專利名稱：角質細胞生長因子－2制劑的制作方法
背景技術：
本發明的領域本發明涉及角質細胞生長因子-2(KGF-2)的液體和凍干制劑及其衍生物。本發明還涉及KGF-2的制劑，尤其是可用于需要軟組織生長和再生之適應征的治療用途的局部和可注射的制劑。
相關領域成纖維細胞生長因子家族曾以參與軟組織生長和再生的一個大家族的生長因子出現。它目前包括在蛋白質水平上享有不同同源性的幾個成員，和除了一個例外之外，似乎具有類似廣泛的促有絲分裂譜，即，促進多種多樣的中胚層和神經外胚層起源的細胞增生和/或促進血管形成。
通過序列同源性或因子純化和克隆，KGF原先被鑒定為FGF的一個家族成員。角質細胞生長因子(KGF)從培養的老鼠角質細胞系中作為一種分裂素分離出來(Rubin，J.S.等，美國國家科學院院報86802-806(1989))。不像其它的FGF家族成員，它對間質來源的細胞很少有活性，但刺激上皮細胞的生長。角質細胞生長因子通過來源于皮膚和胎兒肺臟的成纖維細胞產生(Rubin等，(1989))。角質細胞生長因子mRNA被發現在成年人的腎，結腸和腸骨中表達，但不在大腦或者肺臟中表達(Finch，P.W.等，科學245752-755/(1989))。KGF顯示出FGF蛋白質家族內的保守區。KGF以高親和性與FGF-2受體結合。
消弱的創傷愈合是一個重大的病態源，可以導致一些并發癥，如開裂，吻合崩潰和非治愈的創傷。在正常的個體中，創傷愈合完成簡單。相反，削弱的愈合與幾個疾病狀況相聯系，如糖尿病，感染，免疫抑制，肥胖癥，以及營養不良(Cruse，P.J.和Foord，R.，Arch.Surg.107206(1973)；Schrock，T.R.等，Ann.Surg.177513(1973)；Poole，G.U.，Jr.，外科97631(1985)；Irvin，G.L.等，Am.Surg.51418(1985))。
創傷修復是復雜的相互作用和生物學病變過程的結果。在正常的創傷愈合中描述了三個階段急性炎癥期，胞外基質和膠原合成，以及模型重建(Peacock，E.E.，Jr.，創傷修復，第二版，WB Saunders，費城(1984))。該過程牽涉到角質細胞，成纖維細胞和炎癥細胞在創傷位點的相互作用。
理想的是研制能夠促進和增加軟組織生長和再生的藥物組合物的多肽制劑，該藥物組合物(1)在延長的保存期間是穩定的，(2)增加藥用的活性或多肽的效能或者(3)使得在治療范圍內容易使用或者施用多肽。
發明概要本發明涉及KGF-2的液體和凍干制劑，以及它們的缺失突變體或點突變體或取代突變體(本文稱為KGF-2多肽)。本發明還涉及這些KGF-2多肽制劑促進或者加速軟組織生長或者再生的用途，例如在創傷愈合，或者在治療mucocytis或炎癥性的腸疾病方面的用途。本發明的優選制劑使用新型的KGF-2突變體形式，并且在一個實施方案中，使用一個本文稱為KGF2-Δ33的缺失突變體。本制劑中使用的輔助組分(1)提供KGF-2多肽保存的穩定性，(2)進一步提高治療組合物的軟組織治愈活性，和/或(3)當為特定的治療目的使得容易使用和施用時，以一種活性形式提供KGF-2多肽。
本發明的第一個方面涉及一種包含KGF-2多肽和具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑的制劑。有用的緩沖液包括磷酸鹽，醋酸鹽，順烏頭酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，碳酸鹽以及檸檬酸鹽緩沖液，優選的為檸檬酸鹽。
本發明的第二個方面涉及一種包含KGF-2多肽，冷凍干燥成塊劑和具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑制劑。有用的緩沖液包括磷酸鹽，醋酸鹽，順烏頭酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，碳酸鹽以及檸檬酸鹽緩沖液，優選的為檸檬酸鹽。
本發明的第三方面涉及一種包含KGF-2多肽和含巰基的混合物、優選地為能夠穩定KGF-2多肽的單巰基甘油制劑。該制劑優選地包含具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑。該制劑還可包含一種或多種抗氧劑或一種或多種金屬螯合劑。
本發明的第四個方面涉及一種包含KGF-2多肽，緩沖液，和使該制劑在某個預定溫度形成凝膠的高分子量化合物的制劑。一種優選的的高分子量化合物是Pluronic或者Poloxamer的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的嵌段共聚物。含巰基的混合物，如單巰基甘油，也可包含在本制劑中以提供多肽附加的穩定性。
本發明的第五個方面涉及一種包含KGF-2多肽，緩沖劑和增稠劑的制劑。增稠劑用來增加該制劑的粘度。優選的增稠劑為羧甲基纖維素(CMC)，羥乙基纖維素(HEC)，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，Natrosol，以及Carbomers。
此外，本發明的制劑也可以包含金屬螯合劑，抗氧劑或者含巰基混合物如抗壞血酸酯，單巰基甘油，半胱氨酸，生育粉，丁化羥基苯甲醚，硫酸鈉，亞硫酸氫鈉，以及偏亞硫酸鈉，以及防腐劑如m-甲苯酚，苯酚，氯丁烷，氯丁醇，苯甲醇，甲基對羥基苯甲酸酯和丙基對羥基苯甲酸酯。抗微生物防腐劑可以減少KGF-2制劑的穩定性，令人驚奇的是，甲基對羥基苯甲酸酯和丙基對羥基苯甲酸酯的結合被發現適于在KGF-2制劑中使用。本發明的制劑在藥瓶的頭部空間也可以有一層氮氣覆蓋物。此外，本發明的制劑可以包含用氦氣，氬氣，或者氮氣清洗制劑緩沖液。
附圖簡要描述圖形1A-1C說明了KGF-2的cDNA與相應的所推導的氨基酸序列。初始的35個或者36個氨基酸殘基代表可能的引導序列(下畫線的)。對氨基酸使用一個字母的縮寫標準。當試圖確定多核苷酸序列時，序列測定的不準確性是一個普遍的問題。利用373自動DNA序列分析儀(應用生物系統公司)進行序列分析。預計序列分析的準確性大于97％的準確率。(SEQ ID NO1和2)
圖2(A)-2(C)描述了通過本發明的KGF-2多肽刺激正常的原初上皮角質細胞的增生作用。圖(2A)顯示KGF-2對正常的原初上皮角質細胞增生的刺激作用。圖(2B)顯示KGF-2Δ33對正常的原初上皮角質細胞增生的刺激作用。圖(2C)顯示KGF-2Δ28對正常的原初上皮角質細胞增生的刺激作用。
圖3顯示了KGF-2Δ33的液體制劑10個月穩定性的生物活性結果。
圖4顯示了KGF-2Δ33的凍干制劑9個月穩定性的生物活性結果。
圖5顯示了單巰基甘油對KGF-2生物活性的影響。
優選實施方案的詳細描述KGF-2刺激上皮角質細胞，但不是間質細胞如成纖維細胞的增生。這樣，“具有KGF-2蛋白質樣活性的多肽”包括在下面陳述的角質細胞增生實驗中顯示KGF-2活性和結合FGF受體異構形式1-iiib和2-iiib的多肽。
本發明涉及KGF-2多肽的藥物和獸藥制劑。通過參考附

圖1的多肽(SEQID NO2)和由保藏的cDNA編碼的多肽，以及包括附圖1多肽(SEQ ID NO2)的片段，衍生物和類似物，或者由保藏的cDNA編碼的本質上保持與親代多肽相同的生物學功能的多肽定義本文的KGF-2多肽。本發明中使用的多肽可以是重組多肽，天然多肽或者是合成的多肽，優選地為重組多肽。
在pH為4.5或小于4.5，或大于8.0pH時，已經發現KGF-2多肽表現出較差的活性和穩定性。本發明者曾發現KGF-2多肽的氧化和沉淀。當試圖把其配制為用于治療目的的制劑時，這些多肽呈現出一定的困難。為了保持理化性質和生物活性，KGF-2多肽可用抗氧劑(如氧清除混合物)，和/或蛋白質穩定劑(如含巰基混合物)，和/或金屬-螯合劑(如EDTA)進行配制。本文所使用的穩定作用是指在指定的時間段內維持KGF-2多肽的理化性質和實質上的生物學活性。
根據本發明的制劑包含凝膠，增稠劑，溶液和凍干形式。這些制劑本文也稱為“藥物組合物”或者“組合物”。可注射的制劑液體制劑本發明的第一個方面涉及KGF-2多肽的液體制劑，包含一種KGF-2多肽和一種具有介于約pH5.0和約pH8.0之間、更優選地為pH5.5至pH6.5之間、最優選地為pH6.2的緩沖能力的緩沖液。有用的緩沖液包括來源于磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述一種酸的堿金屬或堿土金屬鹽。更優選的緩沖液將是醋酸鹽或者為檸檬酸鹽，最優選地為檸檬酸鹽。例如，制劑可以包含通過在水中把一種緩沖量的檸檬酸或其藥學上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。或者，制劑也可包括通過在水中把一種緩沖量的醋酸或其藥學上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。優選的緩沖液濃度從約5mM到約50mM。最優選的醋酸鹽緩沖液將具有約20mM的濃度，以及檸檬酸鹽緩沖液將具有約10mM到約20mM的濃度。制劑也可包含NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者其組合作為一種補劑，濃度約從0mM至150mM，優選地為10至約150mM，最優選地為約125mM，以及金屬螯合劑，如EDTA，濃度約從0mM至10mM，最優選地為約1mM。另外，本發明的液體制劑也可包含一種或多種(a)一種穩定量的抗氧劑，如抗壞血酸和或(b)一種穩定蛋白質量的巰基化合物，例如單巰基甘油(MTG)。不希望被理論所束縛，人們相信巰基混合物如MTG用作保護KGF-多肽中存在的游離硫羥基基團。用于液體制劑的保存條件典型地在約2℃至約8℃。或者，保存條件在-20℃或低于-20℃。最優選地，保存條件在約-20℃。在冷凍狀態下保存KGF-2液體制劑限制了對多肽的氧化量，轉過來導致形成穩定的多肽制劑。
優選地，液體制劑包含(1)一種治療有效量的KGF-2多肽；(2)一種有效量的具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖液；和(3)一種藥學上可接受的稀釋劑；和(4)可有可無的下列一種或多種(a)NaCl，甘氨酸，蔗糖或甘露醇或者其組合體，作為一種補劑(b)一種螯合劑，(c)一種穩定量的抗氧劑，和
(d)一種穩定量的蛋白質穩定劑。KGF-2多肽優選地保存于溶液中。
本發明的組合物通過一起混合上述所列出的組分進行加工，優選地以本文表示的濃度和比例進行加工。
可用于液體制劑的抗氧劑包括硫酸氫鈉，半胱氨酸，亞硫酸鈉，抗壞血酸，生育粉，以及丁化羥基苯甲醚。此外，可用于液體制劑的穩定劑還包括巰基類如半胱氨酸，甲硫氨酸和巰基甘油。可使用的金屬螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)，或二乙三胺五乙酸(DPTA)，以EDTA為優選。
本發明包含抗氧化劑或巰基類的制劑可以增加KGF-2多肽的穩定性。這使具有較長的貨架壽命的藥物產品成為可能。
此外，本發明的制劑還可包含一種或多種防腐劑，如苯甲醇，優選地濃度為約0.5％至約1.5％，最優選地濃度為0.9％；氯丁醇，優選地濃度為約0.01％至約1％，最優選地濃度為0.5％；甲基對羥基苯甲酸酯，優選地濃度為約0.1％至約0.2％，最優選地濃度為0.18％；丙基對羥基苯甲酸酯，優選地濃度為約0.01％至約0.05％，最優選地濃度為0.02％；間-甲酚，優選地濃度為約0.1％至約1％，最優選地濃度為0.3％；和/或苯酚，優選地濃度為約0.1％至約1％，最優選地濃度為0.5％。特別優選地是甲基對羥基苯甲酸酯和丙基對羥基苯甲酸酯一起使用，甲基對羥基苯甲酸酯的濃度為約0.1％至約0.2％，丙基對羥基苯甲酸酯的濃度為約0.10％至約0.05％。最優選地是甲基對羥基苯甲酸酯和丙基對羥基苯甲酸酯的組合，甲基對羥基苯甲酸酯的濃度為0.18％，丙基對羥基苯甲酸酯的濃度為0.02％。
更優選的液體制劑包含(1)濃度范圍為約0.02至約40mg/ml(w/v)的KGF-多肽，更優選地為約0.05至約30mg/ml(w/v)，甚至更優選地為約0.1至約2mg/ml(w/v)，還有更優選地為約10mg/ml(w/v)；并且最優選地為約0.2至4mg/ml(w/v)；(2)濃度范圍在約5mM至50mM，優選地約5mM至30mM的具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖液；和(3)一種藥物學上可接受的稀釋劑，優選地為水，使組合物稀釋至指定的體積。
用于本發明制劑的有用的緩沖液包括來源于醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸，磷酸鹽和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述酸的堿金屬或堿土金屬鹽。優選的為醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液，如醋酸或者其藥學上可接受的鹽，或者檸檬酸或者其藥學上可接受的鹽。該溶液制劑更優選的pH范圍從約pH5.0至約pH8.0，更優選地為pH5.5至pH6.5，以及最優選地為約pH6.2。醋酸鈉或者檸檬酸鈉是優選的的緩沖劑，尤以檸檬酸鈉鹽為最優選。
優選地向上述溶液中加入的還有(4)一種螯合劑，如濃度范圍在約0.1mM至約10mM，更優選地在約1mM的EDTA；(5)一種補劑，如濃度范圍在約0.01mM至約150mM，更優選地為約125mM的NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者它們的組合體。
可選擇地，一種液體制劑也可以包含一種穩定蛋白質的量的選自下組的混合物(a)約0.5％至約2％w/v的甘油，(b)約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，或者(c)約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油。
本發明該方面的優選實施方案包括通過混合下列物質所形成的組合物(1)濃度為約0.02至約40mg/ml(w/v)，更優選的濃度約0.1至約20mg/ml，最優選的為約0.2至4mg/ml的KGF-2多肽。
(2)10mM的檸檬酸鈉或者20mM醋酸鈉；(3)125mM NaCl；(4)1mM EDTA；和(5)作為稀釋劑的水。
更優選地，該溶液制劑包含通過混合以下物質所形成的組合物(1)約0.2至4mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的醋酸鈉；
(3)125mM的NaCl；(4)1mM的EDTA；和(5)作為稀釋劑的水，其中溶液在約pH6.2，并且在約-20℃保存。
最優選地，該溶液制劑包含通過混合以下物質所形成的組合物(1)約1.0mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的檸檬酸鹽，pH5-5.5；和(3)0.01％的多山梨酸酯80。
該溶液優選地還包含約7％蔗糖或者2％甘氨酸與0.5％蔗糖的組合體。
或者，該溶液制劑包含通過混合以下物質所形成的組合物(1)約1.0mg/ml的一個KGF-2多肽；(2)20mM的檸檬酸鹽，pH5-5.5；(3)1mM的EDTA；和(4)0.01％的多山梨酸酯80。
該溶液優選地還包含約7％蔗糖或者2％甘氨酸與0.5％蔗糖的組合體。
本發明者已經發現KGF-2多肽容易氧化，凝聚和在溶液中沉淀。雖然KGF-2的氧化作用不破壞生物活性，限制該產品的氧化程度導致一種更穩定的產品。本發明者觀察到，如果液體制劑pH太低，KGF-2多肽將失去生物活性。此外，隨著溶液的pH接近KGF-2的pI，蛋白質將從溶液中沉淀下來。因此，本發明者曾測定液體制劑應該保持在約pH6.0至約pH7.0的范圍內，并且約6.2的pH對穩定KGF-2多肽來說是最合適的。而且，發明者令人驚奇地測定到檸檬酸鹽緩沖液特別能穩定KGF-2多肽。
雖然，使用約pH6.0-6.2的檸檬酸鹽緩沖液提供一種可減少KGF-2多肽的凝聚，并且增加穩定性的液體制劑，但液體多肽制劑中KGF-2多肽仍然易受氧化和沉淀。因此，發明者開發了一種下面陳述的凍干制劑。凍干制劑本發明的第二個方面涉及KGF-2多肽的凍干制劑，包含一種KGF-2多肽和一種具有介于約pH5.0和約pH8.0之間、更優選地為pH5.5至pH6.5、最優選地為pH6.2的緩沖能力的緩沖液。有用的緩沖液包括來源于磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述酸的堿金屬或堿土金屬鹽。更優選的緩沖液將是磷酸鹽或者檸檬酸鹽，最優選地為檸檬酸鹽。例如，制劑可以包含通過在水中把一種緩沖量的檸檬酸或其藥學上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。優選的緩沖液濃度從約5mM到約50mM。更優選的緩沖液濃度約為10mM。最優選地，以約10mM的濃度加入檸檬酸緩沖液。在該制劑中優選地還包含作為補劑的氯化鈉，濃度為約0mM至150mM，最優選地為約20mM，以及金屬螯合劑，如EDTA，濃度為約0mM至10mM，最優選地為約1mM。此外，成塊劑/低溫防凍劑如蔗糖，甘氨酸，甘露醇，海藻糖或者其它的藥物學上可接受的成塊劑也包括在該制劑中。使用的成塊劑的量將使溶液是等滲的，范圍在約2％至10％w/v。優選的濃度如下5％甘露醇，7％蔗糖，8％海藻糖，或者2％甘氨酸加0.5％蔗糖。更優選地，使用蔗糖或者蔗糖/甘氨酸的混合物。此外，本發明的凍干制劑也可包含一種或多種的(a)穩定量的抗氧劑，如抗壞血酸或者(b)穩定量的巰基類化合物，例如單巰基甘油。凍干制劑的保存條件典型地是約2℃至約25℃。更優選的保存條件在約2℃至約8℃或者約2℃至約8℃之下。
在初始溶液中濃度為約0.02mg/ml至約10mg/ml的蛋白質被冷凍干燥為KGF-2多肽。
初始的凍干溶液優選地包含(除KGF-2多肽之外)(1)有效量的檸檬酸或者其藥物學上可接受的鹽，優選地為檸檬酸鈉，濃度范圍在約5mM至約20mM；(2)濃度范圍為約0mM至約125mM的NaCl，(3)濃度范圍為約0mM至約10mM的EDTA，(4)一種或多種濃度范圍為約2％w/v至15％w/v的蔗糖，甘露醇，甘氨酸或海藻糖，或者它們的混合物；和(5)水。
冷凍干燥緩沖液優選的pH范圍為約5.5至約8.0，優選地為約pH6.2。
更優選地，冷凍干燥緩沖液包含10mM的檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM的pH6.2的EDTA和7％蔗糖。
凍干的KGF-2多肽制劑在無菌水中重構，以保持約290mOsm的等滲狀態。KGF-2多肽可在無菌水中重構，可以也可以不含有穩定量的抗氧化劑，包含a)約0.01％至約2％w/v的單巰基甘油，b)約0.01％至約2％w/v的抗壞血酸，c)約0.01％至約2％w/v的甲硫氨酸或者，d)它們的組合體。
本發明包括產生穩定的KGF-多肽制劑的冷凍干燥循環。冷凍干燥循環被設計來在初級的干燥階段把KGF-2多肽產品保持在它的折迭溫度之下。此外，含水量優選地定為不到5％，更優選地不到2％％。對任何特定的蛋白質必須在個體基礎上測定這種凍干流程。根據本發明的對含有凍干制劑的KGF-2蔗糖的一個示范凍干循環周期測定如下
根據本發明的對KGF-2凍干制劑的另一個示范凍干循環周期測定如下
本發明的冷凍干燥制劑提供了意外地增加的穩定性的產品。的確，本發明的凍干KGF-2制劑在溫度高達45℃至少9個月生物學性質還是穩定的(圖4)。逆相高效液相色譜顯示本發明的凍干KGF-2制劑在45℃或低于45℃的溫度和75％的相對濕度下保持其理化性質多達8個月。在這樣的高溫下，保持如此之長的時間穩定性對蛋白質是十分不尋常的。增稠的和凝膠制劑本發明的第三個方面涉及KGF-2多肽增稠的或者凝膠制劑。
1)增稠劑增稠劑可以添加到上述所描述的液體制劑中，以增加產生制劑的粘度。具有增加的粘度的一種制劑對局部用藥是有益的，這些局部用藥的地方在控制藥物釋放，粘附到創傷外面或者避免流失掉可能是重要的。這些增稠的制劑被用于局部的用途，如創傷愈合，治療皮膚病或任何其它的通過局部施用KGF-2的藥物組合物能夠治療的用途。
增稠劑應該提高粘度到約50至約10,000厘泊(cps)，更優選地為約50至約1,000cps，最優選地約200至約300cps。利用一個旋轉紡錘粘度計測定粘度。最優選的增稠劑濃度為0至5％(w/w)。增稠的溶液總將保持液體狀態。
合適的增稠劑的例子包括，但不限于水溶性的乙醚化的纖維素和carbomer(高分子量的丙烯酸與烯丙基蔗糖或戊赤鮮糖的烯丙基醚交聯的聚合物)。乙醚化的纖維素的例子是本領域中熟知的(在USP中列出)，包括烷基化纖維素，羥基烷基化的纖維素和烷基化的羥基烷基化纖維素，例如，甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥基丙基甲基化的纖維素等等。在另一實施方案中，局部的或切開的凝膠可包含約0至20％重量的具有50,000至約700,000的分子量的纖維素衍生物。在一優選實施方案中，纖維素衍生物以約2％至8％的重量存在，具有約80,000至約240,000的分子量范圍。優選的纖維素衍生物為羥基丙基甲基化的纖維素，甲基纖維素，羧甲基纖維素，羥基乙基纖維素。
當增稠劑加入到注射制劑中時，為其最佳的穩定性可以加入或者從制劑中去除上面詳述的鹽和緩沖劑。例如，可以增加檸檬酸鹽濃度。例如，優選濃度為約10mM至約500mM的檸檬酸鹽，更優選地為約10mM至約50mM的檸檬酸鹽，最優選地為約10mM至20mM的檸檬酸鹽。此外，在凍干制劑中可減少蔗糖的量到約0至約5％蔗糖的范圍。
增稠劑可直接加入到根據本發明的液體凍干制劑中，然后凍干。或者，根據本發明的凍干制劑可通過加入合適的稀釋劑，最優選地為加入含有溶解在其中的增稠劑的水重構。通過噴霧施用這些增稠的制劑。
根據本發明，一種優選的增稠KGF-2多肽溶液的例子包括通過混合下列物質所形成的產品(1)一種局部有效量的KGF多肽，優選地為KGF-2A33；(2)約10mM至約500mM的檸檬酸鈉鹽緩沖液；(3)約0.01至約150mM的NaCl；(4)約0.75至約1.27mM，優選地為約1ml的EDTA；(5)約0.1％至約7％的蔗糖，或約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖的組合體；(6)約0.75至約1.5％(w/w)的羧甲基纖維素，或約0.5至約1.5％的羥基丙基甲基纖維素，或者約0.25至約0.75％的羥基乙基纖維素，或者約0至1％的carbomer，或者任何它們的組合體。
這樣一種制劑的pH最優選地為pH6.2。
2)凝膠劑本發明的另一方面涉及KGF-2多肽的凝膠制劑。凝膠劑可以添加至本發明的可注射制劑中以提供一種在室溫下保持液體的制劑，并且當施用到皮膚的表面時(在約37℃)可以凝固。這些制劑對局部用藥是有用的，這些局部用藥的地方在控制藥物釋放，粘附到創傷外面或者避免流失掉可能是重要的。這些凝膠的制劑被用于局部用途，如創傷愈合，治療皮膚病或任何其它的通過局部施用一種KGF-2的藥物組合物能夠治療的用途。
根據本發明的KGF-2多肽凝膠制劑包含
(1)一種局部有效量的KGF多肽；(2)一種緩沖液；(3)一種藥物學上可接受的稀釋劑，優選地為水；和(4)一種形成凝膠的高分子量化合物。
本發明的凝膠制劑的粘度在室溫下為約1至約10,000cps的范圍，最優選地為室溫下約20至約100cps。利用一個旋轉紡錘粘度計測定粘度。
本發明中使用的形成凝膠的高分子量化合物典型地是水溶性的能夠形成粘性水溶液的聚合物，或者非水溶性的，遇水膨脹的也能形成粘性溶液和一旦與皮膚接觸即形成凝膠的聚合物(例如膠原蛋白)。
有用的形成凝膠的高分子量化合物可選自乙烯基聚合物，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，多糖，蛋白，聚(乙烯氧化物)，丙烯酰胺聚合物及其衍生物，和/或它們的鹽。在美國專利5,427,778中可以發現能夠用來制造藥物凝膠制劑、用于治愈創傷的其它化合物，本文充分予以一并參考。
有用的乙烯聚合物(或者替代聚乙烯)包括多丙烯酸，多甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯乙醇。有用的多糖包括纖維素衍生物，粘多糖，瓊脂，果膠，褐藻酸，葡聚糖，α-直鏈淀粉，支鏈淀粉，殼聚糖。有用的粘多糖包括透明質酸，軟骨素，4-硫酸軟骨素，硫酸乙酰肝素，肝素。粘多糖與任何其它凝膠形成聚合物，例如，膠原蛋白，明膠，纖連蛋白一起結合可用來提高創傷愈合。丙烯酰胺聚合物可以是聚丙烯酰胺或者聚甲基丙烯酰胺。
優選的高分子量凝膠形成混合物是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物，尤其是那些在貿易上指定為PLURONICS(BASF)或者POLAXAMERS(BASF)的嵌段共聚物。
在一優選的實施方案中，本發明的凝膠按重量比可以包含約10至約60％的具有平均分子量為約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。在一更加優選的實施方案中，本發明的凝膠按重量比可以包含約14至約18％的具有分子量范圍為1,000至15,000的嵌段共聚物。本發明的優選嵌段共聚物是Pluronic F108和Pluronic F127。
聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(Pluronic或者Poloxamer)在局部藥物傳送系統的應用中具有很大的潛力，因為它們表現出可逆的熱凝膠化行為，具有很好的藥物釋放特征以及較低的毒性。當溶液加熱即形成凝膠。因此，凝膠在室溫下是一種低粘性的水溶液，但當它接觸哺乳動物身體時，被體溫溫暖，粘度隨著溶液形成凝膠而增加。例如，Pluronic凝膠可用于KGF-2多肽控制傳輸到創傷以及其它需要局部傳輸藥物的位點。KGF-2多肽可與Pluronic以液態方式結合，并施用到創傷處。凝膠化作用發生并有效地減少多肽釋放至創傷的速率，進而以延長多肽和創傷位點之間的接觸。利用這樣的凝膠制劑的益處包括保持創傷濕潤，持有在形狀上合適于創傷或其它可施用化合物的位點的藥物化合物。
根據本發明的KGF-2多肽的優選凝膠制劑包含檸檬酸鹽緩沖液和Pluronic。該制劑可以包括一定量的檸檬酸酸或者其藥物學上可接受的鹽。
根據本發明的凝膠制劑也可包括螯合劑，穩定量的抗氧劑或者巰基類。凝膠制劑包含以一定量形成凝膠的高分子量化合物，如Pluronic，或者水溶性乙醚化的纖維素，等等。在根據本發明的凝膠制劑中，KGF-2多肽優選地為約0.01mg/ml至約10mg/ml的濃度。
優選地，凝膠制劑的形成通過混合(1)一種KGF-2多肽，優選地為KGF-2Δ33，以最終計算的0.01mg/ml至約10mg/ml的濃度；(2)一種有效量的緩沖劑；(3)約10％至約60％，或者更優選地為約14％至約18％的重量的平均分子量為約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物；和(4)一種藥物學上可接受的稀釋劑，優選地為水。
另一個優選的凝膠制劑包含(1)一種藥物學上具活性量的KGF-2多肽；(2)約10mM至約500mM檸檬酸鈉鹽；(3)約0.01mM至約150mMNaCl；(4)約1mM EDTA；
(5)約0.1％至約7％蔗糖或者約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖；(6)約14％至約18％Pluronic F127；和(7)水，其中制劑的pH約為pH6.2。
最優選地，凝膠制劑包含(1)一種KGF-2多肽，優選地KGF-2Δ33，在約為0.01mg/ml至約10mg/ml(w/v)的濃度范圍，更優選地約0.1mg/ml至約3mg/ml的濃度范圍，最優選地為約0.2mg/ml的濃度；(2)濃度范圍約5mM至20mM的檸檬酸鈉；(3)約10％至約25％(w/v)，優選地為約15至約25，最優選地為約16％的Pluronic127或者Poloxaxner407；(4)約6.7％至約7.3％的蔗糖，優選地為約7％蔗糖或者約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖；和(5)加水至體積。
凝膠制劑還可以包含下列的一種或多種(6)濃度范圍約0.1mM至約10mM的EDTA。
(7)濃度范圍約0.01mM至約125mM的NaCl。凝膠制劑的優選pH范圍從約pH5.0至約pH8.0，優選地為pH6.2，產生的凝膠制劑應該是等滲的。
3)附加的穩定劑本發明的所有前述的制劑可從抗氧化劑，金屬螯合劑，含巰基類混合物和其它通用的穩定劑中受益。這樣的穩定劑的例子包括，但不限于(a)約0.5％至約2％w/v的甘油，(b)約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，(c)約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油，(d)約1mM至約10mM的EDTA，(e)約0.01％至約2％w/v的抗壞血酸，(f)0.003％至約0.02％w/v的多山梨酸酯80，(g)0.001％至約0.05％w/v的多山梨酸酯20，
(h)精氨酸，優選的濃度在約0.5％至約2.5％，最優選地在約1.7％，(i)肝素或者肝素類似物(帶負電荷的)，(j)葡聚糖硫酸鹽，濃度優選地在約0.05％和0.5％，(k)環化糊精或者硫酸鹽環化糊精，(1)陰離子或者多陰離子種類[肝素類似物]，(m)賴氨酸，優選地為10％的濃度，(n)羥基丙基-σ-環化糊精，優選地在約2至10％的濃度，(o)硫酸鹽-σ-環化糊精，優選地在約0.1％和10％的濃度，最優選地在約1％，或者(p)它們的組合體。KGF-2多肽的施用本發明的KGF-2多肽制劑可以使用熟知的在藥物組合物中有用的合適的藥物稀釋劑。這樣的稀釋劑包括但不限于鹽水，緩沖液鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，以及它們的組合。該制劑應該適宜于施藥的模式。優選地，根據本發明上述指定的方法調制藥物組合物。水是優選的稀釋劑。
具有KGF-2活性的多肽以藥物組合物的方式與一種或多種藥物學上可接受的賦形劑施用。不言而喻的是當施藥給一個患者時，本發明的藥物組合物的每日總使用劑量將由出診醫生在其正確的判斷范圍內作出決定。對任一特定病人的特定療效劑量水平將取決于多種因素，包括欲達成的反應類型和程度；特定的組合物，包括是否使用另一種藥劑(如果有的話)；年齡，體重，一般健康，性別和病人的飲食；施藥的時間，施藥的途徑，和組合物分泌的速率；治療持續的時間；與特定的組合物一起使用或同時使用的藥物(如一種化療劑)；以及醫學領域熟知的同類因素。在Remington的藥物科學中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發現本領域熟知的合適的制劑。因此，通過這樣的考慮確定用于本文目的的“有效量”的KGF-2。
本發明的藥物組合物可以以一種方便的形式進行施藥，如通過口服，直腸給藥，局部給藥，靜脈注射，腹膜內注射，肌內注射，皮下注射，關節內施藥，鼻內施藥，吸入，眼內施藥，以及皮內途徑施藥。腸胃外的和局部施藥是優選的用藥途徑。如本文所使用的“腸胃外的”指包括靜脈注射，肌內注射，腹膜內注射，胸骨內注射，皮下注射以及關節內注射和灌輸的用藥方式。
藥物組合物以一定量的、有效治療和/預防特定指征的方式施藥。在大多數情況下，考慮到用藥途徑，癥狀等，KGF-2劑量從每日約1μg/kg至約30mg/kg體重。然而，劑量可以低至0.001g/kg。例如，在特定的局部施藥的情況下，優選施藥劑量從每平方厘米約0.01g至9mg。在鼻內和眼內用藥的情況下，優選的用藥劑量從約0.001μg/kg至約10mg/ml，更優選地從約0.05mg/ml至約4mg/ml。
作為一個一般性建議，腸胃外施用的KGF-2多肽總的藥物有效量的范圍在病人體重的1μg/kg/天至10mg/kg/天，雖然，如上面提到的，這將取決于療效而定。如果連續不斷地施藥，KGF-2多肽典型地以一個約1μg/kg/小時至約50μg/kg/小時的計量速率施藥，例如，使用一個微型泵，通過每天1-4次注射或者通過皮下灌輸。也可使用一種靜脈注射的袋裝溶液或瓶裝溶液。
如果連續施藥不長于一定的最低天數，KGF-2多肽影響纖維蛋白系統的一個療程似乎是最佳的，對小鼠來說為7天。需要觀察治療后產生反應的變化和間隔，治療的時間隨著需要的效果而定。
對于腸胃外施藥，在一實施方案中，一般通過把所需純度的KGF-多肽、以一個單位劑量的可注射形式(溶液，懸浮液，或乳化液)與一個藥物學上可接受的載體(即使用的劑量和濃度對受體為無毒的，并且與制劑中的其它成分具相容性的載體)相混合配制KGF-2多肽制劑。例如，制劑優選地不包括氧化劑和其它已知對多肽有害的化合物。
一般地，通過把KGF-2多肽與液體載體或細小的分開的固體載體或兩者均一地和密切地相互接觸調制制劑。如果必要的話，產品可制成所需的制劑。優選地，載體為腸胃外的一種載體，更優選地為一種與受體血液等滲的溶液。這些載體工具的例子包括水，鹽水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的載體工具如固定油，乙基油酸以及脂質體也是有用的。在Remington的藥物科學中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發現本領域熟知的合適的制劑。
KGF-2多肽也可以液體，滴劑，或增稠的液體，凝膠施用到眼中治療動物和人體的淚腺損傷，失調和病變。
KGF-2多肽也可以液體滴劑或噴霧的形式通過在鼻內施藥到鼻腔粘膜上治療動物和人體的鼻腔粘膜和鼻竇上皮的失調，損傷和病變。
一般地，通過把KGF-2多肽與液體載體或細小的分開的固體載體或兩者均一地和密切地相互接觸調制制劑。如果必要的話，產品可制成所需的制劑。優選地，載體為腸胃外的一種載體，更優選地為一種與受體血液等滲的溶液。這些載體工具的例子包括水，鹽水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的載體工具如固定油，乙基油酸以及脂質體也是有用的。在Remington的藥物科學中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發現本領域熟知的合適的制劑。
載體也可以包含少量的合適的添加劑，如提高等滲性和化學穩定性物質。這樣的物質所使用的劑量和濃度對受體是無毒的，包括緩沖液如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，醋酸，以及其它的有機酸或者它們的鹽；抗氧劑如抗壞血酸；低分子量的多肽(不到10個殘基)，即多精氨酸或三肽；蛋白質，如血清白蛋白，明膠，或者免疫球蛋白；親水性的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；單糖，雙糖，和其它的碳水化合物，包括纖維素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或者糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或者山梨醇；平衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如多山梨酸酯，poloxamers，或者PEG。
KGF-2典型地以這種載體制成的制劑在濃度約為0.01μg/ml至50mg/ml，優選地為0.01μg/ml至10mg/ml，pH為約5至8，優選地約6至約7，最優選地約pH6.2。不言而喻的是使用某種前述的賦形劑，載體，或穩定劑將導致KGF-2鹽的形成。
用于治療用藥的KGF-2可以是無菌的。通過無菌過濾膜(例如，0.2微米的膜)以過濾的方式容易完成無菌處理。治療的KGF-2組合物可置于一個具有無菌出口的容器中，例如，一個靜脈注射的溶液袋或通過皮下注射針頭可刺穿的塞子的藥水瓶。
KGF-2平常地保存于單位或多劑量的容器中，例如，密封的安瓿或藥瓶，作為一種水溶液或一個供重新恢復其水分的凍干制劑。作為一個凍干制劑的例子，3ml的藥水瓶注入1ml的過濾滅菌1％(w/v)的KGF-2水溶液，產生的混合物再冷凍干燥。通過利用注射用水(可選擇性包括一種或多種抗氧化劑)重構凍干的KGF-2制備灌輸溶液。
用藥劑量也可以以患者特定的方式進行安排，以便在血液中提供KGF-2活性的一種所預定的、例如，如同通過RIA技術所測定的濃度。因此，可以調整病人的用藥劑量以便達到有規律的、正在通過血液的濃度，如RIA所測定的、從50ng至1000ng/ml，優選地為150至500ng/ml的濃度級別進行劑量用藥。
KGF-2也可適當地借助于持續釋放系統用藥。持續釋放的組合物的合適的例子包括半滲透的已成型的物件形式的聚合物基質，例如，薄膜，或微膠囊。持續釋放的基質包括多聚乳酸(美國專利3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.Sidman等，生物聚合物22547-556(1983))，多聚(2-羥基乙基異丁烯酸)(R.Langer等.J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)，R.Langer.Chem.Tech.1298-105(1982))，和乙烯乙烯基醋酸(R.Langer，出處同上)或多聚-D-羥基丁酸(EP133,988)。持久釋放的KGF-2組合物也包括脂質體包載的KGF-2。包含KGF-2的脂質體用本質上已知的方法制備DE3,218,121；Epstein，等，美國國家科學院院報823688-3692(1985)；Hwang等，美國國家科學院院報774030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；以及EP102,324。
一般地，脂質體為小的(約200-800埃)單層脂質體類型，其中脂的含量大于約30mol百分比的膽固醇，所選擇的比例調整為最理想的KGF-2療法。
本發明也提供了包含一個或多個裝有一種或多種本發明藥物組合物組分的容器的藥物包或試劑盒。與這些容器相關聯的是政府機構以表格形式規定的布告，控制藥物或生物產品的制造，使用和銷售，該布告反應生產機構的批準，以及供人類施藥的用途和銷售。另外，本發明的多肽，拮抗劑和拮抗物可與其它治療化合物連同使用。
當本發明者檢查按本發明制劑制備的KGF-2多肽的生物活性和穩定性時，驚奇地發現單巰基甘油的使用可以穩定KGF-2多肽，并且在創傷治愈中作為KGF-2多肽的一種增效劑。用于單巰基甘油增效的最適濃度范圍為0.1％至2％w/v。KGF-2多肽KGF-2刺激上皮細胞和表皮角質細胞，但不是間質細胞如成纖維細胞的增生。這樣，“具有KGF-2蛋白樣活性的多肽”包括在下面和美國申請08/910,875陳述的在角質細胞增生試驗中表現KGF-2活性，并且能與FGF受體異構體1-iiib和2-iiib結合的多肽。雖然活性程度不必與KGF-2蛋白質的活性相同，優選地，與KGF-2蛋白質相比，“具有KGF-2蛋白樣活性的多肽”表現出實質上相似的活性(即，相對于參照KGF-2蛋白質而言，候選多肽表現出更大的活性，或不超過十倍的活性，優選地，不大于約兩倍的活性)。
本發明的制劑中使用的KGF-2多肽可以有，也可以沒有N-末端的甲硫氨酸，優選地，多肽將缺乏N-末端的甲硫氨酸。
KGF-2 cDNA克隆于1994年十二月年十六日，以ATCC保藏號75977保藏于美國典型培養物保藏中心，專利保藏處(10801 University，Manassas，VA 20110-2209)。此外，插入到表達載體pHE4-5、編碼KGF-2Δ33的cDNA于1998年一月九日，以ATCC保藏號209575保藏于美國典型培養物保藏中心。
當涉及圖1的多肽(SEQ ID NO2)或保藏的cDNA編碼的多肽時，術語“片段”，“衍生物”和“類似物”是指本質上保留與這種多肽一樣的生物學功能或活性的多肽。因此，類似物包括通過切割前蛋白部分以產生有活性的、成熟的多肽方式被激活的前蛋白。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或者合成多肽，優選地為重組多肽。
圖1(SEQ ID NO2)的多肽片段，衍生物或者類似物，或者由保藏的cDNA所編碼的多肽可以是(i)一種多肽，在其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優選地為保守的氨基酸殘基)所替代，這種替代的氨基酸殘基可以是也不一定是遺傳密碼所編碼的，或(ii)一種多肽，在其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基，或(iii)一種多肽，在其中成熟的多肽與另一種混合物相融合，如一種增加多肽的半保留期的混合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)一種多肽，在其中附加的氨基酸與成熟多肽相融合，如一個引導或分泌序列、或者一個用于純化成熟多肽的序列、或者一個前蛋白序列。這樣的片段，衍生物或者類似物被認為在本領域技術人員所掌握的范圍之內。
術語“肽”和“寡肽”被認為是同意的(如同一般所公認的)，每個術語可按上下文的需要相互交換使用，表示一條通過肽鍵偶聯的至少兩個氨基酸的鏈。本文的單詞“多肽”用于含有十個氨基酸以上的鏈。本文所有的寡肽或多肽公式或序列都以從左到右和由氨基端到羧基端的方向書寫。
本領域所公認的是KGF-2多肽的某些氨基酸序列的變化對該蛋白質的結構或者功能沒有顯著的影響。如果注視序列中的這些變化，應該牢記的是在蛋白質上將有決定其活性的關鍵區域。一般來說，如果使用執行相似功能的殘基，取代形成三級結構的氨基酸殘基是可能的。在其它實例中，如果氨基酸殘基的改變發生在蛋白質的非關鍵區域，這種殘基的類型可能是完全不重要的。
本發明的多肽優選地是一種分離的形式。分離的“多肽”是指從其天然環境中分離的多肽。因此，產生的多肽或包含于一個重組宿主細胞內的多肽被認為是為本發明的目的而分離的。部分地或實質上從一個重組宿主細胞或一個天然來源中純化的多肽也是指這種含義。
本發明的藥物制劑包含SEQ ID NO2的KGF-2多肽(尤其是成熟多肽)及其缺失突變體，以及一些與SEQ ID NO2多肽具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％相似性(更優選地至少90％，95％，96％，97％，98％，99％同源性)的多肽和它們的缺失突變體，還包括具有這樣的多肽部分它們一般地包含至少30個氨基酸和更優選地至少50個氨基酸這樣的多肽部分(如下面描述的缺失突變體)。
如本領域所熟知的，通過把一種多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代序列與第二種多肽氨基酸序列相比較確定兩種多肽之間的“相似性”。
兩種多肽的“％相似性”是指使用Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix第8版本，遺傳學計算機小組，大學研究公園，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)，通過比較兩種多肽的氨基酸序列和比較用于測定相似性的欠缺背景所產生的相似性分值。Bestfit程序利用Smith和Waterman的局部同源性算法(應用數學進展2482-489，1981)尋找兩種序列之間的最佳同源片段。
例如，具有與KGF-2多肽的參照氨基酸序列至少95％“同源性”的氨基酸序列的一種多肽是指除多肽序列可以包括多達5個氨基酸的改變(KGF-2多肽參照氨基酸的每100個氨基酸)之外，多肽的氨基酸序列與參照序列是相同的。換句話說，為了獲得氨基酸序列與一個參照氨基酸序列具有至少95％的同源性的多肽，參照序列中的多達5％的氨基酸殘基可以被缺失或用另外的氨基酸取代，或者參照序列中多達5％的總氨基酸殘基數量的氨基酸可以插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發生在參照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置上，或者介于這些末端位置的其它任何地方，要么單獨地散布于參照序列的殘基中或者分布在參照序列內的一個或多個相鄰基團上。
作為一個實用的物質，任何特定的多肽是否與圖1[SEQ ID NO2]中表示的氨基酸序列，或與保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或者99％的同源性可用已知的計算機程序如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix第8版本，遺傳學計算機小組，大學研究公園，575 Science Drive，Madison，WI 53711)進行常規測定。當使用Bestfit或者任何其它序列對比程序來確定一種特定的序列與根據本發明的參照序列是否具有同源性，例如95％的同源性時，當然要設置參數，在參照氨基酸序列的整個長度范圍上計算同源性的百分率，并允許參照序列中氨基酸殘基總數有多達5％的同源性缺口。
本發明的蛋白質可以是天然存在的，重組產生的，或者使用本領域熟知的技術化學合成的(例如，參見Creighton，1983，蛋白質結構和分子原則，W.H.Freeman和Co.，N.Y.，以及Hunkapiller.M.等，自然310105-111(1984))。例如，對應于本發明的KGF-2多肽的一個片段的多肽可通過使用多肽合成儀合成。而且，如果需要的話，還可向KGF-2多肽序列中引入非傳統的氨基酸或化學氨基酸類似物作為取代或添加。非傳統的氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-型同分異構體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟基-氨基酸，設計的氨基酸如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，一般的氨基酸類似物。而且，氨基酸可以是D(右旋的)或者L(左旋的)。
非天然存在的變異體可使用本領域已知的突變技術產生，這些突變技術包括，但不限于，寡核苷酸介導的突變，丙氨酸掃描，PCR突變，點指導的突變(參見，例如，Carter等，核酸研究134331(1986)；和Zoller等，核酸研究106487(1982))，盒式突變(參見，例如，Well等，基因34315(1985))，限制性選擇突變(參見，例如，Well等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
另外，本發明包括在翻譯期間或之后差異修飾的KGF-2多肽，例如，通過糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護/封阻基團衍生化，蛋白質的水解切割，與一個抗體分子或其它細胞配體形成鍵合，等等。通過已知的技術可以進行任何的化學修飾，這些技術包括，但不限于，通過溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4的化學切割，乙酰化作用，甲基化作用，氧化作用，還原作用，以及在衣霉素存在時的代謝合成，等等。
本發明包括的附加的翻譯后修飾包括，例如N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈，N-末端或C-末端的加工，化學部分與氨基酸主鍵的附著，以及由于原核宿主細胞表達而產生的N-末端甲硫氨酸殘基的添加或缺失。多肽也可用一個可檢測的標記修飾，如酶的，熒光的，同位素的或親和標記以便于蛋白質的檢測和分離。
本發明還提供了化學修飾的KGF-2的衍生物，這些衍生物可提供一些另外的優點，如增加的可溶性，穩定性和多肽的循環時間，或者減少免疫原性(參見美國專利4,179,337)。供衍生化的化學部分可選自水溶性的聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚合物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇等等。多肽可在分子內的隨機位置或分子內的預定位置修飾，并且一種，兩種，三種或多種連接的化學部分。
聚合物可以具有任何分子量，可以是分支的或不分支的。對聚乙二醇，優選的的分子量在約1kDa和約100kDa之間(術語“約”指在聚乙二醇的制備物中，某些分子比規定的分子量將更重一些，某些分子比規定的分子量將更輕一些)以便于處理和制造。也可以使用其它分子量大小的聚乙二醇，取決于所需的治療外觀(例如所需的持續釋放的時間，影響效果，如果對生物活性有任何影響的話，處理的便利，抗原性的程度或者缺乏以及聚乙二醇對用于治療的蛋白質或者類似物的其它已知的影響)。例如，聚乙二醇的平均分子量約為200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10,000，10,500，11,000，11,500，12,000，12,500，13,000，13,500，14,000，14,500，15,000，15,500，16,000，16,500，17,000，17,500，18,000，18,500，19,000，19,500，20,000，25,000，30,000，35,000，40,000，50,000，55,000，60,000，65,000，70,000，75,000，80,000，85,000，90,000，95,000，或者100,000kDa。
如同上面所指出的，聚乙二醇可以有一個分支結構。分支的聚乙二醇曾有過描述，例如，在美國專利5,643,575；Morpurgo等，應用生物化學和生物技術5659-72(1996)；Vorobjev等，核酸182745-2750(1999)；以及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10638-646(1999)，各自公開的內容在此一并參考。
考慮到對蛋白質的功能或抗原結構域的影響，聚乙二醇分子(或其它的化學部分)應該附著在蛋白質上。有一些對本領域的技術人員于可供使用的附著方法，例如，EP 0401 384，本文一并參考(PEG偶聯到G-CSF上)，也參見Malik等，Exp.Hematol.201028-1035(1992)(利用tresyl氯化物報告GM-CSF的錨定作用)。聚乙二醇經反應基團，如一個游離的氨基或羧基，通過氨基酸殘基可以共價地結合。反應基團是活化的聚乙二醇分子可以結合的那些基團。具有一個游離的氨基基團的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N-末端的氨基酸殘基；具有一個游離的羧基基團的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C-末端的氨基酸殘基。巰基基團也可用作附著聚乙二醇分子的一個反應基團。優選地用于治療用途的是附著在氨基基團上，如附著在N-末端上或賴氨酸基團上。
如上面所建議的，聚乙二醇通過鍵合到任何一些氨基酸殘基上可附著在蛋白質上。例如，聚乙二醇通過共價鍵結合到賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸殘基上可連接到蛋白質上。可使用一種或多種化學反應把聚乙二醇附著在蛋白質特定的氨基酸殘基上(例如，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸)或者附著到蛋白質的不止一種類型的氨基酸殘基上(如，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸和它們的組合體)。
人們可以期望尤其在N-末端被化學修飾的蛋白質。利用聚乙二醇作為本發明組合物的說明，人們可以從各種各樣聚乙二醇分子(按分子量，分支，等等)中，從反應混合物中的聚乙二醇分子與蛋白質(或多肽)的比例，從所使用的錨定反應的類型，以及從獲得選擇的N-末端被錨定的蛋白質的方法中選擇。獲得N-末端被錨定的制劑(即，如果必要的話，從其它單錨定的部分中分離該部分)的方法可通過從錨定的蛋白質分子群體中提純N-末端錨定的物質。通過還原烷基化作用可獲得在N-末端修飾位置上的經化學修飾的選擇性蛋白質，該還原烷基化作用利用在一特定的蛋白質中不同類型的可供衍生化的一級氨基酸基團(賴氨酸對N-末端)的差別反應性。在合適的反應條件下，在蛋白質的N-末端用一個含羧基的聚合物可完成實質上選擇性的衍生化。
如同上面所表明的，本發明的蛋白質的錨定可通過任何一些方式完成。例如，聚乙二醇可直接地或通過一個介入的接頭附著在蛋白質上。對聚乙二醇附著在蛋白質上的無接頭系統在以下參考文獻中有過描述Delgado等，Crit.V.Thera.Drug Carrier Sys.9249-304(1992)；Francis等，國際血液學雜志.681-18(1998)；美國專利4,002,531；美國專利5,349,052；WO 95/06058；和WO 98/32466，每篇文獻的公開的內容在此一并參考。
無須介入的接頭把聚乙二醇直接地附著在蛋白質的氨基酸殘基上的一個系統使用三氟乙磺酸化(tresylated)MPEG(使用三氟乙磺酰氯(ClSO2CH2CF3)，通過單甲氧基聚乙二醇(MPEG)的修飾而產生的)。蛋白質與三氟乙磺酸化MPEG反應，聚乙二醇直接地附著在蛋白質的蛋白質的胺基團上。因此，本發明包括通過本發明的蛋白質與具有2，2，2-三氟乙磺酰基團的一個聚乙二醇反應而產生的蛋白質-聚乙二醇綴合物。
用一些不同的介入接頭，聚乙二醇也可附著在蛋白質上。例如，美國專利5,612,460，其整個說明書本文一并參考，公開了用于連接聚乙二醇和蛋白質的氨基甲酸乙酯接頭。蛋白質-聚乙二醇綴合物(其中聚乙二醇通過一個接頭附著在蛋白質上)也可以通過蛋白質與化合物(如MEPG-琥珀酸琥珀酰亞氨基酯，用1，1’羰基二咪唑活化的MPEG，MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸鹽，MPEG-p-氮苯基碳酸鹽，和各種各樣的MPEG-琥珀酸酯衍生物)反應產生。一些另外的聚乙二醇衍生物和把聚乙二醇附著在蛋白質上的反應化學在WO 98/32466中描述過，其整個說明書本文一并參考。用本文陳述的反應化學所產生的錨定的蛋白質產物包括在本發明的范圍之內。
附著在本發明的每種蛋白質上的聚乙二醇部分的數量(即，取代的程度)也是可以變化的。例如，本發明的錨定蛋白質可連接到平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20，或更多的聚乙二醇分子上。類似地，在這些范圍內如每個蛋白分子上有1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20聚乙二醇部分的平均取代程度。測定取代程度的方法，例如在Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sye.9249-304(1992)中有過描述。KGF-2缺失突變體天然的KGF-2在含水的狀態下是相對不穩定的，并且在加工和保存期間經歷化學和物理降解，導致生物活性的喪失。天然的KGF-2在含水的溶液中在溫度提高時也傾向于聚集，并且在酸性條件下被滅活。
特別優選的KGF-2多肽是如下所顯示的缺失突變體(數字起始于蛋白質的第一個氨基酸(Met)Thr(殘基36)--Ser(殘基208) Gly(41)--Ser(208)Cys(37)--Ser(208) GIn(42)--Ser(208)Gln(38)--Ser(208) Asp(43)--Ser(208)Ala(39)--Ser(208) Met(44)--Ser(208)Leu(40)--Ser(208) Val(45)--Ser(208)Ser(46)--Ser(208)Pro(47)--Ser(208)Glu(48)--Ser(208)Ala(49)--(Ser208)Thr(50)--Ser(208)Asn(51)--Ser(208)Ser(52)--Ser(208)Ser(53)--Ser(208)Ser(54)--Ser(208)Ser(55)--Ser(208)Ser(56)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(200)Phe(57)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ala(199)Ser(59)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ser(198)Ser(62)--Ser(208)Met(I)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(197)Ala(63)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Asn(196)Gly(64)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(195)Arg(65)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(194)Val(67)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(193)Ser(69)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(192)Val(77)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(191)Arg(80)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(188)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(207)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(187)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(206)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(183)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(205)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Met(204)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Pro(203)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Leu(202)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Phe(201)優選的實施方案包括N-末端缺失Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)。其它優選的的N-末端與C-末端缺失突變體包括Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；和Gly(138)--Ser(208)。其它優選的C-末端缺失突變體包括Met(1)，Thr(36)，或者Cys(37)--Lys(153)。
本發明還包括從N-末端和C-末端兩者都缺失的氨基酸的缺失突變體。這樣的突變體包括所有以上描述的N-末端缺失突變體與C-末端缺失突變體的組合，例如，Ala(39)--His(200)，Met(44)--Arg(193)，Ala(63)--Lys(153)，Ser(69)--Lys(153)，等等。利用本領域的技術人員所熟知的重組技術可以產生這些組合。
因此，供本發明的藥物制劑使用的優選KGF多肽包括N-末端缺失突變體，包括那些含有圖1(Seq ID NO2)中顯示的氨基酸序列，但除了至少第一個38個N-末端氨基酸殘基的缺失之外(即，圖1(Seq ID NO2)中的至少Met(1)-Gln(38)但不超過其第一個147個N-末端的氨基酸殘基的缺失)。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個38個N-末端氨基酸殘基(即至少Met(1)-Gln(38)的缺失)但不超過其第一個147個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個46個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個62個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少第一個68個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個76個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個92個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個103個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少第一個122個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個137個N-末端的氨基酸殘基)的突變體。
除含有以上描述的N-末端缺失突變體范圍的KGF-2突變體的制劑之外，本發明還針對具有所有上述描述范圍的制劑，即圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個62個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個68個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個62個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個76個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個62個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個92個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個62個氨基酸殘基但不超過其第一個103個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個68個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個76個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個68個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個92個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個68個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個103個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個46個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個62個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個46個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個68個N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個46個N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個76個N-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
在另一實施方案中，本發明提供了包含C-末端缺失突變體的制劑。優選地，所說的C-末端缺失突變體的N-末端氨基酸殘基是圖1(Seq ID NO2)中的第1個氨基酸殘基(Met)，第36個氨基酸殘基(Thr)，或者第37個氨基酸殘基(Cys)。除了不包含至少最后的C-末端氨基酸殘基(Ser(208)但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基的缺失(即圖1(Seq ID NO2)中的氨基酸殘基Glu(154)-Ser(208)的缺失)之外，包含突變體的這些制劑包含那些包含圖1(Seq ID NO2)中所顯示的氨基酸序列。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基但不超過最后的65個C-末端氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后10個C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后30個C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后40個C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少最后50個C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基)的突變體。
除包含以上描述的C-末端缺失突變體范圍的KGF-2突變體的制劑，本發明還針對具有所有上述描述范圍的制劑，即圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的10個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的20個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的40個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq IDNO2)中的至少最后的10個C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的20個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的40個C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的20個C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個C-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
在另一實施方案中，KGF-2多肽可以是一個具有從N-末端和C-末端兩者都缺失的氨基酸的缺失突變體。這樣的突變體包括所有以上描述的N-末端缺失突變體與C-末端缺失突變體的組合。除圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個46個N-末端氨基酸殘基但不超過第一個137個N-末端氨基酸殘基的缺失和至少最后的C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基的缺失之外，這種突變體包括那些含有圖1(Seq ID NO2)中表示的氨基酸序列。或者，一種缺失可包括圖1(Seq ID NO2)中的第一個62個，68個，76個，92個，103個或122個N-末端氨基酸殘基但不超過第一個137個N-末端氨基酸殘基以及圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個，20個，30個，40個或50個C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個C-末端氨基酸殘基的缺失。還包括所有上述所描述的范圍的組合。KGF-2取代突變體有用的KGF-2多肽包括那些具有氨基酸取代的多肽。天然的成熟KGF-2包含44個帶電殘基，其中32個帶有正電荷。取決于這些殘基在蛋白質的三維空間結構中的位置，用帶負電荷或中性電荷的氨基酸取代一個或多個這些成簇的殘基可以改變相鄰氨基酸的靜電相互作用，并且對增加蛋白質的穩定性和減少其凝聚作用可能是有用的。蛋白質的凝聚作用不僅僅導致其活性的喪失，當配制藥物制劑時也成問題，因為它們可以具有免疫原性(Pinckard等，Clin.Exp.ImmuNOl.2331-340(1967)，Robbins等，糖尿病36838-845(1987)，Cleland等，Grit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10307-377(1993))。任何修飾應該考慮到在蛋白質分子的三級結構中最大限度地減少電荷排斥。因此，具有特別興趣的是用另一種電荷和用中性的或帶負電荷的氨基酸取代帶電的氨基酸。后者(指用中性的或帶負電荷的氨基酸取代)導致具有減少的正電荷的蛋白質，以改進KGF-2的特性。與天然多肽相比，這種改進包括增加類似物的穩定性和減少其凝聚作用。
氨基酸的取代也可改變結合到細胞表面受體的選擇性。Ostade等，自然361266-268(1993)描述了某種TNFα突變導致TNFα選擇性地只結合于其中一種兩種已知的TNF受體。
KGF-2分子可以包含一種或多種來源于自然突變或人類操縱的氨基酸取代，缺失或添加。某些優選的突變例子是Ala(49)Gln，Asn(51)Ala，Ser(54)Val，Ala(63)Pro，Gly(64)Glu，Val(67)Thr，Trp(79)Val，Arg(80)Lys，Lys(87)Arg，Tyr(88)Trp，Phe(89)Tyr，Lys(91)Arg，Ser(99)Lys，Lys(102)Gln，Lys103(Glu)，Glu(104)Met，Asn(105)Lys，Pro(107)Asn，Ser(109)Asn，Leu(111)Met，Thr(114)Arg，Glu(117)Ala，Val(120)Ile，Val(123)Ile，Ala(125)Gly，Ile(126)Val，Asn(127)Glu，Asn(127)GIn，Tyr(130)Phe，Met(134)Thr，Lys(136)Glu，Lys(137)Glu，Gly(142)Ala，Ser(143)Lys，Phe(146)Ser，Asn(148)Glu，Lys(151)Asn，Leu(152)Phe，Glu(154)Gly，Glu(154)Asp，Arg(155)Leu，Glu(157)Leu，Gly(160)His，Phe(167)Ala，Asn(168)Lys，GIn(170)Thr，Arg(174)Gly，Tyr(177)Phe，Gly(182)Gln，Ala(185)Val，Ala(185)Leu，Ala(185)Ile，Arg(187)GIn(190)Lys，Lys(195)Glu，Thr(197)Lys，Ser(198)Thr，Arg(194)Glu，Arg(194)Gln，Lys(191)Glu，Lys(191)Gln，Arg(188)Glu，Arg(188)Gln，Lys(183)Glu。
例如，通過設計，Ala(49)Gln是指圖1(Seq ID NO2)中的第49個位置的Ala被Gln所取代。
這些變化的氨基酸優選地具有次要的性質，如不顯著地影響蛋白質的折疊或者活性的保守氨基酸取代。對本領域技術人員熟知的保守氨基酸取代的例子陳述如下芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸疏水性的 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸較小的丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸當然，技術人員想取代的氨基酸的數量依賴于許多因素，包括以上描述的那些因素。一般地說，對任何給定的KGF-2多肽的取代的氨基酸數量將不超過50，40，30，20，10，5，或者3個(取決于特定的目的)。例如，在KGF-2的C-末端可作一些取代以改進穩定性。
通過本領域熟知的方法，可以鑒定KGF-2中對功能必需的氨基酸，如定點突變或丙氨酸掃描突變(Cunningham和Well，科學2441081-1085(1989))。后一種方法的步驟在氨基酸分子的每個殘基引入單個丙氨酸突變。然后對產生的突變體分子測定其生物學活性，如受體結合或活體外或活體內的增生活性(參見，例如，實施例1)。也可通過結構分析如晶體化，核磁共振或光親和標記測定配體-受體結合的關鍵位點。(例如，參見Smith等。分子生物學雜志224899-904(1992)；和de Vos等。科學255306-312(1992))。
其它有用的KGF多肽包括在氨基酸位置37，106和150以絲氨酸取代半胱氨酸的多肽。不均衡數量的半胱氨酸意味著至少一個半胱氨酸殘基可用于使蛋白質呈現不需要的三級結構的分子間的交互連接或形成鍵合。一個或多個半胱氨酸被絲氨酸或丙氨酸取代的新型的KGF-蛋白一般地能以較高產量的可溶性的、正確折疊的蛋白質形式提純。雖然不希望束縛于理論，人們相信第106個位置上的半胱氨酸殘基對功能是重要的。該半胱氨酸殘基在所有其它的FGF家族成員中都是高度保守的。
另外的KGF-2多肽在以下專利申請中都有過描述PCT/US95/01790，于1995年2月14日申請，美國專利申請08/461,195，于1995年6月5日申請，08/696,135，于1996年8月13日申請，60/023,852，于1996年8月13日申請，60/039,045，于1997年2月28日申請，08/862,432，于1997年5月23日申請，60/055,561，于1997年8月13日申請，08/910,875，于1997年8月13日申請，09/023,082，于1998年2月13日申請，09/345,373，于1999年7月1日申請，60/142,343，于1999年7月2日申請，60/143,648，于1999年7月14日申請，60/144,024，于1999年7月15日申請，60/148,628，于1999年8月12日申請，60/149,935，于1999年9月24日申請，60/163,375，于1999年11月3日申請，60/171,677，于1999年12月22日申請，和60/198,322，于2000年4月19日申請，所有公開內容本文一并參考。KGF-2多肽組合物的治療用途本發明的多肽可以刺激角質細胞的細胞生長和擴散。因此，本發明的組合物可用于刺激上皮細胞增生和用于創傷治愈為目的的基部角質細胞生長，并且刺激毛囊產生，和治愈皮膚創傷。這些創傷可以具有表面的性質或者是很深的創傷，并且包括皮膚的真皮和表皮損害。
KGF-2對治療一些疾病是有用的。例如，KGF-2在體外和體內的各種的創傷治愈模型中是有活性的。參見，美國專利申請08/910,875，申請于1997年8月813日和09/023,082，申請于1998年2月13日。
被KGF-2施藥的個體以一種正常的速率可以治愈創傷，或者其治愈被削弱。當施藥給其治愈不被削弱的個體時，施用KGF-2加速正常的治愈過程。當施藥給其治愈被削弱的個體時，施用KGF-2有利于以其它方式慢慢地治愈或者根本不能治愈的創傷的治愈。一些疾病和癥狀可以導致治愈被削弱。這些疾病和癥狀包括糖尿病(例如，II型糖尿病)，用類固醇和非類固醇藥物因子的治療，局部缺血障礙或傷害。
一些生長因子顯示了在治愈削弱的個體中可促進創傷治愈。這些生長因子包括生長激素釋放因子，血小板來源的生長因子，和基本的成纖維細胞生長因子。因此，本發明還包括與一種或多種生長因子或其它的促進創傷治愈的因子連同施用的KGF-2組合物。
本發明的組合物也促進在個體中由外科手術過程造成的吻合和其它傷口(兩種傷口都以正常速率愈合創傷，并且治愈也受削弱)的治愈。
也可以使用本發明的組合物刺激細胞，例如，肌肉細胞，構成神經組織的細胞，前列腺細胞和肺部細胞的分化。
本發明的組合物在臨床上對刺激創傷的傷口治愈是有用的，這些創傷包括外科傷口，切除傷口，牽涉損害真皮和表皮的深度創傷，眼組織創傷，牙組織創傷，口腔創傷，糖尿病引起的潰瘍，真皮潰瘍，肘潰瘍，動脈潰瘍，靜脈郁積潰瘍，在正常的個體和那些誘導反常的創傷治愈狀況(如尿毒癥，營養不良，維生素缺乏癥，肥胖癥，感染，免役抑制和與用類固醇、輻射治療和用抗腫瘤藥物以及抗代謝物治療相關的并發癥)的個體暴露于熱或冷的極端溫度、或暴露于化學藥品引起的灼傷。組合物對促進與局部缺血和局部缺血傷害(例如，通過靜脈循環系統返回和/或不足的削弱所造成的慢性靜脈腿潰瘍)相關聯的創傷治愈；對皮層損失之后的皮層重建；對增加表皮的抗拉強度和表皮厚度；對增加皮膚移植到傷口層的粘附和刺激傷口層的上皮重新形成都是有用的。
KGF-2多肽的其它治療用途包括，但不限于，例如，刺激上皮細胞增生和基部的角質細胞，其目的在于治療灼傷和皮膚缺陷如牛皮癬和表皮水皰癥。KGF-2也可用來減少由于輻射，化療治療或者病毒感染引起的消化道毒性的副作用。KGF-2可以用來治療肝臟，肺臟，腎，胸部，胰腺，胃部，小腸，以及大腸的疾病和癥狀。KGF-2可用來治療腸炎疾病，糖尿病，血小板減少，血纖維蛋白原過少，血清蛋白減少，球蛋白過少，出血膀胱炎，口腔干燥，角膜結膜炎干燥。KGF-2可以用來刺激唾腺，淚腺的上皮細胞，刺激鼻竇的上皮再形成和鼻部粘膜的生長。
一些其它的可通過本發明的組合物治療的疾病癥兆在美國專利申請08/910,875，和09/023,082中有過描述，本文一并參考。
本發明涉及KGF-2的新型液體和凍干制劑以及它們的缺失突變體。本發明還涉及治療用途的KGF-2制劑。該制劑給有活性的KGF-2多肽提供優越的穩定性，在一些實例中，加強和顯著地增加該多肽的創傷治愈活性。
如本文所使用的，“個體”是指動物，優選地為哺乳動物(如類人猿，奶牛，馬，豬，公野豬，綿羊，嚙齒動物，山羊，狗，貓，小雞，猴子，野兔，雪貂，鯨魚，以及海豚)，更優選地為人類。
本發明的制劑中所使用的KGF-2Δ33多肽可以有也可以不必有N-末端甲硫氨酸，優選地多肽將缺乏N-末端甲硫氨酸。本發明的KGF-2多肽制劑的穩定性可由以下描述的增生試驗測定。
KGF-2其它的治療用途在美國專利申請60/074,585(申請于1998年2月13日)，60/114,484(申請于1998年12月30日)，以及09/248,998(申請于1999年2月12日)中都有過描述，所有的專利申請說明書本文一并參考。角質細胞增生試驗皮膚角質細胞是皮膚表皮中的細胞。在創傷治愈中，皮膚中角質細胞的生長和擴散是一個重要過程。因此，角質細胞的增生實驗在刺激角質細胞生長和創傷治愈中是蛋白質活性的一個有價值的指示物。
然而，角質細胞難于在體外生長。極少的角質細胞細胞系可以存活。這些細胞系具有不同的細胞和遺傳缺陷。為了避免由于這種細胞缺陷(如主要的生長因子的喪失和主要的生長因子對生長的依賴性)造成的該試驗的復雜性，選擇原初皮膚角質細胞用于該試驗。這些皮膚角質細胞是從Clonetics公司(San Diego，CA)獲得的。
KGF-2多肽的生物活性是使用經成纖維細胞生長因子2iiib受體(FGFR2iiib)轉染的鼠的Baf3 2b細胞通過細胞增生試驗測定的。在細胞暴露于以下描述的蛋白質之后，通過滲入[甲基-3H]-胸苷測定這些細胞的增生。該試驗在96孔組織培養平板中進行的，每個孔中用約22,000個Baf32b細胞。這些細胞暴露于不同濃度的KGF-2多肽中，設三個重復，于37℃下在CO2培養箱中培養約48小時。然后向每個孔中加入近似量的含標記的胸苷的細胞培養基，并繼續培養5小時。然后用細胞收獲器，在一個96孔格式的玻璃纖維過濾墊上收獲細胞。干燥過濾墊，用平底的液體閃爍器記數滲入到每種樣品的放射活性。在這些測定條件下，與用適當稀釋的空白對照緩沖液或簡單地用磷酸鹽緩沖液處理的細胞相比，暴露于KGF-2的細胞表現出增加的放射活性滲入。
另一個有用的角質細胞擴散試驗是用Alamar藍。當加入到培養基中時，Alamar藍是一種通過線粒體代謝能存活的藍色染色。該染料在組織培養的上清液中變為紅色。紅色染料的量可直接地通過介于570nm至600nm之間的光密度的讀數差異定量測定。該讀書反應細胞活性和細胞數量。
正常的皮膚角質細胞(CC-0255，NHEK-新的混合)是從Clonetics公司(San Diego，CA)購買的。這些細胞是第2代。角質細胞生長于完全的角質細胞生長培養基中(CC-3001，KGM；Clonetics公司)，直到它們達到80％的融合性。這些細胞根據生產商的說明書進行胰蛋白酶消化。簡單地，細胞用Hank的平衡鹽溶液洗滌兩次。加入胰蛋白酶中和溶液。細胞在室溫下以600xg離心5分鐘，再用預熱的培養基以每平方厘米3000個細胞涂板于一個新的燒瓶中。對于增生試驗，用完全培養基在Corning平底96孔平板中的每個孔中涂板1000至2000個角質細胞，最外面一排除外。這有助于使孔的溫度和濕度波動保持到最低。用5％的CO2在37℃下過夜培養細胞。用角質細胞基本培養基(CC-3101，KBM，Clonetics公司)洗滌細胞兩次，并向每個孔中加入100μl的KBM。溫育24小時。用KBM以系列緩沖液稀釋生長因子，并向每個孔中加入100μl。用KGM作為正對照，KBM作為負對照。每個濃度點使用6個孔。培養2至3天。在培養的最后，用KBM洗滌細胞一次，與10％的v/v的預先混合于培養基中的Alamar藍一起加入100μl的KBM。培養6至16小時，直到KGM陽性對照中的培養基顏色開始變為紅色為止。通過直接地把平板置于平板讀數計中測定570nm的光密度減去600nm的光密度。KGF-2缺失突變體的構建通過下列流程構建用于本發明組合物的有用的缺失突變體。
利用一優化的KGF-2構建體為模板，從KGF-2基因的5’端和3’端構建缺失突變體。缺失是根據可能消極地影響在大腸桿菌中的表達的基因區選擇的。對5’端的缺失，使用下面列出的引物作為5’端引物。這些引物含有指定的限制位點和編碼起始甲硫氨酸的ATG。KGF-2(FGF-12)208氨基酸的3’HindIII引物用作3’引物。用標準的條件完成25輪PCR擴增。KGF-236aa/208aa的缺失突變體產物進行5’端位置的BspHI消化和3’端位置的HindIII消化，并克隆至用BspHI和HindIII消化的pQE60中。所有其它產物用NcoI作5’端的限制酶消化和用HindIII作3’端的限制酶消化，并克隆至用NcoI和HindIII消化的pQE60中。對KGF-2(FGF-12)，36aa/153aa與128aa3’端的HindIII用作3’端引物，FGF-12 36aa/208aa用作5’端引物。對于FGF-12 62aa/153aa，128aa3’端的HindIII用作3’端引物，FGF-1262aa/208aa用作5’端引物。產生的這些克隆的命名是指由缺失產生的多肽的第一個和最后一個氨基酸。例如，KGF-2 36aa/153aa是指缺失突變體的第一個氨基酸為KGF-2的第36個氨基酸，最后一個氨基酸為KGF-2的第153個氨基酸。這些KGF-2缺失突變體的構建在美國專利申請08/910,875，和09/023,082，中有過描述，本文一并參考。此外，如以下所指出的，每個突變體都向其N-末端加入了甲硫氨酸。然而，根據本發明在制劑所使用的KGF-2缺失多肽可以具有或者也不必有N-末端的甲硫氨酸，優選地多肽將缺乏N-末端的甲硫氨酸。缺失引物序列FGF12 36aa/208aa5’Bsphl GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQ ID NO3)FGF12 63aa/208aa5’NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG(SEQ ID NO4)FGF12 77aa1208aa5’NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG(SEQ ID NO5)FGF12 93aa/208aa5’NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC(SEQ ID NO6)FGF12 TO4aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC(SEQ ID NO7)FGF12 123aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC(SEQ ID NO8)FGF12 138aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG(SEQ ID NO9)FGF12 3’HindIII(用于所有以上的缺失克隆)CTGCCCAAGCTfl7ATTATGAGTGTACCACCATfGGAAG(SEQ ID NO10)FGF12 36aa/153aa
5’Bsphl(同上)3’HindIIICTGCCCAAGCTTATTACTFUCAGCTTACAGTCATTGT(SEQ ID NO11)FGF12 63aa/153aa5’NcoI和3’HindIII，同上N-末端缺失突變體KGF-2Δ33的構建在pQE6中構建KGF-2Δ33為了使得可以進行聚合酶鏈式反應指導的擴增和KGF-2Δ33亞克隆至大腸桿菌蛋白表達載體pQE6中，用下列堿基序列合成對應于所需的KGF2區域的兩個寡引物(5952和19138)。引物59525’GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3’(SEQ ID NO12)引物191385’GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3’(SEQ ID NO13)對N-末端引物(5952)，引入一個AflIII限制性位點，而對C-末端引物(19138)，引入一個HindIII限制性位點。引物5952在KGF2編碼區附近和框架內也包含一個ATG序列，使克隆片段在大腸桿菌內翻譯，而引物19138在KGF2編碼區附近和框架內包含保證在大腸桿菌內正確翻譯終止的兩個終止密碼子(優選地在大腸桿菌中使用)。
用本領域技術人員熟知的標準條件和成熟的KGF-2(aa36-208)的核苷酸引物作為模板完成聚合酶鏈式反應。產生的擴增子用AflIII和HindIII限制性消化并亞克隆至NcoI/HindIII消化的pQE6蛋白質表達載體中。
在pHE1中構建KGF-2Δ33為了使得可以進行聚合酶鏈式反應指導的擴增和KGF-2Δ33亞克隆至大腸桿菌蛋白表達載體pHE1中，用下列堿基序列合成對應于所需的KGF2區域的兩個寡引物(6153和6150)。引物61535’CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3’(SEQ ID NO14)引物61505’CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG3’(SEQ ID NO15)對N-末端引物(6153)，引入一個NdeI限制性位點，而對C-末端引物(6150)，引入一個Asp718限制性位點。引物6153在KGF2編碼區附近和框架內也包含一個ATG序列，使克隆片段在大腸桿菌內翻譯，而引物6150在KGF2編碼區附近和框架內包含保證在大腸桿菌內正確翻譯終止的兩個終止密碼子(優選地在大腸桿菌中使用)。
用本領域技術人員熟知的標準條件和成熟的KGF-2(aa36-208)的核苷酸引物作為模板完成聚合酶鏈式反應。產生的擴增子用NdeI和Asp718限制性消化并亞克隆至NdeI/Asp718消化的pQE6蛋白質表達載體中。
KGF-2Δ33的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA(SEQ ID NO16)KGF-2Δ33的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO17)B.優化的KGF-2Δ33多核苷酸序列的構建為了增加KGF2Δ33在大腸桿菌中的表達水平，對完整基因的密碼子進行優化、以便與用于大腸桿菌中的那些密碼子最高度地匹配。由于用來產生KGF2Δ33的模板在N-末端區內為密碼子最優化的，C-末端氨基酸(84-208)需要最優化。
首先，氨基酸172-208是密碼子優化而產生KGF2Δ33(s172-208)。這可通過一個重復的PCR策略完成。寡核苷酸PM07和PM08(對應于氨基酸172-208)相結合，并通過把它們加熱到70℃一起退火，冷卻至37℃。然后用退火的寡核苷酸作為模板用于標準的由引物PM07和PM08指導的PCR反應。在一個單獨的PCR反應中，用本領域的技術人員所熟知的標準條件和用KGF2Δ33作為模板，寡聚核苷酸PM05(它與KGF2的編碼區內的PstI位點重疊)和PM11用于擴增對應于氨基酸84-172的KGF2的區域。在第三個PCR反應中，第一個PCR反應的產物(對應于密碼子優化的氨基酸172-208)與第二個PCR反應的產物(對應于密碼子非優化的氨基酸84-172)相結合，并用作引物PM05和PM10指導的標準PCR反應的模板。產生的擴增子用Pst1/HindIII消化并亞克隆至用Pst1/HindIII消化的pQE6KGF2Δ33，有效地取代了相應的非密碼子優化區，并創建pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
為了完成對KGF2的密碼子優化，用重疊的寡聚核苷酸產生一個為對應于氨基酸84-172的KGF2區域所優化的合成的基因密碼子。四個寡核苷酸(PM31，PM32，PM33，PM34)相結合，完成7個循環的以下PCR94℃，30秒；46.5℃，30秒；72℃，30秒。
用標準的程序，使用1μ的第一個PCR反應為模板，完成PM35和PM36指導的第二個PCR反應。產生的密碼子優化的基因片段用Pst1/Sal1消化，并亞克隆到Pst1/Sal1消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中，以創建一個充分優化的KGF2編碼基因，pQE6KGF2Δ33s。
為了創造一個可供選擇的大腸桿菌蛋白質表達載體，把KGF2Δ33s用引物PM102和PM130在pQE6KGF2Δ33s上進行PCR擴增。產生的擴增子用NdeI和EcoRV消化，并亞克隆到用NdeI和Asp718(平端的)消化的pHE1表達載體上以創建pHElΔ33s。
用于構建密碼子優化的KGF2Δ33s的寡核苷酸序列PM05CAACCACCTGCAGGGTGACG(SEQ ID NO18)PM07AACGGTCGACAAATGTATGT GGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC(SEQ ID N019)PM08 GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTITTACGACGGGTTTTCTGACCACG(SEQ ID NO20)PM09GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO21)PM10GGGCCCAAGCTTAAGAGTG(SEQ ID NO22)PM11GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO23)PM31 CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTFCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTG GTACCA AG(SEQ ID NO24)PM32 AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTUCTTGGTACCAGAAAC TTTACC(SEQ ID NO25)PM33 GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAAC(SEQ ID NO26)PM34 GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC(SEQ ID NO27)PM35GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAG(SEQ ID NO28)PM36GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG(SEQ ID NO29)PM102CCGGCGGATCCCATATGTCTFACAACCACCTGCAGG(SEQ ID NO30)PM130CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG(SEQ ID NO31)KGF2Δ33(s172-208)的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAA(SEQ ID NO32)KGF2Δ33(s172-208)的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO33)實施例實施例1KGF-2的液體制劑混合下列組分以產生一種液體KGF2Δ33制劑，該制劑保存于-20℃。
2mg/ml的KGF-2Δ33多肽，20Mm醋酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA，水，pH6.2。
在2-8℃或2-8℃以下的保存條件下，該制劑保持其體外生物活性多達10個月。在第10個月的生物活性于圖3所示。該制劑在2-8℃或2-8℃以下的保存條件下保持其所有的理化活性多達11個月。
用如下的細胞增生試驗測定生物學活性。BaF3細胞，在常規下生長并保存在含有10％的NBCS，10％的WEHI細胞條件培養基，2mM的谷氨酰胺，600μg/ml的GENETICIN，1μl的β-巰基乙醇/每500ml生長培養基，50個單位的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中(Ornitz，D.，M.等(1996)生物化學雜志。27115292-15297)。對于細胞增生試驗，通過離心收獲BaF3細胞，用基本培養基洗滌(這種培養基具有與生長培養基相同的成分，但是不包含WEHI細胞條件培養基，并且補充有1μg/ml的肝素)。經過這些操作之后，細胞重新懸浮于基本培養基中，在96孔的細胞培養簇皿中，每個孔中涂布22,000個細胞/180μl。在另一個96孔的平板中配制合適的KGF2稀釋液(高于10倍的所需的終濃度)，并加入到細胞中至終體積200μl。涂布有細胞的平板在37℃，5％的CO2培養箱中培養36-40小時，并向每個孔中加入50μl的含0.5μCi的甲基-3H胸苷的基本培養基。平板在培養箱中再培養5小時，并用Tomtec收獲器96在玻璃纖維過濾器上通過過濾收獲細胞。滲入的胸苷在一個Wallacβ平板閃爍計數器上記數。
實施例2KGF-2的凍干制劑混合下列組分以產生KGF-2Δ33的凍干制劑。
10mg/ml的KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM的氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，水(冷凍干燥后去除)pH6.2。
在45℃或以下的保存條件0下，這種制劑保持其體外生物學活性多達9個月。在第9個月的生物學活性表示于圖4。生物學活性用實施例1中詳述的細胞增生試驗測定。反向HPLC證明該制劑在45℃或之下和75％的相對濕度下保持其理化活性多達8個月。
實施例3KGF-2的增稠制劑混合下列組分以產生KGF-2Δ33的增稠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，1.25％羧甲基纖維素，水，pH6.2。
該制劑通過向羧甲基纖維素溶液中加入KGF-2Δ33多肽制備而成。產生的制劑粘度用旋轉的紡錘粘度計測定為約250cps。在羧甲基纖維素存在時，KGF-2多肽保持生物學活性。該制劑的生物學活性用實施例1中詳述的細胞增生試驗測定。
實施例4KGF-2的凝膠制劑混合下列組分以產生KGF-2Δ33凝膠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，16％的Pluronic F127，水，pH6.2。
在約2℃至8℃下加入KGF-2Δ33至Pluronic溶液。產生的制劑粘度是20℃下約為50cps，并于37℃下凝固。如同實施例1中詳述的細胞增生試驗所測定的，KGF-2在Pluronic F127存在時保持生物學活性。
實施例5KGF2被單巰基甘油激活KGF-2Δ33的蛋白質儲備制劑(0.1至2.0mg/ml)用或者不用單巰基甘油(MTG)制備。
蛋白質制劑用pH7.2的1倍的磷酸緩沖鹽(PBS)稀釋，以獲得供細胞增生試驗使用的所需濃度。細胞培養BaF32b細胞，在常規下生長并保存在含有10％的NBCS，10％的WEHI細胞條件培養基，2mM的谷氨酰胺，600μg/ml的GENETICIN，1μl的β-巰基乙醇/每500ml生長培養基，50個單位的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中(Ornitz，D.，M.等(1996)生物化學雜志。27115292-15297)。細胞增生試驗對于細胞增生試驗，通過離心收獲BaF3細胞，用基本培養基洗滌(這種培養基具有與生長培養基相同的成分，但是不包含WEHI細胞條件培養基，并且補充有1μg/ml的肝素)。經過這些操作之后，細胞重新懸浮于基本培養基中，在96孔細胞培養皿中，每個孔中涂布22,000個細胞/180μl。在另一個96孔的平板中配制合適的KGF2稀釋液(高于10倍的所需的終濃度)，并加入到細胞中至終體積200μl。涂布有細胞的平板在37℃，5％的CO2培養箱中培養36-40小時，并向每個孔中加入50μl的含0.5μCi的甲基-3H胸苷的基本培養基。平板在培養箱中再培養5小時，并用Tomtec收獲器96在玻璃纖維過濾器上通過過濾收獲細胞。滲入的胸苷在一個Wallacβ平板閃爍計數器上記數。結果A.MTG濃度對KGF-2活性的影響把KGF-2暴露于不同濃度的單巰基甘油(MTG)進行細胞增生試驗。對照樣品不含賦形劑。使用MTG，觀察到的其各種濃度的MTG對KGF-2活性的刺激作用表示于圖5中。活性的增加介于對照的10-150％，取決于所使用的MTG的濃度。用該生長因子家族的其它成員沒有觀察到這種增加的細胞增生活性。從這些觀察得出的結論是，MTG對KGF-2活性的刺激作用是十分獨特的。結論單巰基甘油似乎特異性地刺激KGF-2的體外細胞增生活性。
實施例6含有檸檬酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列組分以產生在室溫下為液體的KGF-2制劑，施用到皮膚上后形成凝膠。
20mM檸檬酸鈉鹽，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％的Pluronic127，pH6.0，
水。
實施例7含有醋酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列組分以便產生一旦施用后可形成凝膠的KGF-2制劑。
20mM醋酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％的Pluronic 127，pH6.0，水。
實施例81.液體KGF-2制劑以4種單獨的制劑和在3個單獨的pHpH5.0，pH5.5和pH6.0下，評估檸檬酸鈉作為緩沖液保持KGF-2Δ33的適宜性。
制劑A.1或者2mg/ml的KGF-2Δ3320mM的檸檬酸鈉，125mM氯化鈉，1mMEDTA二鈉，水。
B.如同以上的“A”，還包括1％的甘油。
C.如同以上的“A”，還包括0.05％的甲硫氨酸。
D.如同以上的“A”，還包括1％的單巰基甘油。
在所有上述制劑中KGF-2Δ33的濃度為1和2mg/ml。
2.凍干制劑在3種成塊劑(甘露醇，蔗糖和海藻糖)中的一種存在時，冷凍干燥KGF-2Δ33。
制劑
A.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及4％甘露醇，pH6.0B.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及7％蔗糖，pH6.0C.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及8％海藻糖，pH6.0KGF-2Δ33多肽的濃度為3mg/ml和8mg/ml。評價參數(在重構之前和之后)為RP-HPLC，SDS-PAGE，外觀。
3.10mg/ml的KGF-2冷凍干燥評估制劑是否使得可以將10mg/ml的蛋白質冷凍干燥以及評估重構之后蛋白質的穩定性。
制劑10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及4％甘露醇，pH6.0。
凍干產品用水或含有1％的單巰基甘油的水重構。
實施例9增稠劑的穩定性根據前面的實施例的方法配制下列制劑。劑型1和2是單獨凍干的KGF-2；劑型3和4包含增稠劑作為凍干塊狀物的部分；和劑型5-8包含增稠劑為液體稀釋劑的部分。
實施例10KGF-2在治療慢性創傷中的用途預計涉及多次的，局部施藥。由于不存在任何的防腐劑，凍干的劑型需要一個單獨的藥物產品藥瓶以便每次使用時重構。每次給藥時，將導致大量的藥物浪費以及在制備產品中需要更加密集型的勞動。理想地，KGF-2的商業劑型包括一個單一的可供多次使用的盛有KGF-2的藥瓶。為了研究該劑型的可行性，檢查了KGF-2與防腐劑的相容性。
防腐劑選自一系列FDA批準的化合物。所選擇的五種候選防腐劑基于在醫生書桌參考書(PDR)中流行以及以前所出版的生物藥品著作。因為尚未最終決定劑型和劑量形式，最初并沒有著重強調在pH6.2時與彈性閉合物的相容性或者穩定性。根據文獻的一些數值以及FDA/USP和BP的指南選擇濃度。下表陳列出本研究中考查的五種候選防腐劑。
1“對羥基苯甲酸酯類”在本實施例中定義為0.18％的甲基對羥基苯甲酸酯和0.02％的丙基對羥基苯甲酸酯。
為了使用防腐劑，必須滿足兩個標準。首先，必須確定藥物產品的相容性和穩定性。第二，必須確定對微生物的影響(每USP<51>)。本研究的目的在于檢查KGF-2與這些防腐劑的短期相容性。材料和方法制劑所有的化學藥品從Spectrum購買，并且是USP/NF級別或相當于該級別。KGF-2滲濾到一種含有下列之一的基礎制劑緩沖液中0.9％的苯甲醇，0.5％的氯丁醇，0.5％的苯酚，0.3％的甲酚，或者0.18％甲基對羥基苯甲酸酯+0.02％的丙基對羥基苯甲酸酯(對羥基苯甲酸酯類)。用一個Biomax10kD的膜在Amicon攪拌槽中完成滲濾。所有的處理在2-8℃下進行。對每次滲濾，總共完成5次緩沖液交換，滲濾過程中的恢復率大于90％。KGF-2稀釋成為1.0mg/mL，并且注入1.0mL到2mL的Schott Purform藥瓶中，并用Diakyo D-777血清瓶塞和鋁卷曲封印密封。藥水瓶保存在-80℃，2-8℃，和25℃/60％的相對濕度下。含有沉淀的制劑在進一步分析前用0.2μl的濾膜過濾。外觀利用正常放大率的向前照明熒光燈在黑白背景下進行視覺檢查。SDS-PAGE在非還原的條件下用16％的Tris-甘氨酸NOvex凝膠完成SDS-PAGE。每個泳道中上樣共2μg的KGF-2。凝膠在恒壓(125V)下電泳約2小時。按照制造商的使用說明書用Daiichi銀染料進行染色。生物活性利用經成纖維生長因子2iiib受體穩定轉染的老鼠的淋巴細胞系，Baf32b，測定KGF-2的生物活性。活性是在細胞增生的基礎上、在細胞暴露于KGF-2之后通過滲入的[甲基-3H]胸苷所測定的。差式掃描熱量測定法(DSC)在一個熱量測定科學NaNO DSC儀(型號5100)上獲得每個制劑的DSC溫度圖譜。掃描從5℃到80℃以每分鐘1℃的速率沿加熱和冷卻兩個方向進行。熔點(Tm)以熱轉變的頂點測量。在任何樣品中在冷卻方向沒有觀察到信號，表明解折疊是不可逆轉的。RP-HPLC(濃度，純度，氧化百分率)在一個裝備Waters 960光電二極管矩陣檢測器的2690聯合系統上完成RP-HPLC。用一個線形梯度的溶劑A(0.1％的TFA溶于水中)至溶劑B(0.07％的TFA溶于乙腈)用Watersδ-Pak C18柱子(2.1×150毫米，5μm，300埃)分離。利用已知濃度的內標，通過把一個未知濃度的總的峰面積與一條標準曲線相關聯測定濃度。標準參照物的典型層析譜表示如下。兩個主要的峰被分離開，且在以前被鑒定為完整的KGF-2峰和一個氧化形式的KGF-2峰。氧化百分率被報道為占總面積的面積百分比。純度百分率是歸因于完整的和氧化形式總和的面積百分率。結果氯丁醇和對羥基苯甲酸酯類在2-8℃下表現出與KGF-2有希望的相容性。當保存于2-8℃下時，苯甲基醇，甲酚和苯酚造成KGF-2的迅速凝聚。當保存于25℃時，一個星期之后所有的制劑均具有較差的外觀。在甲酚和苯酚存在的情況下，當置于凍/融條件下時，KGF-2從溶液中沉淀出來。
試驗過的所有防腐劑對KGF-2的熱穩定性均有一種輕微的不穩定的影響。在所有的防腐劑存在時，DSC測定的熔點溫度顯示出約5℃的下降。在試驗過的防腐劑中，對羥基苯甲酸酯類的影響最小。
KGF-2的比活性不受任何試驗過的防腐劑存在的影響。雖然保存于25℃的制劑總活性在保存6個星期之后因KGF-2的沉淀的確有下降，在氯丁醇，對羥基苯甲酸酯類和苯甲醇制劑中的可溶性蛋白仍保持其比活性。
在2-8℃的保存條件下，如同RP-HPLC所測定的，所有制劑保持其10％的起始濃度范圍之內。當保存于25℃時，包含甲酚和苯酚的制劑表現出最快速度的沉淀。在試驗過的制劑中，包含氯丁醇和對羥基苯甲酸酯類的那些制劑在短期的穩定性期間在溶液中保持最多的KGF-2。
苯甲醇造成KGF-2的迅速氧化，其后為氧化形式的降解。這可由高的初始水平的氧化作用(在滲濾期間形成的)，緊接著為緩慢地過渡至進一步氧化形式表現出來。當保存于2-8℃時，剩余的制劑具有每月約4％的可比較的氧化速率。當保存于25℃時，氧化速率增加至每月30-40％。在試驗過的制劑中，包含對羥基苯甲酸酯類的制劑具有最緩慢的平均氧化速率。
作為一個總的層析面積的百分率，以KGF-2的主要和氧化形式的總和測定純度。包含苯甲醇和苯酚的制劑最初表現出低的純度，其后為純度的提高，然后為純度逐漸降低。這與在零時間的層析峰的急劇增加(該層析峰似乎與可溶性的集合物相對應)相符合。隨著沉淀的繼續形成，這種峰隨即消失，任何其它的峰面積爾后也沒有增加。當保存于25℃時，包含對羥基苯甲酸酯類的制劑保持最高的純度。
SDS-PAGE顯示在零時間以及在保存6個星期時包含苯甲醇的二聚體帶的輕微的增加，在保存于25℃的制劑中觀察到模糊的泳道條紋和二聚體濃度的增加。結論在被檢查的條件下，KGF-2與苯甲醇，甲酚和苯酚是不相容的。在這些制劑中，聚合其后的沉淀是降解的主要途徑。在試驗過的防腐劑中，甲基/丙基對羥基苯甲酸酯對KGF-2的短期穩定性的影響最小。
實施例11KGF-2的凍干制劑混合下列組分以便產生KGF-2Δ33的預混合制劑。
3.3mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化物鈉，1mM EDTA，2％的w/v的甘氨酸0.5％的w/v的蔗糖，水(凍干即被去除)，pH6.2。
接下來按照以上描述的第二個凍干循環凍干該制劑。
在25℃或低于25℃的保存條件下，這種制劑保持其體外生物活性多達12個月。
實施例12KGF-2局部制劑混合下列組分以便產生局部應用的KGF-2制劑。
1.0mg/ml的KGF-2Δ33，0.46％羥乙基纖維素(HFC)7％蔗糖，20mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，pH6.2。
清晰明了的是，本發明可以以前面描述的和實施例中特別描述的以外的方式實施。
按照上述教導，本發明的許多修改和變化是可能的，因此，這些修改和變化也在附加權利要求的范圍之內。
本文引用的所有出版物(包括專利，專利申請，期刊文章，實驗室手冊，書籍，或者其它的文件)的全部公開內容在此一并參考。
序列表<110>人類基因組科學公司Gentz，Reiner L.
Chopra，ArvindKaushal，ParveenSpitznagel，ThomasUnsworth，EdwardKhan，Fazal<120>角質細胞生長因子2-2制劑<130>1488.103PC05<140>待定<141>與此一道<150>US 60/137,448<151>1999-06-02<150>US 60/160,913<151>1999-10-22<160>33<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>627<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(624)<400>1atg tgg aaa tgg ata ctg aca cat tgt gcc tca gcc ttt ccc cac ctg 48Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1 5 10 15ccc ggc tgc tgc tgc tgc tgc ttt ttg ttg ctg ttc ttg gtg tct tcc 96Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser20 25 30gtc cct gtc acc tgc caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag144Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu35 40 45gcc acc aac tct tct tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga192Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly50 55 60agg cat gtg cgg agc tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg aga 240Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65 70 75 80aag cta ttc tct ttc acc aag tac ttt ctc aag att gag aag aac ggg 288Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly85 90 95aag gtc agc ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag 336Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu100 105 110ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc 384Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser115 120 125aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa 432Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys130 135 140gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga 480Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145 150 155 160tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg 528Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met165 170 175tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca 576Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr180 185 190cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca 624Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser195 200 205tag 627<210>2<211>208<212>PRT<213>人類<400>2Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1 5 10 15Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser20 25 30Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
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權利要求
1.一種藥物組合物，其包含(a)一種約0.02到約40mg/ml(w/v)濃度范圍的KGF-2多肽；(b)一種在約5mM到約50mM濃度范圍，具有約pH5.0到約pH8.0的緩沖能力的緩沖液；和(c)一種使組合物稀釋到指定體積的藥學上可接受的稀釋劑；和(d)一種選自下組的防腐劑間-甲酚，氯丁醇，和甲基對羥基苯甲酸酯與丙基對羥基苯甲酸酯的混合物；或它們的反應產物。
2.權利要求1的藥物組合物，其還包含一種或多種(a)約0mM到約10mM濃度范圍的螯合劑；和(b)約0mM到約150mM濃度范圍的補劑。
3.權利要求2的藥物組合物，其中所說的補劑選自下組NaCl，甘氨酸，蔗糖，甘露醇，和它們的混合物。
4.權利要求1的藥物組合物，其還包含以下之一1.約0.5％至約2％w/v的甘油，2.約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，或者3.約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油。
5.權利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.05至約30mg/ml(w/v)濃度范圍存在。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.1至約20mg/ml(w/v)濃度范圍存在。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.2至4mg/ml濃度范圍存在。
8.權利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是KGF-2-Δ33。
9.權利要求1的藥物組合物，其中所說的稀釋劑是水。
10.權利要求2的藥物組合物，其中所說的螯合劑是約1mM濃度的EDTA，并且所說的補劑以約125mM的濃度存在。
11.權利要求1的藥物組合物，其中所說的pH從約pH5.5至約pH6.5。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所說的pH約為pH6.0。
13.權利要求1的藥物組合物，其中所說的緩沖液選自下組磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀碳酸，以及它們的堿金屬或堿土金屬鹽。
14.權利要求13的藥物組合物，其中所說的緩沖液是磷酸鹽，醋酸鹽，或檸檬酸鹽。
15.權利要求13的藥物組合物，其中所說的緩沖液是檸檬酸鹽。
16.權利要求1的藥物組合物，其中所說的緩沖液以約5mM至約30mM的濃度范圍存在。
17.權利要求16的藥物組合物，其中所說的緩沖液是以約10mM至約20mM濃度存在的檸檬酸鹽。
18.權利要求1的藥物組合物，還包含穩定量的一種或更多的(a)抗氧化劑或者(b)巰基化合物。
19.權利要求1的藥物組合物，其中所說的組合物保存在-20℃或-20℃以下的溫度下。
20.權利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2Δ33多肽選自下組具有N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺少N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，以及它們的混合物。
21.權利要求1的藥物組合物，還包含一種成塊劑。
22.權利要求21的藥物組合物，其中所說的成塊劑選自下組蔗糖，甘氨酸，甘露醇，海藻糖，以及它們的混合物。
23.權利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑是蔗糖或蔗糖和甘氨酸的混合物。
24.權利要求2的藥物組合物，其還包含一種成塊劑。
25.權利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑以約2％至約10％w/v的濃度存在。
26.權利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑是5％的甘露醇，7％的蔗糖，8％的海藻糖，或2％的甘氨酸加0.5％的蔗糖。
27.權利要求21的藥物組合物，其中所說的pH為約6.2。
28.權利要求21的藥物組合物，其中所說的稀釋劑是水。
29.權利要求21的藥物組合物，其中所說的緩沖液選自下組磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀碳酸，以及它們的堿金屬或堿土金屬鹽。
30.權利要求29的藥物組合物，其中所說的緩沖液是一種磷酸鹽或者檸檬酸鹽。
31.權利要求30的藥物組合物，其中所說的緩沖液是一種檸檬酸鹽。
32.權利要求28的藥物組合物，其中超過90％的水被凍干除去。
33.權利要求32的藥物組合物，該組合物由一定量的無菌水重構，無菌/水的量能有效保持約290mOsm的等滲狀態。
34.權利要求21的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是KGF-2-Δ33。
35.權利要求34的藥物組合物，其中所說的KGF-2Δ33多肽選自下組具有N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺少N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，以及它們的混合物。
36.權利要求21的藥物組合物，其中所說的緩沖液以約5mM至約50mM的濃度加入。
37.權利要求36的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM濃度的檸檬酸鹽。
38.權利要求21的藥物組合物，其還包含一種穩定量的一種或多種(g)抗氧化劑或(h)巰基化合物。
39.權利要求21的藥物組合物，其中所說的組合物由含有穩定量的抗氧化劑的無菌水重構，該抗氧化劑包括a)約0.01％至約2％w/v單巰基甘油，b)約0.01％至約2％w/v抗壞血酸，c)約0.01％到約2％w/v甲硫氨酸或者d)它們的組合。
40.權利要求1的藥物組合物，其還包含一種有效量的把粘度提高到約50至約10,000cps的增稠劑。
41.權利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑以提高粘度到約50至約1,000cps的有效量存在。
42.權利要求41的藥物組合物，其中所說的增稠劑以提高粘度到約200至約300cps的有效量存在。
43.權利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑以0至5％(w/w)的濃度存在。
44.權利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑是一種水溶性的乙醚化的纖維素或一種高分子量的丙烯酸與烯丙基蔗糖或戊赤鮮糖的烯丙基醚交聯的聚合物。
45.權利要求44的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素是烷基化的纖維素，羥基烷基化纖維素，羧基纖維素或者烷基羥基烷基化的纖維素。
46.權利要求40的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素是甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素。
47.權利要求46的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素衍生物具有約50,000至約700,000的分子量，并且以約0至約20％的濃度(按重量)存在。
48.權利要求47的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素衍生物具有約80,000至約240,000的分子量，并且以約2％至約8％的濃度(按重量)存在。
49.權利要求42的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM到約50mM濃度的檸檬酸鹽。
50.權利要求49的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM到約2mM濃度的檸檬酸鹽。
51.權利要求49的藥物組合物，其中所說的成塊劑是約0.01％到約5％濃度的蔗糖。
52.權利要求51的藥物組合物，其中所說的增稠劑直接地加到液體制劑中，然后凍干。
53.權利要求51的藥物組合物，通過加入一種合適的含有溶解在其中的增稠劑的稀釋劑來重構制劑，把其中所說的增稠劑加入到凍干制劑中。
54.權利要求21的藥物組合物，還包含一種有效量的把粘度提高到約50至約10,000cps增稠劑。
55.權利要求1的組合物，其還包含有效量的在室溫下把粘度提高到約0.1至約10,000cps的凝膠劑。
56.權利要求1的組合物，其還包含有效量的在室溫下把粘度提高到約0.1至約10,000cps的凝膠劑。
57.權利要求55的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種能夠形成膠粘水溶液的水溶性聚合物，或者是一種能夠形成膠粘溶液的非水溶性的，遇水可膨脹的聚合物。
58.權利要求57的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的高分子量聚合物乙烯聚合物，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，多糖，蛋白質，聚環氧乙烷，丙烯酰胺聚合物或它們的鹽。
59.權利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是(1)選自下組的乙烯聚合物聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯酒精，和它們的鹽或酯；或(2)選自下組的多糖纖維素衍生物，粘多糖，瓊脂，果膠，褐藻酸，葡聚糖，α-直鏈淀粉，支鏈淀粉，殼聚糖，和它們的鹽和酯。
60.權利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的粘多糖透明質酸，軟骨素，4-硫酸軟骨素，硫酸乙酰肝素，肝素以及它們的鹽和酯。
61.權利要求60的組合物，其中所說的粘多糖與膠原蛋白，明膠，或纖連蛋白以結合形式存在。
62.權利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的丙烯酰胺聚合物聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺。
63.權利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
64.權利要求63的組合物，其它包含約10％至約60％重量的具有平均分子量約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
65.權利要求64的組合物，其它包含約14％至約18％重量的具有1,000至15,000分子量范圍的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
66.權利要求1的組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.01mg/ml至約10mg/ml濃度存在。
67.權利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是選自下組的N-末端缺失體Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)。
68.權利要求67的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽具有N末端甲硫氨酸，缺乏N末端甲硫氨酸，或者是它們的混合物。
69.權利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是選自下組的N-末端或C-末端缺失突變體Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；Gly(138)--Ser(208)；Met(1)，Thr(36)；和Cys(37)--Lys(153)。
70.權利要求69的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽具有N末端甲硫氨酸，缺乏N末端甲硫氨酸，或者是它們的混合物。
71.權利要求1的藥物組合物，其還包含以下之一(a)賴氨酸；(b)羥丙基-β-環狀糊精；或(c)硫酸鹽-β-環狀糊精；或者它們的組合體。
72.權利要求1的藥物組合物，其中所說的防腐劑是甲基對羥基苯甲酸酯與丙基對羥基苯甲酸酯的混合物。
73.權利要求72的藥物組合物，其中所說的組合物包含0.18％甲基對羥基苯甲酸酯和0.02％丙基對羥基苯甲酸酯。
74.一種藥物組合物，其包含(a)約1.0mg/ml的KGF-2；(b)20mM檸檬酸鹽，pH5-5.5；和(c)0.01％的聚山梨酸酯80。
75.權利要求74的藥物組合物，其還包含1mMEDTA。
76.一種藥物組合物，包含(A)約3.3mg/ml的KGF-2；(B)10mM檸檬酸鈉(C)20mM氯化鈉；(D)1mM的EDTA(E)2％w/v的甘氨酸；(F)0.5％w/v的蔗糖；(G)水；和(H)pH約6.2；或者它們的反應產物。
77.權利要求77的藥物組合物，其中超過90％的水由凍干去除。
78.一種藥物組合物，其包含(a)約1.0mg/ml的KGF-2；(b)0.46％羥乙基纖維素；(c)7％蔗糖；(d)20mM檸檬酸鈉；(e)20mM氯化鈉；(f)1mM的EDTA；和(g)pH約6.2；或者它們的反應產物。
全文摘要
本發明涉及液體和凍干形式的角質細胞生長因子－2(KGF－2)及其衍生物。本發明還涉及具有治療用途,例如,促進或者加速創傷愈合的KGF－2制劑。
文檔編號A61K47/26GK1359299SQ00809802
公開日2002年7月17日 申請日期2000年6月2日 優先權日1999年6月2日
發明者R·L·詹茨, A·卓普拉, P·考沙爾, T·斯皮茨納吉爾, E·昂斯沃斯, F·肯 申請人:人類基因組科學公司