本(ben)申(shen)請要求2014年(nian)8月8日提交的(de)標題為“凋(diao)亡(wang)小體”的(de)美國臨時(shi)專利申(shen)請號62/035,246(代理人案號064693-0302)的(de)權(quan)益(yi)，其(qi)全部內容以引(yin)用的(de)方式(shi)并(bing)入本(ben)文。

技術領域

本公(gong)(gong)開(kai)涉(she)及(ji)凋亡(wang)小(xiao)體。本公(gong)(gong)開(kai)具體地涉(she)及(ji)一種包(bao)含凋亡(wang)小(xiao)體的組合物。本公(gong)(gong)開(kai)還(huan)涉(she)及(ji)由干細胞(bao)制備凋亡(wang)小(xiao)體。本公(gong)(gong)開(kai)還(huan)涉(she)及(ji)包(bao)括使用包(bao)含凋亡(wang)小(xiao)體的組合物的醫學治療。

相關技術描述

本(ben)公(gong)開總體上涉及(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)療(liao)法(fa)和(he)(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)治(zhi)療(liao)產品(pin)。細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)治(zhi)療(liao)產品(pin)的(de)(de)一些(xie)實例包括干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)來(lai)源(yuan)的(de)(de)產品(pin)和(he)(he)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，諸(zhu)(zhu)如(ru)(ru)來(lai)自間充質干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、造血干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、胚胎干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)臍(qi)帶(dai)血干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)那些(xie)；癌癥療(liao)法(fa)和(he)(he)免(mian)疫(yi)療(liao)法(fa)，諸(zhu)(zhu)如(ru)(ru)樹突細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)疫(yi)苗(miao)；活化的(de)(de)T淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)或(huo)B淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、單(dan)核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)以及(ji)(ji)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)或(huo)未修(xiu)飾(shi)的(de)(de)癌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、同種異體胰島(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、用于骨(gu)再生的(de)(de)骨(gu)形(xing)成細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、用于軟骨(gu)修(xiu)復的(de)(de)軟骨(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、角質形(xing)成細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)肝細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。參見，例如(ru)(ru)，Wonnacott K.“Cellular Therapy Products”Food and Drug Administration,Web Seminar Series,UCM273197。這個出版物的(de)(de)全部內容以引用的(de)(de)方(fang)式并入本(ben)文。

細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療產品(pin)的實(shi)例(li)為(wei)包含間充質干細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(MSC)的組合物。MSC擁有多(duo)潛能分化潛力和(he)(he)調控(kong)免(mian)疫(yi)應答的能力。例(li)如，參見(jian)Uccelli等“Mesenchymal stem cells in health and disease”(2008)Nat.Rev.Immunol.8:726-736；Nauta等“Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells”(2007)Blood 110:3499-3506；和(he)(he)Aggarwal等“Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses”(2005)Blood 105:1815–1822；這些(xie)出(chu)版物的全部內(nei)容(rong)以引(yin)用的方(fang)式并入本(ben)文(wen)。MSC已經顯示在體(ti)外或體(ti)內(nei)分化成的細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型(xing)包括(kuo)成骨細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、軟骨細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、肌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、脂肪細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、內(nei)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)β-胰島支持細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

MSC具(ju)有較大自我更新能力(li)，同時(shi)(shi)保持其多潛(qian)能性。證(zheng)實多潛(qian)能性的(de)(de)標準測試是(shi)細胞分(fen)化(hua)為成骨(gu)細胞、脂肪細胞和軟(ruan)骨(gu)細胞以(yi)(yi)及(ji)可能的(de)(de)神(shen)經元樣細胞。然(ran)而，培養(yang)物將分(fen)化(hua)的(de)(de)程度因(yin)個(ge)體和誘導分(fen)化(hua)的(de)(de)方(fang)式(例(li)如，化(hua)學對比(bi)機械)而不同。已知(zhi)細胞增殖和分(fen)化(hua)的(de)(de)能力(li)隨供體的(de)(de)年齡以(yi)(yi)及(ji)培養(yang)時(shi)(shi)間降低。

公開(kai)(kai)了(le)人(ren)MSC可以避(bi)免(mian)同種識別(bie)、干(gan)擾樹突(tu)細(xi)(xi)胞和(he)T細(xi)(xi)胞功能并通過(guo)分泌細(xi)(xi)胞因(yin)子(zi)產(chan)生局部(bu)免(mian)疫抑制微環(huan)境(jing)。還(huan)公開(kai)(kai)了(le)當細(xi)(xi)胞暴露(lu)于特征在于存(cun)在升高的局部(bu)干(gan)擾素-γ水平的炎性環(huan)境(jing)時，可增強人(ren)MSC的免(mian)疫調節(jie)功能。

因(yin)此，MSC可用(yong)于組織再生和(he)免疫療法。例如，參見Le Blanc等“Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-versus-host disease:a phase II study”(2008)Lancet 371:1579-1586；Sun等“Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans”(2009)Stem Cells 27:1421-1432；和(he)Akiyama等“Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis”(2012)Cell Stem Cell 10:544-555；這些出版(ban)物的全部內容以引用(yong)的方式并入(ru)本文。

然(ran)而(er)，仍然(ran)需要(yao)其(qi)他來源的(de)(de)細(xi)胞治療產品(pin)和用(yong)于其(qi)制(zhi)備的(de)(de)新方法，以及(ji)此類產品(pin)用(yong)于醫學治療的(de)(de)用(yong)途。

概述

本公開涉及(ji)(ji)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)。本公開具體(ti)(ti)地涉及(ji)(ji)一種包(bao)含(han)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)的組合(he)(he)物。本公開還涉及(ji)(ji)由(you)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)。優選地，凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)由(you)多潛(qian)(qian)能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)或多能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)、而(er)不是(shi)全能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)。更優選地，凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)由(you)多潛(qian)(qian)能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)、而(er)不是(shi)多能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)或全能(neng)(neng)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)。本公開還涉及(ji)(ji)包(bao)括使用(yong)包(bao)含(han)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)的組合(he)(he)物的醫(yi)學(xue)治療。

本公開(kai)涉及(ji)一種(zhong)組(zu)合(he)物。所述組(zu)合(he)物可(ke)適合(he)于治療哺乳動物。所述組(zu)合(he)物可(ke)包含凋(diao)(diao)亡小體。凋(diao)(diao)亡小體可(ke)包含凋(diao)(diao)亡干細胞。

在(zai)本公開中，凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可包括(kuo)(kuo)(kuo)任何凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。例如(ru)，凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可包括(kuo)(kuo)(kuo)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)胚(pei)胎(tai)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)胎(tai)兒干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)成體(ti)(ti)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)羊膜干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)臍(qi)帶血(xue)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)多能干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)組(zu)合(he)。例如(ru)，凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可包括(kuo)(kuo)(kuo)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。例如(ru)，凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可包括(kuo)(kuo)(kuo)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨髓(sui)(sui)(sui)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)髓(sui)(sui)(sui)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、來(lai)自人脫落乳牙(ya)(ya)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)周韌帶干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)囊干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)胚(pei)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、來(lai)自根尖牙(ya)(ya)乳頭(apical papilla)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)口腔(qiang)上皮祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)齦(yin)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨膜來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)唾液腺來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)組(zu)合(he)。例如(ru)，凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可包括(kuo)(kuo)(kuo)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于培養的(de)(de)(de)(de)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)、來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于未培養的(de)(de)(de)(de)牙(ya)(ya)齦(yin)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)小(xiao)體(ti)(ti)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)(ya)髓(sui)(sui)(sui)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨髓(sui)(sui)(sui)來(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)組(zu)合(he)。

在(zai)本公開中(zhong)，凋亡干(gan)細胞可通(tong)過(guo)干(gan)細胞的(de)(de)細胞凋亡來(lai)獲(huo)得，例如(ru)，干(gan)細胞的(de)(de)細胞凋亡可通(tong)過(guo)饑(ji)餓法(fa)、紫外線照射法(fa)、熱應力法(fa)、星形孢菌素法(fa)或其(qi)組(zu)合(he)進行誘導。

例如，凋(diao)亡干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)可通(tong)過將(jiang)干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)在無(wu)血(xue)清培(pei)養基中(zhong)孵(fu)育1小時(shi)至(zhi)(zhi)1,000小時(shi)范圍內(nei)的(de)時(shi)間段來獲得。或者，凋(diao)亡干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)可通(tong)過將(jiang)干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)在無(wu)血(xue)清培(pei)養基中(zhong)孵(fu)育10小時(shi)至(zhi)(zhi)100小時(shi)范圍內(nei)的(de)時(shi)間段來獲得。

在(zai)另一個實例中，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)30℃至(zhi)100℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)持續預(yu)定(ding)時(shi)間段(duan)來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。或者(zhe)，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)30℃至(zhi)100℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)1分鐘至(zhi)1,000分鐘范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)時(shi)間段(duan)來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。或者(zhe)，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)30℃至(zhi)100℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)10分鐘至(zhi)100分鐘范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)時(shi)間段(duan)來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。或者(zhe)，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)40℃至(zhi)70℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)持續預(yu)定(ding)時(shi)間來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。或者(zhe)，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)40℃至(zhi)70℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)1分鐘至(zhi)1,000分鐘范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)時(shi)間段(duan)來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。或者(zhe)，凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)通過(guo)在(zai)40℃至(zhi)70℃范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)溫(wen)(wen)度下(xia)加(jia)熱(re)(re)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)10分鐘至(zhi)100分鐘范(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)時(shi)間段(duan)來(lai)(lai)獲(huo)(huo)得。

然而(er)，在(zai)另(ling)一個實例中(zhong)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用1nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)10,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)1小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用1nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)10,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)5小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)100小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用100nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)1小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用100nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)5小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)100小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用1nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)10,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)無血清(qing)(qing)培養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)1小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用1nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)10,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)無血清(qing)(qing)培養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)5小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)100小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用100nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)無血清(qing)(qing)培養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)1小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。或者(zhe)，凋亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可(ke)(ke)(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)用100nm星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)(zhi)(zhi)1,000nM星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)星(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)形(xing)(xing)孢(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)(su)處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)(li)(li)無血清(qing)(qing)培養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)持(chi)(chi)(chi)(chi)續(xu)5小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)至(zhi)(zhi)(zhi)100小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)范(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)(wei)(wei)(wei)內(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)段(duan)(duan)來(lai)獲得(de)。

然而，在(zai)(zai)另一個(ge)實例中(zhong)，凋(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞可通過在(zai)(zai)100nm至(zhi)400nm范(fan)圍(wei)內(nei)(nei)的波(bo)長(chang)下(xia)照射(she)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞持(chi)續(xu)0.1分(fen)(fen)鐘至(zhi)1,000分(fen)(fen)鐘范(fan)圍(wei)內(nei)(nei)的時(shi)(shi)間段來獲(huo)得。或者，凋(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞可通過在(zai)(zai)對(dui)于UV燈100nm至(zhi)400nm范(fan)圍(wei)內(nei)(nei)的波(bo)長(chang)下(xia)照射(she)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞持(chi)續(xu)1分(fen)(fen)鐘至(zhi)100分(fen)(fen)鐘范(fan)圍(wei)內(nei)(nei)的時(shi)(shi)間段來獲(huo)得。

本(ben)公(gong)開還涉及一種用(yong)于制(zhi)備本(ben)公(gong)開的組合物的方法。所述(shu)制(zhi)備方法可(ke)例(li)如包(bao)(bao)括誘導干(gan)細胞(bao)(bao)的細胞(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)且由此(ci)制(zhi)備包(bao)(bao)含凋(diao)亡(wang)干(gan)細胞(bao)(bao)的凋(diao)亡(wang)小體。

在所述制備方法中(zhong)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可包括任何干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。例(li)(li)如(ru)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可包括胚胎(tai)(tai)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、胎(tai)(tai)兒(er)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、成(cheng)體干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、羊膜干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、臍帶血干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、誘導(dao)的(de)多能干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或其(qi)組合。例(li)(li)如(ru)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可包括間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。例(li)(li)如(ru)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可包括骨髓來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)間充(chong)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙髓干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)自人脫落(luo)乳牙的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙周韌帶干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙囊干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙胚祖細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)自根(gen)尖牙乳頭的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、口腔上皮祖細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)/干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙齦來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨膜來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、唾(tuo)液(ye)腺來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或其(qi)組合。例(li)(li)如(ru)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可包括培養的(de)間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、未(wei)培養的(de)牙齦來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、牙髓干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨髓來(lai)(lai)(lai)源(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或其(qi)組合。

例如，在本公開中，細胞凋亡(wang)可通(tong)過饑餓法(fa)(fa)、紫外線照射法(fa)(fa)、熱應力法(fa)(fa)、星形孢菌素法(fa)(fa)或(huo)其組合進行誘導。

在本公開中(zhong)，凋亡(wang)小體可例如通(tong)過離心進行收集。

所述(shu)制備方法(fa)還可包括(kuo)通過熒光顯微(wei)術技(ji)術、流式細胞術技(ji)術、離心技(ji)術或其組合來鑒定(ding)、定(ding)量和/或分離凋亡小體。

本(ben)公(gong)開還(huan)涉及一(yi)種治(zhi)療(liao)(liao)(liao)人(ren)受(shou)試(shi)(shi)者(zhe)的方法。所述(shu)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)方法可例如(ru)包括向人(ren)受(shou)試(shi)(shi)者(zhe)施用(yong)有效量的組合物(wu)并且由此(ci)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)所述(shu)人(ren)受(shou)試(shi)(shi)者(zhe)，所述(shu)組合物(wu)包含(han)(han)含(han)(han)有人(ren)凋亡干細(xi)胞的凋亡小(xiao)體(ti)。

在本(ben)公開中，治療(liao)可(ke)包括治療(liao)疾病。所述疾病可(ke)例(li)如包括炎癥、自身免疫性疾病、由(you)卵巢切除術引起的骨丟失、腫瘤(liu)形成和/或傷口。

例如(ru)(ru)，炎(yan)(yan)癥(zheng)(zheng)和(he)/或(huo)(huo)(huo)自(zi)身(shen)(shen)免(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)以(yi)是(shi)(shi)移植(zhi)物抗(kang)宿主病(bing)(GvHD)、糖(tang)尿病(bing)、類(lei)風濕性(xing)(xing)(xing)關節炎(yan)(yan)(RA)、自(zi)身(shen)(shen)免(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)腦脊髓炎(yan)(yan)、全身(shen)(shen)性(xing)(xing)(xing)紅斑狼瘡(SLE)、多發性(xing)(xing)(xing)硬化(hua)癥(zheng)(zheng)(MS)、牙(ya)周炎(yan)(yan)、炎(yan)(yan)性(xing)(xing)(xing)腸(chang)病(bing)(IBD)、粘膜炎(yan)(yan)、結腸(chang)炎(yan)(yan)、敗血癥(zheng)(zheng)等或(huo)(huo)(huo)其(qi)組(zu)合。例如(ru)(ru)，炎(yan)(yan)癥(zheng)(zheng)和(he)/或(huo)(huo)(huo)自(zi)身(shen)(shen)免(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)包(bao)括(kuo)結腸(chang)炎(yan)(yan)。例如(ru)(ru)，炎(yan)(yan)癥(zheng)(zheng)和(he)/或(huo)(huo)(huo)自(zi)身(shen)(shen)免(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)包(bao)括(kuo)全身(shen)(shen)性(xing)(xing)(xing)紅斑狼瘡。例如(ru)(ru)，所述疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)以(yi)是(shi)(shi)由卵巢切除術引起的骨丟(diu)失。例如(ru)(ru)，所述疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)以(yi)是(shi)(shi)腫瘤形成。例如(ru)(ru)，所述腫瘤可(ke)以(yi)是(shi)(shi)肝細胞癌、多發性(xing)(xing)(xing)骨髓瘤或(huo)(huo)(huo)其(qi)組(zu)合。例如(ru)(ru)，所述疾(ji)(ji)病(bing)可(ke)以(yi)是(shi)(shi)傷口(kou)。

在所述治療方法中，人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)例如(ru)(ru)包括(kuo)人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)胚胎干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)胎兒干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)成體干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)羊膜(mo)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)臍帶(dai)血干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)誘導的(de)(de)(de)(de)多能干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)(qi)組合。例如(ru)(ru)，人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)包括(kuo)人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。例如(ru)(ru)，人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)包括(kuo)人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)髓(sui)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)髓(sui)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)(lai)自人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)脫落乳牙(ya)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)周(zhou)韌(ren)帶(dai)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)囊干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)胚祖(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)(lai)自人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)的(de)(de)(de)(de)根尖牙(ya)乳頭的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)口腔上皮祖(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)/干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)齦(yin)(yin)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)膜(mo)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)唾液腺(xian)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)(qi)組合。例如(ru)(ru)，人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)包括(kuo)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)的(de)(de)(de)(de)培養(yang)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)小(xiao)體、來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)的(de)(de)(de)(de)未培養(yang)的(de)(de)(de)(de)牙(ya)齦(yin)(yin)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)(chong)(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)小(xiao)體、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)髓(sui)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、人(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)(ren)凋(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)髓(sui)來(lai)(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)其(qi)(qi)組合。

本公開還涉及一種改(gai)善(shan)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)特(te)性的(de)(de)(de)方法(fa)(“改(gai)善(shan)方法(fa)”)。所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)使用有(you)效(xiao)量(liang)的(de)(de)(de)本公開的(de)(de)(de)組(zu)合(he)物。所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)包(bao)(bao)含凋亡(wang)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)凋亡(wang)小體(ti)(ti)。所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)改(gai)善(shan)：(a)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)集落形成(cheng)；(b)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)調節(jie)；(c)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)骨(gu)(gu)(gu)(gu)生(sheng)成(cheng)；(d)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)脂肪形成(cheng)；或其組(zu)合(he)。例如(ru)(ru)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)改(gai)善(shan)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)集落形成(cheng)。例如(ru)(ru)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)改(gai)善(shan)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)調節(jie)。例如(ru)(ru)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)改(gai)善(shan)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)骨(gu)(gu)(gu)(gu)生(sheng)成(cheng)。例如(ru)(ru)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)(shu)改(gai)善(shan)方法(fa)可(ke)(ke)包(bao)(bao)括(kuo)改(gai)善(shan)骨(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)間充(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)和(he)(he)/或體(ti)(ti)外(wai)的(de)(de)(de)脂肪形成(cheng)。

還可進行和遵循(xun)本(ben)文所(suo)述(shu)的(de)產品(pin)(諸如包(bao)含凋亡小體(ti)的(de)組合(he)物)、其制備方法及其使用方法的(de)任何組合(he)。

這些以(yi)及其他部件(jian)、步驟、特(te)征(zheng)、對象、益處以(yi)及優點(dian)現在將從閱讀以(yi)下說明性實施方案的(de)詳述、附圖(tu)以(yi)及權利要求(qiu)的(de)綜述變得顯而易見。

附圖簡述

附圖(tu)公開了說明性實(shi)施(shi)方(fang)案(an)。附圖(tu)并不(bu)列(lie)出(chu)所有(you)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)。此外或(huo)作為替(ti)代，可(ke)使用(yong)其他實(shi)施(shi)方(fang)案(an)。可(ke)省略可(ke)能(neng)是顯而易見的(de)(de)或(huo)不(bu)必要的(de)(de)細(xi)節(jie)，以便(bian)節(jie)省空間或(huo)用(yong)于(yu)更有(you)效的(de)(de)說明。相(xiang)反，可(ke)在無所公開所有(you)細(xi)節(jie)的(de)(de)情況下(xia)實(shi)踐一些實(shi)施(shi)方(fang)案(an)。當相(xiang)同(tong)(tong)的(de)(de)數字(zi)出(chu)現在不(bu)同(tong)(tong)附圖(tu)中時，它是指相(xiang)同(tong)(tong)或(huo)相(xiang)似(si)的(de)(de)部件或(huo)步驟(zou)。

圖(tu)1.GMSC的示意圖(tu)。通過星形孢(bao)菌素法誘導細胞(bao)(bao)凋亡(wang)。通過使用光學顯微鏡(jing)和流式細胞(bao)(bao)術分(fen)析來(lai)檢測細胞(bao)(bao)凋亡(wang)。

圖2.凋(diao)亡(wang)小體收集(ji)的示(shi)意(yi)圖。

圖3.通過熒光顯微術進行的(de)凋亡小體鑒定。

圖4.相對計數法的(de)示意圖以(yi)及通過使用此方法獲得的(de)凋亡小體(ti)計數的(de)實驗結果(guo)。

圖5A-B.使用流式細胞分選法的(de)凋亡(wang)小體純化和分選。DRAQ5用作熒光標記。

圖6.凋亡小體純化的(de)示意圖和通過(guo)此方法純化的(de)細胞的(de)顯(xian)微鏡檢查。

圖(tu)(tu)7A-B.通過凋亡(wang)小(xiao)體進行的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)全身輸(shu)注以(yi)及BMMSC的(de)(de)收(shou)獲的(de)(de)示意圖(tu)(tu)。實(shi)驗CFU數(shu)目示于(yu)此圖(tu)(tu)中。

圖8A-B.通過凋亡小體(ti)(ti)處理進行的BMMSC體(ti)(ti)外增殖。(A)細(xi)胞顯微鏡檢(jian)查和(B)細(xi)胞百(bai)分比。

圖9A-B.在體外用凋亡小體處理的BMMSC的成骨分化潛力。(A)茜素染色和(he)(B)免疫印跡分析。

圖10A-B.用凋亡(wang)小體處(chu)理的(de)(de)BMMSC的(de)(de)礦化組織(zhi)形成潛力。(A)組織(zhi)顯微(wei)鏡(jing)檢查和(B)骨體積(ji)面積(ji)。

圖11A-B.用凋亡(wang)小體處理(li)的BMMSC的脂(zhi)肪形成潛力。(A)油紅O染色(se)和(B)免疫印跡分(fen)析(xi)。

圖12A-B.通過凋亡小體處理(li)改善(shan)BMMSC體外免疫調節潛(qian)力(li)。

圖13A-D.用(yong)凋亡小體處理結(jie)腸炎小鼠。

圖(tu)14A-I.用凋(diao)亡小體處理切除卵巢的小鼠(shu)。

圖15A-G.用凋亡(wang)小體處(chu)理(li)全(quan)身性紅(hong)斑狼瘡(SLE)小鼠。

圖16A-B.凋(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)輸注抑制小(xiao)鼠肝(gan)細(xi)(xi)胞癌模型中的實體(ti)瘤(liu)生長(chang)。(A)用凋(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)處理的異種(zhong)移植(zhi)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)顯示腫(zhong)(zhong)瘤(liu)體(ti)積減小(xiao)。(B)HE染色(se)示出與對照(zhao)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)相比，凋(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)處理的腫(zhong)(zhong)瘤(liu)誘導的造血細(xi)(xi)胞的浸(jin)潤。

圖(tu)17A-B.凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)處理降(jiang)(jiang)低體(ti)外腫瘤(liu)細(xi)胞存(cun)活(huo)。(A)細(xi)胞存(cun)活(huo)分(fen)析表(biao)明與凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)共培養以劑(ji)量依賴(lai)性(xing)方式降(jiang)(jiang)低腫瘤(liu)細(xi)胞存(cun)活(huo)。(B)全基因(yin)表(biao)達模式的微陣列分(fen)析表(biao)明凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)處理增加細(xi)胞凋(diao)亡(wang)(wang)和(he)溶酶體(ti)功能。

圖18.凋亡小(xiao)體輸注提高(gao)多(duo)發性骨髓(sui)瘤小(xiao)鼠模(mo)型的(de)存活率。小(xiao)鼠模(mo)型的(de)卡普蘭-邁耶(ye)(Kaplan-Meier)存活分析表明凋亡小(xiao)體處理(li)顯(xian)著提高(gao)小(xiao)鼠壽(shou)命。

圖19A-E.凋亡小體(AB)腸內輸注改善DSS誘導的結腸炎。(A)由于DSS施用可在小鼠中誘導結腸炎，所以在DSS誘導后約3天輸注約1×10⁷個AB或(huo)骨髓(sui)間充質干(gan)細胞(MSC)，并且在(zai)DDS誘導后約10天收獲樣品以評價(jia)AB的(de)(de)治(zhi)療(liao)(liao)作用(yong)，并使用(yong)MSC腸(chang)內輸注作為陽性對(dui)照。凋(diao)亡小(xiao)體(ti)(ti)處(chu)理顯(xian)示：(B)在(zai)挽救體(ti)(ti)重方(fang)面(mian)與MSC組相比的(de)(de)顯(xian)著治(zhi)療(liao)(liao)作用(yong)和(he)(he)(he)(C)結(jie)(jie)腸(chang)中(zhong)(zhong)的(de)(de)組織學活性指數降(jiang)低和(he)(he)(he)降(jiang)低。(D和(he)(he)(he)E)與結(jie)(jie)腸(chang)炎組相比，AB處(chu)理在(zai)結(jie)(jie)腸(chang)炎誘導后約10天在(zai)小(xiao)鼠中(zhong)(zhong)顯(xian)示在(zai)降(jiang)低Th1和(he)(he)(he)Th17細胞水平方(fang)面(mian)的(de)(de)顯(xian)著作用(yong)。這些實驗結(jie)(jie)果(guo)證明AB腸(chang)內輸注可用(yong)作治(zhi)療(liao)(liao)免疫病癥(zheng)(諸如結(jie)(jie)腸(chang)炎)的(de)(de)新方(fang)法。

圖20A-C.AB輸注改善小鼠耳打孔模型中的傷口愈合。(A)將約5×10⁶個AB在(zai)耳(er)打(da)孔(kong)之(zhi)前或之(zhi)后(hou)輸注到小鼠中(zhong)。(B和(he)C)在(zai)耳(er)打(da)孔(kong)后(hou)約7天，當與未(wei)處理的對照組相比時(shi)，AB處理組的耳(er)孔(kong)面積顯著(zhu)減小。

說明(ming)性(xing)實(shi)施方案的詳述

現在討論(lun)說(shuo)明性實施(shi)(shi)方(fang)案(an)(an)。此外或(huo)作為替代，可(ke)使用其他實施(shi)(shi)方(fang)案(an)(an)。對于本(ben)領(ling)域普通技術人員可(ke)能顯而易見的(de)或(huo)不必(bi)要的(de)某些細節可(ke)從本(ben)公(gong)開(kai)中省(sheng)略以提供清(qing)楚且簡潔的(de)公(gong)開(kai)內容。相反，可(ke)在無(wu)所公(gong)開(kai)的(de)所有細節的(de)情(qing)況下實踐一些實施(shi)(shi)方(fang)案(an)(an)。

在本(ben)公開中使用以下首(shou)字母(mu)縮(suo)略(lve)詞和(he)縮(suo)寫。

AB：凋亡小體

BMMSC：骨髓來(lai)源的(de)間充(chong)質(zhi)干(gan)細胞

BMD：骨礦密度

CFU-F：集落形成單(dan)位-成纖(xian)維細胞(bao)

DFSC：牙囊(nang)干細胞(bao)

DPSC：牙髓干細胞

DSS：葡聚(ju)糖硫(liu)酸(suan)鈉

FACS：熒(ying)光輔助的細(xi)胞分選(xuan)

GMSC：牙齦來源的間(jian)充質(zhi)干細胞

GvHD：移植物抗(kang)宿主疾病

HE：蘇木精和曙紅

HA/TCP：羥基磷(lin)灰石磷(lin)酸三鈣(gai)

MSC：間充質干(gan)細胞

nM：納摩爾

OESC：口腔上皮祖(zu)細(xi)胞/干(gan)細(xi)胞

PDLSC：牙(ya)周韌帶干(gan)細胞

PSC：骨膜(mo)來源(yuan)的干細胞

SCAP：來(lai)自根尖(jian)牙乳(ru)頭的干細胞

SGSC：唾液(ye)腺來(lai)源(yuan)的干細(xi)胞

SHED：來自人脫落(luo)乳(ru)牙的(de)干細胞

SLE：全(quan)身(shen)性紅斑狼瘡

TGPC：牙胚祖細(xi)胞

UV：紫外線

μm：微米

本(ben)(ben)(ben)公(gong)開涉(she)及(ji)凋亡(wang)小(xiao)體(ti)。本(ben)(ben)(ben)公(gong)開具(ju)體(ti)地涉(she)及(ji)一種包含(han)凋亡(wang)小(xiao)體(ti)的(de)組合物(wu)。本(ben)(ben)(ben)公(gong)開還涉(she)及(ji)由(you)干細胞制備凋亡(wang)小(xiao)體(ti)。本(ben)(ben)(ben)公(gong)開還涉(she)及(ji)包括使用包含(han)凋亡(wang)小(xiao)體(ti)的(de)組合物(wu)的(de)醫(yi)學治療。

凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)(ti)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)直(zhi)徑大約0.5-10μm的囊泡(pao)，并且由經歷程序(xu)性細(xi)胞(bao)死亡(wang)(wang)(稱為細(xi)胞(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang))的細(xi)胞(bao)產(chan)生(sheng)，細(xi)胞(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)可(ke)(ke)用(yong)細(xi)胞(bao)收(shou)縮和核染色(se)質的凝聚(ju)引發，接著是(shi)膜(mo)起泡(pao)。細(xi)胞(bao)器、凝聚(ju)的染色(se)質及(ji)其片段可(ke)(ke)被封裝在(zai)質膜(mo)中以(yi)形成凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)(ti)。可(ke)(ke)通過連(lian)續離心從凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)細(xi)胞(bao)中收(shou)集凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)(ti)，如實施例3中所公(gong)開。凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)(ti)可(ke)(ke)被表(biao)征為在(zai)表(biao)面(mian)膜(mo)上的磷脂酰絲氨酸暴露(lu)，其可(ke)(ke)用(yong)膜(mo)聯蛋白(bai)V染色(se)和其他(ta)表(biao)面(mian)標(biao)記物(wu)(諸如TSP-1)進行檢測(ce)。約10％的凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)(ti)可(ke)(ke)含(han)有可(ke)(ke)用(yong)Hoechst 33342標(biao)記的遺傳物(wu)質。

本公開還涉及凋(diao)(diao)亡小體療(liao)(liao)(liao)法(或(huo)凋(diao)(diao)亡小體治(zhi)療(liao)(liao)(liao))。凋(diao)(diao)亡小體治(zhi)療(liao)(liao)(liao)可(ke)包(bao)括但不限于，診斷(duan)、治(zhi)療(liao)(liao)(liao)、治(zhi)愈、愈合、減輕或(huo)預防(fang)哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)的(de)疾病或(huo)損傷和(he)/或(huo)美(mei)容治(zhi)療(liao)(liao)(liao)。所述(shu)哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)可(ke)以(yi)是(shi)人(ren)。所述(shu)哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)可(ke)以(yi)是(shi)非(fei)人(ren)動(dong)物(wu)，諸(zhu)如非(fei)人(ren)靈長類動(dong)物(wu)、馬、綿羊、牛、豬、狗、貓和(he)山(shan)羊。

本公(gong)開(kai)還涉(she)及在(zai)腫(zhong)瘤(liu)和炎(yan)性(xing)(xing)和/或自(zi)身(shen)免疫(yi)性(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)治(zhi)療中(zhong)使用(yong)包含凋亡小體的(de)組合物的(de)方法(“治(zhi)療方法”)。所述腫(zhong)瘤(liu)的(de)實(shi)例可以(yi)是肝細胞癌(ai)和多發性(xing)(xing)骨(gu)髓(sui)瘤(liu)。此(ci)類(lei)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)實(shi)例是移(yi)植物抗宿主疾(ji)(ji)病(bing)(bing)(GvHD)、糖尿病(bing)(bing)、類(lei)風濕性(xing)(xing)關節(jie)炎(yan)(RA)、自(zi)身(shen)免疫(yi)性(xing)(xing)腦脊髓(sui)炎(yan)、全身(shen)性(xing)(xing)紅斑狼瘡(SLE)、多發性(xing)(xing)硬化癥(MS)、牙周炎(yan)、炎(yan)性(xing)(xing)腸(chang)病(bing)(bing)(IBD)、由化學療法或放射療法誘導的(de)消化道粘膜(mo)炎(yan)、結腸(chang)炎(yan)和敗血癥。所述治(zhi)療方法的(de)另一個實(shi)例可以(yi)是治(zhi)療由卵巢(chao)切除術引(yin)起的(de)骨(gu)丟失。

本公開還涉及在(zai)(zai)(zai)BMMSC的(de)(de)(de)(de)改(gai)(gai)善(shan)(shan)中使(shi)用(yong)包(bao)含(han)凋亡小體的(de)(de)(de)(de)組合(he)物的(de)(de)(de)(de)方法(fa)(“改(gai)(gai)善(shan)(shan)方法(fa)”)。改(gai)(gai)善(shan)(shan)BMMSC的(de)(de)(de)(de)此類(lei)用(yong)途的(de)(de)(de)(de)實例包(bao)括，用(yong)于改(gai)(gai)善(shan)(shan)骨(gu)髓間充質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細(xi)胞在(zai)(zai)(zai)體內(nei)(nei)(nei)或(huo)體外的(de)(de)(de)(de)集(ji)落形成(cheng)(cheng)、改(gai)(gai)善(shan)(shan)骨(gu)髓間充質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細(xi)胞在(zai)(zai)(zai)體內(nei)(nei)(nei)或(huo)體外的(de)(de)(de)(de)骨(gu)生成(cheng)(cheng)、改(gai)(gai)善(shan)(shan)骨(gu)髓間充質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細(xi)胞在(zai)(zai)(zai)體內(nei)(nei)(nei)或(huo)體外的(de)(de)(de)(de)脂肪形成(cheng)(cheng)、改(gai)(gai)善(shan)(shan)骨(gu)髓間充質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細(xi)胞在(zai)(zai)(zai)體內(nei)(nei)(nei)或(huo)體外的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫調(diao)節以及其(qi)組合(he)的(de)(de)(de)(de)用(yong)途。

適(shi)用于(yu)治療的組合物(wu)可包(bao)(bao)含凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)。所述組合物(wu)可包(bao)(bao)含可通(tong)過(guo)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)的細(xi)胞(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)制(zhi)備(bei)的凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)。在一(yi)個(ge)實例中，凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)可包(bao)(bao)含凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)。所述凋(diao)(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)可以(yi)是通(tong)過(guo)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)的細(xi)胞(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)制(zhi)備(bei)的干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)。在本公開(kai)的所有實施方(fang)案中，優(you)選(xuan)凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)由(you)多(duo)潛能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)或多(duo)能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)、而不是全能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)。更優(you)選(xuan)地，凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)由(you)多(duo)潛能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)、而不是多(duo)能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)或全能(neng)(neng)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)。

在本公開中，所(suo)述(shu)干細(xi)胞(bao)可(ke)以是(shi)(shi)哺乳(ru)(ru)(ru)動(dong)(dong)物的干細(xi)胞(bao)。所(suo)述(shu)哺乳(ru)(ru)(ru)動(dong)(dong)物可(ke)以是(shi)(shi)人。所(suo)述(shu)哺乳(ru)(ru)(ru)動(dong)(dong)物可(ke)以是(shi)(shi)非人動(dong)(dong)物，諸如非人靈長類(lei)動(dong)(dong)物、馬、綿羊(yang)、牛、豬、狗(gou)、貓和山(shan)羊(yang)。

在本公開(kai)中，人(ren)(ren)的(de)干(gan)細(xi)胞可(ke)用于制備凋亡干(gan)細(xi)胞。此類(lei)人(ren)(ren)來源的(de)凋亡干(gan)細(xi)胞可(ke)用于治療人(ren)(ren)受試者。

本公開涉及組(zu)(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)。所述(shu)組(zu)(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)包含(han)凋(diao)亡小體(ti)。所述(shu)組(zu)(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)包含(han)含(han)有凋(diao)亡小體(ti)的細胞培養(yang)物(wu)(wu)(wu)。所述(shu)組(zu)(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)以是藥物(wu)(wu)(wu)或生物(wu)(wu)(wu)制劑(ji)。所述(shu)組(zu)(zu)(zu)合(he)物(wu)(wu)(wu)可(ke)用于凋(diao)亡小體(ti)治(zhi)療。

在本公開中，所述組合(he)物可包含(han)含(han)有凋亡(wang)干細(xi)胞的(de)凋亡(wang)小(xiao)體。

適用于制(zhi)備示(shi)例性組合物的干(gan)細(xi)胞可(ke)以是(shi)任(ren)何哺(bu)乳(ru)動(dong)物的任(ren)何干(gan)細(xi)胞。例如，所述(shu)干(gan)細(xi)胞可(ke)以是(shi)經(jing)歷治(zhi)療(liao)(liao)(即，包(bao)(bao)括(kuo)使(shi)用包(bao)(bao)含(han)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)自體干(gan)細(xi)胞的凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體的凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體治(zhi)療(liao)(liao)，“自體凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體治(zhi)療(liao)(liao)”)的哺(bu)乳(ru)動(dong)物的干(gan)細(xi)胞。或(huo)者，所述(shu)干(gan)細(xi)胞可(ke)以是(shi)除經(jing)歷治(zhi)療(liao)(liao)(即，包(bao)(bao)括(kuo)使(shi)用包(bao)(bao)含(han)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)同(tong)(tong)種(zhong)異(yi)(yi)體干(gan)細(xi)胞的凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體的同(tong)(tong)種(zhong)異(yi)(yi)體小(xiao)(xiao)(xiao)體治(zhi)療(liao)(liao)，“同(tong)(tong)種(zhong)異(yi)(yi)體凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體治(zhi)療(liao)(liao)”)的哺(bu)乳(ru)動(dong)物以外的哺(bu)乳(ru)動(dong)物的干(gan)細(xi)胞。

以下是適(shi)用于制備包含凋(diao)亡(wang)干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)的凋(diao)亡(wang)小體的干(gan)(gan)細(xi)胞(bao)的實例。

所(suo)述干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞可以是(shi)任何干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞。干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞的實(shi)例可以是(shi)胚胎干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞、胎兒(er)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞、成體(ti)干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞、羊膜干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞、臍帶血干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞、誘(you)導的多能干(gan)(gan)細(xi)(xi)胞或其(qi)組合(he)。

干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)實例(li)可包(bao)括間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(MSC)。間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)實例(li)可包(bao)括骨髓來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)(de)間充(chong)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(BMMSC)、牙(ya)(ya)(ya)髓干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(DPSC)、人脫落(luo)乳(ru)牙(ya)(ya)(ya)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(SHED)、牙(ya)(ya)(ya)周韌(ren)帶干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(PDLSC)、牙(ya)(ya)(ya)囊干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(DFSC)、牙(ya)(ya)(ya)胚祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(TGPC)、根尖牙(ya)(ya)(ya)乳(ru)頭干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(SCAP)、口腔上皮祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(OESC)、牙(ya)(ya)(ya)齦(yin)來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)(de)間充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(GMSC)、骨膜來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(PSC)、唾液腺來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)(de)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(SGSC)以及其組合(he)。

關于(yu)此(ci)類(lei)干(gan)(gan)細胞、適合于(yu)此(ci)類(lei)干(gan)(gan)細胞的(de)(de)(de)收獲的(de)(de)(de)組織、從此(ci)類(lei)組織中分離此(ci)類(lei)干(gan)(gan)細胞的(de)(de)(de)方法(fa)、此(ci)類(lei)干(gan)(gan)細胞的(de)(de)(de)擴增以及此(ci)類(lei)干(gan)(gan)細胞用(yong)于(yu)治療(liao)的(de)(de)(de)施用(yong)方法(fa)的(de)(de)(de)詳(xiang)細公開內容，參見，例(li)如(ru)，Egusa等(deng)(deng)“Stem Cells in Dentistry–Part I:Stem Cell Sources”J.Prosthodontic Res.(212)v56,p151-165；Shi等(deng)(deng)“A composition of stem cells having highly expressed Fas ligand,”WO2015038665A1；Atsuta等(deng)(deng)“Mesenchymal stem cells inhibit multiple myeloma cells via the Fas/Fas ligand pathway”Stem Cell Research&Therapy,2013,4:111；Le等(deng)(deng)“Gingiva Derived Stem Cell and Its Application in Immunomodulation and Reconstruction”，U.S.2012/0128636A1；Shi等(deng)(deng)“A Composition of Mesenchymal Stem Cells”，WO2014210037；Shi等(deng)(deng)“Compositions and Treatment Methods for Mesenchymal Stem Cell-Induced Immunoregulation,”US20150104428A1；Shi等(deng)(deng)“High Telomerase Activity Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,Methods of Producing the Same and Pharmaceuticals and Treatment Methods Based Thereon,”US20130330300A1；以及Shi等(deng)(deng)“Methods and Compositions for Improved Tissue Regeneration by Suppression of Interferon-Gamma and Tumor Necrosis Factor-Alpha,”US20140154220A1。這些出版物各自的(de)(de)(de)全部內容以引用(yong)的(de)(de)(de)方式(shi)并入本文(wen)。

在(zai)另一個(ge)實(shi)例(li)(li)中(zhong)，培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)和(he)/或未培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)MSC可用(yong)(yong)(yong)于制備凋亡(wang)小(xiao)體。在(zai)另一個(ge)實(shi)例(li)(li)中(zhong)，可使用(yong)(yong)(yong)未培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)和(he)/或培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)GMSC、DPSC或其組合。然而(er)，在(zai)另一個(ge)實(shi)例(li)(li)中(zhong)，可使用(yong)(yong)(yong)培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)和(he)/或未培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)BMMSC。而(er)且，在(zai)另一個(ge)實(shi)例(li)(li)中(zhong)，可使用(yong)(yong)(yong)這(zhe)些未培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)和(he)/或培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)干細(xi)胞的(de)(de)組合。

凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)由(you)此(ci)可(ke)由(you)所述干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)制備。因此(ci)，此(ci)類凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)實例(li)可(ke)以是(shi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)間充(chong)質干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)胚胎干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)胎兒干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)成體干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)羊膜(mo)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)臍帶血干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)誘導多能干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)以及其(qi)組(zu)(zu)合。例(li)如，所述凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)以是(shi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)髓來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)間充(chong)質細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)髓干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)自人脫落乳(ru)牙(ya)的(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)周韌(ren)帶干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)囊干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)胚祖(zu)(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、來(lai)(lai)(lai)自根尖牙(ya)乳(ru)頭的(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)口腔(qiang)上皮祖(zu)(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)/干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)齦(yin)來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)間充(chong)質干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)膜(mo)來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)唾液腺來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或其(qi)組(zu)(zu)合。在其(qi)他實例(li)中(zhong)，所述凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)包括來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)于(yu)培養(yang)的(de)間充(chong)質干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)小體、來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)于(yu)未(wei)培養(yang)的(de)牙(ya)齦(yin)來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)間充(chong)質干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)小體、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)牙(ya)髓干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)(wang)(wang)骨(gu)髓來(lai)(lai)(lai)源(yuan)(yuan)的(de)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)或其(qi)組(zu)(zu)合。

干細(xi)(xi)胞的(de)細(xi)(xi)胞凋(diao)亡可(ke)通(tong)過使用(yong)多種(zhong)方(fang)法來實現。例如，凋(diao)亡干細(xi)(xi)胞可(ke)通(tong)過誘導(dao)干細(xi)(xi)胞的(de)細(xi)(xi)胞凋(diao)亡來制備。干細(xi)(xi)胞細(xi)(xi)胞凋(diao)亡方(fang)法的(de)實例可(ke)包括干細(xi)(xi)胞饑餓法、紫外(wai)線照射(she)法、熱應(ying)力法、星形孢(bao)菌素法以(yi)及其組合(he)。

細(xi)胞(bao)凋亡可(ke)通(tong)過(guo)(guo)(guo)使(shi)(shi)用多種方法(fa)進行檢測(ce)。所述檢測(ce)方法(fa)的(de)實例可(ke)以是通(tong)過(guo)(guo)(guo)使(shi)(shi)用光學顯微鏡(jing)的(de)檢測(ce)、通(tong)過(guo)(guo)(guo)使(shi)(shi)用流式細(xi)胞(bao)術的(de)檢測(ce)以及(ji)其(qi)組合。

凋(diao)亡小體可通(tong)過離心進行收集。

凋亡小(xiao)體(ti)可通過熒光顯微術(shu)(shu)技(ji)術(shu)(shu)、流(liu)式細胞術(shu)(shu)技(ji)術(shu)(shu)和/或(huo)離心(xin)技(ji)術(shu)(shu)來(lai)鑒定、定量和/或(huo)純化。

本公開還(huan)(huan)涉(she)及(ji)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)的(de)(de)方(fang)(fang)法(“制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法”)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法可例(li)(li)如(ru)包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)括(kuo)(kuo)獲(huo)得(de)(或收(shou)獲(huo))包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)干細胞(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，使用(yong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)干細胞(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)，以及(ji)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)合物。在另一(yi)個實例(li)(li)中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法可包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)括(kuo)(kuo)獲(huo)得(de)(或收(shou)獲(huo))包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)干細胞(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，將所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)離成細胞(bao)(bao)，從(cong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)細胞(bao)(bao)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)選干細胞(bao)(bao)，使用(yong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)分(fen)(fen)(fen)選的(de)(de)干細胞(bao)(bao)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)，以及(ji)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)合物。然而，在另一(yi)個實例(li)(li)中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法可包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)括(kuo)(kuo)獲(huo)得(de)(或收(shou)獲(huo))包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)干細胞(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，將所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)離成細胞(bao)(bao)，從(cong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)細胞(bao)(bao)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)選干細胞(bao)(bao)，擴增(zeng)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)干細胞(bao)(bao)，使用(yong)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)擴增(zeng)的(de)(de)干細胞(bao)(bao)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)，以及(ji)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)(han)(han)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)合物。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法還(huan)(huan)可包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)括(kuo)(kuo)在分(fen)(fen)(fen)選干細胞(bao)(bao)之(zhi)前培養分(fen)(fen)(fen)離的(de)(de)細胞(bao)(bao)。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)(bei)方(fang)(fang)法還(huan)(huan)可包(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)括(kuo)(kuo)分(fen)(fen)(fen)離干細胞(bao)(bao)。

本公(gong)開(kai)還涉及施用(yong)(yong)包含凋亡小體(ti)的(de)(de)組(zu)合物的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(“施用(yong)(yong)方(fang)(fang)法(fa)”)。所述(shu)施用(yong)(yong)方(fang)(fang)法(fa)可包括適合于細胞或組(zu)織的(de)(de)施用(yong)(yong)的(de)(de)任何方(fang)(fang)法(fa)。可以各(ge)種方(fang)(fang)式施用(yong)(yong)(或遞送)包含適合于治療目的(de)(de)的(de)(de)凋亡小體(ti)的(de)(de)組(zu)合物。例(li)如，它們可輸注、在各(ge)個部位注射(she)或手術植入。

合(he)適(shi)(shi)(shi)的組合(he)物(wu)包括，例(li)如，在(zai)液(ye)(ye)體(優選水性(xing))培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基中的凋亡(wang)小體(或細胞(bao))懸浮液(ye)(ye)，以(yi)及有或無固體支撐物(wu)或封裝材(cai)料的聚集形式的凋亡(wang)小體。所述(shu)液(ye)(ye)體培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基可(ke)以(yi)是藥學上可(ke)接(jie)受的液(ye)(ye)體培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基。所述(shu)液(ye)(ye)體培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基可(ke)適(shi)(shi)(shi)合(he)于注射。合(he)適(shi)(shi)(shi)的液(ye)(ye)體培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基通常是熟(shu)知的，并(bing)且包括，例(li)如，生理(li)鹽水(有或無葡萄糖和/或鉀(jia))、林格氏(shi)溶(rong)液(ye)(ye)、乳酸林格氏(shi)溶(rong)液(ye)(ye)和哈(ha)特曼氏(shi)溶(rong)液(ye)(ye)。

所述組合物可以有效治療哺乳動物的量施用。所述組合物的凋亡小體量(或劑量)可以是有效治療哺乳動物的量。可選擇組合物中凋亡小體的量和/或濃度以提供一定量(的對所治療的哺乳動物來說可接受的組合物)的方便施用。例如，含有高濃度的凋亡小體的液體組合物適合于將相對小體積注射到固體組織中，而含有較低濃度的凋亡小體的液體組合物可有利于通過靜脈內輸注施用。合適的液體組合物可含有，例如，約1×10¹個凋亡小體/mL至約1×10¹⁰個凋亡小體/mL、或約1×10⁵個凋亡小體/mL至約1×10⁷個凋亡小體/mL或約1×10⁶個凋亡小體/mL至5×10⁶個凋亡小體/mL。聚集組合物或固體組合物可含有，例如，約1×10¹個凋亡小體/mg至約1×10¹⁰個凋亡小體/g。

所(suo)述組(zu)合物還可包含載(zai)體(ti)。所(suo)述載(zai)體(ti)可適(shi)合于凋亡(wang)小體(ti)的宿主(zhu)。所(suo)述載(zai)體(ti)的實(shi)例可呈基質、組(zu)織、纖維、珠粒或(huo)其(qi)他材料的形(xing)式。

出(chu)于治(zhi)療目的(de)，可將有效(xiao)量的(de)組合物施用(yong)至有需(xu)要的(de)哺乳動物。在(zai)施用(yong)條件下產生(sheng)所需(xu)作用(yong)的(de)量的(de)“有效(xiao)量”是例如，足以(yi)抑(yi)制(zhi)炎(yan)癥、抑(yi)制(zhi)免疫應答(da)或自身免疫應答(da)、抑(yi)制(zhi)骨丟失、抑(yi)制(zhi)腫瘤生(sheng)長或轉移、促(cu)進傷口愈合、或促(cu)進BMMSC的(de)集落形成(cheng)、骨生(sheng)成(cheng)或脂肪(fang)形成(cheng)的(de)量。

通常，所述有效量可包括每次施用約1×10¹個凋亡小體至約1×10¹⁰個凋亡小體、或約1×10⁵個凋亡小體至約1×10⁷個凋亡小體、或約1×10⁶個凋亡小體至5×10⁶個凋(diao)亡小體。待施(shi)用的(de)(de)(de)凋(diao)亡細胞的(de)(de)(de)精(jing)確劑量(liang)可取決于(yu)多種因(yin)素，包括哺乳動(dong)物的(de)(de)(de)年齡(ling)、體重(zhong)和性別，所治(zhi)療的(de)(de)(de)疾病及其程度和嚴重(zhong)性。普通(tong)技(ji)術的(de)(de)(de)臨床醫生可基(ji)于(yu)這些和其他考(kao)慮來確定適當的(de)(de)(de)劑量(liang)和施(shi)用方法。

在(zai)(zai)本公開中，凋亡(wang)干(gan)細胞(bao)可(ke)(ke)通過由饑餓法(fa)、紫(zi)外線照(zhao)射法(fa)、熱(re)應力法(fa)、星形孢菌素(su)法(fa)或其組合誘導的(de)干(gan)細胞(bao)的(de)細胞(bao)凋亡(wang)來獲得。這些方(fang)法(fa)可(ke)(ke)在(zai)(zai)無血清(qing)培(pei)養基(ji)中進(jin)行(xing)。

例如，為了通過(guo)饑餓(e)法誘導細胞凋亡，可通過(guo)將干細胞在無血(xue)清培(pei)養基中孵育1小(xiao)時至1,000小(xiao)時范(fan)圍(wei)內、或10小(xiao)時至100小(xiao)時范(fan)圍(wei)內的(de)時間(jian)段來獲得凋亡干細胞。

例(li)如(ru)，為了通(tong)過(guo)(guo)熱(re)(re)(re)應力法(fa)誘導細(xi)胞(bao)凋亡(wang)，可(ke)通(tong)過(guo)(guo)在預(yu)定溫(wen)度下加熱(re)(re)(re)干細(xi)胞(bao)持(chi)續(xu)預(yu)定時間(jian)段(duan)來獲(huo)得(de)凋亡(wang)干細(xi)胞(bao)。例(li)如(ru)，為了通(tong)過(guo)(guo)熱(re)(re)(re)應力法(fa)誘導細(xi)胞(bao)凋亡(wang)，可(ke)通(tong)過(guo)(guo)在30℃至100℃范(fan)圍(wei)內(nei)、或(huo)40℃至70℃范(fan)圍(wei)內(nei)的溫(wen)度下加熱(re)(re)(re)干細(xi)胞(bao)持(chi)續(xu)1分鐘(zhong)至1,000分鐘(zhong)范(fan)圍(wei)內(nei)、或(huo)10分鐘(zhong)至100分鐘(zhong)范(fan)圍(wei)內(nei)的時間(jian)段(duan)來獲(huo)得(de)凋亡(wang)干細(xi)胞(bao)。熱(re)(re)(re)應力法(fa)可(ke)在無血清培養基中(zhong)進行。

例如，為了(le)通過(guo)(guo)星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)法誘導細(xi)胞(bao)凋(diao)亡(wang)(wang)，可(ke)通過(guo)(guo)用預(yu)定量的星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)處理干細(xi)胞(bao)持續預(yu)定時(shi)間段來獲得(de)凋(diao)亡(wang)(wang)干細(xi)胞(bao)。例如，可(ke)通過(guo)(guo)用1nm星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)10,000nM星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)范圍內(nei)的量、或(huo)1nm星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)至(zhi)10,000nM星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)范圍內(nei)的量的星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)處理干細(xi)胞(bao)持續1小時(shi)至(zhi)1,000小時(shi)范圍內(nei)、或(huo)5小時(shi)至(zhi)100小時(shi)范圍內(nei)的時(shi)間段來獲得(de)凋(diao)亡(wang)(wang)干細(xi)胞(bao)。星(xing)形(xing)(xing)孢(bao)菌素(su)(su)(su)(su)(su)法可(ke)在無血(xue)清培(pei)養(yang)基中進行(xing)。

例(li)(li)如，為了通過紫外線(UV)法(fa)誘導細胞(bao)凋亡，可(ke)在預(yu)定波(bo)長(chang)(chang)下(xia)照(zhao)射(she)干細胞(bao)持續預(yu)定時間段。例(li)(li)如，可(ke)在100nm至400nm范(fan)圍(wei)內的(de)(de)波(bo)長(chang)(chang)下(xia)照(zhao)射(she)干細胞(bao)0.1分(fen)鐘(zhong)至1,000分(fen)鐘(zhong)范(fan)圍(wei)內、或1分(fen)鐘(zhong)至100分(fen)鐘(zhong)范(fan)圍(wei)內的(de)(de)時間段。UV照(zhao)射(she)法(fa)可(ke)在無(wu)血清培養基(ji)中進行。

還可進行和(he)遵循本文所述(shu)的產品(諸如包(bao)含凋亡小體(ti)的組合物)、包(bao)含含有凋亡干細胞的凋亡小體(ti)的組合物、其制備方法及其使用方法的任(ren)何組合。

本(ben)公開的其他實施例如下。

實施例1.誘導細胞凋(diao)亡的程序。

細胞凋亡可通(tong)過(guo)使用多(duo)種(zhong)方(fang)法來實現。

例如(ru)，在饑餓法中(zhong)，將基本上包(bao)含匯合(he)(he)MSC的細胞(bao)在無血清(qing)培養(yang)基中(zhong)孵(fu)育約72小(xiao)時以誘導(dao)細胞(bao)凋亡。在此方法中(zhong)，所述細胞(bao)可包(bao)含接近100％匯合(he)(he)的MSC。

在(zai)UV照(zhao)射法(fa)中(zhong)，即另(ling)一種示(shi)例性方(fang)法(fa)中(zhong)，可(ke)用UV燈處(chu)理(li)培養的(de)MSC持續5分鐘至10分鐘范圍內的(de)時(shi)間段以(yi)誘導細胞凋亡(wang)。UV燈可(ke)在(zai)約110V、約50Hz和約180W下(xia)操作。

在熱應(ying)力法(fa)中，即(ji)另一(yi)種示例性方(fang)法(fa)中，可(ke)將培養的MSC在45℃至50℃范圍內變(bian)化的溫度下(xia)孵(fu)育40分鐘(zhong)(zhong)至60分鐘(zhong)(zhong)范圍內的時間段以誘導(dao)細胞凋(diao)亡。

在星形孢(bao)菌素(su)法中(zhong)，即另(ling)一種示例性(xing)方法中(zhong)，將(jiang)基本上包含匯合MSC的細胞(bao)在無血清培養基中(zhong)用約250nM星形孢(bao)菌素(su)處理約15小時以(yi)誘導細胞(bao)凋亡(wang)。在此方法中(zhong)，所(suo)述細胞(bao)可包含接近100％匯合的MSC。

上述方法可進(jin)行組合(he)以誘導細(xi)胞凋亡。例(li)如，饑餓法可與UV照射法和/或熱應力組合(he)以誘導細(xi)胞凋亡。

實施例(li)2.細胞凋亡檢測。

細胞(bao)(bao)凋(diao)亡可(ke)通過使(shi)用多種方(fang)法進(jin)行(xing)檢(jian)(jian)測(ce)。例如，可(ke)通過使(shi)用光學(xue)顯微鏡(jing)來(lai)檢(jian)(jian)測(ce)細胞(bao)(bao)收縮(suo)和固縮(suo)。此外(wai)，可(ke)使(shi)用流式細胞(bao)(bao)術(shu)分析檢(jian)(jian)測(ce)膜聯(lian)蛋白(bai)V和7-AAD雙陽性凋(diao)亡細胞(bao)(bao)。

在(zai)一個實施例中，通(tong)過星形孢菌素誘(you)導細(xi)胞(bao)凋亡。通(tong)過使用光(guang)學顯微鏡(jing)和流式細(xi)胞(bao)術分析來檢測(ce)細(xi)胞(bao)凋亡。結果示(shi)于圖1中。可在(zai)光(guang)學顯微鏡(jing)下觀察到來自(zi)培養皿的未附著細(xi)胞(bao)和收(shou)縮。與對照組(zu)相(xiang)比，星形孢菌素處理后，7AAD+或(huo)膜聯蛋白V+或(huo)雙陽性(xing)凋亡細(xi)胞(bao)群體(ti)從3.3％增加至96.8％。

實(shi)施(shi)例(li)3.凋(diao)亡小體收集。

將(jiang)來自誘(you)導的(de)凋亡細胞的(de)培養(yang)基收集在(zai)(zai)(zai)(zai)無菌離心管中(zhong)(在(zai)(zai)(zai)(zai)約(yue)50ml管中(zhong)約(yue)15ml)。首先(xian)，通過在(zai)(zai)(zai)(zai)約(yue)800g下(xia)離心約(yue)10分鐘除(chu)(chu)去死細胞和細胞碎片。然后，將(jiang)上清液轉移到(dao)約(yue)1.5ml EP管中(zhong)。將(jiang)上清液在(zai)(zai)(zai)(zai)約(yue)16,000g下(xia)進(jin)一步離心約(yue)30分鐘以獲得作為沉(chen)淀(dian)(dian)的(de)凋亡小體。為了消除(chu)(chu)培養(yang)基中(zhong)的(de)試劑或血清作用，將(jiang)沉(chen)淀(dian)(dian)重新懸浮并通過PBS洗滌，且在(zai)(zai)(zai)(zai)約(yue)16,000g下(xia)再離心約(yue)30分鐘。此實施例示(shi)意性(xing)地示(shi)于(yu)圖2中(zhong)。

實施例4.凋亡小體(ti)鑒(jian)定。

在此(ci)實施例(li)中，通過使用(yong)熒光(guang)顯(xian)微術(shu)技(ji)術(shu)來鑒(jian)定(ding)凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)。結(jie)果示于(yu)圖(tu)3中。如制造商的(de)(de)說明(ming)書中所述，將(jiang)凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)的(de)(de)膜用(yong)PKH26標記并且將(jiang)遺傳物質用(yong)Hoechst 33342標記。凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)的(de)(de)直徑在0.5μm至10μm的(de)(de)范圍內變(bian)化，平均大小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)為約3.014±1.1093μm。少于(yu)10％的(de)(de)凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)含有遺傳物質。凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)的(de)(de)表面標記物膜聯(lian)蛋(dan)白V、7-AAD和TSP可通過流(liu)式細(xi)胞術(shu)分析來鑒(jian)定(ding)。

實施例5.凋亡小體定量和(he)純化(hua)。

相對(dui)計數法用于凋(diao)(diao)(diao)亡小體(ti)(ti)定(ding)量。首先，將(jiang)已知(zhi)量的熒光染料標記(ji)的珠(zhu)粒(li)(“計數珠(zhu)粒(li)”)添(tian)加到凋(diao)(diao)(diao)亡小體(ti)(ti)懸浮(fu)液中(zhong)。然后，通過使用流式細(xi)胞術分析來檢測凋(diao)(diao)(diao)亡小體(ti)(ti)和計數珠(zhu)粒(li)的相對(dui)比率(lv)。此(ci)方法示意性地示于圖4中(zhong)。根(gen)據下式基于已知(zhi)量的計數珠(zhu)粒(li)來計算(suan)凋(diao)(diao)(diao)亡小體(ti)(ti)的數目(mu)：

凋亡(wang)小體對(dui)細胞的(de)收獲率在5至10的(de)范圍內變(bian)化。

實施例6.通過流式細胞純化進行(xing)的凋(diao)亡小(xiao)體(ti)純化。

在(zai)此(ci)實(shi)施例中，通過使用(yong)流式細胞(bao)分選技術進一步純(chun)(chun)化凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)。這(zhe)些純(chun)(chun)化的凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)可用(yong)于制備本公開的組合(he)物，其中所(suo)述凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)可以(yi)是純(chun)(chun)化的凋(diao)亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)體(ti)。

通過作(zuo)為流(liu)式(shi)細(xi)胞分(fen)選的(de)標(biao)記物的(de)DRAQ5標(biao)記凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)中的(de)遺傳物質(zhi)。將(jiang)凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)分(fen)成兩個群體(ti)(ti)(ti)。結(jie)果示(shi)于圖(tu)5A-B中。DRAQ5陽性(xing)群體(ti)(ti)(ti)含有(you)(you)具有(you)(you)遺傳物質(zhi)的(de)凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)，而DRAQ5陰性(xing)群體(ti)(ti)(ti)含有(you)(you)無遺傳物質(zhi)的(de)凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)。可分(fen)選出3.8％具有(you)(you)遺傳物質(zhi)的(de)凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)，同(tong)時(shi)可在流(liu)式(shi)細(xi)胞分(fen)選期間收集43.13％無遺傳物質(zhi)的(de)凋亡小(xiao)體(ti)(ti)(ti)。

實施(shi)例7.通過(guo)差速離心進行(xing)的凋(diao)亡小體純化。

在此實施例中，通過使用差速離心技術進一(yi)步純(chun)(chun)(chun)化凋亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)。所述(shu)凋亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)的(de)純(chun)(chun)(chun)化方法示意性地示于(yu)圖(tu)6中。這些(xie)純(chun)(chun)(chun)化的(de)凋亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)可(ke)用于(yu)制(zhi)備本公(gong)開的(de)組(zu)合(he)物，其中所述(shu)凋亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)可(ke)以是純(chun)(chun)(chun)化的(de)凋亡(wang)(wang)小(xiao)體(ti)。

基(ji)于(yu)不同的沉(chen)降(jiang)速率，使(shi)用低離(li)心力分離(li)較(jiao)大大小(xiao)的凋(diao)亡(wang)小(xiao)體。首先(xian)，用PBS重新(xin)懸(xuan)浮沉(chen)淀的凋(diao)亡(wang)小(xiao)體，并(bing)且然后在(zai)約4,000g下離(li)心約5分鐘。沉(chen)淀的凋(diao)亡(wang)小(xiao)體的直(zhi)徑在(zai)4μm至10μm的范(fan)圍內變(bian)化，并(bing)且超(chao)過80％的凋(diao)亡(wang)小(xiao)體含(han)有(you)遺傳物質。結果(guo)示于(yu)圖(tu)6中。

實施例(li)8.凋亡小(xiao)體(ti)提高體(ti)內BMMSC集(ji)落(luo)形(xing)成數目。

C3H小鼠在第0天和第2天進行凋亡小體的全身輸注。每次全身輸注的劑量是5×10⁶個(ge)(ge)(ge)凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體細(xi)胞(bao)。在(zai)第(di)7天(tian)從小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)中收(shou)獲BMMSC。如(ru)通過(guo)甲苯胺(an)藍染色所示(shi)，輸(shu)注凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體的(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)比野生型(wt)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)產生更高數目的(de)(de)BMMSC CFU-F。凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體處(chu)理組的(de)(de)CFU-F數目從42個(ge)(ge)(ge)集落(luo)/100萬個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞(bao)增加至(zhi)57個(ge)(ge)(ge)集落(luo)/100萬個(ge)(ge)(ge)細(xi)胞(bao)。參見圖7A-B。這些實驗結(jie)果(guo)證明凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體可提高體內BMMSC集落(luo)形成(cheng)數目。

實施例9.凋亡(wang)小體提高(gao)體外(wai)BMMSC集(ji)落形成數目。

在此實施例中，用凋亡小體處理BMMSC，并通過并入BrdU測定進行分析。據發現當與未處理的BMMSC相比時，BrdU陽性(BrdU⁺)細胞的數目在用凋亡小體(ti)(ti)處理的BMMSC中顯(xian)著(zhu)增加。參見圖8A-B。這些(xie)實(shi)驗結果證明(ming)凋亡小體(ti)(ti)可提高體(ti)(ti)外BMMSC集(ji)落(luo)形成數目。

實施例10.凋(diao)亡(wang)小體改(gai)善體外BMMSC的(de)骨生成。

在此實施例中(zhong)(zhong)，在體(ti)(ti)外用凋(diao)亡小體(ti)(ti)處(chu)理BMMSC。在成骨(gu)誘導后6周，通過茜素紅(hong)(hong)染(ran)色評估BMMSC的(de)成骨(gu)分化潛力。就礦化結節而言，茜素紅(hong)(hong)陽性(茜素紅(hong)(hong)+)面(mian)積被計算為(wei)總(zong)面(mian)積的(de)百分比(bi)。免疫印跡(ji)分析揭(jie)示OCN的(de)表達水平具有相同的(de)趨勢(shi)。實驗結果(guo)示于(yu)圖(tu)9A-B中(zhong)(zhong)。

與未(wei)處理(li)(li)的(de)(de)(de)BMMSC和用低劑量的(de)(de)(de)凋亡(wang)(wang)小體處理(li)(li)的(de)(de)(de)BMMSC相比，用高(gao)劑量的(de)(de)(de)凋亡(wang)(wang)小體處理(li)(li)的(de)(de)(de)BMMSC形成(cheng)顯著增加量的(de)(de)(de)礦化(hua)結節。這些(xie)實(shi)驗(yan)結果(guo)證明(ming)，BMMSC的(de)(de)(de)成(cheng)骨(gu)分化(hua)潛(qian)力可通過(guo)體外凋亡(wang)(wang)小體處理(li)(li)改善。這些(xie)實(shi)驗(yan)結果(guo)還證明(ming)，這種改善潛(qian)力可通過(guo)增加凋亡(wang)(wang)小體的(de)(de)(de)劑量而(er)增加。

實施例11.凋亡小體(ti)改(gai)善體(ti)內BMMSC的骨生(sheng)成。

在(zai)此實(shi)施(shi)例中，通過使用羥基磷灰石磷酸三鈣(gai)(HA/TCP)作為載體(ti)(ti)將在(zai)體(ti)(ti)外用凋亡(wang)小(xiao)體(ti)(ti)處(chu)(chu)理的(de)BMMSC皮下(xia)移植到(dao)免(mian)疫(yi)受損的(de)小(xiao)鼠中。圖10A-B中所示的(de)實(shi)驗(yan)結果(guo)表明(ming)，當(dang)與(yu)未處(chu)(chu)理的(de)BMMSC相比時(shi)，用凋亡(wang)小(xiao)體(ti)(ti)處(chu)(chu)理的(de)BMMSC形(xing)成更多(duo)的(de)礦化組織。這些(xie)實(shi)驗(yan)結果(guo)證(zheng)明(ming)，BMMSC的(de)礦化組織形(xing)成潛力可通過用凋亡(wang)小(xiao)體(ti)(ti)體(ti)(ti)內(nei)處(chu)(chu)理BMMSC而(er)改善。

實(shi)施例12.凋亡小(xiao)體改(gai)善體外BMMSC的脂肪形成。

在此實施例中(zhong)，在體外用凋亡小(xiao)體處理BMMSC。在脂(zhi)肪形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)誘(you)導后4周(zhou)，通過油(you)紅O染色評估BMMSC的(de)(de)脂(zhi)肪形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)潛力(li)。油(you)紅O陽(yang)性(油(you)紅-O+)細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)數目被計算為(wei)總細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)百分比。圖11A-B中(zhong)所示的(de)(de)實驗結果(guo)表(biao)明，用凋亡小(xiao)體處理的(de)(de)BMMSC具有(you)升高的(de)(de)分化(hua)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)脂(zhi)肪細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)潛力(li)。免疫(yi)印跡測定(ding)表(biao)明脂(zhi)肪細(xi)(xi)(xi)胞特異性分子LPL和PPARγ2的(de)(de)表(biao)達水平具有(you)相同的(de)(de)趨勢。這些實驗結果(guo)表(biao)明，BMMSC的(de)(de)脂(zhi)肪形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)潛力(li)可通過用凋亡小(xiao)體體外處理BMMSC而改(gai)善。

實(shi)施例13.凋亡小體改善體外BMMSC的免(mian)疫調節。

BMMSC可(ke)直接(jie)誘(you)導(dao)活(huo)性T細胞凋(diao)(diao)亡(wang)作為免疫(yi)調節特性。BMMSC/T細胞共培養系統(tong)顯示，當(dang)與未處(chu)理的BMMSC相比(bi)時，凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)體處(chu)理的BMMSC具(ju)有顯著提高的誘(you)導(dao)膜(mo)聯蛋(dan)白V+7AAD+雙(shuang)陽性凋(diao)(diao)亡(wang)T細胞的能力。實驗結(jie)果示于圖12A-B中。

實施(shi)例14.凋亡小體對(dui)誘導性結(jie)腸炎小鼠具有治療作用。

在此實施例中，用5×10⁶個凋亡小體的劑量輸注具有DSS誘導的實驗性結腸炎的第一組小鼠(“AB輸注”)。對于陽性對照，用5×10⁵個BMMSC的(de)劑量輸注(zhu)具(ju)有DSS誘(you)(you)導(dao)的(de)實驗(yan)性(xing)結(jie)腸(chang)(chang)炎(yan)(yan)的(de)第(di)(di)二(er)組(zu)(zu)小(xiao)鼠(“MSC輸注(zhu)”)。具(ju)有DSS誘(you)(you)導(dao)的(de)實驗(yan)性(xing)結(jie)腸(chang)(chang)炎(yan)(yan)的(de)第(di)(di)三組(zu)(zu)小(xiao)鼠未(wei)經處理(“結(jie)腸(chang)(chang)炎(yan)(yan)”)。第(di)(di)一和第(di)(di)二(er)小(xiao)鼠組(zu)(zu)在(zai)誘(you)(you)導(dao)結(jie)腸(chang)(chang)炎(yan)(yan)后輸注(zhu)3天(tian)。從(cong)誘(you)(you)導(dao)結(jie)腸(chang)(chang)炎(yan)(yan)開(kai)始，在(zai)10天(tian)的(de)時間段內記錄(lu)三個小(xiao)鼠組(zu)(zu)的(de)重量損(sun)失。結(jie)果(guo)示于圖(tu)13A-D中。

與(yu)結腸(chang)(chang)(chang)炎(yan)(yan)組(zu)相比(bi)，凋(diao)(diao)亡小(xiao)體處理在(zai)結腸(chang)(chang)(chang)中發揮更顯著的(de)(de)疾病表型(xing)、體重損失(shi)的(de)(de)恢復(fu)和組(zu)織學活性(xing)指數的(de)(de)降低。與(yu)結腸(chang)(chang)(chang)炎(yan)(yan)組(zu)相比(bi)，凋(diao)(diao)亡小(xiao)體處理在(zai)結腸(chang)(chang)(chang)炎(yan)(yan)誘導后10天在(zai)小(xiao)鼠中顯示(shi)在(zai)降低Th17細胞水平方(fang)面的(de)(de)顯著作用(yong)。這些(xie)實驗結果證明，凋(diao)(diao)亡小(xiao)體可用(yong)于治(zhi)療免(mian)疫(yi)障礙疾病如結腸(chang)(chang)(chang)炎(yan)(yan)。

實(shi)施例(li)15.凋亡小體對(dui)切除卵巢的小鼠具有治療作用。

在此實施例中，用5×10⁶個凋亡小體的劑量輸注第一組切除卵巢的小鼠(“OVX+AB”)。對于陽性對照，用5×10⁵個BMMSC的劑(ji)量輸注(zhu)(zhu)第二組切(qie)除卵巢的小鼠(shu)(“OVX+MSC”)。第三組切(qie)除卵巢的小鼠(shu)未(wei)經處理(li)(“OVX”)。第四組未(wei)切(qie)除卵巢的小鼠(shu)也未(wei)經處理(li)(“假”)。第一和第二小鼠(shu)組在誘導卵巢切(qie)除術后兩周進行(xing)輸注(zhu)(zhu)。結果示于圖14A-I中(zhong)。

蘇(su)木精和曙紅(HE)染色顯示BMMSC和凋(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)體處(chu)理均顯著(zhu)挽救了切(qie)除(chu)卵巢(chao)的(de)(de)小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)骨(gu)(gu)丟失。與未處(chu)理的(de)(de)切(qie)除(chu)卵巢(chao)的(de)(de)小(xiao)(xiao)鼠相比，凋(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)體處(chu)理顯著(zhu)提高股骨(gu)(gu)BV/TV中(zhong)的(de)(de)骨(gu)(gu)礦(kuang)物質密度(du)(BMD)。此外，凋(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)體輸(shu)注(zhu)挽救了OVX來源的(de)(de)骨(gu)(gu)髓MSC的(de)(de)CFU-F數目、群體倍增、骨(gu)(gu)生成能力和脂肪形成能力。同時，凋(diao)亡(wang)小(xiao)(xiao)體輸(shu)注(zhu)降低了Th1和Th17t細胞(bao)的(de)(de)水平。

實施例16.凋亡小(xiao)體對全身性(xing)紅斑狼(lang)瘡(SLE)小(xiao)鼠具有治療(liao)作用。

在此實施(shi)例中，MRL/lpr小鼠(shu)(shu)用作全身性紅斑狼瘡模型。用凋亡小體輸注第(di)一(yi)組MRL/lpr小鼠(shu)(shu)(“Lpr+AB”)。對(dui)于陽性對(dui)照(zhao)，用BMMSC輸注第(di)二(er)組MRL/lpr小鼠(shu)(shu)(“Lpr+MSC”)。第(di)三(san)組MRL/lpr小鼠(shu)(shu)未經處理(“lpr”)。第(di)四(si)組C3H小鼠(shu)(shu)也未經處理(“C3H”)。結果示于圖15A-G中。

凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)輸(shu)注(zhu)挽救了(le)(le)間(jian)充質干細(xi)胞(bao)(MSC)功能缺陷并(bing)(bing)且(qie)重建了(le)(le)MRL/lpr小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)梁(liang)骨(gu)結構。與(yu)未處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)MRL/lpr小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)相(xiang)比(bi)(bi)(bi)，凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)輸(shu)注(zhu)顯著提(ti)高(gao)股骨(gu)BV/TV中(zhong)的(de)(de)(de)骨(gu)礦物質密度(du)(BMD)。凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)輸(shu)注(zhu)降低(di)了(le)(le)自身抗(kang)體(ti)水(shui)平并(bing)(bing)且(qie)改善(shan)了(le)(le)MRL/lpr小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)腎功能。與(yu)未處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)組(zu)相(xiang)比(bi)(bi)(bi)，外(wai)周血中(zhong)C3、抗(kang)dsDNA的(de)(de)(de)水(shui)平在(zai)凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)輸(shu)注(zhu)組(zu)中(zhong)降低(di)，而白蛋白水(shui)平得(de)到挽救。凋亡(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)輸(shu)注(zhu)降低(di)了(le)(le)Th17T細(xi)胞(bao)水(shui)平并(bing)(bing)且(qie)恢復(fu)了(le)(le)Treg/Th17比(bi)(bi)(bi)率。

實施例(li)17.凋亡小體(ti)對腫瘤具有治(zhi)療作用(yong)。

在(zai)實體(ti)瘤和(he)造(zao)血(xue)系統(tong)腫(zhong)瘤中評價凋亡小體(ti)的治療作(zuo)用。對于此評價，建立了肝細胞癌(ai)和(he)多發性骨髓瘤的小鼠(shu)腫(zhong)瘤模型。

對于肝細胞癌的小鼠模型，通過肌內注射HepG2細胞來產生肝細胞癌的異種移植物。簡言之，在重量匹配的約8周齡雌性NOD/SCID小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME,USA)中實施所述小鼠模型。將HepG2肝細胞癌細胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在補充有約10％胎牛血清(Summit Biotechnology,Fort Collins,CO,USA)和抗生素(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)的杜氏改良的伊格爾氏培養基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中在約37℃、約5％CO₂下培養。°將懸浮在PBS中的HepG2細胞(約1×10⁶個細胞(bao)/10克體重)肌內注射到NOD/SCID小鼠的后腿(tui)中，并且PBS注射充當陰(yin)性對照。

為了測(ce)試凋亡小(xiao)體(ti)對原位癌(ai)的作(zuo)用(yong)，將二乙基亞(ya)硝胺(an)作(zuo)為致(zhi)癌(ai)物注(zhu)射到B6C3F1小(xiao)鼠(shu)中以(yi)用(yong)于誘導原位肝細胞癌(ai)。簡言之，使用(yong)約4周齡B6C3F1雄(xiong)性小(xiao)鼠(shu)來產生癌(ai)模型。向(xiang)小(xiao)鼠(shu)腹膜(mo)內施用(yong)單(dan)一劑量的二乙基亞(ya)硝胺(an)(約100mg/克(ke)體(ti)重)。

對于多發性骨髓瘤模型，將從親本鼠5T33(IgG2bκ)多發性骨髓瘤的非基質依賴性細胞系亞克隆的5TGM1MM細胞系在具有約10％胎牛血清和抗生素的伊斯科夫氏改良的杜氏培養基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中的長期懸浮培養物中生長。在重量匹配的約10周齡雌性NOD/SCID小鼠中實施5TGM1多發性骨髓瘤模型。將小鼠圈養于隔離籠中，并且任意提供高壓滅菌的食物和酸化水。通過尾靜脈靜脈內接種約200μl PBS中的5TGM1細胞(約6×10⁶個/10克體重)來誘(you)導彌散(san)性多發(fa)性骨(gu)髓瘤。

如下在體內遞送凋亡小體。將具有肝細胞癌和多發性骨髓瘤的異種移植腫瘤的小鼠隨機分為處理組和對照組。在腫瘤細胞接種約1周后，經由尾靜脈注射遞送單一劑量的凋亡小體(約3×10⁶個(ge)/10克體重)(治療組(zu))，并且PBS注射充當對照。

對于原位肝細胞癌的小鼠模型，經由尾靜脈向小鼠每月施用凋亡小體(約3×10⁶個/10克體重)。

如下評估凋亡小體的治療作用。在腫瘤接種后約4周，手術收獲肝細胞癌的異種移植腫瘤。通過下式測量腫瘤的體積來評估凋亡小體的治療作用：體積＝長度×寬度²×0.52。為了揭示有(you)或無凋(diao)亡小體處理的腫瘤的組織學，將(jiang)組織在約(yue)4％多聚甲醛中固定約(yue)48小時(shi)，并且隨后(hou)包埋(mai)于(yu)石蠟中用(yong)于(yu)蘇木精(Hematoxyin)-曙紅染色。

對(dui)于(yu)評估凋(diao)亡小體在多發性(xing)骨髓瘤模型中的治(zhi)療作(zuo)用，對(dui)不(bu)同組中的小鼠(shu)的8周存活率進行了比較。通過卡普蘭-邁耶存活法分析結果。

如下測定凋亡小體對腫瘤細胞的體內細胞毒性。將HepG2肝細胞癌細胞以約1×10⁵個細胞/孔的濃度接種在24孔板中。在細胞接種后約12小時，通過凋亡小體(約1×10⁶個凋(diao)亡(wang)小(xiao)體/孔)或PBS處理細胞(bao)(bao)，并(bing)且在細胞(bao)(bao)培養物中施(shi)用(yong)不同濃度的凋(diao)亡(wang)小(xiao)體以用(yong)于評價細胞(bao)(bao)毒(du)性(xing)。在凋(diao)亡(wang)小(xiao)體處理后(hou)約(yue)2天，通過自(zi)動細胞(bao)(bao)計(ji)數器(qi)(Bio-rad,Hercules,CA,USA)測定細胞(bao)(bao)存活，并(bing)且通過臺盼藍(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)染色排除死細胞(bao)(bao)。

腫(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)(de)凋亡(wang)(wang)處理的(de)(de)(de)結果(guo)(guo)如下。肌(ji)內(nei)接(jie)種(zhong)(zhong)HepG2細(xi)胞(bao)(bao)成(cheng)功地在(zai)NOD/SCID小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)產生(sheng)了腫(zhong)(zhong)瘤(liu)生(sheng)長(chang)。為(wei)了測(ce)試在(zai)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)模型(xing)中(zhong)的(de)(de)(de)治(zhi)療作用，將(jiang)凋亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)(ti)(ti)全身輸注到(dao)具有異種(zhong)(zhong)移植腫(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)。腫(zhong)(zhong)瘤(liu)體(ti)(ti)(ti)(ti)積測(ce)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)結果(guo)(guo)顯示，接(jie)受凋亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)(ti)(ti)處理的(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)的(de)(de)(de)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)顯著小(xiao)(xiao)(xiao)于無所述處理的(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)的(de)(de)(de)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(圖16A)。通過進行性腫(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)長(chang)填充了由(you)HepG2細(xi)胞(bao)(bao)產生(sheng)的(de)(de)(de)異種(zhong)(zhong)移植腫(zhong)(zhong)瘤(liu)，并(bing)且在(zai)凋亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)(ti)(ti)處理后(hou)，腫(zhong)(zhong)瘤(liu)被(bei)具有大面(mian)積壞死的(de)(de)(de)造血細(xi)胞(bao)(bao)浸(jin)潤(圖16B)。為(wei)了證實治(zhi)療作用，體(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)共(gong)培(pei)養測(ce)定表(biao)明(ming)了凋亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)(ti)(ti)對HepG2細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)明(ming)顯細(xi)胞(bao)(bao)毒(du)性，其呈劑量(liang)(liang)依(yi)賴性方式(圖17A)。全基因表(biao)達模式的(de)(de)(de)比較表(biao)明(ming)，在(zai)凋亡(wang)(wang)小(xiao)(xiao)(xiao)體(ti)(ti)(ti)(ti)處理后(hou)，腫(zhong)(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)經(jing)歷增強(qiang)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)(wang)和溶酶體(ti)(ti)(ti)(ti)功能(圖17B)。

在多發性骨髓瘤(liu)的小鼠模型中(zhong)，接受全身凋(diao)亡小體輸注的小鼠比(bi)對照小鼠存活顯著更長，從而表明所(suo)述治療有效地抑制疾(ji)病(bing)進展(圖18)。

實施例18.凋亡小體腸(chang)內輸注改善結腸(chang)炎。

如圖19中所示，凋亡小體(AB)輸注改善了DSS誘導的結腸炎。由于DSS輸注可在小鼠中誘導結腸炎，所以在DSS誘導后約3天腸內輸注約1×10⁷個AB或骨髓(sui)間(jian)充質干(gan)細胞(MSC)，并(bing)(bing)且(qie)在DDS誘導后(hou)(hou)約10天(tian)收獲樣品以評價AB的(de)(de)治(zhi)療(liao)作用，并(bing)(bing)使(shi)用MSC腸(chang)內(nei)輸注作為陽性對照(zhao)(圖19A)。在挽救體重方面凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)體處(chu)(chu)理(li)顯(xian)(xian)示(shi)出與MSC組(zu)(zu)相比(bi)的(de)(de)顯(xian)(xian)著(zhu)治(zhi)療(liao)作用(圖19B)。凋(diao)(diao)亡(wang)小(xiao)體處(chu)(chu)理(li)還顯(xian)(xian)示(shi)了結(jie)腸(chang)中(zhong)組(zu)(zu)織學活性指數(shu)的(de)(de)降低(圖19C)。與結(jie)腸(chang)炎(yan)組(zu)(zu)相比(bi)，AB處(chu)(chu)理(li)在結(jie)腸(chang)炎(yan)誘導后(hou)(hou)約10天(tian)在小(xiao)鼠(shu)中(zhong)顯(xian)(xian)示(shi)在降低Th1和(he)Th17細胞水平方面的(de)(de)顯(xian)(xian)著(zhu)作用(圖19D-E)。這(zhe)些實驗結(jie)果證明(ming)AB輸注可(ke)用作治(zhi)療(liao)免疫病癥(諸如結(jie)腸(chang)炎(yan))的(de)(de)新方法(fa)。

實施例(li)19.凋亡(wang)小(xiao)體輸注(zhu)改(gai)善傷口愈合。

如圖20A-C中所示，AB輸注改善小鼠耳打孔模型中的傷口愈合。將約5×10⁶個AB在(zai)耳(er)打(da)孔之前或之后輸注到(dao)小(xiao)鼠中(圖20A)。在(zai)耳(er)打(da)孔后約7天，當(dang)與未處理的(de)對照組(zu)相比時，AB處理組(zu)的(de)耳(er)孔面積顯著減小(xiao)(圖20B-C)。

還可進行和遵循本文所述的產品(諸如包含凋亡小(xiao)體的組(zu)(zu)合物)、其(qi)制備(bei)方法及(ji)其(qi)使用(yong)方法的任(ren)何組(zu)(zu)合。

已討論的(de)(de)部(bu)件(jian)、步驟(zou)、特(te)征、目的(de)(de)、益處和(he)優(you)點僅是說(shuo)明性的(de)(de)。其(qi)(qi)中(zhong)的(de)(de)任何(he)(he)一個或(huo)與其(qi)(qi)相關的(de)(de)討論均不(bu)意圖以任何(he)(he)方(fang)式(shi)限制保(bao)護范(fan)圍。還預(yu)期許多其(qi)(qi)他(ta)(ta)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)。這些其(qi)(qi)他(ta)(ta)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)包括具有更(geng)少的(de)(de)、另(ling)外的(de)(de)和(he)/或(huo)不(bu)同的(de)(de)部(bu)件(jian)、步驟(zou)、特(te)征、目的(de)(de)、益處和(he)優(you)點的(de)(de)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)。這些其(qi)(qi)他(ta)(ta)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)還包括將部(bu)件(jian)和(he)/或(huo)步驟(zou)不(bu)同地(di)布置和(he)/或(huo)排序的(de)(de)實(shi)(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)。

除非另外說(shuo)明，否則在本說(shuo)明書(shu)中(zhong)(包括在以(yi)下權利要求(qiu)書(shu)中(zhong))所(suo)闡述的(de)所(suo)有測(ce)量值、值、等級、位(wei)置、量值、大小及其他規范(fan)均為近似(si)的(de)，而不(bu)是準確的(de)。它們(men)(men)意圖具有合理的(de)范(fan)圍，這個(ge)范(fan)圍與(yu)它們(men)(men)相關的(de)功能(neng)一致(zhi)并(bing)且與(yu)它們(men)(men)所(suo)屬領域中(zhong)的(de)習慣一致(zhi)。

在本(ben)(ben)公開中提到(dao)的所(suo)有(you)文章、專利(li)、專利(li)申請和其他出版物以引用的方式(shi)并入本(ben)(ben)文。

在本公開中(zhong)，不定冠詞(ci)“一個”和短(duan)語“一個或(huo)多個”以(yi)及(ji)“至少(shao)一個”是(shi)同(tong)義的并且意思是(shi)“至少(shao)一個”。

諸如(ru)“第(di)一(yi)”和“第(di)二”等關系(xi)(xi)性術語僅(jin)僅(jin)可以用來將一(yi)個實(shi)(shi)體(ti)或動(dong)作與(yu)另(ling)一(yi)個實(shi)(shi)體(ti)或動(dong)作區(qu)分(fen)開，而沒(mei)有必要(yao)(yao)要(yao)(yao)求或暗示它(ta)們之(zhi)間的任何實(shi)(shi)際關系(xi)(xi)或順序。術語“包(bao)(bao)括(kuo)(comprises/comprising)”和其(qi)任何其(qi)他(ta)變型(xing)在結合說明書或權利(li)要(yao)(yao)求書中的要(yao)(yao)素(su)列表使用時意(yi)圖指示所述列表不是排(pai)他(ta)的并(bing)且可包(bao)(bao)括(kuo)其(qi)他(ta)要(yao)(yao)素(su)。類似(si)地，在沒(mei)有進一(yi)步約束(shu)的情況下，前面(mian)有“一(yi)個”的要(yao)(yao)素(su)并(bing)不排(pai)除存在相同類型(xing)的另(ling)外的要(yao)(yao)素(su)。

提(ti)供摘要(yao)(yao)來(lai)幫助讀者快速(su)確(que)定技術性公(gong)(gong)開(kai)的本(ben)質。應理解(jie)(jie)，所(suo)(suo)(suo)提(ti)交的摘要(yao)(yao)不是用來(lai)解(jie)(jie)釋或限制權(quan)(quan)利(li)要(yao)(yao)求(qiu)書(shu)的范圍或含(han)義。此外，在上文詳(xiang)細描述中(zhong)的各種特征(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)在各種實施方(fang)(fang)案(an)(an)中(zhong)被(bei)分組在一起以(yi)精簡本(ben)公(gong)(gong)開(kai)。這種公(gong)(gong)開(kai)的方(fang)(fang)法不應被(bei)解(jie)(jie)釋為需(xu)要(yao)(yao)所(suo)(suo)(suo)要(yao)(yao)求(qiu)保(bao)(bao)護的實施方(fang)(fang)案(an)(an)需(xu)要(yao)(yao)比每個權(quan)(quan)利(li)要(yao)(yao)求(qiu)中(zhong)所(suo)(suo)(suo)明確(que)表述的特征(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)更多的特征(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)。相反，如(ru)以(yi)下(xia)權(quan)(quan)利(li)要(yao)(yao)求(qiu)書(shu)所(suo)(suo)(suo)反映的，本(ben)發明的主題存在于單個所(suo)(suo)(suo)公(gong)(gong)開(kai)實施方(fang)(fang)案(an)(an)的少于所(suo)(suo)(suo)有特征(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)中(zhong)。因此，以(yi)下(xia)權(quan)(quan)利(li)要(yao)(yao)求(qiu)書(shu)因此并入詳(xiang)述中(zhong)，其中(zhong)每項權(quan)(quan)利(li)要(yao)(yao)求(qiu)自身可作為單獨要(yao)(yao)求(qiu)保(bao)(bao)護的主題。