專利名稱：人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，特別是涉及到研究人腸道病毒71型疫苗的方法。
背景技術：
人腸道病毒71型(EV71)于1969年首次被分離鑒定，是手足口病的病原體之一。 該病毒主要感染5歲以下兒童，主要導致手足口病及皰疹性咽峽炎，少數情況下的并發癥 包括腦膜炎，肺水腫，出血等，嚴重病例可導致死亡。人腸道病毒71型曾引起世界范圍內的 多次疾病暴發流行，上世紀80年代以來，人腸道病毒71型引發的手足口病在亞太地區肆 虐，引發了嚴重的嬰幼兒死亡病例。我國自1981年在上海發現本病，以后各個省市均有報道。2009年3月全國通過傳 染病網絡直報系統報告的手足口病病例是54713例，死亡31例。從今年年初到4月7號， 網絡直報顯示，全國累計報告手足口病例115618例，其中重癥773例，死亡50例。人腸道病毒71型多肽鏈全長2，193個氨基酸，在體內合成后切割成11個蛋白，包 括VP1，VP2, VP3, VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。目前該病的治療尚無有效地藥物，而研制安全而具有良好保護性能的疫苗，被認 為是防御EV71病毒感染的有效方法。目前報道的疫苗主要是使用滅活或減毒的全病毒，或 者全病毒的結構類似物，此類疫苗在小鼠模型中均能給與幼鼠良好的抗病毒保護作用。此 外，VPl蛋白被普遍認為集中了優勢的抗原決定簇，該蛋白被用作亞單位疫苗時，也能在體 外表現出較好的保護效果，但是體內試驗并不理想。但是，日本學者用減毒的全病毒疫苗免疫實驗猴時，動物仍表現出一定的神經癥 狀，使人們對于全病毒疫苗的安全性提出了懷疑。此前，我們發現了 EV71病毒與人腦組織存在免疫交叉，并發現了引發這種免疫交 叉的區域，據此，我們進一步設計了剔除強交叉區域的混合亞單位疫苗。

發明內容
鑒于以上需要，本發明的主要目的在于提供一種無潛在毒副反應的人腸道病毒71 型(EV71)的亞單位混合疫苗。本發明提供的人腸道病毒71型(EV71)的亞單位混合疫苗，其包括下述屬于人腸 道病毒71型多肽鏈的多肽中的一個或多個的任意組合，以及必要的佐劑，所述多肽分別為
ppppppppPPPP
r1-69‘ r70-159' r140-249' r324-443‘ r444-565' r566-665' r746-876‘ r1197-1338' r1441-1526' r1549-1668' r1649-1731 ' r 1732-1851 '
Pl952-2071 'P2072-2193' P1843-1951，所述下標數字代表所述多肽在EV7 1多肽鏈中的位置，從多肽鏈N 端起始。所述人腸道病毒71型可以是任何一種人腸道病毒71型毒株；以上述15個多肽中任何一個或者多個的組合為母版，可以添加或刪除少于或等 于50個屬于EV71多肽鏈的序列；以上述15個多肽中任何一個或者多個的組合為母版，可以添加或刪除任何不屬于EV71多肽鏈編碼區的序列；所述多肽通過以下方法篩選a.人腸道病毒71型多肽鏈的分割和工程表達將人腸道病毒71型多肽鏈分割成由22 156個氨基酸組成的多肽，共22個，分 別在大腸桿菌中表達，使用6XHis tag標簽進行純化；b.人腸道病毒71型多肽鏈的分割多肽抗原性的確定將純化的蛋白對實驗動物進行免疫，獲得的抗血清分別與健康成年人和胎兒的腦 組織進行免疫組化試驗，鑒定能與正常腦組織發生交叉反應的抗血清，確定與人體存在強 交叉免疫原區域的人腸道病毒71型多肽；確定與人體存在弱交叉免疫原區域的人腸道病 毒71型多肽；確定與人體不存在交叉免疫原區域的人腸道病毒71型多肽。上述步驟a中，將EV71病毒的多肽鏈進行順序分割，將2193個氨基酸從N端依次 分割成22 156個氨基酸構成的多肽，共22個，絕大多數多肽的分子量在IOkDa左右；上述步驟a中，相鄰并且同屬于一個蛋白的兩個多肽之間存在4 19個氨基酸的 重疊，避免了抗原決定簇的篩選遺漏；上述步驟a中，多肽的N端與6XHis tag標簽進行融合表達，因為6XHis tag蛋 白標簽不會對多肽的抗原性產生明顯影響，同時有利于多肽的純化；上述步驟b中，P23Q_323，P646_755，P857_1Q12，P1329_144q4種多肽與人體抗原的交叉反應結 果為強陽性，下標數字表示在多肽在總病毒中多肽鏈上的位置，從N端起始，它們分別屬于 人腸道病毒 71 型中的 VP2，VP1，2A，2C 蛋白 ，P324_443，P444_565，P566_665，P746_876，P1441_1526，
Pl549-1668，Pl732-1851， 1952"2071' ^2012-219^^ 種多肽與人體抗原的交叉反應結果為弱陽性，它們分
別屬于人腸道病毒 71 型中的 VP4，VP3，VP1，3A，3C 以及 3D 蛋白；P7(1_159，P14ch249，P1197^1338, P1649-I73I' P1843-19515種多肽與人體抗原不存在交叉反應，它們分別屬于人腸道病毒71型中的 VP2，2C，3C以及3D蛋白。將上述15個多肽中的一個或者多個的組合進行等量，組成亞單位混合疫苗，進行 效果驗證疫苗對雌性小鼠進行免疫，測定了小鼠血清的抗體滴度，中和效價和與人腦組織 的交叉反應。免疫后的雌鼠進行交配，母源抗體可以通過胎盤屏障進入到幼鼠體內，對幼鼠 進行病毒攻擊后，通過測定幼鼠組織中病毒數量變化和病理表現，證明該疫苗具有良好保 護性能。疫苗對雌性小鼠進行兩次免疫后，病毒中和效價達到26以上。對免疫后雌鼠產下 的幼鼠攻毒后，母源抗體可以有效的清除幼鼠體內的病毒，7日后肌肉組織內病毒含量接近 于零，且在5日內可以有效的清除75%以上幼鼠組織內的病毒，7日內可以有效的清除全部 幼鼠組織內病毒，保護率接近100%。病理觀察發現幼鼠的組織沒有明顯的病理變化。綜上所述，本發明提供的所述人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，可以在體內外 起到抗病毒感染的保護作用，是具有潛在臨床應用價值的備選疫苗。
具體實施例方式以下結合具體實施方案對本發明作進一步詳細說明，但不作對其的限定實施例1
多肽的篩選步驟一人腸道病毒71型的分割和工程表達分割所采用的菌株名稱為Fuyang-0805a，其NCBI中存儲號為⑶350629。該菌株 的基因組CDS區共6582bp，編碼2193個氨基酸，分割多肽的大小控制在100個氨基酸(aa) 左右，下限為22aa，上限為156aa，位于同一個蛋白內的相鄰兩個多肽間存在4 15aa的重 疊，如表1。表1人腸道病毒71型的分割方式多肽名稱 所屬蛋白多肽編碼區在人腸道病毒
71型基因組編碼區中的位
置
P1-69VP41-207P70-159VP2208-477P140-249VP2418-747P230-323VP2688-969P324-443VP3970-1329P444-565VP31330-1695P566-665VPl1696-1995P646-755VPl1936-2265P746-876VPl2236-2628P857-10122A2569-3036Pl013-llll2B3037-3333Plll2-12012C3334-3603Pll97-13382C3589-4014Pl329-14402C3985-4320Pl441-15263A4321-4578Pl527-15483B4579-4644Pl549-16683C4645-5004Pl649-17313C4945-5193Pl732-18513D5194-5553P]843-19513D5527-5853P1952-20713D5854-6213P2072-21933D6214-6582擴增多肽編碼區的引物兩端添加NdeI和SacI位點，表達載體使用改造過的 pET28a(+)表達載體，該載體經過修改后，所表達目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白標簽 外，不含有多余的氨基酸序列。構建成功的表達載體轉入Escherichia coli BL21(DE3)中，用0. 5mM IPTG誘導 多肽表達。多肽表達用SDS-PAGE檢測，結果顯示除PKum^Pnf^mH^三個多肽表達 失敗外，其余多肽皆成功表達。
6
步驟二分割多肽的純化多肽以不可溶的包涵體形式表達，純化的包涵體使用8M尿素溶解，隨后使用 Novagen公司的Ni-HTA進行親和層析純化，純化后多肽純度達到95%以上。步驟三確定與人體抗原存在交叉免疫原的多肽純化后的多肽對ICR小鼠免疫，獲得的抗血清分別與健康成年人和胎兒的腦組織 進行免疫組化試驗，確定人體抗原的交叉免疫原。抗血清稀釋倍數為1 200，二抗為購自中山公司的HRP標記的山羊抗小鼠的二 抗，顯色底物為DAB，隨后用光學顯微鏡觀察試驗結果。結果表明，與人體抗原的交叉反應 為強陽性的包括EV71總病毒，以及P23tH323，P
646-755， 857-1012'卩1329-144C)4 f 巾· Ιλ。“
的交叉反應為弱陽性的包括P1
-69
P,
P,
P,
P,
Pl441-1526，P’
P1
1952-2071，
P2Q72-2193IO種多肽。與人體抗原的不存在交叉反應的為 fVo-159，Pl40-249，P
1197-1338'
P
P
1649—1731， r1843-1951
…種多肽<
實施例2 疫苗的檢測
將上述所得的15種弱交叉反應或無交叉反應的多肽組成18種組合，如表2所述 表218種多肽的組合
權利要求
一種人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，包括下述屬于人腸道病毒71型多肽鏈的多肽中的一個或多個的任意組合，以及必要的佐劑，所述多肽分別為P1 69，P70 159，P140 249，P324 443，P444 565，P566 665，P746 876，P1197 1338，P1441 1526，P1549 1668，P1649 1731，P1732 1851，P1843 1951，P1952 2071，P2072 2193，所述下標數字代表所述多肽在EV71多肽鏈中的位置，從多肽鏈N端起始。
2.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，所述人腸 道病毒71型選自于任何一種人腸道病毒71型毒株。
3.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，以上述15 個多肽中任何一個或者多個的組合為母版，再添加少于或等于50個屬于EV71多肽鏈的序 列。
4.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，以上述15 個多肽中任何一個或者多個的組合為母版，再刪除少于或等于50個屬于EV71多肽鏈的序 列。
5.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，以上述15 個多肽中任何一個或者多個的組合為母版，再添加任何不屬于EV71多肽鏈編碼區的序列。
6.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，優選包括P746-876，Pll97-1338，Pl843-1951，P2072-2193^ ^^$5^。
7.根據權利要求1所述的人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，其特征在于，優選包括卩70-159' Pl40-249' P324-443' Ρ746-87θ4 個多月太°
全文摘要
本發明屬于生物醫學領域，提供一種人腸道病毒71型的亞單位混合疫苗，包括下述屬于人腸道病毒71型多肽鏈的多肽中的一個或多個的任意組合，以及必要的佐劑，所述多肽分別為P1-69，P70-159，P140-249，P324-443，P444-565，P566-665，P746-876，P1197-1338，P1441-1526，P1549-1668，P1649-1731，P1732-1851，P1952-2071，P2072-2193，P1843-1951，該疫苗無潛在毒副反應，可以在體內外起到抗病毒感染的保護作用，是具有潛在臨床應用價值的備選疫苗。
文檔編號A61K39/125GK101947316SQ201010105060
公開日2011年1月19日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者劉江寧, 張連峰, 王衛, 秦川 申請人:中國醫學科學院實驗動物研究所