)的創傷治療方法相比，可在更短時間內、 更有效地治愈創傷。


圖1是表示本發明的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的 multiplex cytokine array,是分析人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的成分及有效物質含量的分析表。圖2是表示用于創傷治療效果驗證的創傷動物模型制作及適用過程的相片和模擬圖。圖3a是表示低濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物(IX)、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物(50X)、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液(50X)和hGH、僅處理hGH的創傷模型中實施14日的創傷大小治愈檢測值。圖北是表示這些動物模型的組織學分析結果，提取創傷部位組織并通過 Masson' s Trichrome染色確認了膠原合成的確認結果。圖4是表示為驗證燒傷治療改善效果的燒傷動物模型制作過程的相片和模擬圖。 為進行改善效果的驗證而對各組創傷大小的減小進行了 2周的觀察的結果。圖如是表示低濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物(50X)、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液(50X)和hGH、僅處理hGH的燒創傷模型中實施14日的創傷大小治愈檢測值。圖恥是表示這些動物模型的組織學分析結果，提取創傷部位組織并通過 Masson' s Trichrome染色確認了膠原合成的結果。圖6a是經過UV照射的人皮膚成纖維細胞(HDF)細胞活性的實驗，對照組是未投入本發明的成分的相片，實施例2及實施例3是投入根據本發明的實施例的成分的相片。圖6b是表示圖6a的對照組、實施例2及實施例3的UV照射后人皮膚成纖維細胞 (HDF)的細胞數。圖7是表示對投入本發明實施例2及實施例3的成分的免疫印跡(Westin blotting)分析結果。
具體實施例方式在本說明書中“胚胎干細胞”是包含哺乳動物來源的所有胚胎干細胞，包括人體胚胎干細胞。上述人體胚胎干細胞包含人體桑椹胚(morula)來源的全能細胞。上述人體胚胎干細胞可以使用例如 CHA-hES3(Jumi Kim, Sung-Hwan Moon, Soo-Hong Lee, Dong-Ryul Lee, Gou-Young Koh, and Hyung-Min Chung, Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem cells (2007) STEM CELLS AND DEVELOPMENT 16 :269. 280)等，但并不限定于此。并且，人體胚胎干細胞可被本技術領域的普通技術人員所容易獲得。用于上述培養分泌物提取的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞，優選為在低氧狀態通過胚狀體形成誘導分化后，通過利用了⑶133/KDR的雙重標示的流式細胞分離(Flow Cytometry, FACS)獲得高濃度濃縮后的胚胎干細胞來源內皮祖細胞并進行培養。在本發明中，“人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液”是指從人體胚胎干細胞來源的內皮祖細胞所獲得的培養分泌物，包括將該分泌物濃縮的高濃度濃縮液。以下通過實施例對本發明進行更為詳細的說明。但是這些實施例僅用于例示本發明，本發明的范圍并不限于上述內容。實施例1(1)人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物的取得及濃縮在涂布有膠原的培養皿上，在EGM-2/MV (Cambrex)培養液中培養上述人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞，在培養皿上的細胞濃度分布約為70-80%時通過48個小時培養來獲得人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液。利用TFT membrane濃縮系統將所獲得的分泌物濃縮50倍，從而獲得高濃度的培養分泌物濃縮液。(2)創傷及燒創傷動物模型的制作圖2是表示用于創傷治療效果驗證的創傷動物模型制作及適用過程的相片和模擬圖。用于驗證創傷治療效果的上述創傷動物模型制作是在6周歲的裸鼠背部利用穿刺活檢(biopsy punch)誘導出12mm的皮膚前層剝離創傷，在適用時為了使得培養分泌物濃縮液持續露于創傷部位而在創傷部位布置硅環后制作了動物模型。圖4是表示為驗證燒傷治療改善效果的燒傷動物模型制作過程的相片和模擬圖。 為進行改善效果的驗證而對各組創傷大小的減小進行了 2周觀察的結果。用于驗證燒傷治療效果的上述燒創傷動物模型的制作是在6周歲的CF-I鼠的背部輕放Iron stamp的方法在70°C溫度條件下對5mm皮膚誘導出10秒的皮膚前層燒傷。在受到燒傷后為從組織水中去除多余的熱氣而利用冰包對燒傷部位進行冷卻5分鐘，從而制作了動物模型。(3)人體干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液在創傷及燒創傷動物模型的適
a將所獲得的上述人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液適用于所制作的創傷動物模型。在適用時將200 μ 1的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液適用于創傷動物模型的硅環內部。
為驗證人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的效果，作為比較組在相同的創傷動物模型適用了培養液(EGM-2MV medium)、低濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞分泌物、人體生長荷爾蒙(hGH)后對創傷大小的減小進行了 2周的觀察。并且，在2周后通過組織學分析來對創傷治愈中重要因子即膠原的合成和再上皮化過程進行了觀察。膠原合成的確認是經過Masson，s Trichrome染色。實驗例1利用multiplex cytokine array對在實施例1的(1)中所明示的條件下所培養而得的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液(濃縮50倍的高濃度濃縮液) 進行了有效成分的分析了。圖1是表示根據本發明的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液成分及有效物質含量的分析表。如圖1所示，可知濃縮50倍的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液內大量包含 EGF、FGF-2、Fractalkine、GM-CSF、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-U PDGF-AA, PDGF-BB、VEGF等的血管新生及創傷治愈促進有效成分。通過上述結果可知，在本發明中所使用的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液中大量包含對創傷及燒創傷治療有效的血管新生及創傷治愈促進有效成分。實驗例2通過在實施例1的O)中所明示的方法制作創傷動物模型后，將人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液和其它比較組適用到創傷動物模型背部的硅環內部 (參照圖2)。實驗例3如實施例1的(3)所示，分別適用培養液(EGM-2MV medium,對照組)、低濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物(低濃度)、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮物(高濃度，50倍)人體生長荷爾蒙(hGH)后對各處置組進行了 2周的觀察，觀察了創傷大小的減小程度(參照圖3a)。如圖3a所示，在培養液處置組(Medium) 的情形下，創傷大小的減小最遲，低濃度的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物處置組(低濃度)和人體生長荷爾蒙(hGH)的情形下觀察到創傷大小的減小稍微快于對照組的培養液處置組，但在人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液處置組(高濃度)和人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液和人體成長荷爾蒙(hGH)的復合處置組(高濃度+hGH)的情形下創傷大小的減小明顯快于其它處理組。上述結果表明，本發明中所使用的利用人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的創傷治療效果明顯高于其它處置組。實驗例4如實施例1的C3)所示，將人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液適用于所制作的創傷動物模型，并在2周后提取創傷部位的樣品進行了組織學分析。如圖北所示，根據本發明的治療方法所處置的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液(高濃度)適用組的情形下，與比較組即培養液處置組相比具有明顯高的膠原合成性能，在人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物和人體成長荷爾蒙(hGH)的復合處置組(高濃度+hGH)也與此類似地具有明顯高的膠原合成性能。上述結果表明，利用了本發明中所使用的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的創傷治療效果，是通過創傷治療所必需的膠原的大量合成來實現，由此實現再上皮化所需的橋梁作用從而促進了再上皮化。上述大量的膠原合成表示本發明的皮膚再生用成分可用于皺紋改善或皮膚老化防止用化妝品。實驗例5在通過實施例1的( 所示的方法制作燒創傷動物模型后，將人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液和其它比較組適用于燒創傷動物模型的背部燒創傷部位 (如圖4所示)。實驗例6如實施例1的(3)所示，分別適用培養液(EGM-2MV medium,對照組)、低濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物(低濃度)、高濃度人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮物(高濃度，50倍)人體生長荷爾蒙(hGH)后對各處置組進行了 2周的觀察，觀察了創傷大小的減小效果(參照圖如)。如圖fe所示，觀察到在對照組的情形下創傷大小的減小最遲，在低濃度和高濃度、其它比較組即人體生長荷爾蒙(hGH)的情形下創傷大小的減小效果稍微大于對照組。在高濃度+hGH的情形下創傷大小的減小明顯快于對照組和其它比較組。上述結果表明，本發明中所使用的利用人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物的燒創傷治療效果明顯高于對照組。實施例7將實施例1的(3)所示的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞適用于所制作的創傷動物模型，并在2周后提取創傷部位的樣品，進行了組織學分析。如圖恥所示，可確認以本發明的治療法涂布的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞分泌物處理組的情形下具有明顯高于對照組的膠原合成效果。上述結果表明，利用在本發明中所使用的人體胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物濃縮液的創傷治療效果，是通過創傷治療所必需的膠原的大量合成來實現，由此實現再上皮化所需的橋梁作用從而促進了再上皮化。上述大量的膠原合成表示本發明的皮膚再生用成分可用作皺紋改善或皮膚老化防止用化妝品。實施例2在實施例1的成分中將下表1所示濃度的上皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子-2 (Basic fibroblast growth factor，FGF-2)、血小板衍生生長因子-AA(Platelet-derived growth factor-AA,PDGF-AA)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)混合來制備了皺紋改善或皮膚老化防止用成分。表1
權利要求
1.一種將胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養分泌物或其分離物作為有效成分的皮膚再生用成分。
2.根據權利要求1所述的皮膚再生用成分，其中，上述胚胎干細胞是人體胚胎干細胞。
3.根據權利要求1或2所述的皮膚再生用成分，其中，上述培養分泌物或其分離物是濃縮50倍以上的成分。
4.根據權利要求1或2所述的皮膚再生用成分，其中，上述成分是用于創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形。
5.根據權利要求1或2所述的皮膚再生用成分，其中，上述成分用于皺紋改善或皮膚老化防止用化妝品。
6.一種皮膚再生用成分，其中，作為有效成分包含上皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF) 1，250-1，250, 000pg/ml、堿性成纖維細胞生長因子 _2 (Basic fibroblast growth factor, FGF-2) 35-35，OOOpg/ml、血小板衍生生長因子-AA (Platelet-derived growth factor-AA， PDGF-AA)650-650，000pg/ml、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)400-400，OOOpg/ml。
7.根據權利要求6所述的皮膚再生用成分，其中，進一步包含從Flt-3配體(Flt-3 Ligand) 4-4, 000pg/ml、^ΜΜ ΥΜ "1 α (Interleukin-1 α ， IL-I α ) 2-2, 000pg/ml、 胞介素-ι β (Interleukin-1 β，IL-I β ) 2-2, 000pg/ml、白細胞介素-17 (Interleukin-17, IL-17)0. 2-200pg/ml、血小板來源生長因子-BB (PDGF-BB) 2-2, 000pg/ml、分泌因子 (Rantes, CCL5) 2_2，000pg/ml所構成的組中選擇的一個以上的蛋白質成分。
8.根據權利要求6或7所述的皮膚再生用成分，其中，進一步包括從人神經趨化因子(Fractalkine) 160-160，000pg/ml、白血球增殖促進因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 75-75，000pg/ml、白細胞介素-6 (Interleukin-6， IL-6) 400-400，000pg/ml、白細胞介素-8 (Interleukin-8, IL-8) 19，000-19，000，OOOpg/ ml、白細胞介素-9anterleukin-9，IL-9) 34-34，000pg/ml、趨化因子 IP-10 (Chemokine IP-10) 45-45，000pg/ml、單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-l)6-6, OOOpg/ml構成的組中選擇的一個以上蛋白質成分。
9.根據權利要求6或7所述的皮膚再生用成分，其中，上述成分用于創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形。
10.根據權利要求6或7所述的皮膚再生用成分，其中，上述成分用于皺紋改善或皮膚老化防止用化妝品。
11.一種創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形方法，包括如下步驟(a)培養胚胎干細胞來源內皮祖細胞的階段；(b)去除內皮祖細胞，從而準備培養分泌物或其分離物的階段；(c)將上述培養分泌物或其分離物適用于哺乳動物的皮膚的階段。
12.根據權利要求11所述的創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形方法，其中進一步包括將培養分泌物或其分離物濃縮50倍以上的階段。
13.根據權利要求12所述的創傷治療、燒創傷治療或皮膚整形方法，其中在上述濃縮階段利用使用TFF膜(TFF membrane)的濃縮系統來僅濃縮IOKDa以上的物質。
全文摘要
本發明公開一種利用胚胎干細胞來源內皮祖細胞培養液或培養分泌物的皮膚再生用成分及其用途，本發明未采用胚胎干細胞來源內皮祖細胞而將培養分泌物用于治療劑，從而不具有畸胎瘤(teratoma)形成等的危險性，促進新生血管生成能力而對創傷治療、燒創傷治療有效，并且在將其用作化妝品原料的情形下可增大膠原生成而具有防止皮膚老化的效果。特別是將上述培養分泌物高濃度濃縮的本發明的成分具有高于現有hGH(human growth hormone)的創傷治療效果。
文檔編號A61K9/20GK102333523SQ201080009486
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月23日 優先權日2009年2月27日
發明者成鐘赫, 李旻智, 洪起成, 鄭炯敏, 金珠美 申請人:車比奧及戴奧斯泰有限公司