專利名稱：：維持胚胎干細胞多能性的化合物的制作方法維持胚胎干細胞多能性的化合物相關專利的交叉參考發明領域本申請要求于2005年6月10日提交的臨時專利申請序號為60/689,359的美國申請的優先權。該申請的全部內容在這里被整體引入作為參考并用于所有目的。發明背景本發明涉及用于培養胚胎干細胞(ES)的方法和組合物。所述方法涉及在無血清條件下、在沒有飼養細胞和LIF時，在維持細胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES細胞生長。這些方法部分地促進胚胎干細胞生產中更好的一致性，提供了例如胚胎干細胞在再生醫學中實際應用的新途徑。發明背景胚胎干細胞4艮難維持培養，因為它們傾向于自發地分化(即，獲得特化的結構和/或功能特點)。干細胞分化是由于許多因素，包括生長因子、細胞外基質的分子和成分、環境應激源以及直接的細胞間相互作用造成的。保持在增殖、未分化階段的小鼠或人胚胎干細胞的逐代培養，是一個包括將細胞在補充了胎牛血清的生長培養基中和有時在未分裂細胞的詞養層上進行培養的多步驟的過程。如果向培養基中加入細胞因子一一白血病抑制因子(LIF),小鼠的胚胎干細胞可以在體外在沒有飼養細胞的情況下生長，但是其僅在中到高細胞密度下有效并且來自單細胞的集落形成需要血清或者飼養層的存在。另外，對于人類胚胎千細胞而言，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。本發明提供了在不使用LIF的無血清的培養條件下使用小分子使胚胎干細胞自我更新的方法。使用本發明的小分子來維持胚胎干細胞的多能性可使胚胎干細胞的生產有更好的一致性，提供了例如胚胎干細胞在再生醫學中實際應用的新途徑。發明概述本發明一方面提供了維持多能干細胞的方法，包括在a)基礎培養基;和b)式I的化合物及其N-氧化物衍生物、前體藥物衍生物、受保護的衍生物、單個異構體和異構體混合物、以及可藥用的鹽和溶劑化物(例如水合物)中使細胞生長的步驟<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R,選自氫、Cw烷基、Qs-6鏈烯基、Cwo芳基-C(M烷基、<:5_1()雜芳基-(:0.4烷基、Cwo環烷基-Co-4烷基和C3-K)雜環烷基-C(M烷基；其中R，的任何烷基或鏈烯基任選地被一到三個獨立地選自卣素、羥基、Cw烷基和-NR2R3的基團所取代；其中R,的任何芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基任選地被一到三個選自卣素、羥基、氰基、d-6烷基、d-6烷氧基、Cw鏈烯基、卣代烷基、鹵代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(0)NR2R3、-XNR2C(0)XOR2、-XNR2C(0)NR2R3、-XNR2XNR2R3、XC(0)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(=NR2)NR2R3、-XS(O)。2R4、-XNR2C(0)R2、-XNR2C(0)XNR2R3、-XNR2C(0)R4、-XC(0)R4、-XR4、-XC(0)OR3和-XS(0)o-2NR2R3的基團所取代；其中X是鍵或CL4亞烷基；R2和R3獨立地選自氫、d—6烷基和<:3.12環烷基；且R4是任選地一皮1到3個選自d—6烷基、—XNR2R3、—XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基團所取代的Cwo雜環烷基；其中X、R2和R3如上所述o發明詳述定義"烷基"作為一個基團和作為其它基團例如囟代烷基和烷氧基的結構元素，可以是直鏈或支鏈的。Cw烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卣代烷基包括三氟曱基、五氟乙基等。"芳基，，是指包含6到IO個碳原子的單環或稠合的二環芳環。例如，芳基可以是苯基或萘基，優選苯基。"亞芳基"是指衍生自芳基基團的二價基團。"雜芳基，，被定義為其中一個或多個環原子是雜原子的芳基。例如雜芳基包括吡咬基、吲哚基、p引哇基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并1，3二氧雜環戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧咬基、呋喃基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。"環烷基"是指包含指定環原子數的飽和或部分不飽和的、單環、稠合二環或橋接的多環環系統。例如，QMo環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。雜環烷基是指如本申請中所定義的環烷基，條件是一個或多個所述環碳被選自-O-、-N=、-NR-、-C(O)-、-S-、-8(0)-或-8(0)2-的部分所替代，其中R是氫、Cw烷基或氮保護基團。例如，在本申請中用于描述本發明化合物的C3-8雜環烷基包括嗎啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌咬基、哌啶酮、2-氧代-吡咯-l-基、1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5〗癸-8-基等。"卣素"(或鹵代)優選表示氯或氟，但也可以是溴或碘。"治療"是指減輕或緩解疾病和/或其伴隨癥狀的方法。優選的實施方案的說明本發明涉及培養ES細胞的方法和組合物。所述方法涉及在沒有飼養細胞和LIF的無血清條件下，在維持該細胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES細胞生長。在一個實施方案中，關于式I的化合物Ri選自氫、Cw烷基、Cw鏈烯基、Cw()芳基-C()-4烷基、Cwo雜芳基-C(M烷基、C3.H)環烷基-C。.4烷基和C3.n)雜環烷基-Co.4烷基；其中R,的任何烷基或鏈烯基任選地被一至三個獨立地選自閨素、羥基、C"烷基和-NR2R3的基團所取代；其中R,的任何芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基任選地被一至三個選自鹵素、羥基、氰基、Cw烷基、d—6烷氧基、<:2.6鏈烯基、面代烷基、鹵代烷氧基、—XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0.2R3、—XC(0)NR2R3、—XNR2C(0)XOR2、-XNR2C(0)NR2R3、-XNR2XNR2R3、—XC(0)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、—XNR2C(=NR2)NR2R3、—XS(O)02R4、—XNR2C(0)R2、-XNR2C(0)XNR2R3、—XNR2C(0)R4、—XC(0)R4、—XR4、—XC(0)0R3和一XS(0)o-2NR2R3的基團取代;其中X是鍵或(^4亞烷基；R2和R3獨立地選自氫、d，6烷基和Cw2環烷基；且R4是任選地凈皮1至3個選自Cw烷基、—XNR2R3、—XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基團所取代的Cwo雜環烷基；其中X、R2和R3如上所述。在另一個實施方案中，R,選自氫、甲基、乙基、異丙基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、嘧淀基、3-羥基-l-甲基-丙基、羥基-乙基、苯基、嗎啉代、苯甲基1，2，4三唑-4-基、烯丙基、2-曱基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-乙基、哌溱基-乙基、哌喚基-丙基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、吡唑基、哌咬基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-甲基、嗎啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[l，2，4I三嗪-3-基、[1，3，4噻二唑基；其中任何芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基任選地被l至3個獨立地選自甲基、乙基、氰基、羥基、甲氧基、氨基-羰基-氨基、羥基-甲基、曱基-哌嗪基、曱基-哌溱基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌噪基-曱基、嗎啉代-磺酰基、曱基-旅喚基-磺酰基、甲基-哌嚷基-羰基-氨基、曱基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羥基-乙基、羥基-甲基-羰基-氨基、曱酰基-氨基、二甲基-氨基、二曱基-氨基-曱基、二曱基-氨基-乙基、異丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、曱基-氨基-乙基、嗎啉代-乙基、嗎啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟代、嗎啉代、二甲基-氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二曱氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-l-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基團所取代。本發明優選的化合物選自N-{3-[7-(2-乙基-2H-吡唑-3-基氨基)-l-甲基-2畫氧代-1，4-二氫-211-嘧啶并14，5-(1嘧啶-3-基1-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{4-曱基-3-[1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氫—2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基I-苯基)-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(2，6-二曱基-吡啶-4-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氫-211-嘧啶并[4，5-(1嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；1\-{3-[7-(3-羥基-苯基氨基)-1-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dj嘧啶-3-基卜4-甲基-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；？H3-[7-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l,4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基卜4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基卜4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-7-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧咬-3-基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-[4-曱基-3-(1-甲基-7-曱氨基-2-氧代-l,4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟曱基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟曱基-苯甲酰胺。另外優選的式I化合物詳見于以下實施例和表1。用途ES細胞來源于植入前的胚胎并保留了胎兒的生成細胞的發育潛能，能夠在體外和體內產生所有三個胚層的細胞和組織類型。ES細胞可被視為每次分裂時必須在自我更新(多能性)或可選擇的分化之間進行選擇的細胞。控制選擇分化路徑的信號由細胞微環境中的生長因子提供。生長因子可來自血清或由飼養細胞產生。鑒別這些生長因子和限定它們各自的輸入是了解由干細胞介導的組織增殖、轉化、修復的發育和生理學上調控的關鍵。而且，將這些知識擴展到控制離體干細^1的擴增和分化上可保持在再生醫學和生物制藥發明中的應用前景。小鼠ES細胞最初分離并聯合培養在有絲分裂失活的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上。成纖維細胞飼養層的必要功能是提供細胞因子一一白血病抑制因子(LIF)。LIF缺失的成纖維細胞在支持自我更新上是有缺陷的且LIF可取代小鼠ES細胞常規增殖與重新誘導中對飼養細胞的需求。LIF與連接gpl30受體的相關細胞因子提供了唯一的在分子水平上限定的維持小鼠ES細胞長期自我更新性的途徑，該ES細胞保留了未分化表型、多能性和胚胎增殖能力的基本特性。ES細胞可在添加LIF的商品化的血清代用品中增殖，但是這僅在中至高細胞密度時有效且從單細胞到集落形成需要血清或祠養層存在。而且，對于人ES細胞，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。本發明的方法支持了在無飼養細胞和LIF的無血清條件下培養多能干細胞。本發明的化合物通過它們與ERK1和RasGAP間的相互作用影響小鼠ES細胞的自我更新。例如，持續的ERK1/2活化導致神經元分化，同時抑制RasGAP可激活通過Ras或Ras類的GTP酶信號通路，其可依次通過P13K或其它信號通路增強自我更新。骨形態生成蛋白(BMP)作為包含在血清中的或由飼養層提供的因子也被涉及，其協同LIF在體外維持未分化的小鼠ES細胞。目前的研究表明BMP可通過激活Smad通路和誘導Id基因的表達而替代ES細胞培養中對血清和飼養細胞的需求，Id基因是一種Smad信號通路的共有靶點，其通過負調節堿性的螺旋-環_螺旋蛋白質阻斷分化。盡管BMP促進ES細胞的自我更新性的確切機制尚未確定，最近的研究表明它也可能抑制不依賴Smads的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。重要的是，對p38MAPK的抑制促進缺乏Alk-3(BMPRIA)的胚泡產生ES細胞，且ES細胞可以從缺乏Smad4(所有Smad的共同配偶體)的胚泡中產生，支持了BMP通過基于存在或不存在血清或飼養細胞的不同機制來起作用的假說。考慮到血清和飼養細胞提供細胞存活信號(其表現為生長因子與細胞因子)的可能性和外部的存活信號在低細胞密度環境中(此時來自自分泌和旁分泌因子的刺激作用最小)尤為重要，ES細胞在較差的培養條件下(即，在無血清和飼養細胞條件下)有可能出現細胞凋亡。在低細胞密度下，ES細胞很少產生多能性的集落。為分析單個細胞因子、生長因子以及其它分子對ES細胞自我更新和分化的作用，最好能夠保護細胞免于在無血清和無伺養細胞條件下細胞凋亡。雖然使用添加了N2和B27的培養基在無血清和無飼養條件下擴增ES細胞改善了生存力，并因此使其甚至在低細胞密度條件下存活，但LIF加上這些添加物仍不能支持ES細胞的自我更新，除非培養基更進一步地補充BMP。因為N2和B27添加物包含激素(皮質酮、黃體酮和T3)與視黃醇乙酸酯(視黃酸的前體)并且這些組分中的部分用于ES細胞分化方案，它們的存在使對單個細胞因子、生長因子以及其它分子對ES細胞自我更新和分化作用的分析復雜化。因此，開發在無血清培養條件下用于ES細胞自我更新的小分子，如本發明所述，將使ES細胞的生產具有更強的一致性，提供了在研究領域和再生醫學領域中的ES細胞實際應用的新途徑。另外，開發在無血清培養條件下用于ES細胞自我更新的小分子，如本發明所述，對于限定ES細胞培養環境從而提供自我更新或分化的信號輸入的限定和控制是必要的。多能性的機制也可有助于我們對腫瘤發生的理解(多能干細胞可在體內形成腫瘤，而且在"sternness"基因上的分子改變也可導致腫瘤)。此夕卜，有越來越多的證據表明干細胞與腫瘤細胞間的近親關系正常干細胞與腫瘤細胞自我更新的機制相似；涉及干細胞自我更新的發育信號通路的失控與腫瘤生成有關；腫瘤包括可能源自正常干細胞的"癌癥干細胞"。制備本發明化合物的方法本發明也包括制備本發明化合物的方法。在所述的反應中，保護活性官能團是必需的，例如羥基、氨基、亞氨基、硫代或羧基基團，在希望其存在于終產物的情況下，避免它們不必要地參與反應。常規的保護基團可以按照標準規程使用，例如，參見T.W.Greene和P.G.M.Wutsin"有機化學中的保護基團"，JohnWileyandSons,1991。式I化合物可按下述反應方案I的程序制備其中W如發明概述中式I所定義。式I化合物可通過4吏用合適的酰基活化劑(例如，HATU)在合適的堿(例如DIEA等)和適宜溶劑(例如，DMF)存在下將式2化合物與式3化合物偶合來制備，反應可能需3小時完成。式I化合物可按下述反應方案II的程序制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中A如發明概述中式I所定義。式I化合物可通過將式4化合物與合適的胺在不存在或存在適宜溶劑(例如，AcOH-水)的條件下反應來制備。式I化合物也可通過將式4化合z-c物與合適的胺在升高的溫度下于加有對-曱苯磺酸的合適溶劑(例如，l-丁醇)中進行反應來制備。或者，式I化合物可通過將式4化合物與式RiH的化合物按三種反應方法進行制備。對于雜芳基胺或芳基胺，反應在適當的催化劑(例如Pd(II)鹽等)與適當的溶劑(例如，1，4-二噍烷，或其類似物)存在下、在溫度約80至約150'C之間進行，可能需約20小時完成。烷基胺取代的反應條件包括在適當的溶劑(例如，DMSO、DMF等)中將式4化合物與5-10當量的胺進行加熱。對于式4化合物與芳基胺的縮合，這些反應在酸(例如TsOH、HOAc、HCl等)存在下于合適溶劑(例如DMSO、DMF、乙醇等)中進行。式I化合物合成的詳細實例可見于下文的實施例。制備本發明化合物的其它方法本發明的化合物可通過將游離堿形式的化合物與可藥用的無機或有機酸反應制備成可藥用的酸加成鹽。或者，本發明化合物的可藥用的堿加成鹽可通過將該化合物的游離酸形式與可藥用的無機或有機堿反應制備。或者，本發明化合物的鹽形式可用原料或中間體的鹽制備。本發明化合物的游離酸或游離堿形式可分別從相應的堿加成鹽或酸加成鹽制備。例如酸加成鹽形式的本發明化合物通過用適當的堿(例如，氫氧化銨溶液、氫氧化鈉，等等)處理可轉化為相應的游離堿。本發明化合物的堿加成鹽形式通過用適當的酸(例如，鹽酸等)處理可轉化為相應的游離酸。本發明化合物的非氧化形式可在0至80°C下于合適的惰性有機溶劑(例如乙腈、乙醇、二喁烷水溶液等)中通過用還原劑(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、氫硼化鋰、氫化硼鈉、三氯化磷、三溴化物，等等)處理本發明化合物的N-氧化物來制備。本發明化合物的前體藥物衍生物可通過本領域普通技術人員所知方法(例如，對于更多的細節可參見Saulnier等人(1994)，BioorganicandMedicinalChemistryLetters,Vol.4，p.1985)進行制備。例如，適宜的前體藥物可通過將非衍生的本發明的化合物與合適的氨基曱酰化試劑(例如，l，l-酰氧基烷基碳酰氯(l，l-acyloxyalkylcarbanochloridate)、對-硝基苯基碳酸酯，等等)反應來制備。本發明化合物受保護的衍生物可通過本領域普通技術人員所知方法進行制備。適用于產生和去除保護基團的技術的詳細說明可見于T.W.Greene,"有機化學中的保護基團"，第3版，JohnWileyandSons,Inc.,1999。如水合物)。本發明化合物的水合物可通過從水/有機溶劑混合物中重結晶來方便地制備，所用有機溶劑如二悉英、四氫呋喃或曱醇。反應形成一對非對映異構的化合物、分離該非對映異構體并且回收光學純的對映異構體體制備成其單個立體異構體。當對映異構體的拆分可使用本發明化合物的共價非對映異構體衍生物來實現時，優選易分離的混合物(例如，結晶的非對映異構體的鹽)。非對映異構體具有不同的物理性質(例如熔點、沸點、溶解度、反應性等)并可通過利用這些差異而容易地分離。非對映異構體可通過色鐠，或優選地，通過基于溶解度差異的分離/拆分技術來分離。隨后通過任何不會導致消旋作用的操作方法將光學純的對映異構體與拆分試劑一起進行回收。適用于從其外消旋混合物中拆分立體異構體的4支術的更詳細i兌明可見于JeanJacques,AndreCollet,SamuelH.Wilen，"對映異構體，外消旋物和拆分"，JohnWileyAndSons,Inc.,1981.概括地說，式I化合物可通過下述方法進行制備，其包括(a)反應方案I和II的那些反應；和(b)任選地將本發明的化合物轉化為可藥用鹽；(c)任選地將本發明化合物的鹽形式轉化為非鹽形式；(d)任選地將本發明化合物的非氧化形式轉化為可藥用的N-氧化物；(e)任選地將本發明化合物的N-氧化物形式轉化為其非氧化形式；(f)任選地從本發明化合物異構體的混合物中拆分單個異構體；(g)任選地將本發明的非衍生化合物轉化為可藥用的前體藥物衍生物；和(h)任選地將本發明化合物的前體藥物衍生物轉化為其非衍生形式。在沒有明確描述原料的制備的情況下，所述化合物為已知或可通過本領域類似的已知方法或如下文實施例中所公開的方法進行制備。本領域的技術人員應當理解上述轉化僅僅是本發明化合物制備方法的代表，可類似地使用其它熟知方法。通過下述實例進一步例證本發明的式I化合物的制備(實施例)，但并不限制本發明的范圍。實施例1N誦(3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯曱酰胺將5-溴-2，4-二氯-嘧啶(2.41g，10.6mmol)在約-20。C下用甲胺(8M在乙醇中，3.3mL)在四氫呋喃(15mL)中緩慢地進行處理。在約-20。C下攪拌30分鐘后，將反應混合物分配在CHCl3和飽和NaHC03之間。水層用另外的CHCl3萃取兩次并將合并的有機層用MgS04干燥，過濾和濃縮。粗產物經柱色鐠法(Si02，乙酸乙酯/己烷=3/7)純化以得到1.76g(75。/o)白色固體狀的(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺。將(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺(3.75g，16.9mmo1)、三(二苯亞甲基丙酮)二把(0)(388mg，0.4mmol)和三-2-呋喃基膦(777mg，3.3mmol)在DMF中的混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后加入三丁基乙烯基錫(5.93mL,實施例20.3mmol)。在大約65"C攪拌16小時后，將反應混合物冷卻至室溫并與10%氟化鉀水溶液(800mL)和乙醚(600mL)—起攪拌1小時，之后通過一層Celite過濾。用另外一部分乙醚(200mL)沖洗Celite。分離水層并用CHC13萃取。合并的有機萃取物用MgS04干燥并減壓濃縮以產生粗的油狀物，其通過快速柱色i普(Si02,乙酸乙酯/己烷=1/4)純化以提供白色固體狀的(2-氯-5誦乙烯基-嗜啶-4-基)-曱胺(2.63g，92%)。將(2-氯-5-乙烯基-嘧啶-4-基)-甲胺(2,50g，14.7mmol)在CHCl3/MeOH(15mL/15mL)中的溶液用臭氧鼓泡30分鐘，然后在-78'C下通過氬氣流3分鐘。使反應混合物加溫至室溫并用二甲基硫醚(3.24mL，44.1mmol)處理。反應混合物減壓濃縮得到無色油，其通過快速柱色譜(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/3)經硅膠純化得到白色固體狀的2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-曱醛(2.40g，95%)。將2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-曱醛(1.08g,6.3mmol)和7V-(3-氨基-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基苯甲酰胺(2.04g，6.9mmol)在甲醇(70mL)中的溶液在45。C下攪拌2小時，然后先后用氰基硼氫化鈉(1.19g，18.9mmol)和醋酸(1mL)處理。在室溫下攪拌2小時后，反應混合物用CHCl3稀釋并用飽和NaHC03洗滌。有機層用MgS04干燥并減壓濃縮。殘余物用快速柱色譜(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/2)純化得到白色固體狀的A43-[(2-氯-4-曱氨基嘧吱-5-基甲基)氨基j-4-曱基苯基l3-三氟曱基苯甲酰胺(1.80g，64%)。在O'C下向攪拌的A43-[(2-氯-4-甲氨基嘧啶-5-基甲基)氨基-4-甲基苯基)-3-三氟曱基苯曱酰胺(559mg，1.24mmol)和三乙胺(693jiL，4.97mmol)在四氫吹喃(15mL)的溶液中加入三光氣(147mg，0.49mmol)在四氫呋喃(5mL)中的溶液，并將混合物在室溫下攪拌30分鐘。濾出沉淀物并將濾液在110。C下攪拌3小時。然后將反應混合物用乙酸乙酯稀釋并用飽和NaHC03洗滌。有機層用MgS04干燥并在減壓下濃縮得到粗的油狀物，其通過快速柱色譜(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/2)純化得到白色固體狀的7V-[3-(7-氯-2-氧代一l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-曱苯基]-3-三氟曱基苯曱酰胺(420mg，71%)。將iV-[3-(7-氯-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基)-4-甲基苯基-3-三氟甲基苯甲酰胺(35.0mg，73.6mmol)和苯二胺(79.5mg，736mmo1)的混合物在IOO'C攪拌1小時。將混合物冷卻至室溫并混懸于甲醇中。收集沉淀物并用甲醇洗滌得到白色固體狀的A^3-[7-(3-氨基-苯氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基l-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基-苯曱酰胺(34mg,84%);&NMR400MHz(DMSO陽^j)69.22(s，1H),8.29(s，1H)，8.25(d,1H),8.10(s，1H)，7.95(d，1H)，7.78-7.76(m，2H)，7.62(dd，1H)，7.30(d，1H)，7.05(d，1H)，6.88(d,1H),6.87(s,1H),6.17(dd，1H)，4.92(s，2H)，4.67(d，1H)，4.49(d,1H)，3.33(s，3H),2.12(s，3H);MSm/z548.3(M+1)。實施例27V-[4-曱基-3-(1-甲基-7-曱氨基-2，4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟曱基-苯甲酰胺在0。C下將7NNH3(13.9mL)在曱醇中的溶液加入4-氯-2-曱硫基-5-嘧啶曱酸乙酯(4.50g，19.4mmol)在甲醇中的攪拌的溶液中，并將混合物在室溫攪拌2小時。反應混合物用乙酸乙酯稀釋并用飽和NaHC03溶液洗滌。有機層通過MgS04干燥，過濾和濃縮。粗產物從乙酸乙酯與己烷的混合溶劑中結晶得到2.90g(66%)白色固體狀的4-氨基-2-曱硫基-5-嘧啶甲酸乙酉旨。向攪拌的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸乙酯(2.79g，13.1mmol)的溶液中加入4NNaOH(3.9mL)并將混合物在60。C攪拌3小時。濃縮反應混合物可定量地得到鈉鹽形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸鹽。向鈉鹽形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸(1.28g，6.2mmol)、7V-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯曱酰胺(1.82g,6.2mmol)和DIEA(3.22mL，18.5mmol)在DMF的溶液中加入HATU(2.82g,7.42mmo1)，并將混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物用乙酸乙酯稀釋并用5%Na2S203的水溶液、飽和NaHC03的水溶液和鹽水洗滌。有機層通過MgS04干燥并減壓濃縮。粗產物從甲醇中結晶得到白色固體狀的4-氨基-2-曱硫基-嘧啶-5-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯曱酰基氨基)-苯基卜酰胺(l.79g，61%)。在0。C下向攪拌的4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-曱酸[2-甲基-5-(3-三氟曱基-苯甲酰基氨基)-苯基卜酰胺(286mg，0.62mmol)和二異丙基乙胺(864jiL，4.96mmol)在二嗜、烷(10mL)中的溶液中加入三光氣(184mg，0.62mmol)的二、嗯烷溶液(2mL)，并將混合物在100。C攪拌12小時。反應混合物用乙酸乙酯(50mL)稀釋，并用飽和NaHC03溶液洗滌。將有機層用MgS04干燥，過濾，減壓濃縮，從曱醇中結晶得到白色固體狀的iV-[4-甲基-3-(7-曱硫基-2，4-二氧代-1，4-二氫-211-嘧啶并4，5-(11嘧啶-3-基)-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺(166mg，55%)。在0°C下將7V-[4-曱基-3-(7-曱巰基-2，4-二氧-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧咬-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(218mg，0.45mmol)加入NaH(在礦物油中60%的分散液，19.7mg，0.49mmol)在DMF的混懸液中。當停止產生Bb時，加入碘曱烷(84ftl，1.35mmol)并將反應混合物在室溫下攪拌3小時。混合物用乙酸乙酯稀釋，并用5%的Na2S203水溶液洗滌以除去DMF。有機層用MgS04干燥并減壓濃縮。粗產物從曱醇中結晶得到白色固體狀的7V-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲硫基-2，4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧咬-3-基)-苯基]-3-三氟曱基-苯曱酰胺(184mg，82%)。將間氯過氧苯甲酸(最高77%，97mg，44mmol)加入攪拌的7V-[4-甲基-3-(l-甲基-7-甲硫基-2,4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dj嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟甲基-苯曱酰胺(184mg，0.37mmol)在DMF(4mL)和氯仿(4mL)的混合溶劑中的溶液中，并將混合物在室溫下攪拌1小時。混合物用氯仿稀釋，并用5%的Na2S203水溶液和飽和NaHC03溶液洗滌。有機層用MgS04干燥并減壓濃縮得到A43-(7-甲基亞磺酰基-l-甲基-2，4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基l-3-三氟曱基-苯甲酰胺(167mg，88%)。將Aq3-(7-甲基亞磺酰基-l-甲基-2，4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并4，5-d嘧咬-3-基)-4-曱基-苯基-3-三氟甲基-苯曱酰胺(30mg,58jimol)溶解于在四氫呋喃中的2M甲胺溶液(lmL)中，并將混合物在60。C攪拌1小時。將反應混合物濃縮，溶于DMSO中，并通過制備型LCMS純化得到A^4-曱基-3-(l-曱基-7-甲氨基-2，4-二氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基j-3-三氟曱基-苯甲酰胺(20mg，71%);&NMR400MHz(DMSO-^)S10.70(s，1H)，8.95(s，0.33H，8.85(s，0.66H),8.39(m,3H)，8.11(d，1H)，7.93(t，1H)，7.84(m，2H)，7.49(d，1H)，3.65(d，2H)，3.58(s，1H)，3.08(m，3H)，2.17(s，3H);MSw/z485.3(M+l)。通過重復上述實施例所描述的方法，使用適宜的原料，獲得了如表1所鑒定的以下的式I化合物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>結構式物理數據力畫R400MHz(DMSO-rf6)和/或MS(m/z)匪R400MHz(DMSO畫rf"89.64(s，lH)，9.60(d，lH)，8.29(s，lH)，8.21(d，1H),8.14(s，1H)，7.95(d，1H)，7.78(m，3H)，7.63(d，1H)，7.42(d，1H),7.31(d，1H)，7.20(t，1H)，6.77(d，lH)，4.68(d，lH)，4.53(d，lH)，3.35(s，3H)，2.97(s，3H)，2.13(s，3H);MSm/z626.3(M+l)。_醒R400MHz(DMSOO69.22(s，lH)，8,29(s,m)，8.25(d,1H)，8.10(s，1H),7.95(d，1H),7.78-7,76(m，2H)，7.62(dd，lH),7.30(d，1H)，7.05(d，1H)，6.88(d，1H)，6.87(s，1H)，6.17(dd，m)，4.92(s，2H)，4.67(d，1H)，4.49(d，1H)，3.33(s，3H)，2.12(s，3H);MSwa/z548.3(M+1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>使用飼養細胞依賴性的小鼠ES細胞系(其使用Oct4-GFP報告基因結構進行了基因工程操作并在未分化的多能性階段表達綠色熒光蛋白(GFP)),對化合物在無飼養細胞和LIF條件下維持ES細胞未分化狀態的能力進行篩選。本發明化合物在不需要LIF和飼養細胞下維持了小鼠ES細胞超過10次傳代的未分化狀態。多能ES細胞表達Oct4、Nanog、ALP、SSEA-1并形成致密的集落。通it^^:的集落與扁平的和/或鵝卵石樣細胞的存在來指示分化。通過本發明化合物擴增的小鼠ES細胞保留了多潛能細胞的多種標記物，包括Oct-4、nanog、SSEA-1和ALP,可在體外分化為功能性的神經元和心肌細胞并且可在體內供給健康的嵌合體小鼠。通過所述的TOPflash報告基因檢測法還發現本發明化合物不能激活Wnt通路,而且通過免疫印跡法發現其不能激活JAK-STAT通路。'H匪R400MHz(DMSO-A)S10.51(s，lH)，9.43(s，lH)，9.22(s，lH)，8.29(s，1H)，8，25(d,1H)，8.12(s，1H)，7.96(d,1H),7.80-7.77(m，2H)，7.62(dd，lH)，7.297.31(m，2H)，7.13(d，lH),7.02(t，lH)，6.34(d,1H)，4.68(d，lH),4.51(d，lH)，3.34(s，3H),2.12(s，3H);MSm/z549.2(M+l)'維持小鼠胚胎干細胞(mES)的自我更新在涂覆了明膠的細胞培養板上在GM中用伺養細胞維持小鼠ES細胞。小鼠ES細胞每三天用0.05Q/。胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)傳代。最佳分傳比是l:6。維持ES細胞及下文所述實施例4和5所用的材料包括Oct4-GFPmES細胞(飼養層依賴性的細胞)；mESRl細胞(非飼養層依賴性的細胞)；DMEM(GIBCO，11965-084);用于基因敲除的DMEM(KODMEM)(GIBCO,10829-018);DMEM/F12(GIBCO，11330-032);胎牛血清(FBS)(GIBCO，26140-079);用于基因敲除的血清替代品(KO-SR)，(GIBCO，10828-028);B-27無血清添加劑(50X)，(GIBCO17504-044);N-2添加劑(100X)(GIBCO，17502-048);LIF(106個單位)(Chemicon，ESG1106);L畫谷氨酰胺(GIBCO，25030-081);非必需氨基酸(GIBCO，11140-050);2-巰基乙醇(1000X),(GIBCO，21985-023);0.05%胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，25300-054);0.1%明膠溶液(Stemcelltech.，07903);基礎培養基(BM):KODMEM、15%KO-SR、IXL-谷氨酰胺、1X非必須氨基酸、IX2-巰基乙醇；以及生長培養基(GM):基礎培養基+103單位的LIF。鑒定本發明化合物的篩選方法384孔板在37'C下用0.1%明膠溶液涂覆過夜。吸去明膠溶液。將Oct4-GFP小鼠ES(祠養層依賴性的)細胞在涂覆過明膠的板子上以1000個細胞/50nlGM/孔接種。培養過夜后，將培養基更換為BM并將5pM的化合物加入各孔。培養3天后，更換培養基并再次添加化合物。再過3天后，固定細胞并用熒光成像讀板系統(FLIPR)進行檢測。其中細胞保持GFP表達的孔被選為基礎采樣信號。基礎采樣信號經小鼠ES細胞集落形態學進行進一步驗證。使用這種方法，確認本發明化合物可在無飼養層條件下維持小鼠ES細胞的自我更新。實施例3小鼠ES細胞在分化培養基O)M)中保持多能性。通過視黃酸(RA)誘導的DM:BM+0.3|iiMRA，通過FBS裔導的DM:DMEM、20%FBS。將96孔板在37tl下用0.1%的明膠溶液涂覆過夜。吸去明膠溶液。將小鼠ES細胞在涂覆過明膠的板上以104個細胞/50^11GM/孔接種。培養過夜后，將培養基更換為DM并將3|iiM的本發明化合物加入各孔。培養三天后，將培養基更換為新鮮的培養基和化合物。再培養3天后，固定細胞并利用多能性標記的表達和集落形態學進行檢測。有效濃度通過GFP表達的維持和集落形態學進行測定。本發明不同化合物的有效濃度的列表^^開于下表3。實施例4無飼養層的多次傳代的培養條件將六孔板用每孔0.1%的明膠lml涂覆并在37。C下孵育過夜。在除去明膠溶液后，小鼠ES細胞在每孔中以2xl05個細胞/2ml培養基進行接種。細胞每三天用0，05。/o胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)傳代。最佳分傳比依賴于不同的培養基(表2)。表2顯示了不同的無祠養層培養條件的實例，其中本發明化合物是N-{4-甲基-3-[1-曱基-7-(2-曱基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4,5-d嘧啶-3-基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(化合物213，表l)。表2:不同的無伺養層的培養條件<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>應當理解，實施例和本文所述的實施方案僅用于說明性的目的，在此基礎上，本領域技術人員可以進行各種修飾或改變并且這些修飾和改變包含于本申請的主旨和范圍以及所附權利要求的范圍之內。所有在此處引用的公開物、專利和專利申請均引入本文作為參考。權利要求1.一種維持多能干細胞的方法，其包括在a)基礎培養基；和b)式I的化合物及其可藥用鹽、水合物、溶劑合物和異構體中使細胞生長的步驟其中R1選自氫、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10雜芳基-C0-4烷基、C3-10環烷基-C0-4烷基和C3-10雜環烷基-C0-4烷基；其中R1的任何烷基或鏈烯基可任選地被一到三個獨立地選自鹵素、羥基、C1-6烷基和-NR2R3的基團所取代；其中R1的任何芳基、雜芳基、環烷基或雜環烷基可任選地被一到三個選自鹵素、羥基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6鏈烯基、鹵代烷基、鹵代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(O)NR2R3、-XNR2C(O)XOR2、-XNR2C(O)NR2R3、-XNR2XNR2R3、-XC(O)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(＝NR2)NR2R3、-XS(O)0-2R4、-XNR2C(O)R2、-XNR2C(O)XNR2R3、-XNR2C(O)R4、-XC(O)R4、-XR4、-XC(O)OR3和-XS(O)0-2NR2R3的基團所取代；其中X是鍵或C1-4亞烷基；R2和R3獨立地選自氫、C1-6烷基和C3-12環烷基；且R4任選地被1到3個選自C1-6烷基、-XNR2R3、-XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基團所取代的C3-10雜環烷基；其中X、R2和R3如上所述。2.如權利要求l所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。3.如權利要求l所述的方法，其中所述細胞是人胚胎干細胞。4.如權利要求4所述的化合物，其中A選自氫、甲基、乙基、異丙基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、嘧t基、3-羥基-l-甲基-丙基、羥基-乙基、苯基、嗎啉代、苯甲基、[1，2，41三唑-4-基、烯丙基、2-甲基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-乙基、哌溱基-乙基、哌溱基-丙基、噻唑基、噁唑基、吡咬基、吡唑基、哌咬基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-曱基、嗎啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[l，2，4j三嗪-3-基、[1，3，4噻二唑基；其中任何芳基、雜芳基、環烷基或雜環坑基任選地被1至3個獨立地選自甲基、乙基、氰基、羥基、曱氧基、氨基-羰基-氨基、羥基-甲基、曱基-哌溱基、甲基-哌溱基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-曱基、嗎啉代-磺酰基、甲基-哌嗪基-磺酰基、甲基-旅，秦基-羰基-氨基、曱基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羥基-乙基、羥基-甲基-羰基-氨基、曱酰基-氨基、二甲基-氨基、二甲基-氨基-曱基、二曱基-氨基-乙基、異丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、曱基-氨基-乙基、嗎啉代-乙基、嗎啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟、嗎啉代、二甲基曙氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二曱氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-l-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基團所取代。5.如權利要求4所述的化合物，其選自]\-{3-[7-(2-乙基-211-處峻-3-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基I-4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-{4-曱基-3-1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基-苯基卜3-三氟甲基-苯曱酰胺；N-(3-[7-(2，6-二甲基-吡啶-4-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-(1嘧啶-3-基1-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯曱酰胺；N-(3-[7-(3-羥基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基卜4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-P-[7-(3-氨基-苯基氨基)小曱基-2-氧代-1，4-二氫-2H-嘧啶并[4,5-d嘧啶-3-基-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基-苯曱酰胺；N-{3-7-(3-曱磺酰基氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基-4-甲基-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(2，5-二甲基-211-吡唑-3-基氨基)-1-曱基-2-氧代-1，4-二氫-211-嘧啶并[4，5-^嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲基氨基-2-氧代-l,4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基)-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-l-曱基-2-氧代-l，4-二氫-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-曱基-苯基-3-三氟甲基-苯甲酰胺。全文摘要本發明涉及用于培養胚胎干細胞(ES)的方法和組合物。所述方法涉及在無血清條件下、在沒有飼養細胞和LIF時，在維持細胞的多能性/自我更新的式(I)的小分子存在下使ES細胞生長。這些方法部分地促進胚胎干細胞生產中更好的一致性，提供了例如胚胎干細胞在再生醫學中實際應用的新途徑。文檔編號C07D487/04GK101238129SQ200680028606公開日2008年8月6日申請日期2006年6月8日優先權日2005年6月10日發明者P·G·舒爾茨,勝丁,鳳閆,陳水冰申請人:Irm責任有限公司;斯克里普斯研究所