專利名稱：：細胞生長因子治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞生長因子預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的應用，特別是涉及肝細胞生長因子在基因預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性皮膚潰瘍及肺纖維化疾病中的應用，還涉及角質細胞生長因子在基因預防和/或治療潰瘍性疾病及肺纖維化疾病中的應用。
背景技術：
：皮膚急性創傷一般均能自愈，應用藥物或生長因子等措施可使之加速愈合。但對于因各種原因例如血管性疾病、糖尿病、長期局部壓迫等所致的慢性創傷，則由于此類創面與急性創面無論血管供應或創面組織結構二者大相徑庭，因此甚難愈合，各種措施亦多未能見效，以致慢性潰瘍經久不愈，進而嚴重影響患者的生活質量，甚至危及生命。另外，潰瘍性結腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是一種慢性潰瘍性疾病，是世界衛生組織公認的臨床難治性疾病，亦是結腸腫瘤發生的主要危險因子之一，其發病率近年來呈逐年增高趨勢。因此，治療慢性潰瘍是目前醫學中的一大難題，同時又是極需解決的難題。雖然關于血管生長因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(H印atocyteGrowthFactor,HGF)可促進急性傷口的愈合文獻早已多有報導，但因急慢性創面的組織結構，諸多生物成分的功能改變很大，故它們對慢性皮膚潰瘍的作用則很有爭議，PufeT等認為慢性潰瘍組織尚缺乏其他生長因子，故VEGF亦無法發揮其作用(PufeT，PaulsenFwtal:JPathol.2003;200(1):130-6，Theangiogenicpeptidevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)isexpressedinchronicsacralpressureulcers.)。NayariF等更明石角報導慢性皮膚潰瘍情況下，內源性HGF并無效果，歸咎于其無生物活性之故(NayariF，OlsonHetal:J.Dermatol.Sci.2005;37(2):75-85，Hepatocytegrowthfactor;expression，concentrationandbiologicalactivityinchroniclegulcers)。因此，應用生長因子基因預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎的措施未有探索。肺纖維化是另一類慢性嚴重危害人類健康的呼吸系統疾病。其病因、發病機制復雜，也缺乏理想的防治方法，也是一個急需解決的難題。肺纖維化疾病包含的種類頗多，如原因不明肺纖維化疾病(特發性肺纖維化，idiopathicpulmonaryfibrosis)、反復感染引起的肺纖維化疾病、輻射引起的肺纖維化疾病、或塵埃引起的肺纖維化疾病(塵肺病，pneumoconiosis)等。曾有報道(LongX，XiongSDetal.ChinMedJ，2007，120(16):1432—1437.Effectofintramuscularinjectionofh印atocytegrowthfactorplasmidDNAwithelectroporationonbleomycin-inducedlungfibrosisinrats)應用基因重組質粒防治肺纖維化得到一定效果，由于其為電擊肌肉注射，表明效率尚低，而且肌肉注射后分泌HGF進入血流，則可分布各個組織，此可能引起誘發腫瘤的危險性，難以在實踐中應用。此外，還有塵埃引起的肺纖維化疾病，因其發病機制不同，尚未見應用基因治療的報道。因此，尋找潰瘍性疾病及肺纖維化疾病的新治療方法，仍是本領域技術人員努力探索的研究課題。
發明內容本發明人發現肝細胞生長因子(H印atocyteGrowthFactor,HGF)對于潰瘍性疾病具有甚為良好的治療效果。具體地說，本發明發現攜帶人肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的制劑可局部應用以轉染肝細胞生長因子基因到組織細胞，得以產生HGF蛋白，從而對于潰瘍性疾病特別是慢性皮膚潰瘍可起到良好的治療效果。此外，本發明通過肺纖維化動物試驗，并應用SPH(攜帶HGF基因真核表達質粒的減毒沙門氏菌菌株)直接灌入肺內的方法，取得了治療肺纖維化的實效。此外，本發明還發現，角質細胞生長因子(KeratinocyteGrowthFactor,KGF)在潰瘍性疾病特別是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎的預防、治療和抗復發方面均有效果，并且無誘發腫瘤風險。此外，本發明還通過局部應用攜帶KGF基因真核表達質粒的減毒沙門氏菌菌株(在本文可縮寫為SPK)治療動物肺纖維化模型，取得了預防和/或治療肺纖維化的實際效果。本發明基于以上發現而得以完成。發明概述概述地說，本發明提供了細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和/或肺纖維化疾病的藥物中的用途。根據本發明的上述用途，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子(在下文中，可縮寫為HGF)和角質細胞生長因子(在下文中，可縮寫為KGF)。根據本發明的上述用途，其為細胞生長因子在制備用于基因預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的藥物中的用途。根據本發明的上述用途，所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎例如頑固性潰瘍性結腸炎。進一步地，本發明提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的細胞生長因子和任選的藥學可接受的載體。根據本發明的上述藥物組合物，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。根據本發明的上述藥物組合物，所述的藥物組合物可用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病，特別是用于基因預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病。根據本發明的上述藥物組合物，所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎例如頑固性潰瘍性結腸炎。再進一步地，本發明提供了一種在需要的受試者中預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的細胞生長因子。根據本發明的上述方法，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。根據本發明的上述方法，所述的藥物組合物可用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病，特別是用于基因預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病。根據本發明的上述方法，所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎例如頑固性潰瘍性結腸炎。更概述地說本發明提供了以下項目1、細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和/或肺纖維化疾病的藥物中的用途。2、項目1的用途，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。3、項目2的用途，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用；和/或所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。4、項目2或3的用途，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子；和/或所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。5、項目1至4任一項的用途，其特征在于以下任意一項或多項i)所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒；ii)所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒；iii)所述的重組腺病毒為Ad-HGF;iv)所述的重組腺病毒為Ad-KGF;v)所述的重組減毒沙門氏菌為SPH;vi)所述的重組減毒沙門氏菌為SPK;vii)所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎；viii)所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。6、一種藥物組合物，其包含治療有效量的細胞生長因子和任選的藥學可接受的載體。7、項目6的藥物組合物，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。8、項目7的藥物組合物，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中；和/或所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中。9、項目7或8的藥物組合物，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子；和/或所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。10、項目6至9任一項的藥物組合物，其特征在于以下任意一項或多項i)所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒；ii)所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒；iii)所述的重組腺病毒為Ad-HGF;iv)所述的重組腺病毒為Ad-KGF;v)所述的重組減毒沙門氏菌為SPH;vi)所述的重組減毒沙門氏菌為SPK;vii)所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎；viii)所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。11、項目6至10任一項的藥物組合物，其可用于預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病及肺纖維化疾病。12、項目6至11任一項的藥物組合物，其為粉針劑、注射液、涂抹液、噴霧劑、貼膜劑、搽劑、洗劑、溶液劑、粉末劑、氣霧劑、微粒化制劑、微囊劑等。13、在需要的受試者中預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的細胞生長因子。14、項目13的方法，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。15、項目14的方法，其中:所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用；和/或所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。16、項目14或15的方法，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子；和/或所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。17、項目13至16任一項的方法，其特征在于以下任意一項或多項i)所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒；ii)所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒；iii)所述的重組腺病毒為Ad-HGF;iv)所述的重組腺病毒為Ad-KGF;v)所述的重組減毒沙門氏菌為SPH;vi)所述的重組減毒沙門氏菌為SPK;vii)所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎；viii)所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。發明詳述具體地說，本發明第一方面提供了肝細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的藥物中的用途。具體而言，本發明提供的是肝細胞生長因子在制備用于基因預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的藥物中的用途。所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及頑固性潰瘍性結腸炎。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用。本發明還可以使用其它的對于人體無毒或減毒的細菌，使這些細菌攜帶肝細胞生長因子基因后使用，這些細菌包括但不限于雙歧桿菌、大腸桿菌等。換言之，本發明所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子。本發明所述的肝細胞生長因子當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的肝細胞生長因子。但本發明優選的是使用人肝細胞生長因子，包括人肝細胞生長因子的所有分類，例如亞類、亞組、亞群、亞族等。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-HGF。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為SPH。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。本發明第二方面提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的肝細胞生長因子和任選的藥學可接受的載體。根據本發明，所述的藥物組合物可用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病。所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-HGF。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為sra。根據本發明第二方面的藥物組合物，其可用于預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病及肺纖維化疾病。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍。所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。根據本發明第二方面任一項所述藥物組合物，其為粉針劑、注射液、涂抹液、噴霧劑、貼膜劑、搽劑、洗劑、溶液劑、粉末劑、氣霧劑、微粒化制劑、微囊劑等。本發明第三方面提供了一種在需要的受試者中預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的肝細胞生長因子。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子。本發明所述的肝細胞生長因子當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的肝細胞生長因子。但本發明優選的是使用人肝細胞生長因子。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-HGF。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為SPH。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍。所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。根據本發明的詳細記載，上文或下文所述特別是上文所述本發明的第一方面、第二方面和第三方面針對肝細胞生長因子的任一項或任一實施方面或任一特征，其同樣適用于角質細胞生長因子。在下文中，本發明還提供了角質細胞生長因子的醫療用途。本發明第四方面提供了角質細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的藥物中的用途。具體而言，本發明提供的是角質細胞生長因子在制備用于基因預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的藥物中的用途。所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用。本發明還可以使用其它的對于人體無毒或減毒的細菌，使這些細菌攜帶角質細胞生長因子基因后使用，這些細菌包括但不限于雙歧桿菌、大腸桿菌等。換言之，本發明所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。本發明所述的角質細胞生長因子當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的角質細胞生長因子。但本發明優選的是使用人角質細胞生長因子，包括人角質細胞生長因子的所有分類，例如亞類、亞組、亞群、亞族等。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-KGF。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為SPK。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第四方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。本發明第五方面提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的角質細胞生長因子和任選的藥學可接受的載體。根據本發明，所述的藥物組合物可用于預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病。所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病，更特別的是慢性皮膚潰瘍以及潰瘍性結腸炎。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-KGF。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為SPK。根據本發明第五方面的藥物組合物，其可用于預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病及肺纖維化疾病。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍。所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第五方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。根據本發明第五方面任一項所述藥物組合物，其為粉針劑、注射液、涂抹液、噴霧劑、貼膜劑、搽劑、洗劑、溶液劑、粉末劑、氣霧劑、微粒化制劑、微囊劑等。本發明第六方面提供了一種在需要的受試者中預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的角質細胞生長因子。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。本發明所述的角質細胞生長因子當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的角質細胞生長因子。但本發明優選的是使用人角質細胞生長因子。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組腺病毒為Ad-KGF。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為SPK。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍。所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎。在本發明第六方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。根據本發明的詳細記載，上文或下文所述特別是上文所述本發明的第四方面、第五方面和第六方面針對角質細胞生長因子的任一項或任一實施方面或任一特征，其同樣適用于肝細胞生長因子。下面對本發明作進一步詳細的描述。本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。本領域技術人員公知，本發明使用的術語"預防"和"治療"具有它們的一般意義上的含義。本發明使用的術語"細胞生長因子"是指動物例如哺乳動物例如人的細胞生長因子，例如但不限于肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。本發明優選的細胞生長因子是來源于人的細胞生長因子。本領域技術人員清楚，"細胞生長因子"或"人細胞生長因子"具有本領域公知的含義。本發明使用的術語"肝細胞生長因子"是指哺乳動物例如人的肝細胞生長因子。本發明優選的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子。本領域技術人員清楚，"人肝細胞生長因子"具有本領域公知的含義。本發明使用的術語"角質細胞生長因子"是指哺乳動物例如人的角質細胞生長因子。本發明優選的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。本領域技術人員清楚，"人角質細胞生長因子"具有本領域公知的含義。本發明使用的術語"SPH"是指攜帶HGF基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種，其它類似縮寫亦有類似含義。本發明的sra具備親肺和腸粘膜功能，轉染肝細胞生長因子基因效率比質粒要高，且只在局部表達分泌HGF，無進入血流而引起誘發腫瘤的危險的顧慮，因此具有實用的價值。另外，本發明認為HGF尚有調節免疫功能的作用而具有治療效果，為此，本發明進行潰瘍性結腸炎和肺纖維化動物試驗，并應用sra直接應用于腸或肺內方法，取得實效。本發明使用的術語"SPK"是指攜帶KGF基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種。在本發明中，所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒或重組腺病毒或重組減毒沙門氏菌的形式使用。插入的質粒為卡那抗性的真核表達質粒，例如本發明人自行改構的pcKH及pUDKH;重組腺病毒例如本發明人構建的Ad-HGF;重組減毒沙門氏菌例如本發明人構建的攜帶HGF基因真核表達質粒的減毒沙門氏菌Ty21a的菌株SPH，其已于2009年1月15日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提交保藏，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2877，參椐的微生物(株)為Ty-21a-HGF，建議的分類命名為沙門氏菌，Salmonellasp.。對于角質細胞生長因子，可以采用與以上肝細胞生長因子所述類似的方式處理。本發明所述的慢性潰瘍是指患者經手術后，或長期局部壓迫，或由于全身病變而致局部皮膚(含粘膜)出現慢性潰瘍。本發明提供了用于治療此類潰瘍的一種新穎方法，該方法包括將攜帶人肝細胞生長因子基因或角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌(含其它對于人體無毒或減毒菌)，給予慢性潰瘍患者從而治療該疾病。肺纖維化疾病則包含的種類頗多，如原因不明肺纖維化疾病(特發性肺纖維化，idiopathicpulmonaryfibrosis)、反復感染引起的肺纖維化疾病、輻射引起的肺纖維化疾病、或塵埃引起的肺纖維化疾病(塵肺病，pneumoconiosis)等。根據本發明的精神，還提供了治療上述肺纖維化疾病的方法，該方法包括將攜帶人肝細胞生長因子基因或角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌，給予肺纖維化疾病患者從而治療該疾病。本發明的藥物組合物中除了肝細胞生長因子或角質細胞生長因子外，根據需要還可含有本領域技術人員已知的制藥中常用的藥學可接受的載體，例如藥用輔助劑，例如賦形劑、穩定劑、防腐劑、載體等，例如生理鹽水、葡萄糖溶液、甘露醇、乳糖等。應用本發明提供的治療方法比其他的治療手段更具有科學性，療效更明確。在目前尚無針對慢性潰瘍及肺纖維化疾病的較好臨床治療手段的情況下，本發明提供了一種新的有效治療方法，本發明的治療方法比以往的防治手段更具有科學性，療效更明確。圖1描繪了KGF-1基因的PCR擴增，其中lanel為PCR產物；lane2為Maker2000。圖2描繪了真核表達載體的酶切鑒定，其中Lanel為pcDNA3.0-KGF質粒；lane2為質粒EcoRI和XhoI雙酶切產物；lane3為Maker2000。圖3描繪了重組減毒沙門氏菌TPK的篩選，其中lanel為質粒EcoRI和XhoI雙酶切產物；lane2為Maker2000。圖4用圖片描繪了SPK對大鼠慢性難愈合創面修復的影響圖5為SPH治療組的肺組織肉眼觀察結果。圖6為模型對照組的肺組織肉眼觀察結果。圖7為sra治療組的肺組織學顯微觀察結果。圖8為模型對照組的肺組織學顯微觀察結果。圖9-1、圖9-2和圖9-3分別是模型對照組與pcKH和pcK-KGF治療組的肺組織肉眼觀察結果。圖10-1、圖10-2和圖10-3分別是模型對照組與pcKH和pcK-KGF治療組的肺組織學顯微觀察結果。圖11-1、11-2、11-3、和11-4分別描繪了RT-PCR檢測肺表面活性蛋白A/C的表達。其中，圖11-1是P-actin凝膠電泳圖，圖11-2是SP-A凝膠電泳圖，圖11_3是SP-C凝膠電泳圖，圖-4是KGF凝膠電泳圖。具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。這些實施例描述攜帶人肝細胞生長因子基因的重組質粒，或重組腺病毒，或重組減毒沙門氏菌的制備以及對大鼠皮膚潰瘍及肺纖維化的治療作用以進一步闡述本發明。雖然在下文未針對角質細胞生長因子進行相關試驗，但是，本領域技術人員根據本發明公開的教導，可以以下文實施例類似的方式實施涉及角質細胞生長因子的相應試驗，并且可以獲得預期的結果。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。實施例1(1)攜帶人肝細胞牛長因子某因的重組質粒dcKH及dUDKH和重組腺病毒AchHGF格(A)dcKH質粒的構建用常規分子生物學技術，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech公司，美國)中通過多聚酶鏈反應(PCR)(上游引物為5'-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3'[SEQIDNO.01]，下游弓l物為5，_tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3，[SEQIDNO.02])分離得到人HGF編碼區cDNA(2184bp)，測序并進行綜合分析，將測得的人HGF全長cDNA序列與GeneBank已公布的人HGF全長cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人HGFcDNA序列與GeneBank已公布的人HGF全長cDNA序列完全一致。然后將其亞克隆至我們自行改構的真核表達載體pcK的多克隆位點(BamHI，ApaI位點)，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的重組載體pcKH，人肝細胞生長因子基因受CMV啟動子調控。pcK是將商業載體pcDNA3(購自Invitrogen公司，美國)的氨卞抗性基因換為卡那霉素抗性基因而改構所得，將pcDNA3載體用Sspl(購自Promega)及Avrll(購自Promega)雙酶切，切去氨節基因(約0.6kb)，pEGFP-Nl(購自Invitrogen)用Avrll酶切，分別回收大片段(約4.8kb)及小片段(1.lkb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK;分別用BamHI(購自Promega)和Apal(購自Promega)雙酶切pcK及pSK-HGF，分別回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，該片段含有完整的人HGF基因)用T4DNA連接酶連接，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的真核表達載體，含卡那霉素抗性基因，命名為pcKH。用限制性內切酶NotI和HindIII從載體pEGFP-Nl(購自Invitrogen公司，美國)上切下EGFP(綠色熒光蛋白)基因序列，并將其克隆至載體PcK的多克隆位點(NotI，HindIII位點)，獲得攜帶EGFP的質粒pcK-GFP，用于質粒轉染靶組織效率的觀察。(B)pUDKH質粒的構建i.用PCR方法從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech公司，美國)中擴增肝細胞生長因子cDNA。按文獻報道的人肝細胞生長因子HGFcDNA序列設計引物，從人胎盤cDNA文庫克隆人肝細胞生長因子基因。測序并進行綜合分析，將測得的人HGF全長cDNA序列與GeneBank已公布的人HGF全長cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人HGFcDNA序列與GeneBank已公布的人HGF全長cDNA序列完全一致。PCR產物克隆至pBluescriptSK(+)(pSK)載體中，命名為pSK-HGF。ii.構建帶有卡那抗性基因、CMV啟動子、多克隆位點和polyA加尾信號的用于插入HGF基因的表達載體(pUDK)。首先用內切酶PacI從載體pShuttle-CMV(Stratagene公司，美國)上切下含卡那抗性基因(Kan+)、pBR322復制子區域的片段(-2930bp)，回收、末端補平并去除5'_P;再用內切酶PvuII和NruI依次酶切pcDNA3質粒，回收含CMV啟動子、多克隆位點和polyA加尾信號的片段(-1080bp);最后將上述2個片段連接并轉化大腸桿菌DH5a感受態，用常規分子生物學方法鑒定陽性重組子。所得質粒命名為pUDK。iii.構建攜帶HGF基因的基因治療用載體pUDKH。先用內切酶EcoRV酶切pUDK質粒，去除5'_P后回收；再用BamHI和ApaI依次酶切pSK-HGF質粒，回收HGF基因片段(_2200bp)，末端補平后再回收；上述2個片斷連接并轉化大腸桿菌DH5a感受態，用常規分子生物學方法鑒定陽性重組子，保存菌種。所得質粒命名為pUDKH。HGF的表達裝置依次為CMV啟動子、人HGFcDNA、BGHpolyA信號。用EcoRI，PvuII，Kpnl，及HindIII4種限制性內切酶對構建完成的質粒進行進一步的酶切鑒定，最終結果表明質粒pUDKH構建成功。用HindIII，Notl限制性內切酶從載體pcDNA3_GFP(參見(l))切下GFP(綠色熒光蛋白)基因序列，并將其克隆至載體PUDK的HindIII，NotI多克隆位點，獲得攜帶GFP的質粒，pUDK-GFP用于質粒轉染耙組織效率的觀察。以上所有限制性內切酶和DNA連接酶均購自寶生物工程(TaKaRa)公司。(C)質粒的制備、純化及質量控制用本領域的常規技術方法，將pcKH、pUDKH質粒以及pcK-GFP和pUDK-GFP分別轉化常規的感受態細菌(例如大腸桿菌DH5a)，然后大規模發酵細菌擴增質粒，離心回收菌體，采用堿變性法提取重組質粒，層析法大規模純化質粒，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法確定DNA的純度和含量。獲得所需的質粒用于下述實驗。(D)重組腺病毒Ad-HGF的構建與制備將HGFcDNA克隆至pXC幾l-CMV/pA(含有CMV啟動子、PolyA信號以及腺病毒基因組左端序列的穿梭質粒，由美國百特醫療用品公司基因治療部提供)載體的HindIII和NotI位點之間，從而獲得攜帶人肝細胞生長因子基因表達盒以及腺病毒基因組左端序列的穿梭質粒(pXC幾l-CMV/pA-HGF)。然后用Lipofec窗IN(購自GIBC0公司，美國)介導pXCJLl-CMV/PA-HGF和GT4050(含有El區、E3區及包裝信號區缺失的復制缺陷型5型腺病毒基因組的質粒，由美國百特醫療用品公司基因治療部提供)共轉染293細胞(以腺病毒El基因轉化的人胚腎細胞系，ATCC)，當出現明顯細胞病變效應(CPE)后，用噬斑分析法篩選單克隆重組腺病毒，PCR法鑒定陽性重組腺病毒，并將其在293細胞中擴增后用氯化銫密度梯度離心法純化。然后通過測定260nm和280nm光吸收、快速CPE分析及噬斑分析確定病毒的純度和感染滴度。Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒，由美國百特醫療用品公司基因治療部提供)，制備同Ad-HGF，用于重組腺病毒轉染靶組織效率的觀察。參考以上方法還構建和制備了重組腺病毒Ad-KGF。(2)攜帶人角質細朐牛長閔子(KGF)某閔的直核表汰載體DcK-KGF的構律與制備(A)KGFcDNA的克降按文獻報道(RubinJS，etal.ProcNatlAcadSeiUSA1989.86:302-306;FinchPW，etal.Science1989,245(4919):752-755)的人角質細胞生長因子(KeratinocyteGrowthFactor,KGF)cDNA序列設計引物，在正向引物中引入BamHI酶切位點，反向引物中引入EcoRI酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5'-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3'[SEQIDNO.03]，反向引物的寡核苷酸序列為5'-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3'[SEQIDNO.04]，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech)克隆人角質細胞生長因子(KGF)基因。PCR參數為94。C預變性5min，94。C40s，55。C40s，72。C60s，循環數為30，72。C延伸10min。PCR產物(圖1)用Sanger雙脫氧終止法測定人KGFcDNA序列(上海生工生物工程技術服務公司)。將測得的人KGFcDNA序列與文獻報道的人KGFcDNA序列進行比較分析表明，本發明克隆的人KGFcDNA序列與文獻報道的人KGFcDNA序列完全一致，具體參見后文序列表部分[SEQIDNO.05]。(B)攜帶人角質細朐牛長閔子某閔的直核表汰載體DcK-KGF構律將pcDNA3載體(購自Clontech)用Sspl(購自Promega)及AvrII(購自Promega)雙酶切，切去氨芐基因(約0.6kb)，pEGFP-Nl(購自Invitrogen)用AvrII酶切，分別回收大片段(約4.8kb)及小片段(1.lkb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK。分別用BamHI(購自Promega)和EcoRI酶(購自Promega)雙酶切pcK及KGFPCR產物，分別回收大片段及小片段(約430bp的DNA片段，該片段為人KGF基因)用T4DNA連接酶連接，獲得攜帶人角質細胞生長因子基因的真核表達載體，含卡那霉素抗性基因，命名為pcK-KGF(圖2)。(C)攜帶人角質細胞牛長因子某因的真核表汰載體DcK-KGF的制備用本領域的常規技術方法，將pcK-KGF質粒轉化常規的感受態細菌(例如大腸桿菌DH5a)，然后大規模發酵細菌擴增質粒，離心回收菌體，采用堿變性法提取重組質粒，柱層析法大規模純化質粒(采用無內毒素質粒大提試劑盒，TIANGEN)，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法確定DNA的純度和含量。獲得所需的質粒用于下述實驗。(3)重組減毒沙門氏菌SPH的構建與制備(A)HGFcDNA的克隆按文獻報道(MiyazawaK，etal.BBRC，1989，163:967-973;NakamuraT，etal.ProgressinGrowthFactorResearch1991,3:67-85)的人肝細胞生長因子(H印atocyteGrowthFactor,HGF)cDNA序列設計引物，并在正向引物中引入BamHI酶切位點，反向引物中引入SalI酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5'-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3'[SEQIDNO.01]，反向引物的寡核苷酸序列為5'-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3'[SEQIDN0.02]，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech)克隆人肝細胞生長因子基因。PCR參數為94。C60sec，55。C60sec，72。C90sec，循環數為30，72。C延伸7min。PCR產物(圖1)克隆至pBluescriptSK(pSK)載體(購自Clontech)的BamHI(購自Promega)和Sail酶(購自Promega)酶切位點中，命名為pSK-HGF。用Xhol酶(購自Promega)酶切pSK-HGF，0.8%瓊脂糖(西班牙原裝)凝膠電泳分離后，分別回收(凝膠回收試劑盒，購自Promega)大小約3.5kb、l.lkb、0.6kb的DNA片段，將3.5kb片段用T4DNA連接酶(購自BioLabs)自連得到pSK-HGFl，再將1.lkb和0.6kb片段分別插入pSK載體的Xhol酶切位點中，分別命名為pSK-HGF2和pSK_HGF3。測序反應策略是pSK-HGFl用T3引物作一反應；pSK-HGF2用T3和T7引物分別作一反應；pSK-HGF3用T7引物作一反應。用Sanger雙脫氧終止法測定人HGFcDNA序列(上海生工生物工程技術服務公司)。對pSK-HGFl、pSK-HGF2、pSK-HGF3分別用T3、T7引物作四個反應后測序并進行綜合分析，將測得的人HGF全長cDNA序列與文獻報道的人HGF全長cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人HGFcDNA序列與文獻報道的人HGF全長cDNA序列完全一致。(B)麟A隨齢K附細隨禾亥表汰謝本dcK幽聿將pcDNA3載體(購自Clontech)用Sspl(購自Promega)及AvrII(購自Promega)雙酶切，切去氨芐基因(約0.6kb)，pEGFP-Nl(購自Invitrogen)用AvrII酶切，分別回收大片段(約4.8kb)及小片段(1.lkb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK。分別用BamHI(購自Promega)和Apal(購自Promega)雙酶切pcK及pSK-HGF，分別回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，該片段含有完整的人HGF基因)用T4DNA連接酶連接，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的真核表達載體，含卡那霉素抗性基因，命名為pcKH。(C)麟HGF細,新少H舗翻燃i.電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50yL接種于5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約0.4)，4t:條件下，4000r.min-l離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌后的細菌懸于lml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Multiporator4308Eppendorf電轉儀)將pcKH、pcK和pcK-GFP(攜帶綠色熒光蛋白的真核表達載體，用于示蹤觀察轉染效率，發明人研究室保存)質粒各0.2iig轉化200iiL預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2.5kV，電容25iiF，電阻200Q，放電時間0.5s。加入S0C培養基lml，37t:輕柔震蕩培養45min，涂布于含卡那霉素(100mg.L—0固體LB培養基平皿，37t:培養16h后各挑取2個菌落進行鑒定。ii.陽性工程菌的篩選從培養板各挑取2個單菌落，分別接種于3mL含卡那霉素的LB培養液中，37。C震搖培養。轉入pcKH的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因HGF)及提取質粒后BamHI/Apal雙酶切鑒定；轉入pcK的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV);轉入pcK-GFP的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及在熒光顯微鏡下觀察GFP)。擴增真核表達啟動子CMV的引物為:上游5'-cccagtacatgaccttatggg-3'[SEQIDNO.06]，下游5'-ggagacttggaaatecccgt-3'[SEQIDN0.07]，PCR參數為94。C30sec，55°C30sec，72。Clmin，循環數為30，72。C延伸5min。擴增HGF的引物為:上游5'-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3'[SEQIDNO.01]，下游5'-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3'[SEQIDNO.02]，PCR參數為:94。C60sec，55。C60sec，72。C90sec，循環數為30，72t:延伸7min。iii工稈菌SPH的制備將攜帶HGF基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種(SPH)接種于含卡那霉素(50iig/mL)的LB培養基中，3537°C8%C02培養箱中培養24h做為一代菌種，將一代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養做為二代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和二代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將二代克氏瓶菌種刮于lOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為1.7Xl(T個/mL，30L發酵罐發酵12h后3000r/min離心20min，收集菌體73g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約26g。(4)重會目減毒沙門氏菌SPK的構律與制備(A)KGFcDNA的克降按文獻報道(RubinJS，etal.ProcNatlAcadSeiUSA1989.86:302-306;FinchPW，etal.Science1989,245(4919):752-755)的人角質細胞生長因子(KeratinocyteGrowthFactor，KGF)cDNA序列設計引物，在正向引物中引入BamHI酶切位點，反向引物中引入EcoRI酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5'-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3'[SEQIDNO.03]，反向引物的寡核苷酸序列為5'-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3'[SEQIDNO.04]，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech)克隆人角質細胞生長因子(KGF)基因。PCR參數為94。C預變性5min，94。C40s，55。C40s，72。C60s，循環數為30，72。C延伸10min。PCR產物(圖1)用Sanger雙脫氧終止法測定人KGFcDNA序列(上海生工生物工程技術服務公司)。將測得的人KGFcDNA序列與文獻報道的人KGFcDNA序列進行比較分析表明，本發明克隆的人KGFcDNA序列與文獻報道的人KGFcDNA序列完全一致，具體參見后文序列表部分[SEQIDNO.05]。(B)攜帶人角質細胞牛長因子某因的真核表汰載體DcK-KGF構建將pcDNA3載體(購自Clontech)用Sspl(購自Promega)及AvrII(購自Promega)雙酶切，切去氨芐基因(約0.6kb)，pEGFP-Nl(購自Invitrogen)用AvrII酶切，分別回收大片段(約4.8kb)及小片段(1.lkb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK。分別用BamHI(購自Promega)和EcoRI酶(購自Promega)雙酶切pcK及KGFPCR產物，分別回收大片段及小片段(約430bp的DNA片段，該片段為人KGF基因)用T4DNA連接酶連接，獲得攜帶人角質細胞生長因子基因的真核表達載體，含卡那霉素抗性基因，命名為pcK-KGF(圖2)。(C)攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌菌株的篩選與制備i.電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50yL接種于5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約0.4)，4t:條件下，4000r.min—1離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌后的細菌懸于lml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Multiporator4308Eppendorf電轉儀)將pcK-KGF質粒0.2iig轉化200iiL預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2.5kV，電容25iiF，電阻200Q，放電時間0.5s。加入SOC培養基lml，37t:輕柔震蕩培養45min，涂布于含卡那霉素(lOOmg.L—0固體LB培養基平皿，37t:培養16h后各挑取2個菌落進行鑒定。ii.陽件工稈菌菌株SPK的篩詵從培養板各挑取2個單菌落，分別接種于3mL含卡那霉素的LB培養液中，37。C震搖培養。轉入pcK-KGF的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因KGF)及提取質粒后BamHI/EcoRI雙酶切鑒定(圖3);擴增真核表達啟動子CMV的引物為上游5'-cccagtacatgaccttatggg-3'[SEQIDN0.06]，下游5'-ggagacttggaaatecccgt_3'[SEQIDNO.07]，PCR參數為94°C30sec，55。C30sec，72。Clmin，循環數為30，72。C延伸5min。擴增KGF的引物為上游5'-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3'[SEQIDNO.03]，下游5'-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3'[SEQIDNO.04]，PCR參數為94。C60sec，55°C60sec，72°C90sec，循環數為30，72t:延伸7min。篩選的陽性工程菌株命名為SPK。工稈菌SPK的制備將攜帶KGF基因真核表達載體的減毒沙門氏菌菌種(SPK)接種于含卡那霉素(50i!g/mL)的LB培養基中，3537°C8%C02培養箱中培養24h做為一代菌種，將一代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養做為二代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和二代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將二代克氏瓶菌種刮于lOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為1.7Xl(T個/mL，30L發酵罐發酵12-14h后4000r/min離心20min，收集菌體70g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約20g。實施例2:HGF重會目質粒dcKH及重會目減毒沙門氏菌SPH治療大鼠皮膚急惽件潰瘍的效果觀,察(一)SPH對Wistar大鼠急性創面修復的影響(1)實驗動物及樽型:軍事醫學科學院實驗動物中心提供的Wistar大鼠7只，雄性，體重220240克。實驗前一周購入，自由飲水與攝食，實驗當日禁食，在麻醉條件下背部凈毛，面積7X5cm，待消毒后用特制致傷器(打孔器，直徑1.8cm)在大鼠背部脊柱兩側各旁開1.5cm處各壓一痕跡，用剪刀沿痕跡剪去全層皮膚，形成兩個圓形創面，止血后備用。(2)SPH應用方法將Wistar大鼠7只隨機分為二組并編號，17號的左側創面為第一組(生理鹽水組)，右側創面為第二組(sra組)。第一組給予生理鹽水0.1ml/創面，第二組給予sra30mg/創面。傷后給予油紗覆蓋再用無菌紗布繞胸部包扎，松緊適宜(以不影響呼吸為準)，SKl膠囊每三天換藥一次，至傷后14天。每次換藥將紗布揭開，創面無菌處理后，用注射器將生理鹽水均勻滴注于相應創面，棉簽蘸膠囊粉劑均勻涂于創面，用無菌紗布包扎后單籠喂養。(3)評價指標與方法:創面照相，透明膜描記稱量法記錄傷后0、3、7、14天創面面積；傷后3天處死一只大鼠，14天后全部處死其余14只大鼠，取創面組織，經福爾馬林固定后常規染色，重點觀察創面肉芽組織生長(包括毛細血管生長，膠原沉積)與再上皮化變化，以評價修復結果。(4)實驗結果(A)創面面積;經不同治療方法處理的創面面積隨時間延長而逐漸縮小；sra組創面在治療后3天、7天和14天均較生理鹽水組者為小，結果見表1。表1不同治療方法處理后各時間點創面面積比較(cm2，；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(b)組織學檢杳切片經HE染色，傷后3天見生理鹽水組和SKI組創面均有極少量肉芽組織生成，但sra組肉芽多于生理鹽水組。傷后14天，創面接近愈合，sra組愈合情況好于生理鹽水組。(C)實驗結論本實驗觀察到SKI對Wistar大鼠創面修復有促進作用，表現在促進創面肉芽組織生長，加速創面再上皮化。(二)SPH與pcKH對大鼠慢性難愈合創面修復的影響(1)實驗動物及樽型:甘肅省中醫學院實驗動物中心提供的Wistar大鼠9只，雄性，體重200220克。用高脂飼料加小劑量STZ腹腔注射建立實驗性2型糖尿病大鼠慢性難愈合創面模型，血糖水平持續高于22mmol/L時，實驗當日禁食，在麻醉條件下背部凈毛，面積7X5cm，待消毒后用特制致傷器(打孔器，直徑1.5cm)在大鼠背部壓一痕跡，用剪刀沿痕跡剪去全層皮膚，形成一個圓形創面，止血后備用。(2)SPH與pcKH的應用將模型大鼠隨機分為三組Sra組、pcKH組和對照組，每組3只。在創口制備好即刻，每個創面分別給予o.03gsra和相當o.03gsra提取的質粒量的pcKH及同體積的pbs溶液。每次換藥將紗布揭開，創面無菌處理后，用注射器將生理鹽水均勻滴注于相應創面，棉簽蘸膠囊粉劑均勻涂于創面，用無菌紗布包扎后單籠喂養。三日一次，共3次。(3)大體觀察創口愈合速度基因轉移后每兩天檢測創口的橫徑和縱徑。結果sra組創口愈合速度明顯快于pcKH及對照組。創口橫徑和縱徑測量值也表明SKI組創口愈合速度明顯快于pcKH及對照組，結果見表2、表3。表2不同治療方法處理后各時間點創面橫徑(a)和縱徑(b)比較(cm，S士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表3不同治療方法處理后各組平均愈合天數比較G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(4)組織學柃杳;傷口愈合后取創面皮膚組織，經福爾馬林固定后常規染色，重點觀察創面肉芽組織生長與再上皮化變化，以評價修復結果。結果切片經he染色后，可見sra組創面愈合情況好于pcKH及對照組，pcKH組愈合情況好于對照組，主要表現在上皮化組織SPH組平整且增生不明顯，可見較多新生的小血管，對照組愈合面凹凸不平且增生非常顯著，少見血管形成，pcKH組介于SKI組與對照組之間。表明SKI組治愈傷口的作用明顯優于pcKH組及對照組而且修復的皮膚組織很為正常，其可抑制瘢痕組織形成。(5)輔斜侖:本實驗觀察到SKI對Wistar大鼠慢性難愈合慢性創面修復有促進作用，表現在促進創面快速修復，加速創面再上皮化，促進肉芽組織生長，促進局部血管形成，抑制瘢痕增生形成。(三)Ad-HGF對大鼠惽件難愈合創面修復的影響(1)實驗動物及樽型同上一試驗。(2)Ad-HGF應用;將模型大鼠隨機分為二組Ad-HGF組、對照組，每組5只。在創口制備好即刻，每個創面分別給予相當8xl()8pfu的Ad-HGF藥液及同體積的PBS溶液一次。(3)t翻辦'隨A鵬:基因轉移后不同時間(0、3、7、10、14、21天)檢測創口面積。結果AchHGF組創口愈合速度明顯快對照組。結果見表4-l、表4-2。表4-lAd-HGF對大鼠潰瘍創面面積的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注*與對照組比:*p<0.05，"p<0.01，***p<0.001。表4-2Ad-HGF對大鼠潰瘍創面愈合率的影響組別劑量/創面創面愈合率(％)3天7天10天14天21天對照PBS30.3±7.256.4±6.974.1±5.881.8±5.795.0±1.3Adv陽H8xlOspft>42.5±12.5*67.2±6.2**86.9±4.1***93.3±2,4***99.8±0.3***注:(1)*與對照組比:*p<0.05，"p<0.01，***p<0.001(4)實驗結論:本實驗觀察到Ad-HGF對Wistar大鼠慢性難愈合慢性創面修復有促進作用，表現在促進創面快速修復，創面愈合率高。發明人還發現，重組腺病毒Ad-KGF也具有與上述Ad-HGF類似的令人滿意的結果。(四)SPK對大鼠惽件難愈合創面修復的影響(1)實驗動物及樽型同卜.一試驗。(2)SPK應用將模型大鼠隨機分為六組對照組、SPK不同劑量組，每組5只。在創口制備好即刻，每個創面分別給予15，30，60，120ug的SPK溶液和及同體積的PBS溶液。三日一次，共3次。(3)大體觀察創口愈合諫度:基因轉移后不同時間(0、3、7U0、14、21天)檢測創口面積。結果SPK組創口愈合速度明顯快對照組。結果見表5、表6。表5SPK對大鼠潰瘍創面面積的影響組別劑量ug/創面傷后創面面積(cm2)0天3天7天10天14天21天對照PBS2.44±0.111.70±0.221.09±0.230.65±0.130.46±0.170.13±0.08PC-SPK12S2.48±0.091.23±0.25*"0.67士0.15"'0.47士0.07"0.20士0.07"'0.05士0.05'PC-SPK602.45±0.091.48±0.22'0.83±0.18'0.36士0.10"0,19士0.04"'0.05±0.06PC-SPK302.45±0.091.56±0.160.87土0.22'0.40土0.10"0.29土0.03'0.12±0.05PC-SPK152.45±0.071.75±0.111.00±0.220.55±0.140.39±0.090.15±0.12注*與對照組比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。表6SPK對大鼠潰瘍創面愈合率的影響組別劑量ug/創面創面愈合一3天7天10天14天21天對照PBS30.2±9.455.4±9..973.8±4.981.1±7.594.4±2.9PC-SPK12550,5±10.2***73.2±5.7***80.9±3.1"91.9±3.1**97.9±1.9*PC-SPK6039.3±9.5*66.0±7..3A85.0±4.5*A92.1±1.6**97.8±2.6PC-SPK3036.4±7364.4±9.1*83.5±4..2**88.1±1.6*95..2±2.1PC-SPK1528.6±5.859.0±8..977.3±6.583.6±4.293.9±4.8注*與對照組比:*p<0.05，<0.01，***p<0.001(4)組織學柃杳;傷后7，14和21天組織病理學觀察，結果顯示傷后7天多數對照組皮膚缺損表面可見薄層壞死組織和變性壞死的炎細胞，少量肉芽組織增生，偶見毛細血管，未見表皮再生現象(圖4，照片l)，而SPK組見有大量肉芽組織，毛細血管較多(圖4，照片4);傷后14天對照組皮膚缺損處肉芽組織增生不良，伴有水腫，缺損邊緣可見表皮再生，但層次較薄，伴有壞死(圖4，照片2)，而SPK組皮膚缺損處肉芽組織已經轉變成纖維結締組織，層次較厚，毛細血管豐富，缺損邊緣可見表皮明顯再生，并向缺損處伸展覆蓋(圖4，照片5);傷后21天對照組皮膚缺損處肉芽組織已轉變成纖維結締組織，層次較厚，伴有水腫，缺損邊緣可見表皮明顯再生，并向缺損處伸展覆蓋(圖4，照片3)，組織結構尚不完整，而SPK組皮膚缺損處肉芽組織已經轉變成纖維結締組織，層次較厚，除個別動物外，多數動物創傷處表皮缺損已完全愈合(圖4，照片6)。各照片詳細說明如下照片1.對照鼠傷后7天皮膚缺損表面可見較多不規則壞死組織和大量變性壞死的炎細胞，未見肉芽組織增生和表皮再生現象。照片2.對照鼠傷后14天皮膚缺損處肉芽組織增生不良，伴有水腫，缺損邊緣可見表皮再生，層次較薄，伴有壞死，照片3.對照鼠傷后21天皮膚缺損處肉芽組織已經轉變成纖維結締組織，層次較厚，缺損邊緣可見表皮明顯再生并向缺損處大幅度伸展覆蓋，照片4.SPK治療鼠傷后7天皮膚缺損處肉芽組織增生，層次較厚，伴有水腫，缺損邊緣可見表皮再生并向缺損處伸展覆蓋，照片5.SPK治療鼠傷后14天皮膚缺損處肉芽組織已經轉變成纖維結締組織，層次較厚，缺損邊緣可見表皮明顯再生并向缺損處大幅度伸展覆蓋，照片6.SPK治療鼠傷后21天皮膚缺損處肉芽組織向纖維結締組織轉變，層次較厚，缺損邊緣可見表皮明顯再生并向缺損處伸展覆蓋。(5)實驗結論:本實驗觀察到SPK對Wistar大鼠慢性難愈合慢性創面修復有促進作用，表現在促進創面快速修復，創面愈合率高，創面表皮明顯再生并向缺損處伸展覆蓋。實施例3:重飽減毒沙門氏菌SPH治療大鼠潰瘍件結腸炎的效果觀,察(1)實驗動物及樽型:Wistar健康大鼠50只，體重220250g，清潔級，由甘肅中醫學院動物中心(SPF)提供。50只Wistar大鼠實驗前禁食不禁水48h，隨機取40只第Od大鼠吸入乙醚麻醉，仰臥位，將一根聚乙烯管(直徑約2mm)經肛門插入腸道，深度8cm，將30mg(150mg/kg)TNBS與50%乙醇等體積溶液(V/V)注入腸道，保持肛門高位5min，防止液體流出，余10只大鼠以等量生理鹽水取代TNBS灌腸液灌腸，其余過程均相同。(2)動物分組及治療:將TNBS灌腸的40只大鼠隨機分為4組SP(攜帶空質粒pcK的減毒沙門氏菌菌株)治療組、Sra(攜帶HGF基因真核表達質粒pcKH的減毒沙門氏菌菌株)治療組、SPG(攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)質粒的的減毒沙門氏菌菌株)觀察組、模型對照組，生理鹽水灌腸大鼠設為正常對照組，每組10只。灌腸后第3d開始灌胃治療，隔日一次，每只0.5ml菌液。將SP、SPH、SPG菌液分別接種于含卡那霉素的LB培養基中振蕩過夜，9h后收集菌體，PBS洗滌后，用100g/LNaHC03溶液懸浮，調整細菌數為2X10、fu/mL，立即灌胃。模型對照組和正常對照組給予同體積100g/LNaHC03。(3)*翻,:正常對照組大鼠腸管黏膜皺襞紋理清晰，未見糜爛及潰瘍；模型對照組及SP治療組大鼠腸管變粗，腸壁部分甚至膨脹巨大變薄，腸管黏膜壞死組織、潰瘍及糜爛面的上面有黑黃色膜狀物附著，其附近黏膜充血、水腫明顯；sra治療組大鼠腸壁與正常大鼠接近，尤其是6次灌胃治療后。(4)組織學觀察:光鏡下觀察大鼠結腸組織可見，正常對照組粘膜、腺體結構清晰，粘膜下血管豐富；模型對照組粘膜糜爛、剝脫程度較重，潰瘍數量多，潰瘍面大，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，腺體破壞，組織壞死，未見明顯增生現象(Bl);SP治療組與模型對照組相比無明顯差別(ci);sra治療組結腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細胞浸潤程度減輕，潰瘍面明顯縮小或完全愈合，腸腺增生，潰瘍底部可見黏膜下層有新生肉芽組織增生，毛細血管增生明顯(Dl)。(5)輔斜侖:本實驗觀察到Sra對Wistar大鼠潰瘍性結腸炎難愈合創面修復有促進作用，表現在能明顯減輕TNBS誘發潰瘍性結腸炎模型大鼠的癥狀及炎癥，對已形成的粘膜損傷及潰瘍有促修復作用，促進局部血管形成。實施例4:重會目減毒沙門氏菌SPH治療大鼠肺纖維化的效果觀察(1)實驗動物及樽型:Wistar健康大鼠12只，體重180200g，由甘肅中醫學院動物中心(SPF)提供。BLM由天津太河制藥有限公司提供，用時以生理鹽水稀釋為4mg/mL;攜帶肝細胞生長因子基因的減毒沙門氏菌(SPH)由蘭州軍區蘭州總醫院實驗中心提供。將Wistar大鼠在實驗環境訓養1周后，用乙醚麻醉，仰臥固定于鼠臺上，充分暴露喉頭，頸部剪毛碘伏消毒后逐層分離并暴露氣管，lml注射器經氣管軟骨環間隙朝向肺部剌入氣管，然后緩慢注入0.5mL(2mg)博萊霉素生理鹽水溶液(10mgkg-l)，并繼續向氣管內推注空氣0.5mL后，立即將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布并沖散到末端氣體交換單位。大鼠造模一周后，將12只體質狀態基本一致的隨機分為2組Sra治療組(6只)、模型對照組(6只)。(2)實驗動物處理同造模時所用方法SPH治療組滴入lX109cfu的SPH0.2mL，繼續滴入生理鹽水0.3mL，推入少量空氣，將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布；SP治療組滴入1X109cfu的SPH0.2mL，繼續滴入生理鹽水0.3mL，推入少量空氣，將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布；模型對照組僅滴入生理鹽水0.5mL。(3)氣管肺泡原位灌洗:給藥30d后，頸椎脫臼處死動物，固定板上，無菌條件下進行氣管肺泡原位灌洗，方法剪毛、消毒后切開頸部皮膚，充分暴露氣管后，用輸液管前端細的部分剪去針頭后，大致從氣管3-4軟骨環之間插入，5ml注射器注入3ml生理鹽水反復洗肺兩次，同時輕揉肺部，吸出肺泡灌洗液(TALF)，回收率4560%，1000rpm離心五分鐘，上清待測總蛋白，留0.5ml混勻后進行細胞分類計數。(4)肺組織觀察:對各組肺組織大體進行肉眼觀察；并在灌洗完后，用眼科剪取左右肺各一葉，固定于4%甲醛溶液18h后，行HE染色。(5)輔魏:(A)鵬目會壯翻^:模型組及SP治療組大鼠肺臟顏色灰暗，光澤差，表面粗糙不平，質地較硬，體積增大，仔細觀察可見散在的灶狀出血點；sra治療組雙肺表面顏色略暗，粗糙程度明顯低于模型組，出血點等病灶較少，質地較軟。SPH治療組和模型對照組的肺組織肉眼觀察結果分別參見圖5和圖6。(B)細胞分類i十數:離心后吸去多余上清留0.5ml的TALF混勻后進行細胞分類計數，Sffl治療組中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞絕對值(計數值)均較模型組低，中性粒細胞相對值也較低，而淋巴細胞相對值較模型組高，且差異均極顯著(P<0.01)，結果見表7。表7各組細胞分類計數<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注與模型對照組比較，①P<0.01，②P<0.Ol，N:中性粒細胞，L:淋巴細胞，E:噬酸性粒細(C)肺組織學觀察結果:HE染色鏡檢，模型組肺實質病變嚴重，實變和纖維化程度重，膠原沉積及纖維化區域較多、多灶性，有纖維化早期改變，多見淋巴炎性細胞浸潤；sra治療組與模型組比較支氣管周圍也有灶性炎癥、個別區域肺泡間隔增厚，纖維細胞、上皮細胞增生，卻程度均較模型組輕。SPH治療組和模型對照組的肺組織學顯微觀察結果分別見圖7和圖8。(D)實驗結論:本實驗觀察到SKI對Wistar大鼠有顯著降低炎性細胞，減少肺組織中膠原形成，從而有抑制肺纖維化形成的的作用。實施例5:重飽減毒沙門氏菌SPK治療大鼠潰瘍件結腸炎的效果觀,察(1)實驗動物及樽型:Wistar健康大鼠40只，體重220250g，清潔級，由甘肅中醫學院動物中心(SPF)提供。40只Wistar大鼠實驗前禁食不禁水48h，隨機取30只第Od大鼠吸入乙醚麻醉，仰臥位，將一根聚乙烯管(直徑約2mm)經肛門插入腸道，深度8cm，將2ml5%的乙酸溶液注入腸道，保持肛門高位5min，防止液體流出，余IO只大鼠以等量生理鹽水取代乙酸溶液灌腸液灌腸，其余過程均相同。(2)動物分飽及治療:將模型大鼠隨機分為3組SP(攜帶空質粒pcK的減毒沙門氏菌菌株)治療組、SPK(攜帶KGF基因真核表達質粒pcK-KGF的減毒沙門氏菌菌株)治療組和模型對照組，生理鹽水灌腸大鼠設為正常對照組，每組10只。灌腸后第3d開始灌胃治療，隔日一次，每只0.5ml菌液。將SP及SPK菌液分別接種于含卡那霉素的LB培養基中振蕩過夜，9h后收集菌體，PBS洗滌后，用100g/LNaHC03溶液懸浮，調整細菌數為2X10、fu/mL，立即灌胃。模型對照組和正常對照組給予同體積lOOg/LNaHC03。(3)大體觀察;正常對照組大鼠腸管黏膜皺襞紋理清晰，未見糜爛及潰瘍；模型對照組及SP治療組大鼠腸管變粗，腸壁部分甚至膨脹巨大變薄，腸壁外周粘連嚴重，腸管黏膜可見明顯潰瘍及糜爛面，其附近黏膜充血、水腫明顯；SPK治療組大鼠腸壁與正常大鼠接近，尤其是6次灌胃治療后。(4)組織學觀察:光鏡下觀察大鼠結腸組織可見，正常對照組粘膜、腺體結構清晰，粘膜下血管豐富；模型對照組粘膜糜爛、剝脫程度較重，潰瘍面大，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，腺體破壞，組織壞死，未見明顯增生現象(B2);SP治療組與模型對照組相比無明顯差別(C2);SPK治療組結腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細胞浸潤程度減輕，潰瘍面明顯縮小或完全愈合，腸腺增生，潰瘍底部可見黏膜下層有新生肉芽組織增生，毛細血管增生明顯(D2)。(5)實驗結論:本實驗觀察到SPK對Wistar大鼠潰瘍性結腸炎難愈合創面修復有促進作用，表現在能明顯減輕乙酸誘發潰瘍性結腸炎模型大鼠的癥狀，對已形成的粘膜損傷及潰瘍有促修復作用，促進局部血管形成。實施例6:SPK、SPH與pcK-KGF、pcKH對大鼠放射性難愈合創面修復的影響(1)動物樽型制備15只Wistar雌性大鼠，4-6周，體重200-250g，購于甘肅中醫學院動物中心。乙醚麻醉大鼠，減去背部體毛，碘伏消毒，于背部脊柱左右兩側手術制備直徑約為1.5cm的皮膚切口，深達皮下。然后以412cGy的X射線局部照射切口部位，制成輻射創傷模型。(2)SPK、SPH與pcK-KGF、pcKH應用將15只大鼠隨機分成5組，每組3只，分別為SPK組(108cfuSPK菌/傷口)；pcK-KGF組(20iigpcK-KGF質粒/傷口);SPH組(108cfuSPH菌/傷口);pcKH組(20iigpcKH質粒/傷口)；對照組(100iiL生理鹽水/傷口)。X射線照射后立即給藥，隔日一次，共三次。每天觀測并記錄切口的愈合情況。(3)大體觀察創口愈合速度基因轉移后每兩天檢測創口的橫徑和縱徑，計算創口面積。結果轉基因組創面較對照組創面愈合速度明顯快，尤其是攜帶KGF基因的兩組(pcK-KGF組和SPK組)結果更明顯(見表8)。如表8所示，KGF組的創傷愈合速度比對照組明顯加快，圖示HGF代表pcKH質粒，KGF代表pcK-KGF質粒。表8不同治療方法處理后各組平均愈合天數比較G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(4)組織學柃杳:傷口愈合后取創面皮膚組織，經福爾馬林固定后常規染色，重點觀察創面肉芽組織生長與再上皮化變化，以評價修復結果。結果切片經HE染色后，可見轉基因組創面較對照組創面愈合好，尤其是pcK-KGF組和SPK組更為顯著。主要表現在上皮化組織pcK-KGF組和SPK組平整且增生不明顯，可見較多新生的小血管，對照組愈合面凹凸不平且增生非常顯著，少見血管形成，pcKH組與sra組介于二者之間。(5)實驗結論:本實驗觀察到SPK、Sra與pcK-KGF、pcKH對Wistar大鼠輻射性難愈合慢性創面修復有促進作用，表現在促進創面快速修復，加速創面再上皮化，促進肉芽組織生長，促進局部血管形成。另外，發明人還發現，重組腺病毒Ad-KGF和Ad-HGF在上述實施例3、4、5、6中進行試驗也獲得了與上述實施例3、4、5、6類似的令人滿意的結果。實施例7:DcK-KGF、DcKH對大鼠肺纖維化的治療作用(1)云M勿樽型制備:Wistar健康大鼠18只，體重180250g，由甘肅中醫學院提供。將Wistar大鼠在實驗環境中訓養1周后，用乙醚麻醉，仰臥固定于鼠臺上，充分暴露喉頭，頸部剪毛碘伏消毒后逐層分離并暴露氣管，1ml注射器經氣管軟骨環間隙朝向肺部剌入氣管，然后緩慢注入0.5mL博萊霉素生理鹽水溶液(10mg/kg)，并繼續向氣管內推注空氣0.5mL后，立即將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布并沖散到末端氣體交換單位。大鼠造模一周后，將18只體質狀態基本一致的隨機分為3組pcK-KGF治療組(6只)、pcKH治療組(6只)，模型對照組(6只)。(2)DcK-KGF與ocKH應用同造模時所用方法，pcK-KGF治療組滴入20iigpcK-KGF質粒(溶于0.2ml生理鹽水中)，繼續滴入生理鹽水0.3mL，推入少量空氣，將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布；pcKH治療組滴入20iigpcKH質粒(溶于0.2ml生理鹽水中)，繼續滴入生理鹽水0.3mL，推入少量空氣，將大鼠直立，旋轉，使藥液在雙肺內均勻分布；模型對照組僅滴入生理鹽水0.5mL。(3)肺組織大體觀察:模型組大鼠肺臟顏色灰暗，光澤差，表面粗糙不平，質地較硬，仔細觀察可見散在的灶狀出血點；pcKH和pcK-KGF治療組雙肺表面顏色略暗，粗糙程度明顯低于模型組，出血點等病灶較少，質地較軟。模型對照組與pcKH和pcK-KGF治療組的肺組織肉眼觀察結果分別參見圖9-1、圖9-2和圖9-3。(4)肺組織學觀察:對各組肺組織大體進行肉眼觀察；并在灌洗完后，用眼科剪取左右肺各一葉，固定于4X甲醛溶液，HE染色。HE染色鏡檢，模型組肺實質病變嚴重，纖維化樣區域較多、多灶性，有纖維化早期改變，多見淋巴炎性細胞浸潤；pcKH和pcK-KGF治療組與模型組比較支氣管周圍也有灶性炎癥、個別區域肺泡間隔增厚，纖維細胞、上皮細胞增生，卻程度均較模型組輕。模型對照組與pcKH和pcK-KGF治療組的肺組織學顯微觀察結果分別見圖10_1、圖10_2和圖10_3。(5)肺會目織RNA的提取每組各取0.lg左右的肺組織，加入液氮后研磨至粉狀，轉移到經DEPC處理的離心管中。加入lmlRNAisoReagent裂解夜室溫靜置5min，加入1/5體積(0.2ml)的氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5min。12000rpm4"離心15min，取上層水相轉移至新的離心管中加入與上清液等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，室溫靜置20min。12000rpm4"C離心10min，棄去上清液，加入lml4"預冷的75%乙醇洗滌沉淀，12000rpm4"離心5min，棄去上清液，待乙醇干燥后，加入50ii1DEPC水溶解RNA，-7(TC保存。(6)RT-PCR按照M-MLV逆轉錄酶說明書，進行逆轉錄。反應體系共20iU，RNA樣品5iU。反應條件為42。C，60min;70。C，15min;4。C，5min。大鼠肺表面活性蛋白A(SP-A)引物為A15'-CAGTCCTCAGCTTGCAAGGATC-3，[SEQIDNO.08]，A25'-GCGTTCTCCTCAGGAGTCCTC-3'[SEQIDNO.09]。PCR反應體系為50ii1，反應條件為94。C，5min;94。C，30s，58°C，30s，72°C，60s，32個循環；72。C，10min。大鼠肺表面活性蛋白C(SP-C)引物為C15'-CCATACTGAGATGGTCCTTGAG-3'[SEQIDNO.10]，C25'-GTCTGGAGCCATCTTCATGATG-3'[SEQIDNO.11]。PCR反應體系為50ii1，反應條件為94。C，5min;94。C，30s，55°C，30s，72°C，60s，32個循環；72。C，lOmin。P-actin作為陽性對照，其引物為F15'-TGACGTGGACATCCGCMAG-3'[SEQIDN0.12]，F25'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'[SEQIDNO.13]。PCR反應體系為50iil，反應條件為94。C，5min;94。C，30s，53°C，30s，72°C，60s，32個循環；72。C，lOmin。角質細胞生長因子(KGF)引物為K15'-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3'[SEQIDNO.03]，K25'-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3'[SEQIDNO.04]。PCR反應體系為50iU，反應條件為94。C，5min;94。C，30s，55°C，30s，72°C，60s，32個循環；72。C，lOmin。PCR產物采用1%的凝膠電泳進行檢測。RT-PCR檢測肺表面活性蛋白A/C的表達。結果分別見圖11-1、11-2、11-3、和11-4。如圖ll-l所示，其為e-actin凝膠電泳圖，圖中顯示，各組均可見205bp處的P-actin條帶，并無顯著性差異，說明各組RNA無明顯差異。圖11-1中，Lanel:2000Maker;Lane2:3dpcK-KGF組；Lane3:3dpcKH組；Lane4:3d對照組；Lane5:5dpcK-KGF組；Lane6:5dpcKH組；Lane7:5d對照組；Lane8:7dpcK-KGF組；Lane9:7dpcKH組；LanelO:7d對照組。如圖11-2所示，其為SP-A凝膠電泳圖，圖中顯示，給藥處理3天后，各組的SP-AmRNA均處于較低水平，無明顯差異。第5天后，pcK-KGF、pcKH組出現145bp的目標條帶，SP-AmRNA水平顯著增加。第7天后，各組的SP-AmRNA水平均明顯提高。圖11_2中，Lanel:7dpcK-KGF組；Lane2:7d對照組；Lane3:7dpcKH組；Lane4:5dpcK-KGF組；Lane5:5d對照組；Lane6:5dpcKH組；Lane7:3dpcK-KGF組；Lane8:3d對照組；Lane9:3dpcKH組；Lane10:2000Maker。如圖11-3所示，其為SP-C凝膠電泳圖，圖中顯示，給藥處理3天后，各組的SP-CmRNA均處于較低水平，無明顯差異。第5天后，只有pcK-KGF組出現199bp的目標條帶，其SP-CmRNA水平顯著增加。第7天后，各組的SP-CmRNA水平均明顯提高，但pcK-KGF組明顯高于其他兩組。圖3SP-C中，Lanel:2000Maker;Lane2:7dpcK-KGF組；Lane3:7d對照組；Lane4:7dpcKH組；Lane5:5dpcK-KGF組；Lane6:5d對照組；Lane7:5dpcKH組；Lane8:3dpcK-KGF組；Lane9:3d對照組；LanelO:3dpcKH組。如圖11-4所示，其為KGF凝膠電泳圖，圖中顯示，給藥處理3、5、7天后，與對照組相比，各pcK-KGF組的KGFmRNA水平均明顯提高，說明pcK-KGF質粒應用后可觀察到明顯KGF表達。圖11-4中，Lanel:7dpcK-KGF組；Lane2:7d對照組；Lane3:7dpcKHH組；Lane4:5dpcK-KGF組；Lane5:5d對照組；Lane6:5dpcKH組；Lane7:3dpcK-KGF組；Lane8:3d對照組；Lane9:3dpcKH組；LanelO:2000Maker。(7)輔斜侖:本實驗觀察到pcK-KGF、pcKH可抑制博萊霉素致Wistar大鼠肺纖維化的作用。實驗結果表明重組質粒或重組腺病毒或重組沙門氏菌可有效治療大鼠急，慢性創面的損傷及肺纖維化損傷。根據以上結果說明，本發明涉及的肝細胞生長因子確實具有治療大鼠慢性創面愈合及肺纖維化愈合的作用，并且可以預見具有細胞生長因子具有本發明預期的用途。序列表〈110〉北京三有利技術發展有限公司中國人民解放軍蘭州軍區蘭州總醫院〈120〉細胞生長因子治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的應用〈130>IDC090022〈160>13〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>32〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>1ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc〈210>2〈211>34〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>2tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt34〈210>3〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>3catggatccatgagctetgattecatgg朋g31〈210>4〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>4gtcg朋ttctteagtgattgccateggcag30〈210>5〈211>420〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉克隆的人KGFcDNA序列〈400>5agctetgattacatggaaggtggtgatettcgtgtgcgtcgtctgttctgtcgtecccag60tggtetctgcgtetcgateaacgtggca朋gtea朋ggc3cccaag朋atg朋g朋teat120tecaatetcatgg朋3tccgteccgtggcagttggtettgtggcaatc朋aggcgtgg朋180agcgagttctatctggc朋tg朋c朋gg朋ggtaaactgtatgc朋3g朋ag朋tgcaat240g朋gattgte3cttcaaagaactgattctgg朋朋ccattacaacacctecgcatctgct3003朋tggacccac朋cggtggcga朋tgtttgttgccctgaatc朋朋gggcattccggtg360cgtggtea朋a朋cc朋g旭3g朋c朋3朋accgcccactttctgcctetggcaatcact420〈210>6〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>6cccagtacatgaccttatggg〈210〉7〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>7ggagacttggaaatccccgt〈210>8〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>8cagtcctcagcttgcaaggatc〈210>9〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉引物〈400>9gcgttctcctcaggagtcctc〈210>10<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>10ccatactgagatggtccttg〈210>11〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400>11gtctggagccatcttcatgatg〈210>12〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉引物〈400>12tgacgtggac3tccgc朋ag〈210>13〈211>20〈212>醒<213>人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>13Ctgg朋ggtgg￡lC￡lgCg￡lgg權利要求細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和/或肺纖維化疾病的藥物中的用途。2.權利要求1的用途，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。3.權利要求2的用途，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用；和/或所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌的形式使用，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式使用。4.權利要求2或3的用途，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子；和/或所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。5.權利要求1至4任一項的用途，其特征在于以下任意一項或多項i)所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒；ii)所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒；iii)所述的重組腺病毒為Ad-HGF;iv)所述的重組腺病毒為Ad-KGF;v)所述的重組減毒沙門氏菌為SPH;vi)所述的重組減毒沙門氏菌為SPK;vii)所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎；viii)所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。6.—種藥物組合物，其包含治療有效量的細胞生長因子和任選的藥學可接受的載體。7.權利要求6的藥物組合物，其中所述的細胞生長因子選自肝細胞生長因子和角質細胞生長因子。8.權利要求7的藥物組合物，其中所述的肝細胞生長因子是以攜帶肝細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶肝細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中；和/或所述的角質細胞生長因子是以攜帶角質細胞生長因子基因的重組質粒、重組腺病毒、或重組減毒沙門氏菌形式存在于該藥物組合物中，或者以攜帶角質細胞生長因子基因的其它對于人體無毒或減毒細菌例如雙歧桿菌、大腸桿菌的形式存在于該藥物組合物中。9.權利要求7或8的藥物組合物，其中所述的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子；和/或所述的角質細胞生長因子是人角質細胞生長因子。10.權利要求6至9任一項的藥物組合物，其特征在于以下任意一項或多項i)所述的重組質粒為pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他攜帶HGF基因的真核表達質粒；ii)所述的重組質粒為pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他攜帶KGF基因的真核表達質粒；iii)所述的重組腺病毒為Ad-HGF;iv)所述的重組腺病毒為Ad-KGF;v)所述的重組減毒沙門氏菌為SPH;vi)所述的重組減毒沙門氏菌為SPK;vii)所述的潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病可以為糖尿病，輻射，動脈、靜脈狹窄或堵塞，褥瘡，慢性粘膜潰瘍或其他病因引起的而致局部組織慢性潰瘍；所述的潰瘍性疾病還可以是潰瘍性結腸炎；viii)所述的肺纖維化疾病可以為原因不明肺纖維化疾病，反復感染引起的肺纖維化疾病，輻射引起的肺纖維化疾病，或塵埃引起的肺纖維化疾病等。11.權利要求6至10任一項的藥物組合物，其可用于預防和/或治療潰瘍性疾病特別是慢性潰瘍性疾病及肺纖維化疾病。12.權利要求6至11任一項的藥物組合物，其為粉針劑、注射液、涂抹液、噴霧劑、貼膜劑、搽劑、洗劑、溶液劑、粉末劑、氣霧劑、微粒化制劑、微囊劑等。全文摘要本發明涉及細胞生長因子治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的應用，具體涉及細胞生長因子例如肝細胞生長因子或角質細胞生長因子在制備用于預防和/或治療潰瘍性疾病和/或肺纖維化疾病的藥物中的用途。本發明還涉及包含所述細胞生長因子例如肝細胞生長因子或角質細胞生長因子的藥物組合物，以及使用所述肝細胞生長因子或角質細胞生長因子在需要的受試者中預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病的方法。根據本發明可以有益地預防和/或治療潰瘍性疾病和肺纖維化疾病。文檔編號A61P1/04GK101780269SQ201010000800公開日2010年7月21日申請日期2010年1月20日優先權日2010年1月20日發明者呂同德,吳祖澤,哈小琴,唐仲雄,尹強,王曉娜申請人:北京三有利科技發展有限公司;中國人民解放軍蘭州軍區蘭州總醫院