專利名稱：：用PDGFRα抗體治療骨腫瘤的方法用PDGFRa抗體治療骨胂瘤的方法本申請是2006年6月19日提交的中國國家申請號為200680028647.0，國際申請號為PCT/US2006/023856，發明名稱為"治療轉移性骨癌的受體拮抗劑"的發明申請的分案申請。本申請要求保護美國臨時申請第60/691,192號的權益。發明領域本發明提供了通過給予IGF-IR拮抗劑和/或PDGFRa拮抗劑治療骨癌尤其是轉移性骨癌的方法。本發明還提供了與人PDGFRa結合并中和該受體的激活作用的抗體。本發明進一步提供了中和PDGFRa的激活作用的方法和單獨使用該抗體或與其他藥物聯合使用治療肺瘤疾病的方法。
背景技術：
：前列腺癌是男性最普遍的癌癥，美國每年約有220,000例前列腺癌，死亡29000例。很大一部分被診斷患有前列腺癌的男性都患有癌轉移疾病。而且，盡管已接受了手術或放療，但是許多前列腺癌患者最終還是會發生癌癥轉移。骨是前列腺癌最常見的轉移位點，同時也是乳腺癌和肺癌的常見轉移位點。許多前列腺癌轉移是雄性激素依賴型，所以迅速產生了許多通過手術或藥物去雄的治療方法，但在幾乎所有的病例中，這種癌癥會最終變成非雄性激素依賴型，導致很高的發病率和死亡率。一旦發生了骨轉移，現有療法的作用是非常有限的。至今報道的最有效的并被認可的治療轉移性前列腺癌的療法(給予多西他賽)可以將生存中值延長約三個月。(Petrylak等，2004,N.Engl.J.Med.351:1513;Tannock等"2004，N.Eng.J.Med.351:1502)。因此，我們目前急需治療轉移性骨癌的方法。胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)是一種普遍存在的跨膜酪氨酸激酶受體，對正常胎兒期和出生后期的生長和發育是必需的。IGF-IR位于絕大多數類型細胞的表面，作為生長因子IGF-I和IGF-II(以下統稱為IGFs)的信號轉導分子。IGF-IR可以刺激細胞增殖、細胞分化、細胞大小的改變并阻止細胞凋亡。它被認為對細胞轉化是近乎必需的(見下列綜述Adamsetal.,Cell.Mol.LifeSd.57:1050-93(2000);Baserga,Oncogene19:5574-81(2000))。有報道表明，前列腺癌骨轉移瘤的組織樣品中IGF-IR的表達水平高。骨中IGFs的儲存量是人體最多的。IGF-IR是一種預先形成的異源四聚體，包含由二好u鍵共價連接的兩個a鏈和兩個卩鏈。該受體的亞基作為一條180kd單多肽鏈的一部分被合成，這條多肽鏈再經過蛋白水解加工后生成a(130kd)和卩(95kd)亞基。整個a鏈都位于細胞外并且包含與配體結合的位點。卩鏈具有跨膜域、酪氨酸激酶域和一個C-末端延伸，該末端延伸對于細胞分化和轉化是必需的，但是對于分裂素信號轉導和阻止細胞凋亡并非必需。IGF-IR與胰島素受體(IR)具有高度相似性，尤其是(3鏈的序列(70%同源性)。正是由于這一同源性，近期許多研究都表明這些受體可以形成含有一個IR二聚體和一個IGF-IR二聚體的雜合體(Pandinietal.,Clin.Cane.Res.5:1935-19(1999))。在正常細胞和轉化細胞中都會形成這種雜合體，并且該雜合體的含量取決于細胞中兩種同型二聚體受體(IR和IGF-IR)的濃度。雖然雜合受體是由IR和IGF-IR成對組成的，但是該雜合體特異性地與IGFs結合，親和力與IGF-IR的相似，與胰島素的結合較弱(SiddleandSoos，TheIGFSystem.HumanaPress,pp.199-225.1999)。因此這些雜合體可以與IGFs結合并在正常細胞和轉化細胞中傳導信號。第二種IGF受體IGF-IIR或者稱作甘露糖-6-磷酸(M6P)受體，也可以以高親和力與IGF-II配體結合，^旦是卻沒有酪氨酸激酶活性(Oatesetal.,BreastCancerRes.Treat.47:269-81(1998))。這是由于它能夠導致IGF-II的降解，被認為是IGF-II的匯點，可以拮抗該配體的促生長作用。腫瘤細胞中IGF-IIR的減少可以通過發揮其對IGF-II與IGF-IR結合的拮抗作用促進生長。(Byrdetal.,J.Biol.Chem.274:24408-16(1999》.來源于血小板的a和卩生長因子受體(PDGFRa和PDGFR卩)是III-型受體酪氨酸激酶。PDGFRa在發育中發揮關鍵作用并且在成年階段也發揮重要的功能。例如，無效突變的小鼠純合體會在胚胎形成時死亡。在發育后期PDGFRa在許多細胞間質結構中表達，而相鄰的上皮細胞產生血小板來源的生長因子(PDGF)。正常或增生前列腺的組織樣品中都4企測不到PDGFRa，然而，對照受試者的原發前列腺癌組織和骨質中都表達PDGFRa。而且，從不同癌轉移位點獲得的前列腺細胞系中，骨轉移來源的PC3細胞表達PDGFRa,但是從淋巴結(LNCaP)和腦(DU-145)組織轉移灶獲得的細胞系中不表達。生長因子的血小板來源的生長因子家族由五種不同的二硫鍵鍵合的二聚體組成，PDGF-AA、-BB、-AB、-CC和-DD,其通過PDGFRa和PDGFR卩發揮作用。這些生長因子是嵌合分子，由可同時結合兩個受體蛋白的二硫鍵鍵合并誘導受體二聚化、自身磷酸化和細胞內信號轉導的多肽鏈組成。PDGFRa和PDGFR卩結構上類似，并且能夠形成異二聚體以及同二聚體。因為PDGFR卩與PDGF-A鏈的結合親和力不強，PDGF-AA僅活化aa受體二聚體，而PDGF-AB和PDGF-CC則活化aa和a(3受體異二聚體。發明概述本發明涉及對原發性和轉移性骨肺瘤的治療，包括源自前列腺、乳腺或肺并表達胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)和/或來源于血小并反的a生長因子受體(PDGFRa)的肺瘤。被治療的腫瘤可以是激素/雄性激素依賴型或激素/雄性激素非依賴型，并且可以是源自前列腺，乳腺或肺的肺瘤。本發明提供了治療骨腫瘤病人的方法以及抑制骨紳瘤生長的方法。所述方法包括給予有效量的IGF-IR拮抗劑或有效量的PDGFRa拮抗劑。所述受體拮抗劑包括抗體和抗體片段以及細胞內小分子抑制劑。本發明提供了可以與其靶受體結合并抑制配體結合的抗-IGF-IR或抗-PDGFRa抗體。本發明還提供了可以中和IGF-IR或PDGFRa的激活的抗體和其他拮抗劑。另外某些抗體可以通過例如內化和/或降解作用對它們的靶受體進行下調。因此所述抗體和小分子拮抗劑的作用是抑制下游信號轉導分子例如Akt、p42/p44和MAPK的激活。所述方法包括單獨使用IGF-IR或PDGFRa拮抗劑，二者同時使用或與其他癌癥療法例如化療藥物和放療聯合使用。本發明還提供了可以與PDGFRa和核苷酸結合的抗體和抗體片段以及用于生產抗體的宿主細胞。所述抗體可以阻斷配體的結合并中和受體的激活。本發明還提供了單獨使用所述抗體、與其他受體拮抗劑或抗腫瘤藥物聯合使用或作為綴合物用于肺瘤疾病的治療。抗-PDGFRa抗體可用于許多腫瘤的治療，例如卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、肺癌、肝細胞癌、胃腸道間質瘤、黑素瘤、腎細胞癌、前列腺腫瘤和軟組織肉瘤。圖1描述了在一個治療階段中去雄SCID小鼠LuCaP35V皮下移植腫瘤的生長，該治療從腫瘤達到150-200mmS時開始進行。A組未接受治療的對照組；B組單獨使用多西他賽(10mg/kg或20mg/kg)或與抗IGF-IR抗體(40mg/kgIMC-A12)聯合使用對動物進行為期四周的治療；C組未接受治療和接受治療的荷載LuCaP35V皮下移植腫瘤的小鼠血清PSA水平。被治療的小鼠接受了多西他賽(20mg/kg)單獨治療或多西他賽(10mg/kg或20mg/kg)和抗IGF-IR抗體(40mg/kgIMC-A12)的聯合治療。治療從腫瘤生長至150-200mn^時開始，四周后結束。圖2表示多西他賽(10mg/kg)(A組)單獨治療或與抗IGF-IR抗體(40mg/kgIMC-A12)(B組)聯合治療后的LuCaP35V移植腫瘤的單細胞懸液。標注Rl的區域表示含有片段DNA的凋亡細胞(FITC標記升高)。圖3表示多西他賽(10mg/kg或20mg/kg)單獨治療或與抗IGF-IR抗體(40mg/kgIMC-A12)聯合治療結束后移植腫瘤的DNA合成(BrDu吸收)。圖4描述了用多西他賽與A12聯合治療和多西他賽單獨治療后，與前列腺肺瘤侵襲(TUBB)，抗雄性激素療法抗性(BIRC5)和細胞凋亡誘導相關基因的差異表達。圖5表示治療停止后A12的血清水平。圖6表示未患有疾病的動物經過連續的多西他賽(10mg/kg或20mg/kg)單獨治療或與抗IGF-IR抗體(40mg/kgIMC-A12)聯合治療后的體重(一種總細胞毒性的測量方法)。圖7表示抗IGF-IR抗體(IMC-A12)對移植LuCaP23.1細胞的SCID小鼠中移植物產生的PSA的治療作用。圖8表示移植LuCaP23.1細胞的SCID小鼠的一系列X線照片。A12小鼠腹腔注射40mg/mlIMC-A12,每周三次，持續六周。在處死動物時進行X線拍照。圖9表示荷載脛骨內LuCaP23.1人前列腺細胞移植腫瘤的SCID小鼠的PSA水平(a)和具有代表性的放射照片(b)。圖IO描述了人骨髓穿刺液對前列腺癌細胞Akt活性的作用。將細胞裂解物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在Westernblot分析中，將薄膜用靶標為磷酸-Akt(Ser-473，細胞信號轉導技術)，PDGFRa(R&DSysstems)和肌動蛋白(Sigma)的抗體印跡。使用與HRP結合的蛋白A或蛋白G(Sigma)檢測一抗的結合。圖11描述了PC3-ML細胞中AKT-磷酸化的誘導和抑制。A組表示30ng/mlPDFG-BB存在下AG-1296對Akt磷酸化的劑量依賴型抑制作用。B組表示骨髓穿刺液Akt磷酸化和20pMAG-1296的抑制作用。C組表示與100pg/mlPDGF-AA和100pg/mlPDGF-BB聯合誘導有效性相比骨髓穿刺液誘導Akt磷酸化的有效性。D組比較了骨髓穿刺液誘導Akt磷酸化、AG-1296對骨髓穿刺液誘導的Akt磷酸化的抑制和PDFG-AA+PDFG-BB聯合誘導的Akt磷酸化的大圖12描述了PDGFRa拮抗劑對PC3細胞Akt磷酸化的抑制作用。A組表示單克隆抗體IMC-3G3對由30ng/mlPDGF-BB誘導的Akt磷酸化的劑量依賴型作用。B和C組比較了IMC-3G3和AG1296對骨髓穿刺液誘導的Akt磷酸化的作用。D組顯示了對Akt磷酸化的抑制依賴于IMC-3G3的預溫育時間。圖13顯示了抗體與PDGFRa的結合。A:抗-PDGFRa抗體直接與固定化PDGFRa胞外域結合。B:[1251]PDGF-AA與固定化PDGFRa結合的抑制。圖14顯示了對PDGFRa磷酸化和下游效應器分子的特異性抑制。圖15顯示了mAbs對PDGF-AA-激活的PAERa細胞[3司-胸腺嘧啶核苷摻入的抑制。圖16顯示了對SKLMS-1(A)和U118(B)細胞中由PDGF-AA誘導的下游效應器分子激活的抑制。圖17顯示了mAbs對PDGF-AA-激活的U118(A)和SKLMS-I(B)細胞卩H]胸腺嘧啶核苷摻入的抑制。也顯示了PDGF-BB激活的SKLMS-I(C)和U118(D)細胞卩H]胸腺嘧啶核苷摻入的抑制。圖18顯示了對棵鼠中已形成的U118(成膠質細胞瘤；A組)和SKLMS-I(平滑肌肉瘤；B組)移植肺瘤的的劑量依賴型治療作用。圖19顯示了與使用非特異性人IgG治療相比使用抗PDGFRa抗體治療的Ul18腫瘤中體內PDGFRa磷酸化的降低。圖20描述了用于克隆源自雜交瘤的人VH和Vk可變區基因和表達完整人重鏈(IgGl)和輕鏈蛋白的GS表達栽體。這兩個載體是按照實施例中的方法重組構建的并將重組載體轉染至NSO細胞。發明詳述本發明涉及使用與胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)結合的抗體或抗體片段治療骨腫瘤。IGF-I的內分泌表達主要由生長激素調控并由肝臟生成，但是其他類型的組織也可以表達IGF-I包括儲存有大量生長因子的骨。根據腫瘤細胞類型的不同，IGF-I可參與內分泌、旁分泌和/或自分泌調節(Yu,H.andRohan，J.,J.Natl.CancerInst.92:1472-89(2000》。骨腫瘤。所述抗體可以單獨使用或與其他癌癥療法聯合使用，尤其是化療藥物。單獨使用抗IGF-IR療法或與其他包括一種或多種抗腫瘤藥物(例如化療或放療)的療法聯合使用具有顯著功效。對腫瘤生長的抑制常常伴隨細胞凋亡的增加，并可持續至所有治療結束，然而只進行了化療的動物腫瘤又開始生長。研究也發現PDGFRa在骨腫瘤的生長中發揮重要作用。例如，某些表達PDGFRa的腫瘤細胞系優先轉移至骨。與骨髓中出現可溶性因子相對應，這些細胞系顯示出PDGFRa激活和下游信號轉導分子磷酸化增強。骨髓對PDGFRa的激活被PDGFRa拮抗劑降低或完全抑制，在通常狀況下可被經PDGFRa的信號轉導和其他受體酪氨酸激酶體系激活的下游信號轉導分子的磷酸化也被大大降低。一些數據顯示，PDGFRa傳導不僅可以通過直接激活PDGFRa的配體，也可以通過骨髓中存在的可以反式激活該受體的因子來激活PI3K/Akt生存路徑。依據本發明可被治療的原發性骨腫瘤包括但不限于骨肉瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤和血管肉瘤。值得注意的是，惡性繼發性(轉移性)腫瘤比原發性骨腫瘤更加常見。依據本發明可被治療的骨轉移瘤可以有多種來源，最常見的是前列腺癌、乳腺癌和肺癌。轉移性骨癌的來源從病史中可以明顯看出。所述腫瘤可能是成骨性的也可能是溶骨性的。腫瘤發生時可能依賴于IGF-IR的激活，或之后轉為IGF-IR依賴素生成具有抑制作用的物理或化學療法控制的前列腺癌或前列腺癌轉移可能通過對IGF-IR激活的敏感性增強轉變成非激素/雄性激素依賴型。除了提供激素/和雄性激素依賴型肺瘤的療法，本發明還可應用于治療激素/和雄性激素依賴型腫瘤而不需要依賴于對雄性激素或激素的抑制，例如可以通過同時給予IGF-IR抗體和抗腫瘤藥物。這些腫瘤包括在骨中富含IGF-IR的環境中通過IGF-IR激活的骨轉移腫瘤，它們可能對激素刺激敏感但是還沒有敏感到在不含有IGF的環境中生長的程度。對于這樣的腫瘤不一定需要去除激素。PDGF-依賴型骨腫瘤和"骨髓"依賴型腫瘤也可以依據本發明進行治療。與骨髓中出現可溶性因子相應，骨髓依賴型肺瘤中會出現PDGFRa激活。例如這里所舉例說明的，當一種轉移性并表達PDGFRa的人癌細胞系與骨髓穿刺液接觸后會出現PDGFRa激活和Akt磷酸化。一種抗PDGFRa抗體和一種小分子PDGFRa拮抗劑可以分別抑制細胞系中PDGFRa激活和Akt磷酸化。可以激活PDGFRa的可溶性骨髓因子包括但是不限于PDGF-AA和BB。雖然這種骨髓依賴性涉及到經PDGFRa的信號轉導，但也有可能并不僅僅是一種PDGFRa配體與PDGFRa的結合。例如這里舉例說明的，人們注意到特定的配體(PDGF-AA和BB)對PDGFRa激活弱于骨髓穿刺液的激活作用。而且，觀察發現當骨髓穿刺液存在時，隨著溫育時間的延長Akt磷酸化降低。綜合考慮這些結果表明除了對與FDGFs的結合作出反應之外，PDGFRa也可能被對其他骨髓成份敏感的其他信號轉導元件(例如其他受體酪氨酸激酶)反式激活(磷酸化)。在任何一種情況下，在適于轉移至骨生長的細胞系(例如，優先轉移至骨的細胞系)中都可以觀察到骨髓依賴型PDGFRa的激活，該激活可被PDGFRa拮抗劑抑制。而且，使用PDGFRa拮抗劑進行治療可以抑制骨髓誘導的PI3K/Akt抗凋亡途徑的激活和由促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)。使用PDGFRa拮抗劑治療的骨腫瘤可以是轉移自前列腺癌細胞，并且如上所述可能是激素/雄性激素依賴型或轉變成激素/雄性激素非依賴型。這些腫瘤也可以轉移自非前列腺癌細胞。本領域技術人員可以很容易地使用已知的傳統檢測方法對這些狀態和病癥作出診斷。治療意味著對動物某一種疾病的任何治療，包括(l)在容易感染某種疾病但是還未罹患或表現出該疾病任何癥狀的哺乳動物中預防疾病的發生，例如預防臨床癥狀的出現；(2)抑制疾病，例如使疾病停止發展或(3)緩解疾病，例如使疾病癥狀消退。抑制腫瘤生長包括減緩或停止生長以及使肺瘤消退。治療疾病的有效量指當給予治療效果的量。本發明的IGF-IR拮抗劑和PDGFRa拮抗劑可以單獨使用，也可以聯合使用或與其他一種或多種的抗肺瘤藥物(例如化療或放療藥物)聯合使用。在本發明的一個實施方案中，可能需要測定被治療的腫瘤中IGF-IR和/或PDGFRa的表達水平。在這種情況下，可以收集腫瘤活組織并使用本
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的常規方法進行分析。在本發明的另一個實施例中，在相應受體在某種類型的肺瘤中普遍表達或被激活或在疾病進行過程中一定會被表達或被激活的基礎上給予IGF-IR拮抗劑或PDGFRa拮抗劑。IGF-IR拮抗劑可以是胞外拮抗劑或胞內拮抗劑并且可能使用的拮抗劑不止一種。胞外拮抗劑包括但是不限于可以和IGF-IR或一種或多種IGF-IR配體(例如IGF-I和IGF-II是IGF-IR的天然配體)相結合的蛋白質或其他生物分子。在本發明的一個實施方案中，胞外拮抗劑抑制IGF-IR與其配體的結合。在一個實施方案中，所述拮抗劑是一種抗IGF-IR抗體，例如IMC-A12。在另一個實施方案中，所述拮抗劑為可以與IGF-IR片段結合的可溶性配體。胞內IGF-IR拮抗劑可以是生物分子，但是常常為小分子。這樣的例子包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑AG1024(Calbiochem)、胰島素樣生長因子-I受體激酶抑制劑NVP-AEW541(Novartis)和胰島素樣生長因子-I/胰島素受體抑制劑BMS-554417(BristolMyersSquibb)。應當理解的是本發明中可用的小分子是IGF-IR的抑制劑，但是并不需要對IGF-IR具有完全特異性。根據本發明使用的抗-IGF-IR抗體具有下列性質的一種或多種。1)所述抗體與IGF-IR的胞外域結合并抑制IGF-I或IGF-II與IGF-IR的結合。可以使用純化的或膜結合受體通過直接結合分析法測定抑制作用。在這一實施方案中，本發明中所述抗體或它們的片段與IGF-IR優先結合的強度至少應與IGF-IR的天然配體(IGF-I和IGF隱II)相當。2)所述抗體可中和IGF-IR。配體(例如IGF-I和IGF-II)與IGF-IR胞外域的結合可以激活其(3亞基和下游信號轉導分子包括MAPK、Akt和IRS-1的自身磷酸化。對IGF-IR的中和作用包括抑制、降低、滅活和/或破壞一種或多種這些與信號轉導相關的活性。可以使用例如組織、培養細胞或純化的細胞組分檢測體內、先體外后體內(exvivo)或體外中和作用。中和包括對IGF-IR/IR異型二聚體和IGF-IR同型二聚體的抑制。因此，對IGF-IR的中和具有多種作用，包括抑制、降低、滅活和/或破壞生長(增殖和分化)、血管生成((血管再生、侵襲和轉移)和細胞的運動性和轉移(細胞粘附和侵襲力)對IGF-IR中和作用的一個量度標準是對該受體的酪氨酸激酶活性的抑制。可以使用常見的方法測定酪氨酸激酶的抑制，例如通過測定重組激酶受體的自身磷酸化水平和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本發明背景下磷酸化分析對于測定抗體的中和是非常有用的。例如可以使用一種對磷酸酪氨酸具有特異性的抗體在ELASA;險測法或蛋白質印跡法中測定磷酸化。Panek等.，J.Pharmacol.Exp.Thera.283:1433-44(1997)和Batley等.，LifeSd.62:143-50(1998)描述了一些酪氨酸激酶活力的測定方法。本發明的抗體可以將與配體反應的細胞中IGF-IR的酪氨酸磷酸化降低至少75%，優選85%,更優選至少約為90%。IGF-IR中和的另一量度標準是IGF-IR下游底物磷酸化的抑制。相應地可以測定MAPK、Akt或IRS-I的磷酸化水平。磷酸化至少降低約40%，可以達到至少約60%或至少80%。除此之外可以應用檢測蛋白表達的方法測定IGF-IR中和，其中被檢測的蛋白是受IGF-IR酪氨酸激酶活性調節的。這些方法包括免疫組織化學(IHC)法檢測蛋白質表達，熒光素原位雜交法(FISH)檢測基因擴增，竟爭放射性配體結合分析法，固相基質印跡技術例如蛋白質印跡法和DNA印跡法，逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和ELISA。見以下參考文獻Grandis等.，Cancer,78:1284-92(1996);Shimizu等.，JapanJ.CancerRes"85:567-71(1994);Sauter等.，Am.J,Path"148:1047-53(1996);Collins,GHa15:289-96(1995);Radinsky等.，Clin.CancerRes.1:19-31(1995);Petrides等.，CancerRes.50:3934-39(1990);Hoffmann等.，AnticancerRes.17:4419-26(1997);Wikstrand等.，CancerRes.55:3140-48(1995)。也可以使用先體外后體內分析測定IGF-IR中和。例如可以在存在抑制劑和不存在抑制劑的情況下使用被受體的配體激活的細胞系通過促分裂分析法觀察受體酪氨酸激酶的抑制。MCF7乳腺癌細胞系(美國模式培養物保藏中心(ATCC),Rockville,MD)就是如上所述表達IGF-IR并可以被IGF-I或IGF-II激活的細胞系。另外一種方法涉及到檢測表達IGF-IR的腫瘤細胞或轉染后表達IGF-IR的細胞的生長抑制。也可以使用腫瘤模型觀察抑制作用，例如將人腫瘤細胞注射入小鼠。本發明中涉及的抗體并不局限于IGF-IR中和的任何具體機制。本發明的抗-IGF-IR抗體可以胞外結合IGF-IR細胞表面受體，阻斷配體結合(例如IGF-I和IGF-II)和之后通過受體結合性酪氨酸激酶介導的信號轉導以及阻止IGF-IR和信號轉導級聯中下游蛋白質的磷酸化。3)所述抗體可以下調IGF-IR。細胞表面IGF-IR的數量耳又決于受體蛋白的產生、內化和降解。細胞表面IGF-IR的數量可以通過檢測該受體或與該受體結合的分子的內化間接測定。例如，可以通過使表達IGF-IR的細胞與被標記抗體接觸來測定受體內化。使膜結合受體脫離，收集并計數。通過將細胞裂解并檢測裂解物中的被標記抗體測定內化抗體。另一種方法是在使用抗-IGF-IR抗體或其他物質進行治療之后直接測定細胞表面受體的數量。例如可以通過熒光激發細胞分選分析法測定被染色細胞表面的IGF-IR表達。將染色細胞在37。C下溫育。檢測不同時間的熒光強度。可以將被染色細胞的一部分置于4°C溫育(此條件下無受體內化)作為對照。可以使用一種不同的抗體來檢測和測量細胞表面的IGF-IR,這種抗體對IGF-IR具有特異性并且不會阻斷或竟爭被檢測抗體的結合。(Burtrum，等.CancerRes.63:8912-21(2003))用本發明的抗體治療表達IGF-IR的細胞可以降低細胞表面的IGF-IR。在一個優選的實施方案中，用本發明的抗體治療后，這種降低至少可以達到約70%,優選至少約80%，更優選至少90%。在短至四小時的時間內，可觀察到顯著降低。下行調節的另一個量度標準是細胞中所有受體蛋白的減少，這一量度標準反應了內部受體的降解。因此，用本發明抗體處理細胞(尤其是癌細胞)可以引起細胞總IGF-IR量的減少。在一個優選的實施方案中，這一降低可以達到至少約70%,優選至少約80%,更優選至少約90%。對人類受試者的治療，依據本發明優選人源性抗體。所述抗體一個實施方案中，抗IGF-IR抗體可以有一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個互補決定區(CDRs)，這些互補決定區選自SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47和SEQIDNO:49(這些序列分別位于CDR1H、CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。在另一個實施方案中，抗-IGF-IR抗體可以包含一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個互補決定區(CDRs)，這些互補決定區選自:SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57和SEQIDNO:59(這些序列分別位于CDR1H、CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。本發明所述抗體(或其片段)優選含有SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39的重鏈CDRs。或者這些抗體(包括其片段)優選含有SEQIDNO:45、SEQIDNO:47和SEQIDNO:49或SEQIDNO:55、SEQIDNO:57和SEQIDNO:59的輕鏈CDRs。人IgGl抗體IMC-A12(WO2005016970)就是這樣的一種抗體，含有用SEQIDNO:41表示的重鏈可變域和用SEQIDNO:51表示的輕鏈可變域。另一優選人源抗體是IMC-2F8(WO2005016970),含有與IMC-A12相同的重鏈可變域和以SEQIDNO:61為代表的輕鏈可變域。可用的抗體還包括可以與MC-A12或IMC-2F8竟爭結合IGF-IR的抗-IGF-IR抗體以及可以和其他抗原決定簇結合的抗體(例如可以和其他抗原決定簇結合并且表現出如前所述的配體阻斷，受體內化等性質但是不與IMC-A12或IMC-2F8竟爭的抗體)。依據本發明，PDGFRct拮抗劑也可以用于治療。PDGFRot拮抗劑可以是胞外拮抗劑或胞內拮抗劑，并且可以使用不止一種拮抗劑。胞外拮抗劑包括但不限于與PDGFRoc或其一種或多種其配體相結合的蛋白質或生物分子(例如PDGF-AA、-AB、-BB、-CC)。在本發明的一個實施方案中，胞外拮抗劑抑制PDGFRa與其配體的結合。在一個實施方案中，所述拮抗劑為抗-PDGFRoc抗體，例如IMC-3G3。在另一個實施方案中，所述結合蛋白是可與PDGFRoc片段結合的可溶性配體。胞內IGF-IR拮抗劑可以是生物分子，但常常是小分子。在一個實施方案中，所述胞內PDGFRot拮抗劑為AG1296。AG1296(Calbiochem)是PDGFa、PDGF(3s和c-KIT的一種抑制劑，也可以與Flt3反應。其他作用于PDGFRs的小分子包括STI-571(imatinibmesylate、Gleevec、Novartis)和SU11248(sunitinibmalate、SUTENT⑧、Pfizer)。在本發明的一個實施方案中，抗-PDGFRa抗體可以包含一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個互補決定區(CDRs),這些互補決定區選自SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14(分別位于CDRIH/CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。本發明所述抗體(或其片段)優選具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的CDRs。或者本發明抗體及其片段優選具有SEQIDNO:10、SEQIDNO:12的SEQIDNO:14的CDRs。CDRs的氨基酸序列見表1。表lIMC-3G3的CDRs<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在另一個實施方案中，抗PDGFRa抗體或其片段具有SEQIDNO:8的人重鏈可變區和/或SEQIDNO:16的人輕鏈可變區。IMC-3G3就是這樣一種抗體并在本發明中舉例說明。本發明的抗體或其片段優選中和PDGFRa。配體如PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB或PDGF-CC與PDGFRa胞外域的結合可以激活該受體二聚體的形成、自身磷酸化、激活該受體內部的胞質酪氨酸激酶域并啟動參與調節DNA合成(基因激活)和細胞周期進程或分裂的多重信號轉導和反式激活途徑。抗PDGFRa抗體通常可以阻斷配體結合和/或受體二聚體化并抑制一種或多種自身磷酸化，激活賴氨酸激酶活性和信號傳導。本發明的抗-PDGFRa抗體可以特異性地與PDGFRa的胞外配體結合區域結合并阻止PDGFRa配體的結合。這種抗-PDGFRoc抗體或其片段與PDGFRa的結合力優選至少與PDGFRa天然配體相同。另一種情況或除此之外，所述抗體可以特異性與受體單體的某一區域結合，否則這一區域就會形成二聚體的界面。雖然可能阻斷或不阻斷配體與受體單體的結合，但是這種抗體可以阻斷二聚體的形成。如上對抗-IGF-IR抗體所述，可以通過各種體內、先體外后體內和體外方法測定受體中和。在本發明的一個實施方案中，抗-PDGFRa抗體可以將PDGFRa磷酸化至少降低約75%。在其他實施方案中，磷酸化至少降低了約85%或至少約90%。在本發明的一個實施方案中，由于PDGFRa信號轉導受到抑制，磷酸化或下游信號轉導途徑元件(例如Akt、p42/p44等)被至少降低約40%或至少約60%或至少約80%。可以使用特定配體(例如PDGF-AA、-AB、-BB、-CC)、這些配體的混合物或包含PDGFs和其他激活生長因子的骨髓穿刺液等制劑測定受體中和。PDGFRot的中和包括對一種或多種與信號轉導相關活性的抑制、降低、滅活和/或破壞。因此，中和PDGFRa具有多種作用包括對生長(增殖和分化)、血管形成(血管再生、侵襲和轉移)、細胞運動性和轉移性(細胞粘附和侵襲性)的抑制、降低、滅活和/或破壞。如上所述的先體外后體內檢測也可以應用于測定PDGFRa的中和。例如，人SKLMS-平滑肌肉瘤細胞(美國模式培養物保藏中心(ATCC)，Rockville,MD;ATCCHTB-88TM)或由PDGF-AA激活的U118膠質瘤細胞(ATCCHTB-15頂)可以用于分析PDGFRoc抑制。可以用注射入SCID小鼠的表達PDGFRot的人腫瘤細胞確定生長抑制。本發明不受任何PDGFRa中和機制的限制。本發明的抗-PDGFRct抗體與PDGFRa細胞表面受體的胞外域結合，阻斷配體結合(例如PDGF-AA、PDGF畫AB、PDGF-BB、PDGF-CC)，抑制PDGFRa的磷酸化，抑制由受體相關型酪氨酸激酶介導的信號轉導并調節下游信號轉導元件的活性。所述受體_抗體復合物也可以被細胞內化并降解，導致細胞表面受體下調。在腫瘤細胞侵襲和轉移過程中發揮作用的基質金屬蛋白酶也可以被本發明的抗體下調。而且，本發明的抗體可能對生長因子的產生和血管生成顯示出抑制作用。如上所述，本發明的PDGFRa拮抗劑可用于治療骨癌，包括骨轉移性癌。其他表達PDGFRa并可依據本發明被治療的腫瘤包括但是不局限于卵巢腫瘤、乳腺癌、肺癌、肝細胞癌、胃腸道間質癌、腎細胞癌、前列腺肺瘤和軟組織肉瘤。軟組織肉瘤來自以下組織脂肪、肌肉、神經、腱、血管和淋巴組織。通常情況下，所述腫瘤組織過度表達PDGFRa，可以使用例如組織化學法或RNA分析法測定PDGFRot的表達量。例如對放射性標記的IMC-3G3對U118細胞和SKLMS-I胂瘤細胞結合的scatchard分析可以表明細胞表面的PDGFRa數量分別為500和2500。PDGFRa拮抗劑通過抑制經腫瘤細胞自身表達的PDGFRa介導的信號轉導或通過抑制周圍基質細胞表達的PDGFRa(否則這些細胞會被肺瘤細胞表達的PDGFRa旁分泌激活)發揮作用。因此，例如IMC-3G3這樣的抗體和其他PDGFRoc拮抗劑可用于治療具有PDGFRot自分泌和/或旁分泌激活特性的腫瘤。本發明中的抗體片段可以通過分裂完整的抗體或表達編碼所述片段的DNA制備。可以使用下列文章中描述的方法制備抗體片段Lamoyi等.，J.Immunol.Methods,56:235-243(1983)和Parham，J.Immunol.131:2895-2902(1983)。這種片段可能包括一個或兩個Fab片段或F(ab')2片段。這種片段也可能包括單鏈片段可變區抗體，即scFv、雙抗體或其他抗體片段。以下專利中都有公開制備這些功能等價物的方法PCT申請號WO93/21319，歐洲專利申請號.EP239400;PCT申請號WO89/09622;歐洲專利申請號EP338745;和歐洲專利申請號EP332424。用于載體轉化和表達本發明抗體的宿主細胞優選哺乳動物細胞，例如COS-7細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和淋巴樣來源的細胞系，例如淋巴瘤、骨髓瘤(例如NSO)或雜交瘤細胞。也可以使用其他真核宿主例如酵母。如果需要在酵母中表達基因構建體，一種適用于酵母的選擇基因為質粒YRp7中的trpl基因，見Stinchcombetal.Nature,282:39(1979);Kingsman等.，Gene,7:141(1979)。trpl基因能夠為在色氨酸中不能生長的突變酵母株提供選擇標記，例如ATCC編號44076或PEP4-1.見Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中的trpl基因被損害后可以提供一種通過在色氨酸缺乏環境中的生長來檢測轉化的有效方法。同樣，可以用已知的含有Leu2基因的質粒與Leu2缺陷酵母抹(ATCC20,622或38,626)互補。根據本
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的已知方法可在含有可同化的碳源(碳水化合物例如葡萄糖核乳糖)、氮源(氨基酸、多肽、蛋白質或其降解產物例如蛋白胨，銨鹽或其它)和無機鹽(類似物硫酸鹽，磷酸鹽和/或鈉、鉀、鎂和鉤的碳酸鹽)的液體基質中培養被轉化的宿主細胞。所述基質還可包括促生長物質例如微量元素(如鐵、鋅、鎂及其它)。依據本發明可以從由人重鏈和輕鏈可變區基因構建而來的噬菌體展示文庫中分離高親和性的抗_PDGFRa和抗IGF-IR抗體。例如，本發明的一個可變區可以從含有重排的可變區基因的外周血淋巴細胞中獲得。或是從不同來源獲得可變區域部分例如CDR和FW區并進行重組。此外，可變區域部分(例如FW區)還可以是人工合成的共有序列。本發明的抗體和抗體片^a可從例如天然存在的抗體或Fab或scFv的噬菌體展示文庫中獲得。應當理解的是為了從由一個包含VH和V"或的抗體中得到單域抗體，應將CDRs之外的某些氨基酸進行替換以增強結合、表達或溶解性。例如，有必要對那些可能被埋藏在VH-VL界面中的氨基酸殘基進行修飾。此外，本發明的抗體和抗體片段可以通過標準雜交瘤技術(Harlow&Lane,ed.，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,211-213(1998)這里作為文獻引用)使用可生產人免疫球蛋白y重鏈和k輕鏈的轉基因小鼠(例如來自Medarex，SanJose,Calif.的KM小鼠)獲得。在一個優選的實施方案中，將生產人抗體的基因組的重要部分插入小鼠的基因組中使其內源性鼠抗體生產不足。用PDGFRa皮下免疫(S.C)這些小鼠(通常使用完全弗氏佐劑)，在需要的情況下強化免疫。免疫方法為本
技術領域：
常用的方法。本發明中用于鑒定IGF-IR結合抗體的蛋白優選IGF-IR,更優選IGF-IR的胞外域。本發明中用于鑒定PDGFRa結合抗體的蛋白質優選PDGFRa，更優選PDGFRa的胞外域。這些胞外域可以是游離的也可以與其他分子相結合。本發明還提供了編碼如前所述的抗體或其片段的多核苷酸。IMC-A12抗-IGF-IR抗體的詳細信息公開在WO2005016970中。表2為MC-3G3的核苦酸序列。表2-編碼IMC-3G3的CDRs的核苷酸序列重鏈CDR1agtagtagttactacSEQIDNO:1CDR2agtttcttttatact鵬agcacctactacaacccgtccctoaggagtSBQIDNO:3CDR3ca沐cacgtattaetatgg加ggggaattattatggctggttcgaccgcSEQISNO:5輕鏈CDR1agggccagtcagagtgttagcagctacttagccSEQIDNO:9CDR2gatgcatccaacagggccactSEQIDNO:11CDR3cagcagcgtag咖ctggcctccggcgSEQIDNO:13可以通過重組編碼人恒定區和可變區的大部分或全部來源于對應的人抗體區域的DNA(而不是的CDRs基因)和人源的編碼CDRs的基因(用于重鏈可變域CDRs的SEQIDNOS:1、3和5,以及用于輕鏈可變域的CDRs的SEQIDNOS:9、11和13)獲得編碼人源抗體的DNA。編碼抗體片段DNAs的適合來源包括任何表達全長抗體的細胞，例如雜交瘤細胞和脾細胞。如上所述，這些片段自身可以用作抗體等價物或重組成等價物。本部分所描述的DNA缺失和重組可以根據已知方法實施，例如以上列舉的出版物中描述的關于抗體等價物和/或其他重組DNA標準技術(如下所述)的方法，例如下面描述的方法。正如本專業
技術領域：
人員所知，另一個DNAs的來源是由噬菌體展示文庫生產的單鏈抗體。此外，本發明還提供了含有如前所述的核苷酸序列并可操作性的連接于表達序列、啟動子和增強子序列的表達載體。已經開發了許多可以在原核中有效合成抗體多肽的表達載體，例如細菌和包括但不局限于酵母和哺乳細胞培養體系在內的真核體系。本發明的載體可以包括染色體、非染色體和合成DNA序列的片段。可以使用任何適合的表達載體。例如原核克隆載體，包括E.coli的質粒，例如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核載體也包括噬菌體DNA例如MI3和人其他絲狀單鏈DNA噬菌體的衍生物。例如在酵母中可以使用2fi質粒。適用在哺乳細胞中表達的載體包括廣為人知的SV40衍生物，腺病毒，來自于逆轉錄病毒的DNA序列、將如上所述的功能哺乳動物細胞載體重組后衍生而來的穿梭載體和功能質粒和噬菌體DNA。還有其他的本
技術領域：
人員熟知的真核表達載體(例如，PJ.Southern.P.Berg,J.Mol.Appl.Genet"I,327-341(1982);Sub腿ani等.，Mol.Cell.Biol"1:854-864(1981);KaufmannandSharp,"AmplificationAndExpressionofSequencesCotransfectedwitha葉酸脫氬酶互補DNA基因共轉染序列的擴增和表達)，"J.Mol.Biol.159，601-621(1982);KaufmannandSharp,Mol.Cell.Biol.159,601-664(1982);Scahilletal""ExpressionAndCharacterizationOfTheProductOfAHumanImmuneInterferonDNAGeneInChineseHamsterOvaryCells(—種人免疫干擾素DNA基因在中國倉鼠卵巢細胞中產物的表達和特征)"Pro"Nat'lAcad.Sci.USA80，4654-4659(1983);UrlaubandChasin，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA77，4216-4220,(1980))。本發明中可用的表達載體至少包含一個與待表達的DNA序列或片段可操作性連接在一起的表達控制序列。將該控制序列插入所述載體來控制和調節被克隆DNA序列的表達。可用的表達控制序列包括lac系統、trp系統、tac系統、trc系統、噬菌體入的主要操縱基因和啟動子區、fd外殼蛋白的控制區、酵母的糖酵解啟動子(例如3-磷酸甘油酸酯激酶啟動子)、酵母酸性磷酸酯酶啟動子(例如Pho5)、酵母a交配因子啟動子和來源于多瘤、腺病毒、逆轉錄病毒和猿猴病毒(例如SV40的早期和晚期啟動子)的啟動子和其他已知的可以控制原核或真核細胞和其病毒或者它們的組合的表達的序列。本發明也^是供了含有如前所述的表達載體的重組宿主細胞。本發明的抗體可以在細胞系中而不是雜交瘤中表達。含有編碼本發明中多肽鏈序列的核苦酸可用于轉化合適的哺乳動物宿主細胞。根據高表達量、相關蛋白組成性表達和來自宿主蛋白污染最低等標準篩選優選細胞系。可作為宿主用于表達的哺乳細胞系在本專業
技術領域：
已廣為人知，包括許多無限增殖細胞系，例如但不局限于NSO細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)以及其他。其他適合的真核細胞包括酵母和其他真菌。適用的原核宿主包括大腸桿菌(例如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI和大腸桿菌MRC1)、假單胞菌屬菌屬、桿菌屬(例如枯草芽孢桿菌)和鏈霉菌屬。這些重組宿主細胞可用于生產抗體或其片段，通過在允許抗體或其片段表達的條件下進行細胞培養并從宿主細胞或宿主細胞周圍的培養基中純化抗體或其片段。可以通過在編相關抗體基因的5，端插入編碼信號肽或分泌引導肽的序列(見Shokri等.，ApplMicrobiolBiotechnol.60(6):654-64(2003),Nielsen等.，Prot.Eng.10:1-6(1997)和vonHeinje等.，Nucl.AcidsRes.14:4683-4690(1986))使抗體或其片段在宿主細胞內定向分泌表達。這些分泌？I導肽元件可以來自于原核或真核序列。根據上述方法使用了適當的分泌引導肽后，可以使氨基酸與一種多肽的N端結合并引導該氨基酸向宿主細胞細胞膠質外運動并分泌至培養基中。本發明的抗體可與其他氨基酸殘基融合。這樣的氨基酸殘基可以是一種可能有助于分離純化的多肽標簽。也可以考慮使用其他可以使抗體靶向于特定器官或組織的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，通過在轉基因動物中表達編碼所述抗體的核普酸制備該抗體，這樣可以表達并回收抗體。例如可以組織特異性表達抗體，有利于抗體的回收和純化。在一個這樣的實施方案中，在乳腺中表達本發明的一種抗體，可以在泌乳時分泌。轉基因動物包括但不局限于小鼠、山羊和家兔。依據本發明可以使用的抗體包括完整的免疫球蛋白、與抗體結合的免疫球蛋白片段以及含有免疫球蛋白抗原結合域的抗原結合蛋白。與抗原結合的免疫球蛋白包括例如Fab、Fab'和F(ab')2。還有其他已開發的抗體模式，不僅保留了結合的特異性還具有其他有用的特性，例如雙特異性、多價性(多于2個結合位點)和緊密的結構(例如只有結合域)。單鏈抗體缺少部分或完全缺乏與其相應的完整抗體的恒定區。因此它們可以克服一些與使用完整抗體相關的問題。例如，單鏈抗體不會出現重鏈恒定區和其他生物分子之間發生某些不利的反應。此外，單鏈抗體遠小于完整抗體并比完整抗體具有更強的滲透性，這樣就使得單鏈抗體可以更有效地定位并與目標抗原結合位點結合。而且，單鏈抗體相對較小的體積使其在接受者體內引起不良免疫應答的可能性小于完整受體。多單鏈抗體(每一條單鏈抗體含有由一個連接肽共價連接的一個vH和一個V^域)可以通過至少一種或多種的連接肽共價聯接形成多價單鏈抗體，這種抗體可以是單特異性的也可以是多特異性的。多價單鏈抗體的每一條鏈都包括一個輕鏈可變區片段和一個重鏈可變區片段，并且通過連接肽與其他一條或更多的單鏈抗體連接。連接肽至少由15個氨基酸殘基組成。最大氨基酸殘基數約為100。兩條單《連抗體可以組合形成雙抗體，也被成為二i"介二聚體。雙抗體有兩條鏈和兩個結合位點，可以是單特異性也可以是雙特異性。雙抗體的每一條鏈都含有一個與VL域連接的Vh域。域之間的連接肽都足夠短以防止同一條鏈的域發生配對，從而促進不同抗體鏈的互補域配對并重新形成兩個抗原結合位點。三條單鏈抗體可以組合形成三抗體，也稱作三價三聚體。三抗體由一個或VH域的氨基酸末端與一個VL或VH域的碳末端直接融合構建而來，例如，沒有任何聯接肽序列。三抗體有三個Fv頭部，多肽鏈以環狀頭尾相連的形式排列。三抗體一種可能的構象是平面的，三個結合位點在同一平面上互相成120度角。三抗體可以是單特異性、雙特異性或三特異性。因此，本發明的抗體及其片段包括但是不局限于天然抗體、二價片段例如(Fab')2、單價片段例如Fab、單鏈抗體、單鏈Fv(scFv)、單域抗體、多價單鏈抗體、雙抗體、三抗體和其他與抗原特異性結合的類似物質。可以通過化學反應或生物合成的方法將抗-IGF-IR和抗-PDGFRa抗體或抗體片段(這些抗體和片段在與表達IGF-IR(WO2005016970)或PDGFRa的細胞結合時可能會被內化)與抗腫瘤藥物連接。與這樣一種抗體聯接的抗腫瘤藥物包括可以破壞或損害該抗體所結合的肺瘤或該抗體所結合細胞所處環境中的腫瘤的任何藥物。例如，這種抗肺瘤藥物可以是一種細胞毒性藥物例如化療藥物或放射性同位素。本專業
技術領域：
人員都了解這些適合的化療藥物，包括蒽環類抗生素(例如柔紅霉素和阿霉素)、曱氨喋呤、長春花堿酰胺、新制癌菌素、順鉑、苯丁酸氮芥、阿糖胞普、5-氟尿普、苯丙氨酸氮芥、篦麻毒素和刺孢霉素。使用傳統方法將所述化療藥物與所述抗體結合(例如見Hermentin和Seiler,BehringInst.Mitt.82:197-215(1988))。本專業技術人員也熟知可用做抗腫瘤藥物的放射性同位素。例如可以使用1311或211At。使用傳統技術將這些同位素與所述抗體連接(例如見Pedley等.，Br.J.Cancer68,69-73(1993))。另外一種選擇是將可以激活前體藥物的酶作為抗腫瘤藥物與所述抗體連接。在這一方法中，給予的前提藥物一直保持非活性形式直至到達靶位點并在那里被轉化成細胞毒素形式。在具體操作中，給予病人抗體-酶復合物并使其定位于需要治療的組織區域。然后給予病人前體藥物，這樣就會在需要治療的組織區域發生向細胞毒性藥物的轉化。其他的抗肺瘤藥物包括細胞因子，例如白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)或腫瘤壞死因子a(TNF-a)。所述抗體將細胞因子定向于腫瘤從而使細胞因子發揮對腫瘤的損害或破壞作用而不影響其他的組織。使用傳統的重組DNA技術可以使細胞因子在DNA水平與所述抗體結合。在本發明的某一個實施方案中，將抗IGF-IR或抗-PDGFRa抗體與一種或多種抗肺瘤藥物聯合使用。例如聯合療法，見以下專利美國專利號6,217,866(Schlessinger等)(抗-EGFR抗體與其他抗腫瘤藥物聯合使用)；WO"MOO23(Waksal等)(抗-EGFR抗體與放射聯合使用)。可以使用任何一種適當的抗腫瘤藥物，例如化療藥物、放療藥物或它們的組合。所述抗腫瘤藥物可以是一種烷化劑或一種抗代謝物。烷化劑的例子包括但是不局限于順鉑、環磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和氮烯咪胺。抗代謝物的例子包括但是不局限于阿霉素、柔紅霉素和紫杉醇、吉西他濱(2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷)。可用的抗腫瘤藥物也包括促分裂抑制劑例如紫杉烷類、多西他賽和紫杉醇TAX。拓樸異構酶抑制劑是另一類可與本發明中抗體結合的抗腫瘤藥物。它們包括樸異構酶I抑制劑和樸異構酶II抑制劑。樸異構酶I抑制劑包括依立替康(CPT-11)、氨基喜樹堿、喜樹堿、DX-8951f和托泊替康。樸異構酶II抑制劑包括鬼臼乙叉甙(VP-16)和鬼臼噻吩甙(VM-26)。目前正在評價其他一些物質的樸異構酶抑制活性和作為抗腫瘤藥物的有效性。在一個優選的實施方案中，所使用的樸異構酶抑制劑為依立替康(CPT-ll)。在一個特殊的實施方案中，將抗-IGF-IR抗體與多西他賽聯合使用。在本發明的另一個實施方案中將抗-IGF-IR抗體與阿霉素聯合使用。如果抗肺瘤藥物為放射線，放射線的來源可以在被治療病人的體外(外線束放射療法-EBRT)或體內(近距離放射療法-BT)。抗腫瘤藥物的給予劑量取決于多種因素例如包括藥物類型、被治療腫瘤的類型和嚴重程度和該藥物的給藥方式。應當強調的是本發明并不局限于任何具體的劑量。所述抗體(抗-IGF-IR或抗-PDGFRa)和抗體加抗腫瘤藥物療法也可用于接受輔助性激素療法(例如乳腺癌)或去雄療法(例如前列腺癌)的病人。本發明的抗-IGF-IR和抗-PDGFRa拮抗劑可以聯合4吏用或與可以中和其他參與肺瘤生長或血管發生的受體的受體拮抗劑聯合使用。例如在本發明的一個實施方案中，將一種抗-IGF-IR抗體和一種抗-PDGFRa抗體聯合使用。在一個實施方案中，目標肺瘤細胞表達IGF-IR和PDGFRa，普通信號轉導元件可被經每一種受體的信號轉導激活。雖然對一種受體的抑制會普遍？)起普通下游元件激活減少，但是對兩種受體的同時抑制會進一步減少激活。在另一個實施方案中腫瘤或周圍組織的某些細胞顯著表達一種受體，另外的細胞顯著表達另一種受體。將拮抗劑聯合使用可以減少腫瘤細胞的生長和周圍細胞的旁分泌刺激。雙特異性抗體可以作為聯合用藥的另一選擇。有許多被設計成能包含各種所需特性的雙特異性抗體。例如雙特異性抗體具有最小的體積。具有4個抗原結合位點的雙特異性抗體(每一種結合專一性有2個位點)與相應的天然抗體具有類似的結合親和力。某些雙特異性抗體包括Fc區，因此保留了天然抗體的效應器功能(例如，補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC))。WO01/90192中描述了IgG樣四價抗體，WO2006/020258中描述了一種包含兩個雙抗體并保留了效應器功能的四價抗體。在另一個實施方案中，將一種抗IGF-IR抗體或一種抗-PDGFRa抗體或其他拮抗劑與一種可以和表皮生長因子受體特異性結合的受體拮抗劑(例如EGFR、Her2/erbB2、erbB3、erbB4))聯合使用。尤其優選可以與EGFR的胞外域結合并阻斷一種或多種配體結合或中和配體誘導的EGFR激活的抗原結合蛋白。EGFR拮抗劑也包括例如EGF、TGF-a、雙調蛋白、肝素結合-EGF(HB-EGF)和卩-細胞調節素。盡管TGF-oc表現出更強的促血管形成作用，但是EGF和TGF-a被認為是引起EGFR-介導激活的主要外源性配體。EGFR拮抗劑也包括可以抑制EGFR與其他EGFR受體亞基(即EGFR同型二聚體)發生二聚體化或與其他生長因子受體(例如HER2)發生異二聚體化的物質。EGFR拮抗劑還包括生物分子和小分子，例如可以直接作用于EGFR胞質域并抑制EGFR介導的信號轉導的合成激酶抑制劑。Erbitux(cetuximab)就是可以與EGFR結合并阻斷配體結合的EGFR拮抗劑。IRESSATM(ZD1939)是小分子EGFR拮抗劑，它是喹唑啉書f生物可以作為一種類ATP抑制EGFR。見美國專利5,616,582(ZenecaLimited);WO96/33980(ZenecaLimited)第4頁；也可見,Rowinsky等，舊金山第37屆美國臨床腫瘤學會年度會議中發表的摘要5,舊金山，CA,2001年5月12-15日；Anido等，舊金山第37屆美國臨床腫瘤學會年度會議中發表的摘要1217,舊金山，CA，2001年5月12-15日。Tarceva⑧(OSI-774)是另一種小分子EGFR拮抗劑，它是4-(取代苯胺)喹唑啉衍生物[6，7-雙(2-曱氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔-苯)胺氫氧化物]EGFR抑制劑。見WO96/30347(PfizerInc.),例如從第二頁第12行至第4頁第34行和第19的14-17行。也可見Moyer等，CancerRes"57:4838-48(1997);Pollack等，J.Pharmacol,291:739-48(1999).。Tarceva⑧可能通過抑制EGFR磷酸化及其下游的PI3/Akt和MAP(有絲分裂原激活蛋白)激酶信號轉導途徑發揮功能，導致p27介導的細胞周期停止。見Hidalgo等，舊金山第37屆美國臨床腫瘤學會年度會議中發表的摘要281,舊金山,CA，2001年5月12-15日。許多其他已報道的可以抑制EGFR的小分子都被認為對EGFR的酪氨酸激酶域具有特異性。關于小分子EGFR拮抗劑的例子描述可見WO91/116051、WO96/30347、WO96/33980、WO97/27199(ZenecaLimited)。WO97/30034(ZenecaLimited)、WO97/42187(ZenecaLimited)、WO97/49688(PfizerInc.)、WO98/33798(WarnerLambertCompany),WO00/18761(AmericanCyanamidCompany)和WO00/31048(WarnerLambertCompany)。特異性小分子EGFR拮抗劑的例子包括C1-1033(Pfizer),它是酪氨酸激酶的喹唑啉(N-[4-(3-氯-4-氟-苯基氨基)-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)的抑制劑，以下專利對EGFR進行了描述，WO00/31048第8頁第22-26行描述了一種EGFR吡咯并嘧啶抑制劑PKIl66(Novartis)，WO97/27199第10至12也對該抑制劑進行了描述；GW2016(GlaxoSm他Kline)是一種EFGR和HER22的抑制劑；EKB569(Wyeth)可以在體內和體外抑制表達EFGR或HER22細胞的生長；AG-1478(Tryphostin)是一種可以抑制來自EGFR和erbB-2的信號轉導的喹唑啉小分子；AG-1478(Sugen)是一種也可以抑制蛋白質激酶CK2的雙底物抑制劑；被報道可以抑制EGFR酶活性和腫瘤生長的PD153035(Parke-Davis)可以誘導培養細胞的凋亡并增強細胞毒性化療藥物的細胞毒性。SPM-924(SchwarzPharma)是一種酪氨酸激酶抑制劑可用于前列腺癌的靶向治療；CP-546,989(OSIPharmaceuticals)被報道是一種血管形成抑制劑可用于實體瘤的治療。ADL-681是一種EGFR激酶抑制劑可用于癌癥的靶向治療；PD158780是一種吡咯并嘧啶并被才艮道可以抑制小鼠A4431移植腫瘤的生長；CP-358,774是一種被報道可以抑制小鼠HN5移植物自身磷酸化的喹唑啉；ZD1839是一種被報道的對小屬移植腫瘤模型包括外陰癌、NSCLC、前列腺癌、卵巢癌和結腸直腸癌具有抗癌活性的p套唑啉；CGP59326A是一種被報道的對小鼠EGFR陽性移植腫瘤的生長具有抑制作用的吡咯并嘧啶;PD165557(Pfizer);CGP54211和CGP53353(Novartis)為二苯胺基鄰苯二曱酰亞胺(dianilnophthalimides)。天然EGFR酪氨酸抑制劑包括5,7,4'-三羥基異黃酮、除莠霉素、橡黃素和三羥異黃酮。其他已報道的可以抑制EGFR并因此也屬于本發明范圍的小分子是三環類化合物如美國專利號5,679,683中描述的化合物；喹唑啉衍生物，例如美國專利號5,616,582中所述衍生物和吲哚化合物，例如美國專利號5,196,446中描述的化合物。另一種可與IGF-IR或PDGFRa—起做為作用靶的受體為血管內皮生長因子受體(VEGFR)。在本發明的一個實施方案中，將一種抗-IGF-IR抗體或抗-PDGFRa抗體與一種VEGFR拮抗劑聯合使用。在一個實施方案中使用了與VEGFR-I/FIt-I受體特異性結合的拮抗劑。在另一個實施方案中，所述VEGFR拮抗劑與VEGFR-2/KDR受體特異性結合。尤其優選可與VEGFR-I或VEGFR-2胞外域結合并通過它們的配體(VEGF對VEGFR-2的激活力最強；P1GF對VEGFR-I的激活力最強但也可被VEGF激活)阻斷和/或中和配體誘導激活的抗原結合蛋白。例如，IMC-1121是一種可以與VEGFR-2結合并將其中和的人源抗體(WO03/075840;Zhu)。另一個例子為MAb6.12,它可以與可溶性的并表達于細胞表面的VEGFR-I結合。ScFv6.12包括小鼠單克隆抗體MAb6.12的Vl和VH域。一種生產MAb6.12的雜交瘤細胞系已按照國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約及其相關規定保存，ATCC編號為PTA-3344。在另一個實施方案中，所述VEGFR拮抗劑與一種VEGFR配體結合并阻斷配體對VEGFR的激活。例如，Avastin(bevacizumab)就是一種可以結合VEGF的抗體。其他與肺瘤形成有關的腫瘤生長因子受體有神經生長因子受體(NGFR)和成纖維細胞生長因子受體(FGFR)。在另一種可選擇的實施方案中，所述抗-IGF-IR和抗-PDGFRa抗體可以與一種或多種的輔助藥物聯合使用，例如細胞因子(例如IL-10和IL-13)或其他免疫激活劑，例如(但不局限于)趨化因子、肺瘤相關抗原和多肽。例如見Larrivee等，出處同上。應當理解的是只給予一種抗-IGF-IR或抗-PDGFRa抗體已足以預防、抑制或降低肺瘤的生長進程，達到有效治療。在一種聯合療法中，在用另一種藥物開始治療之前、治療中和治療后給予抗-IGF-IR或抗-PDGFRa抗體，也可以在任何時間組合給予，例如在使用抗肺瘤藥物療法開始治療前和治療中、治療前和治療后、治療中和治療后或治療前、中、后。例如，所述抗體可以在》文療開始前l至30天給予，優選第3至20天，更優選第5至12天。在一個優選的實施方案中化療可與抗體療法同時或優選在抗體療法之后聯合使用。在本發明中，可使用任何適當地方法或途徑給予本發明抗體或選擇性地聯合給予抗肺瘤藥物和/或其他受體拮抗劑。依照本發明可使用的抗腫瘤藥物包括任何被認為治療病人腫瘤的最適療法。不同的惡性肺瘤要求使用特異性的抗腫瘤抗體和特異性的抗腫瘤藥物，這些取決于病人的個體情況。給藥途徑包括例如口服、靜脈注射、腹膜內注射、皮下注射或肌肉注射。拮抗劑的給藥劑量取決于許多因素，包括例如拮抗劑類型、被治療腫瘤的類型和嚴重程度、拮抗劑的給藥途徑。應當強調的是本發明并不局限于任何具體的方法或給藥途徑。本專業領域技術人員會理解治療的劑量和頻率取決于病人個體的耐受力和所使用的阻斷劑或抑制劑的藥理學和藥代學性質。理想狀態下我們希望達到所用藥物的飽和藥代學。例如，抗-IGF-IR和抗-PDGFRa抗體的負荷劑量可以為10至約1000mg/m2,優選200-400mg/m2。之后可以再給予幾天或幾周的附加劑量，例如200-400mg/m2。監控病人副作用的發生，當發生嚴重副作用時停止治療。本專業領域技術人員也知道如何監控治療過程以確定有效劑量。對于轉移自前列腺的骨轉移，一種方法是監控PSA的濃度。其他監控骨轉移的方法包括骨掃描和核磁共振。對于癌癥誘導骨丟失(CTIBL)會引起危險或產生問題的病人(例如接受輔助激素療法治療乳腺癌或去雄療法治療前列腺癌的病例如二膦酸鹽。二膦酸鹽包括例如氯膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸在內的物質。在整個申請中，各種出版物、參考文章、教科書、技術手冊、專利和專利應用均作為參考。這些出版物、專利、專利應用和其他文件的教義和公開內容都完整地以引用形式包含在本申請中以更全面地描述本發明相關技術的狀態。應當理解和預見的是本專業領域技術人員可以對在此公開的本發明原理進行各種變化但是這些變體也屬于本發明范疇。以下實施例對本發明進行進一步闡明，但是并不限制本發明的范圍。從許多出版物中都可以獲得傳統實驗方法的詳細描述，例如構建體和質粒、表達抗體和抗體片段所使用的方法。這些出版物包括Sambrook，J等，(1989)分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社；Coligan,J.等.(1994)免疫學實驗室指南，Wiley&Sons,Incorporated;Enna，SJ.等.(1991)藥理學實驗室指南，Wiley&Sons;Bonifacino,J.S.等.(1999)生物學實驗室指南，Wiley&Sons。這里提到的參考書均以完整的包含在本申請中。實施例實施例1IMC-A12和多西他賽對腫瘤生長的作用。如前所述(4)將雄性激素依賴型(AI)LuCaP35V腫瘤小塊(20-30mm3)分別皮下移植(s.c.)至32個6周大的去雄SCID小鼠。當觀察到被移植腫瘤的體積達到150-200mm3時，將動物隨機分成4組進行治療研究。第一組動物接受20mg/kg多西他賽的治療。第二組動物接受10mg/kg多西他賽的治療。第三組動物接受10mg/kg多西他賽和40mg/kgA12的聯合治療。第四組動物接受20mg/kg多西他賽和40mg/kgA12的聯合治療。所有的治療均為腹膜內給藥(ip)。多西他賽每周給藥l次。A12每周給藥3次。所有動物均接受4周治療并且在實施安樂死之前進行四周的監控。每周對腫瘤進行2次測量，腫瘤的體積根據下列公式計算體積LXW2/2。根據我們華盛頓大學IACUC批準的動物實驗規程，當肺瘤體積達到1000mm3之前或者動物的體重減少超過了原始體重的20%時將一些動物提前處死。每兩周將動物稱重一次。每周進行眼窩竇取血采樣。分離血清并使用EVIxTotalPSAAssay(AbottLaboratories,AbottPark,IL)測定PSA水平。在將小鼠處死前lh向腫瘤中注射BrdU以評價體內腫瘤細胞的生長速率。將小鼠處死之后收集腫瘤并分成兩份。一部分胂瘤固定在10%的中性緩沖液福爾馬林(NFB)中并用液體石蠟包埋。制備5微米大小的切片并進行免疫組織化學(IHC)染色。剩余部分的腫瘤通過研磨和過70(im尼龍篩分離制備成單細胞。如圖1所示，LuCaP35V移植腫瘤在小鼠中生長迅速，在不進行任何治療的情況下平均生長速率為362.0土72.0mm/周。在實驗組開始治療后三個星期內所有非治療組的動物都必須處死，因為此時它們的腫瘤體積都超過了1000mm3。當單獨使用40jng/kgA12治療動物時，治療過程中腫瘤的生長速率降低至192.7±35.6mmV周。當給予動物10mg/kg的多西他賽時LuCaP35V腫瘤的生長速率降低至平均29.6土6.1mmV周。當使用多西他賽和A12聯合治療時LuCaP35V腫瘤的生長速率進一步降低至平均7.9±1.0mm3/周(圖lb)。多西他賽和A12聯合使用的抑制效果可以持續至治療結束后第四個星期。如果給予動物更高劑量的多西他賽(20mg/kg)，不論是否與A12聯合使用，腫瘤體積在為期四周的治療期內沒有增加，相反，還觀察到腫瘤體積有減小的趨勢。但是在治療結束后的四個星期中，使用多西他賽和A12聯合治療的動物組中肺瘤體積進一步減小。相比之下，單獨使用多西他賽治療的動物組腫瘤體積的平均增長速率為27.0±16.1mmV周。這些結果表明在給定的多西他賽劑量下，聯合使用A12可以增強多西他賽在治療過程中或治療之后對肺瘤生長的抑制作用。PSA是普遍使用的評價前列腺腫瘤生長的臨床參數。在治療中和治療后測定動物的血清PSA水平。如圖Ic所示，使用A12和多西他賽或單獨使用20mg/kg多西他賽治療的動物，血清PSA水平沒有發生明顯變化，與腫瘤生長受到抑制相一致。在治療結束之后，單獨使用多西他賽治療的動物血清PSA水平增加，相比之下，使用多西他賽和A12聯合治療的動物PSA水平保持不變甚至降低。這些數據都表明使用多西他賽和A12聯合治療可在治療結束后仍然保持對腫瘤生長的抑制作用。多西他賽與抗-IGF-IR抗體聯合使用誘導細胞凋亡。使用如前所述的末端脫氧核苷酸基轉移酶介導的缺口標記技術(TUNEL)和使用Apop-Directkit(BDBioScience)進行碘化丙錠(PI)染色測定多西他賽和A12對實驗結束點的細胞周期和細胞存活率的體內作用。基本過程如下將單細胞懸液中lxl(^細胞固定于10%的中性緩沖液福爾馬林中，然后再用70。/。的乙醇-20。C下固定30分鐘。沖洗數次之后，用0.1%的TritonX-100滲透細胞并與結合FITC的dUTP和末端脫氧核芬酸基轉移酶(TdT)于37。C溫育lh。之后用PI/RNase緩沖液(100嗎/ml的PI，50昭/mlRNase)于室溫下溫育60分鐘。使用流式細胞儀BDFACscan分析樣品。使用CellQuestPRO軟件分析數據。治療結束后四個星期，在使用多西他賽(使用10mg/kg多西他賽治療的動物組為66.7%,使用20mg/kg多西他賽治療的動物組為77.8%)和Al2聯合治療的動物腫瘤中觀察到顯著比例的細胞凋亡(圖.2b和表1),與多西他賽的使用劑量無關。這些腫瘤中細胞凋亡事件的平均發生率為15.0±4.3%。在單獨使用多西他賽治療的動物組中沒有檢測到細胞凋亡。反而，大多數(使用10mg/kg多西他賽的治療組為88%,使用20mg/kg多西他賽的治療組為100%)腫瘤進入正常的細胞周期(圖.2a和表3)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>為了進一步評價治不同療結束后腫瘤細胞的增殖能力，將石蠟切片用抗BrDu抗體染色(paraffin-sectionofstainedwithanti-BrDuantibody)。將腫瘤樣品用10%的NBF固定并包埋在液體石蠟中，切成5pm的薄片。在去掉石蠟和再水化之后，用0.01M的檸檬酸(pH6.0)于95。C下回收抗體2X5min。將薄片冷卻30分鐘，然后用PBS連續潤洗。用0.3%的&02曱醇溶液溫育使內源性過氧化物酶失活。用1.5%常規山羊血清在含有0.05%Tween20的PBS溶液中封閉1小時后，將薄片與小鼠抗-BrdU抗體(1嗎/ml)溫育1小時。然后依次與生物素化的羊抗-小鼠IgG溫育30分鐘，與過氧化酶標記的卵白素(SantaCruzBiotechnology)溫育30分鐘，與二氨基聯苯胺(DAB)/過氧化氫色原體底物(VectorLaboratories,Burlingame,CA)溫育5-10分鐘。所有的溫育過程均在室溫下進行。用蘇木精(Sigma)將薄片反染色，并用封片劑(FisherScientific,FairLawn,NewJersey)封存。對于陰性對照，用小鼠IgG(VectorLaboratories)代替一級抗-BrdU抗體。在Zeiss顯微鏡下觀察薄片并獲得數字圖象。計算每一個切片的10個隨機視野中BrdU標記細胞核數和總細胞核數。用BrdU陽性細胞核數除以總細胞核數就可計算得到增殖率。每一薄片計數IO個區域。使用蘇木精和伊紅(RichardAllen,Kalamazoo,MI)進行H&E染色。使用用多西他賽和A12聯合治療的動物中BrDu攝入明顯少于單獨用多西他賽治療的動物(圖3)。這些BrDu摻入數據與以上對細胞周期和細胞凋亡的觀察結果一致，這表明A12顯著增強了多西他賽的細胞毒性。用多西他賽和抗-IGF-IR-抗體聯合治療的腫瘤與單獨使用多西他賽治療的腫瘤基因表達差異調控的比較。為了確定A12對多西他賽顯著增強作用的潛在機制，使用免疫組織化學和流式細胞儀分析法^f企測所有收獲腫瘤中IGF-IR的表達。所有治療組之間或與對照組相比(數據未顯示)表面IGF-IR的表達量沒有差異。使用cDNA微陣列分析法檢測接受20mg/kg多西他賽治療和接受20mg/kg多西他賽和A12聯合治療的動物腫瘤中治療后的基因表達。基于SAM分析，與單獨使用多西他賽治療的腫瘤相比，在使用多西他賽和A12聯合治療的腫瘤中鑒定出49種基因差別表達，這種差異大于2倍并且錯誤發現率小于(FDR)10%(數據未顯示)。鑒定出13種基因可能參與了細胞凋亡或細胞周期的調控(表4)。兩種治療之間所有13個基因至少存在2倍差異并且FDR小于0.02%。與單獨使用多西他賽治療的肺瘤相比，使用多西他賽和A12聯合治療的肺瘤種有9種基因下調，4種基因上調。表4使用多西他賽+A12聯合治療的肺瘤和單獨使用多西他賽治療的腫瘤中治療后的差別基因表達<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>對于所篩選的基因，所述結果已被實時RT-PCR驗證。純化目標cDNA的標準PCR片段。將該標準片段進行一系列的稀釋，從10ng/(_il至l(r3pg/pl并進行實時RT-PCR繪制標準曲線。使用Superscript第一鏈合成體系(Invitrogen)，用lfig的每一組合并的腫瘤樣品總RNA進行cDNA第一鏈的合成。在含有1^1cDNA第一鏈、特異性引物組和LightcyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreen的20|il反應體系中根據使用說明使用RocheLightcycler進行實時PT-PCR(Roche,Nutley,NJ)。使用Lightcycler軟件v3.5對RT-PCR產物進行解鏈曲線分析。用瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增量。每一種樣品分一式兩份進行分析。結果見圖4。在下調基因中，TUBB表現出多西他賽抗性(Tanaka等.，2004,Int.J.Cancer111,617-26)并且BIRC5(存活素)表達量的增加顯示出與侵襲性前列腺癌和雄性激素療法抗性的相關性(deAngelis等，2004Int.J.Oncol.24，1279-88;Zhang等.，2005,Oncogene24,2474-82)。此外，TUBB是一種IGF-IR調節基因并參與IGF-IR介導的轉化(Loughranetal.，2005，Oncogene24,6185-93)。在四種上調基因中，IGFBP3表現出對IGF-配體信號轉導的抑制作用和對前列腺癌細胞凋亡的誘導作用。(Grimberg等，2000,J.Cell.Physiol.183,1-9)。治療后血清A12的水平。測定接受多西他賽和A12聯合治療的動物血清A12水平。在治療結束2周后血清A12水平下降了100倍，而且在治療結束四周后檢測到的水平更低(圖5)。總細胞毒性。測定多西他賽和IMC-A12聯合使用的細胞毒性。雖然A12與鼠IGF-IR的交叉反應性大于95%,接受聯合藥物治療或接受多西他賽單獨治療的動物與對照荷瘤動物相比并未觀察到不正常的日間活動或行為。在任何治療組中對細胞周期和細胞凋亡的分析均未觀察到對腎臟細胞的顯著作用(數據未顯示)。并未觀察到治療組之間體重的明顯差異(圖6)。抗-IGF-IR抗體療法治療骨轉移。將前列腺癌細胞直接注入SCID小鼠的脛骨評價抗-IGF-IR抗體療法對前列腺癌細胞在骨中轉移生長的治療效果。通過這一方法可以直接生成轉移性腫瘤而不需依賴于來自循環的趨化依賴性侵襲。許多細胞系都可用于建立骨轉移。這些包括可以引起溶骨性病變的PC-3、LuCaP35和LnCaP細胞，還有可以引起成骨性病變的LuCaP23.1細胞。LuCaP23.1細胞可以表達IGF-IR，在骨環境中的成活率為~80%并引起成骨性反應。在預實驗中，腫瘤脛骨與對照脛骨相比，LuCaP23.1細胞樣品表現出骨體積與組織體積比值的顯著增加(對照的254-503%，p=0.024)。脛骨中所有的LuCaP23.1腫瘤均出現新生的骨小梁，但是正常樣品中并未出現，還有大量的腫瘤點取代了正常的骨髓。在一些樣品中腫瘤和骨的生長延伸至原始骨之外。去雄之后也觀察到LuCaP23.1樣品。/。BV/TV增加；有肺瘤生長的脛骨。/。BV/TV為無腫瘤脛骨的212-354%(p=0.024)。對脛骨內LuCaP23.1移植物的觀察結果表明存在肺瘤細胞激活的骨從頭形成。而且，這些腫瘤表現出許多與人成骨細胞轉移樣品的相似性，包括大量的胂瘤點和礦化骨數量的增加。為了評價IMC-A12療法的有效性，將LuCaP23.1肺瘤移植入SCID小鼠并每兩周檢測血清PSA水平以評價腫瘤生長。在移植脛骨腫瘤細胞之前兩個星期將所有動物去雄，當血清PSA水平達到5-10ng/ml(表明已形成了腫瘤)時給予實驗小鼠IMC-A12。每周三次皮下注射40mg/kgIMC-A12，持續6周。使用雙X-射線吸光光度法(PIXImusLunar光密度計)在移植腫瘤時的腫瘤細胞注射位點2.5mmx2.5mm的范圍內或對側脛骨的對應位置測定腫瘤脛骨和無肺瘤的對側脛骨的骨礦物質密度。通過測定血清PSA水平每兩周評價一次損害。當對照組在去雄之后依據血清PSA水平(LuCaP35>60ng/ml,LuCaP23.1>500ng/ml)判斷再次發生了骨損害、X線攝影顯示出骨損害或動物情況惡化(comprimise)時將所有動物處死。在處死動物前一個小時注射BrdU以監控腫瘤細胞增殖。處死之前進行X光照相(FaxitronX-rayMX-20)并在處死時測定兩邊脛骨的BMD。表5-骨礦物質密度(BMD)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>接受IMC-A12治療的小鼠血清PSA水平顯著較低(圖7)并且與成骨性轉移腫瘤相關的BMD增高也出現了顯著降低(表5)。無腫瘤脛骨的BMD測量結果顯示IMC-A12療法并未引起骨密度的降低(骨質疏松)。接受IMC-A12治療小鼠和未接受治療小鼠的X光照片表明接受治療小鼠的腫瘤進程被明顯減少或抑制(圖8)。抗-IGF-IR抗體和多西他賽聯合治療骨轉移。在脛骨腫瘤注射兩周之前將SCID小鼠去雄。將LuCaP23.1前列腺癌細胞直接注射入小鼠脛骨以生成骨轉移，從而增加成骨性損害。該轉移物表達IGF-IR。當血清PSA水平達到5-10ng/ml時表明腫瘤形成，然后將動物隨機分成4組。兩組動物每周腹腔注射三次40mg/kgIMC-A12，持續六周，其中一組每周腹腔注射一次IMC-A12+20mg/kg多西他賽并持續六周，另一組每周腹腔注射三次IMC-A12+10mg/kg多西他賽并持續六周。對照組腹腔注射10或20mg多西他賽并且不使用IMC-A12。每周監測動物的PSA測定值。在治療結束后，繼續每周監測動物的PSA測定值直至單獨使用多西他賽治療的動物組出現腫瘤再生。單獨使用多西他賽治療的動物組PSA水平上升(雖然比未治療動物組的速度更慢)，接受IMC-A12+多西他賽治療的小鼠中PSA水平停止上升，甚至在某些動物中開始下降。觀察結果顯示PSA水平持續降低甚至持續至六周治療結束后。如上所示，在移植腫瘤和處死動物時測定BMD,并在處死之前進行X線拍照。接受IMC-A12+多西他賽治療的動物組BMD增加很小或沒有增加，X線照片顯示的成骨細胞活性很小或無。抗-IGF-IR抗體和多西他賽聯合治療骨轉移。機械消化LuCaP23.1人前列腺腫瘤小塊(20-30mm3)。將2-5x105有活力的LuCaP23.1細胞注射入6-8周大的SCID小鼠脛骨內。將21只小鼠隨機分成三組進行研究。注射肺瘤細胞之后每個星期監測一次血清PSA水平。當血清PSA水平達到5-10ng/ml時表明腫瘤開始生長。第一組使用對照生理鹽水緩沖液。第二組每周腹腔注射一次20mg/kg多西他賽并持續四周。第三組每周腹腔注射三次40mg/kg多西他賽并持續四周。在所有治療結束時用Dexa-掃描和X-射線測定BMD以確定治療引起的效應是成骨性還是溶骨性。血清PSA水平受抑制可反應出(圖.9a)單獨使用多西他賽或聯合使用多西他賽和A12都可以抑制LuCaP23.1腫瘤的生長并且兩種治療之間不存在顯著性差異。但是在治療結束之后，單獨使用多西他賽治療的動物血清PSA水平開始上升，表明腫瘤再次生長；然而在使用聯合療法的動物中觀察到對血清PSA水平的持續抑制，表明治療后腫瘤靜止期的延長。血清PSA水平表現出與骨密度(BMD)和X照片所顯示的骨肺瘤體積的相關性(圖9b)。在第五周，對照組、多西他賽20和多西他賽20+A12治療組動物的平均骨密度分別為0.112士0.01、0.09±0.02和0.05±0.009(均值±SEM)。在治療中骨密度表現出明顯的降低趨勢。實施例2骨髓穿刺液誘導Akt磷酸化。正常男性捐贈人的骨髓樣品由Cambrex(PoieticsDonorProgram)提供。^尋才羊品于1,500rpm離心，分離可溶相與細胞相。將上清依次用0.8)im和0.22pm的濾膜過濾。將50(^1的骨髓穿刺液給予lml培養基中的細胞(1:20終稀釋度)。對于血清存在下進行的實驗，在暴露于骨髓之前將細胞在含有10%FBS和50pg/ml慶大霉素的DMEM中培養24小時。對于無血清存在下進行的實驗(饑餓細胞)用PBS將細胞沖洗兩遍，將生長培養基替換為無血清的DEME并在加入骨髓穿刺液之前將細胞溫育4小時。使用時，在加入骨髓穿刺液之前向培養基中加入一種PDGF受體的特異性抑制劑AG-1296(Rice等"1999，Amer.J.Path.155，213-21)。在預實驗時按照下述方法加入IMC-3G3抗體。在表達FDGFRa的PC3-ML細胞中檢測到骨髓穿刺液對Akt的激活作用，但是在缺乏該受體的DU-145細胞中未檢測到。在一例實驗中為了將血清組分對Akt的激活作用最小化，將細胞在不含血清的培養基中預培養4小時。加入骨髓穿刺液引起PC3-ML細胞中強烈的Akt磷酸化，但是在DU-145細胞中沒有引起這樣的效應(圖.IOA)。為了評價該效應的顯著性，在血清存在下進行第二次實驗。在血清存在的條件下也觀察到了PC3-ML細胞中強烈的Akt磷酸化(圖.IOB)。而DU-145細胞中引發的效應很小。PDGFRa介導的Akt磷酸化。成骨細胞和破骨細胞都分泌PDGF-AA和PDGF-BB，它們在骨髓的可溶性環境中提供這些生長因子。為了確定PC3-ML細胞對骨髓穿刺液的反應性是否與經PDGFRa的信號轉導有關，在存在或不存在20pMAG-1296的條件下在PC3-ML細胞中加入骨髓穿刺液。這一濃度的AG-1296可以完全抑制PDFG-BB誘導的Akt激活(圖IIA)。AG-l296對骨髓穿刺液誘導的Akt激活的抑制大于40%(圖11B和D)。這表明PDGFRa信號轉導與骨髓誘導的Akt激活有顯著關系。評價PDGF-AA和BB對與骨髓穿刺液其他成份相關的PDGFRa信號轉導的直接作用。經測定，三位不同捐贈者骨髓穿刺液中PDGF-AA和BB的濃度在400pg/ml至2ng/ml的范圍內。如果將骨髓穿刺液稀釋20倍，那么被檢測細胞事實上暴露于濃度范圍在20至100pg/ml的PDGF-AA和BB中。因此，用100pg/ml的PDGF-AA和-BB處理PC3-ML細胞。Akt磷酸化程度小于骨髓穿刺液誘導的磷酸化程度的10%。(圖3C和D)因此，PDGFRa信號轉導對Akt途徑的激活可能涉及到PDGFRa配體而不是PDGF-AA和-BB和/或其他機制而不是通過配體直接結合激活PDGFRa。—種抗-PDGFRa抗體對Akt磷酸化的抑制。具有中和作用的抗體IMC-3G3對人PDGFRa具有特異性，檢測該抗體對PC3-ML細胞中Akt磷酸化的抑制。30分鐘預溫育和20pg/ml的濃度可以中和30ng/mlPDGF-BB的刺激作用(圖.12A)。使用該抗體進行治療也可以將骨髓誘導的Akt磷酸化抑制約40%(圖.12B和C)。同時也發現IMC-3G3對Akt磷酸化的抑制作用依賴于預溫育的時間，溫育120分鐘(圖12D)比30分鐘(圖.12B和C)效果更加顯著。這一現象可能的一種解釋就是IMC-3G3誘導PDGFRa內化，其抑制作用不僅與阻斷配體結合相關而且與消除細胞膜受體相關。實施例3分離純化人抗PDGFRa抗體。通過標準雜交瘤技術(Harlow&Lane,ed"Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,211-213(1998),在這里被完整引用)使用表達人免疫球蛋白y重鏈和k輕鏈的轉基因小鼠(MedarexInc.,Sunnyvale,CA)生產人抗PDGFRa抗體。人PDGFRa胞外域(ECD)購自R&DSystems(Minneapolis,MN)。用數量為3xl04急定表達PDGFRa(PAERa)的豬主動脈內皮細胞皮下免疫(s.c)KM小鼠。四周后使用完全弗氏佐劑皮下注射50嗎PDGFRaECD和腹腔注射3xl07PAERa以強化免疫。使用完全弗氏佐劑注射25嗎PDGFRaECD繼續免疫強化兩次，間隔三周。分離具有高血清結合和阻斷滴度的小鼠脾細胞并與骨髓瘤細胞融合。亞克隆培養具有阻斷活性的雜交瘤培養物并使用G蛋白色譜儀純化這些雜交瘤的抗體。在直接結合分析中評價IgGs與PDGFRa的結合力。將PBS溶液中的PDGFRaECD固定于96孔板中(100ng/孔)。用PBST(PBS+0.05。/。吐溫)洗板并用PBSM(含有3%牛奶的PBS,200pL/孔)于25QC下封閉2小時。將用PBSM稀釋的IgGs與固定化PDGFRaECD于25。C下溫育1小時并用PBST洗板。將二抗(羊F(ab')2抗人IgG-辣才艮過氧化物酶結合物(BioSourceInternational,Camarillo,CA)用PBSM以1:5000稀釋，在25。C下加入1小時。用PBST洗板后加入TMB過氧化物酶底物(KPL,Ga池ersburg,MD),用100jaL1mol/LH2S04終止反應。用酶標儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)在A450處讀板。用固相PDGF阻斷分析法評價PDGF阻斷(見Duan等，1991,J,Biol.Chem.266:413-8,在這里被完整引用)。用PBS稀釋PDGFRaECD并涂布在96孔微量滴定板中(Immulon2HB平底1x12Removawell放射蛋白結合聚苯乙烯條；DynexTechnologies,Chantilly,VA)。25。C下，每一個孔包被60ngPDGFRa，持續3小時，總體積為100^L。洗板兩次并用25mmol/LHEPES(pH7.45)、0.5%明膠、100mmol/LNaCl和0.1%吐溫20于4^封閉過夜。將滴定板升溫至25QC并維持20分鐘，然后用結合緩沖液(25mmol/LHEPES(pH7.45)、0.3%明膠、100mmol/LNaCl、0.01%吐溫20)洗板一次。在每一個孔中加入5(VL的IgGs并于25Gc溫育30分鐘。用結合緩沖液稀釋碘化PDGF并在每一孔中加入50nL1nmol/L的溶液。將滴定板于25GC溫育2小時，然后用結合緩沖液洗5次。用y計數器對每一孔進行計數。根據Heldin等，1988,EMBOJ.7,1387-93中描述的方法進行基于細胞的阻斷分析。用BIAcore3000instrument(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)測定抗體與PDGFRa結合的動力學。將PDGFRaECD固定于傳感芯片上并注射不同濃度的抗體。得到每一濃度下的感應圖譜并使用程序BIAEvaluation2.0進行評價以測定速率常數。根據速率常數K。fi/K。n的比值計算親和常數Kd。圖13表示ELISA實驗中人單克隆抗體IMC-3G3與固定化PDGFRaECD的劑量依賴型結合。達到最大PDGFRaECD結合50%的抗體濃度為0.06nmol/L(表6)。BIAcoreinstrument表面等離子體共振才企測表明ED5。與抗體的Kd—致。所述單克隆抗體也可以阻斷[1251]PDGF-BB與固定化受體的結合，IC5o為0.43nmol/L。PDGFRa上與PDGF-AA和PDGF-BB的結合位點在結構上不是共存的。所得數據顯示3G3的表位在空間上與兩種生長因子的結合位點重疊。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>受體磷酸化的抑制和下游效應器分子的激活。用PAERa細胞測定IMC-3G3對PDGF誘導的胞內信號轉導的作用。將細胞接種至6孔Falcon組織培養板(每孔含有細胞250000個)并過夜培養。然后用無血清培養基潤洗并溫育。過夜培養之后使細胞處于休眠狀態，用抗體于37°C處理細胞30分鐘然后加入PDGF-AA或PDGF-BB并在37°C下繼續溫育10分鐘。將細胞脫離并溶解于200|iL的裂解緩沖液中(50mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1%TritonX-100、150mmol/LNaCl、1mmol/LEDTA、0.1%SDS、1mmol/L原釩酸鈉和蛋白酶抑制劑(CompleteMini,Roche,Mannheim,Germany))。用SDS-PAGE和蛋白質印跡法(使用增強化學發光試劑和Hyperfilm(AmershamBiosciences))分析細胞裂解物。檢測抗體對配體誘導的受體酪氨酸磷酸化的抑制能力。濃度分別為1和3nmol/L的PDGF-AA和PDGF-BB可以將PDGFRot酪氨酸磷酸化增強5倍。更高濃度的配體(10nmol/L)會導致更少的受體磷酸化，這可能是由于配體誘導的降解作用。被抗體抑制的PDGF-BB-誘導的受體與背景水平接近(圖14A，頂行)。用PDGF-AA誘導受體磷酸化得到相似的數據。PDGFs轉導絲裂信號并通過下游效應器蛋白發揮對表達相應受體細胞的抗凋亡作用。因此，測定單克隆抗體對MAPKsp44/p42和Akt(分別參與細胞生長和抗凋亡途徑)的抑制。抗-PDGFRa抗體響應PDGF-BB(圖.2A)和PDGF-AA(未顯示)，抑制MAPKs和Akt兩者的磷酸化。對PDGFRa磷酸化的抑制不是劑量依賴型，0.25nmol/L可以達到50%的抑制率(圖.14B)。抗促細胞分裂活性。測定抗-PDGFRa抗體阻斷PDGFAA誘導的PAERa細胞有絲分裂的能力。將細胞接種至96孔組織培養板(每孔含有1x104個細胞)并在每孔加入100pL的培養基過夜培養。用無血清培養基潤洗培養孔并在每個孔中加入75pL無血清培養基使細胞血清饑餓過夜。加入IgG(25pL/孔)并將培養板置于37。C下溫育30分鐘。加入PDGF-AA或PDGF-BB(25^L/孔)并將培養板置于37。C下溫育18-20小時。向每個孔中加入0.25^Ci卩H]胸腺嘧咬核苷(25^L/孔)后將培養板繼續溫育4小時。用無血清培養基稀釋抗體、PDGF和卩H]胸腺嘧啶核苷。用含有1%牛血清白蛋白的PBS沖洗細胞然后用胰蛋白酶(IOO/xL/孔)處理使細胞脫離。用MACHIII細胞收集器將細胞收集至濾器中并用雙蒸水洗滌三次(Tomtec，Inc.,Hamden,CT)。對濾器進行處理后在閃爍計數器(WallacMicrobeta,model1450)上測定DNA的摻入放射活性。向血清々幾餓的PAERa細胞中加入IMC-3G3可以特異性抑制PDGF-AA誘導的胸腺嗜^核苷摻入(圖15)，EC50為8.3nmol/L。該抗體還可以抑制3nmol/LPDGF-BB-誘導的PAERa細胞有絲分裂，EC50為1.25nmol/L(數據未顯示)。表達PDGFRa的人腫瘤細胞系的生長抑制。4全測表達PDGFRa的人腫瘤細胞系以測定人抗-PDGFRa抗體對體內和體外系統惡性增長的作用。經流式細胞儀測定，兩種表達PDGFRa的腫瘤細胞系分別是SKLMS-I(平滑肌肉瘤)和U118(成膠質細胞瘤)。這些細胞系也可以響應有絲分裂檢測中的配體并可以在小鼠中形成腫瘤。SKLMS-I既可以旁分泌激活也可以自分泌激活。定量三明治酶免疫測定法(R&DSystems)顯示SKLMS-I在培養基中生長時會表達PDGF-AA。從圖16A中可以看出PDGF-AA刺激SKLMS-I細胞后，引起IMC-3G3抑制Akt和MAPKs的磷酸化。對Akt磷酸化的抑制為100%,對MAPKs的抑制為80%。該抗體也可以有效抑制U118細胞中的磷酸化。配體誘導的腫瘤細胞的有絲分裂也被阻斷。向血清饑餓的U118細胞中加入抗-PDGFRa抗體時PDGF-AA誘導的胸腺嘧咬核苷摻入被特異性抑制(圖17A),EC5o為3.4nmol/L。該抗體還可以抑制PDGF-AA-誘導的SKLMS-I細胞的促有絲分裂反應(圖17B),EC50為5nmol/L,以及PDGF-BB刺激的促有絲分裂反應(圖17C)。在U118細胞中只觀察到對PDGF-BB誘導的促有絲分裂反應的部分抑制作用(66nmol/L為40%;圖17D)。這是由于這些細胞表達PDGFRa和PDGFRP兩者(數據未顯示)。對肺瘤移植物生長的抑制。在無胸腺棵鼠成膠質細胞瘤(U118)和平滑肌肉瘤(SKLMS-I)皮下移植模型中對IMC-3G3進行體內檢測。通過向雌性無胸腺棵鼠(Crl:NU/NU-nuBR,CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)注射與基質股(CollaborativeResearchBiochemicals,Bedford,MA)混合的10x106SKLMS-1或U118細胞進行皮下肺瘤移植。允許腫瘤的平均體積(兀/6x最長長度x垂直寬度2)達到約400mm3。將小鼠隨機分成5組(n=12)并每周進行兩次腹腔注射。第一組動物為溶劑對照組(0.9%NaCl,USPforIrrigation,B/Braun)。第2至4組動物接受6、20和60mg/kg恒定抗-PDGFRa抗體的治療。第5組小鼠接受60mg/kg人IgG(Sigma)的治療。接受6、20或60mg/kg抗-PDGFRa抗體或人IgG治療的小鼠組的負荷劑量分別為21.4、71.4和214mg/kg。計算負荷劑量，使按照每周兩次的給藥方案從第一次給藥(消除半衰期為7天)開始就可以達到穩態血藥濃度。每兩周測定一次腫瘤體積并通過重復測量ANOVA將治療組的胂瘤生長進4于比4交。如圖18.A所示，與鹽溶液處理(P-0.74)的小鼠相比，人IgG對成膠質細胞瘤的生長沒有作用，然而劑量為6(P=0.06)、20(P=0.03)和60(P=0.0004)mg/kg的抗-PDGFRa抗體顯著抑制了腫瘤的生長。在U118研究結束時，6、20和60mg/kg3G3處理組的％T/C值[(研究結束時3G3處理組的平均腫瘤體積/治療開始時的平均腫瘤體積)/(研究結束時對照處理組的平均腫瘤體積/治療開始時的平均腫瘤體積)x100]分別為67%、63%和35°/。。而且在6、20和60mg/kg3G3處理組中分別在12只小鼠中的4只、11只中的5只和12只中的11只中觀察到肺瘤退化。在所有對照組中都沒有出現退化。圖18B表明6(P=0.02)、20(P=0.003)和60(P<0.0001)mg/kg的治療顯著抑制了平滑肌肉瘤的生長。6、20和60mg/kg治療組的最終。/。T/C值分別為66%、57%和31°/。并且沒有腫瘤退化。治療結束時對移植物的組織學檢查表明接受對照治療的動物組腫瘤與接受治療的動物腫瘤存在顯著差異。將切除的腫瘤于4GC在QDL固定劑中固定24小時。用石蠟包埋后切成4nm的薄片，用Mayer'sH&E(RichardAllen,Kalamazoo,MI)染色福爾馬林固定的樣與鹽溶液-對照組相比，用最高劑量(60mg/kg)治療的U118組中有活力的腫瘤細胞更少并且存在更多的細胞疏松區域(圖.18C)。與鹽溶液-對照組相比，被治療的SKLMS-I移植物在第25天也出現有活力腫瘤細胞數量和細胞填充的減少。對PDGFRa介導的成膠質細胞瘤系激活的體外抑制。在使用抗PDGFRa抗體或人IgG抗體進行治療前一周評價Ul18細胞中受體的磷酸化水平。U118肺瘤(500mmS)小鼠接受治療的負荷劑量為214mg/kg抗體，72小時之后再給予60mg/kg維持劑量的抗體。第一次注射抗體一周(168小時)后(在未觀察到肺瘤退化之前；見圖18A)從小鼠體內收獲腫瘤并在磷酸化檢測裂解緩沖液(見上述內容)中進行均質處理。將裂解物14000rpm離心兩次并測定所收集上清中的蛋白質濃度(Bio-Radproteinassay,Bio-Rad,Hercules，CA)。將每一4分樣品的裂解物(4mg)用抗-PDGFRa抗體進行免疫沉淀。然后使免疫沉淀后的人PDGFRa與抗PDGFRa抗體或抗磷酸酪氨酸抗體形成免疫印跡。圖19表示在這些腫瘤中，與人IgG對照組相比給予抗-PDGFRa抗體引起PDGFRa磷酸酪氨酸水平的降低。細胞系工程。首先，克隆編碼人抗-PDGFRa抗體重鏈和輕鏈可變區的基因并測序。從MEDAREX獲得可以與來源于MEDAREX的雜交瘤中的人免疫球蛋白可變區序列的5，和3'側翼序列退火結合的引物系列。引物對AB88(正向)和AB90(反向)用于擴增重鏈可變區于擴增輕鏈產物。將這些反應的0.4kb產物克隆在載體ZeroBlunt(Invitrogen)中以生產AB88-1(VH)和AB182-3(Vk),所插入序列可使用通用引物T7和M13R進行測序。表7-MEDAREX雜交瘤的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>為了得到表達完整IgGl抗體的質粒載體，通過PCR擴增已克次PCR擴增重鏈時^f吏用25ng的質粒AB88-1作為引物IPHF5(正向)和IPHR5(反向)的模版。二次PCR擴增重鏈時使用5|il的初次反應液作為模版和引物OPSIF和IPHR5。兩個正向引物聯合使用可以在編碼含有19個氨基酸的鼠重鏈基因信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS;SEQIDNO:24)的免疫球蛋白基因的5'端增加57個堿基對，使免疫球蛋白可以被有效處理和分泌。此外，正向引物OPSIF可以增加一個共有"Kozak"序列(JMoI.Biol.196:947)，使得這些基因在哺乳動物細胞中可以被有效翻i奪，還可以增加一個5'HindIII限制性內切酶位點克隆被擴增產物至適當的載體中。重鏈反向引物包括結構內Nhel位點，用于克隆入恒定區載體。根據使用說明使用ExpandPCRkit(BoehringerMannheimInc.)中的ExpandBuffersystem#3在50^1的反應體系中根據下列循環條件進行PCR:一次循環94。2分鐘五次循環94°20秒48。60秒68°2分鐘20次循環94°20秒65°60秒68。2分鐘1次循環68°5分鐘經過兩輪PCR之后純化產物并進行瓊脂糖凝膠電泳，將Hindlll-Nhel消化后的片段克隆至載體pDFc(圖.8),該載體含有人恒定區。第一次PCR擴增輕鏈使用25ng的pAB182-3質粒作為模版引物IPLF4(正向)和IPLR2(反向)。第二次PCR擴增輕鏈使用5|_il的初級反應液作為模版和弓1物OPSIF和IPLR2。對于重鏈而言，兩個正向引物提供分泌信號序列。輕鏈反向引物包括一個結構內BsiWI位點用于克隆進入K恒定區載體pLck(圖.8)。根據上述重鏈擴增方法進行PCR反應。經過兩輪PCR之后，純化產物并進行瓊脂糖凝膠電泳，將產物克隆至pLck,該載體含有人K輕鏈恒定區。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>為了得到可以穩定轉染的單個質粒載體，將含有CVM啟動子、重鏈編碼區和polyA元件的重鏈表達盒作為Notl-Sall消化片段(圖20)克隆至輕鏈載體。這一構建體可用于在骨髓瘤細胞系NSO細胞中產生可以穩定生產的細胞系。用BioRadGenePulserII進行電穿孔并用表達質粒轉染NSO細胞。在轉染之前，用PvuI將質粒DNA線性化，乙醇沉淀并重懸成濃度為0.4mg/ml的溶液(lOOuldH20中含有40ug)。使用250伏400)aFd單脈沖將細胞與40ugDNA在800ul的終體積內電穿孔。將電穿孔后的細胞分散在含有10%經過透析的小牛血清(dFCS)(Hyclone,Lot#:AHA7675)和2mM谷氨酰胺(Invitrogen/LifeTechnologies)的DEME培養基(JRHBiosciencesInc.)中的50ul等分試樣中，移入大約18個96空板的孔中，每孔密度為5,000-10,000個細胞。24小時之后通過加入不含谷氨酰胺但是含有10%小牛血清(dFCS)和補充有IxGSsupplement(JRHBiosciencesInc.)的DEME開始篩選谷氨酰胺合成酶(GS)陽性轉化子。將細胞在37°C下培養2-4周，5%的C02可以使菌落生長并擴張。用抗-人Fc(力ELISA(辣根過氧化物酶于A450nm處^r測)篩選了300多個克隆。擴增表達抗體的克隆(58。/。)并檢測經過3-5天培養后的生產力。通過在每次傳代時加入相等體積的無血清GS-OS培養基擴增陽性細胞系使細胞適應無血清培養基。擴增經過三天亞融合(sub-confluent)24孔培養后可以生產25ug/ml或更多的強陽性細胞用于進一步的分析使其完全適應無血清培養基。應當理解和預見的是本專業領域技術人員可以生產本發明中公開的任何原理的變體，而這些修改都屬于本發明的范疇。序列表<110>ImCloneSystemsIncorporated,etal.<120>用PDGFRa抗體治療骨腫瘤的方法<130>11245/54076<140>ToBeAssigned<141〉2006-06-19<150>60/691,920<151〉2005-06-17<160>63<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉15<212>DNA<213〉人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(15)<400>1agtagtagttactac15SerSerSerTyrTyr15<210>2<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2SerSerSerTyrTyr15<210>3<211>48<212>廳<213>人(Homosapiens)<220〉<221>CDS<222〉(1)..(48)<400>3agtttcttttatactgggageacctactacaacccgtecetcaggagt48SerPhePheTyrThrGlySerThrTyrTyrAsnProSerLeuArgSer151015<210>4<211>16<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<400〉4SerPhePheTyrThrGlySerThrTyrTyrAsnProSerLeuArgSer151015<210>5<211>51<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221><222>CDS(51)<400>5cagtecacgtattactatggttcggggaattattatggctggttcgacGinSerThrTyrTyrTyrGlySerGlyAsnTyrTyrGlyTrpPheAsp48151015cgcArg51<210>6<211>17<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400>6GinSerThrTyrTyrTyrGlySerGlyAsnTyrTyrGlyTrpPheAsp151015<210>7<211>381<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221><222>CDS(l)..(381)<400>7cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtga鄰ccttcggagGinLeuGinLeuGinGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu15101548accctgtecetcacctgcactgtctctggtggctecateaacagtagt96ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerlieAsnSerSer202530a.gttactactggggctggetccgccagtecccagggaaggggctggag144SerTyrTyrTrpGlyTrpLeuArgGinSerProGlyLysGlyLeuGlu354045tggattgggagtttcttttatactgggageacctactacaacccgtec192Ti:plieGlySerPhePheTyrThrGlySerThrTyrTyrAsnProSer505560etcaggagtcgaetcaccatatecgtagacacgtecaagaaccagttc240LeuArgSerArgLeuThrlieSerValAspThrSerLysAsnGinPhe65707580tecctgatgctgagttctgtgaccgccgcagacacggetgtatattac288SerLeuMetLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyr859095tgtgcgagacagtecacgtattactatggttcggggaattatta.tggc336CysAlaArgGinSerThrTyrTyrTyrGlySerGlyAsnTyrTyrGly100105110tggttcgaccgctgggaccagggaaccctggtcaccgtctectea381TrpPheAspArgTrpAspGinGlyThrLeuValThrVa]SerSer115120125<210><211><212><213>8127PRT人(Homo<400〉8sapiens)GinLeuGinLeuGinGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerlieAsnSerSer202530SerTyrTyrTrpGlyTrpLeuArgGinSerProGlyLysGlyLeuGlu354045TrplieGlySerPhePheTyrThrGlySerThrTyrTyrAsnProSer505560LeuArgSerArgLeuThrlieSerValAspThrSerLysAsnGinPhe65707580SerLeuMetLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyr859095CysAlaArgGinSerThrTyrTyrTyrGlySerGlyAsnTyrTyrGly100105110TrpPheAspArgTrpAspGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>9<211>33<212>腿<213>人(Homosapiens)<220〉<221><222〉CDS(l)..(33)<400>9a.gggcca.gtcagagtgttageagetacttagccArgAlaSerGinSerValSerSerTyrLeuAla151033<210〉10<211>11<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400〉10ArgAlaSerGinSerV'alSerSerTyrLeuAla1510<210>11<211〉21<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221〉<222>CDS(l)..(21)<400〉11gatgcatecaacagggccactAspAlaSerAsnArgAlaThr2115<210><211><212><213>12PRT人(Homosapiens)<400〉12AspAlaSerAsnArgAlaThr15<210>13<211>27<212〉DNA<213〉人(Homosapiens)<220〉<221><222〉CDS(1)..(27)<■>13cagcagcgtGinGinArg1ageaactggcctccggcgSerAsnTrpProProAla527<210>14<211>9<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<400>14GinGinArgSerAsnTrpProProAla15<210>15<211>321<212〉腿<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400〉15gaaa"gtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggg48GlulieValLeuThrGinSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015gaaagagccaccetctectgca,gggccagtcagagtgUageagetac96GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGinSerValSerSerTyr202530ttagcctggtaccaacagaaacctggccaggetcccaggetcetcate144LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeulie354045tatgatgcatec幼cagggccactggcateccagccaggttcagtggc192TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlylieProAlaArgPheSerGly505560agtgggtctgggacagacttcactetcaccateageageetagagcct240SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerL,euGluPro65707580gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtageaactggcctccg288GluAspPheAlaValTyrTyrCysG]nGinArgSerAsnTrpProPro859095gcgttcggccaagggaccaaggtggaaateaaa321AlaPheGlyGLnGlyThrLysValGlulieLys100105<210〉16<211>107<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>16GlulieValLeuThrGinSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGinSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeulie354045丁yrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlylieProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinArgSerAsnTrpProPro859095AlaPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysLOO105<210〉17<211>15<212〉PRT<213>未鑒別<400>17GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer151015<210〉18<211〉5<212>PRT<213〉未鑒別<400>18GlyGlyGlyGlySer15<210〉19<211>10<212〉PRT<213>未鑒別<400〉19GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510<210>20<211>21<212〉瞧<213〉人工<220><223>合成引物<400〉20atgaaacacctgtggttcttc<210>21〈211〉21<212>DNA<213〉人丁<220〉<223>合成引物<400>21tgcca,gggggaa.gaccgatgg<210>22<211>24<212>隱<213〉人.丁<220><223〉合成引物<400>22atggaarccccagcgcagcttctc<210>23<211>20<212〉DNA<213>人工<220〉<223>合成引物<400〉23cggga柳tgaagacagatg<210〉24<211>19<212>PRT<213〉小鼠(Musmusculus)<400>24MetGlyTrpSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly151015ValHisSer<210>25<211>53<212>DNA<213>人工<220><223>合成引物<400〉25gagaagcttgccgccaccatgggatggtcatgtatcatcctttUcta.gtage53<210>26<211>58<212>DNA<213>人丁<220><223>合成引物<400>26tcctttttctagtagcaactgcaactggagtacattcacagetgeagctgcaggagtc58<210>27<211〉37<212〉DNA<213〉人丁<220〉<223>合成〈400〉27cgcgctagctgaggagaeggtgaccagggttccctgg37<210>28<211>58<212〉DNA<213〉人工<220><223>合成引物<400〉28"tcctttttctagtagcaactgcaactggagtacattcagaaattgtgttgacacagtc58<210〉29<211>37<212〉DNA<213>人工<220><223〉合成引物<400>29gcgcgtacgtttgatttccaccttggtcccttggccg37<210>30<211>1431<212〉DNA<213〉人(Homosapiens)<220〉<221><222>CDS(1).(1431)<400>30atgggatggMetGly1TrpteatgtateatectttttetagtagcaactgcaactggaSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly5101548gtacatteacagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagValHisSerGinLeuGinLeuG]nGluSerGlyProGlyLeuValLys20253096ccttcggagaccctgt.ccetcacctgcactgtctxtggtggctecateProSerGluThrLeuSerLeuThrCysThrVa]SerGlyGlySerlie354045144aacagtagtagttactactggggctggetccgccagtecccagggaag192AsnSerSerSerTyrTyrTrpGly丁rpl>euArgGinSerProGlyLys505560gggctggagtggattgggagtttcttttatactgggageacctactac240GlyLeuGluTrplieGlySerPhePheTyrThrGlySerThrTyrTyr65707580aacccgtecetcaggagtcgaetcaccatatecgtagacacgtecaag288AsnProSerLeuArgSerArgleuThrlieSerVs]AspThrSerLys859095aaccagttctecctgatgctgagttxtgtgaccgccgcagacacgget336AsnGinPheSerLeuMetLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAla100105110gtatattactgtgcgagacagtecacgtattactatggttcggggaat384ValTyrTyrCysAlaArgGinSerThrTyrTyrTyrGlySerGlyAsn115120125tattatggctggttcgaccgctgggaccagggaaccctggtcaccgtc432TyrTyrGlyTrpPheAspArgTrpAspGinGlyThrLeuValThrVal130135140tecteagetageaccaagggcccatcggtct"tccccctggcaccctec480SerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSer0tecaagageacctxtgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaag528SerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys165170175gactacUccccgaaccggtgacggtgtegtggaacteaggcgccctg576AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeu180185190accageggcgtgcacaccttcccggetgtcetacagtecteaggaetc624ThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuL95200205tactecetcageagegtggtgaccgtgccctecageagettgggcacc672TyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThr210215220cagacctacatetgcaacgtg朋tcacaagcccageaacaccaaggtg720GinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysVal225230235240gacaagagagttgagccca己atcttgtgacaaaactcacacatgccca768AspLysArgValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysPro245250255ccgtgcccagcacctgaaetcctggggggaccgteagtcttcetcttc816ProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhe260265270cccccaaaacccaaggacaccetcatgateteceggacccctgaggtc864ProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluVal275280285acatgcgtggtggtgga.cgtgagecacgaaga.ccctgaggtcaagttc912ThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluVa.lLysPhe290295300aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccg960AsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysPro305310315320egggaggagcagtacaacageacgtaccgtgtggtcagegtxetcacc1008ArgGIaiGluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThr325330335gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtc1056ValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysVa,l340345350tecaacaaagccetcccagcccccategagaaaaccatetecaa.agcc1104SerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAla355360365aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatecegg1152LysGlyGinProArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArg370375380gaggagatgaccaagaaccaggtcagectgacctgcctggtcaaaggc1200GluGluMetThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGly385390395400Uctatcccagegacategccgtggagtgggagageaatgggcagccg1248PheTyrProSerAsplieAlaVa]GluTrpGluSerAsnGlyGinPro405410415gagaacaactacaaga,ccacgcctcccgtgctggactecgacggctecGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySer4204254301296ttcttcetctatageaagetcaccgtggacaagageaggtggcagcagPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGin4354404451344gggaacgtcttcteatgctecgtgatgcatgaggetctgcacaaccacGly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oGluGinTrpLysSer195200205HisArgSerTyrSerCysGinValThrHisGluGlySerThrValGlu210215220LysThrValAlaProAlaGluCysSer225230權利要求1.一種治療骨腫瘤受試者的方法，所述方法包括給予有效量的PDGFRα拮抗劑。2.—種抑制骨腫瘤生長的方法，所述方法包括給予有效量的PDGFRa拮抗劑。3.權利要求1或2的方法，其中骨腫瘤為原發性腫瘤。4.權利要求1或2的方法，其中骨腫瘤為繼發性腫瘤。5.權利要求1或2的方法，其中腫瘤細胞生長為雄性激素依賴型。6.權利要求1或2的方法，其中腫瘤細胞生長為非雄性激素依賴型。7.權利要求1或2的方法，其中腫瘤轉移自前列腺癌。8.權利要求1或2的方法，其中腫瘤轉移自乳腺癌。9.權利要求1或2的方法，其中腫瘤轉移自肺癌。10.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑是抗體或抗體片段。11.權利要求10的方法，其中所述抗體或抗體片段與包括具有SEQIDNO:8的重《連可變區和具有SEQIDNO:16的輕鏈可變區的抗體竟爭性結合PDGFRa。12.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑是PDGFRa的胞內抑制劑。13.權利要求12的方法，其中胞內的PDGFRa抑制劑選自AG1296、STI-571和SU11248。14.權利要求10的方法，其中的抗體或抗體片段是人源性的。15.權利要求10的方法，其中的抗體或抗體片段是人源化的。16.權利要求10的方法，其中的抗體或抗體片段是嵌合的。17.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑可以抑制血小板來源的生長因子與PDGFRa的結合。18.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑可以中和PDGFRa的激活。19.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑可以降低PDGFRa表面受體的濃度。20.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑是可以與Kd值為約10"M^或更小的IGF-IR結合的抗體。21.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑可以抑制PDGFRa下游信號轉導分子的磷酸化。22.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑可以抑制骨髓誘導的Akt激活。23.權利要求1或2的方法，還包括聯合使用第二種受體酪氨酸激酶拮抗劑。24.權利要求1或2的方法，其中PDGFRa拮抗劑是雙特異性抗體。25.權利要求24的方法，其中所述雙特異性抗體對PDGFRa和EGFR具有特異性。26.權利要求1或2的方法，還包括給予有效量的抗腫瘤藥物。27.權利要求l的方法，其中所述抗腫瘤藥物為多西他賽。28.權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤藥物為阿霉素。29.權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤藥物為放射線。全文摘要本發明提供了通過給予IGF-IR拮抗劑和/或PDGFRα拮抗劑來治療骨癌的方法，特別是治療轉移性骨癌的方法。本發明還提供了與人PDGFRα結合并中和該受體的活化的抗體。本發明還提供了中和PDGFRα的活化的方法，以及用該抗體單獨治療或與其它藥物聯合治療哺乳動物的腫瘤疾病。文檔編號A61K39/395GK101612399SQ20091012643公開日2009年12月30日申請日期2006年6月19日優先權日2005年6月17日發明者A·法塔蒂斯,J·胡伯爾,N·盧瓦佐斯申請人:英克隆有限責任公司;華盛頓州大學;德雷克塞爾大學醫學院費城健康及教育公司