miR-425在腫瘤的診斷、治療及預后中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及miR-425在腫瘤診斷、治療及預后中的應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是嚴重危害人類生命健康的疾病，我國每年癌癥發病人數約307萬人，而每年因癌癥死亡的人數約220萬人。世界衛生組織2012年《世界癌癥報告》指出中國新診斷癌癥病例為307萬，占到全球總數的21.8% ;而年死亡人數220萬，占到全球癌癥年死亡人數的26.9%。更為嚴重的是這些數據正以驚人的速度逐年增長。惡性腫瘤已超過心血管疾病成為致死的首要原因。因此，探索癌癥發生的分子機制研宄及尋找其有效治療手段對人類健康具有重大意義。
[0003]根據世界衛生組織(WHO)公布的資料顯示，肺癌的發病率和死亡率在世界各國均呈明顯上升趨勢。在中國，肺癌是目前致死率最高的癌癥，而缺乏有效的早期檢測手段是導致肺癌預后差的重要因素。已有統計研宄表明中晚期肺癌患者的五年生存率僅是約13%，然而早期患者的五年生存率卻可達到46%。但是，大多數肺癌患者在疾病中晚期之前經常觀察不到明顯的臨床癥狀，以至于肺癌擴散前的早期檢出率僅有16%。肺癌的早期診斷和預后判斷對于提高肺癌患者的存活率非常重要，目前的診斷技術包括X-ray、CT以及唾液細胞學檢測等，但是這些檢測手段的靈敏度和特異性較差，經常造成假陽性。新的肺癌早期和肺癌進展相關的標記物的發現，可有助于對患者進行有效的診斷和治療。治療方案由癌癥的類型和階段決定，包括手術、放療和/或化療。然而，許多肺癌患者在診斷時已發生轉移，往往失去手術機會，而針對肺癌的化療方案效果亦欠佳，患者容易產生耐藥，五年生存率低于5%，因此，亟需尋找更有效的輔助診斷、治療和預后判斷的方法。
[0004]肝癌是世界第五大癌癥。我國是肝癌大國，患者高達3000萬。目前針對肝癌的治療主要采用早期手術切除，晚期化療，同時輔以放療和免疫制劑注射的傳統方案。但肝癌起病隱匿，預后差，肝癌患者在初次診斷時，便已進入肝癌晚期，失去了根治性治療的機會。開發新型有效的輔助診斷及治療的方法被迫切需要。截止目前，手術切除和肝移植等被認為是肝癌根治性治療的手段，肝切除技術已有顯著的進步，術后并發癥與死亡率也顯著降低，然而，以術后5年生存率為標志的患者生存率仍無根本性改善。傳統的治療方案雖然能緩解早期患者的病情，但對中晚期及轉移復發性患者療效較差。有研宄表明，肝癌患者預后與病人的不同分子分型密切相關。因此，尋找并開發新型有效的輔助診斷肝癌、治療肝癌和肝癌預后判斷的方法極為重要。
[0005]基因治療是新興起的治療方法。隨著基因工程研宄的深入，科學家對于運用基因工程研制腫瘤藥物表現出濃厚的興趣。基因治療有望克服傳統治療的弊端，成為癌癥治療的新途徑。
[0006]MicroRNA簡稱為miRNA，通常長度為19?25個核苷酸，廣泛存在于各種動植物甚至單細胞真核生物中，是一類在進化上高度保守的小分子單鏈RNA。miRNAs已經被證明在腫瘤進程中扮演著一個重要的角色，其主要通過結合到多種靶向mRNAs的3’ UTR從而抑制mRNAs的轉錄。
[0007]在人類基因組序列中，miR-425為一種microRNA，miR-425前體定位在三號染色體，其含有 87 個堿基，序列為 gaaagcgctt tggaatgaca cgatcactcc cgttgagtgggcacccgaga agccatcggg aatgtcgtgt ccgcccagtg ctctttc， 成熟體序列為aucgggaaugucguguccgccc。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種腫瘤檢測試劑盒。
[0009]本發明的另一目的在于提供一種腫瘤預后試劑盒。
[0010]本發明的再一目的在于提供一種腫瘤治療藥劑。
[0011]本發明所采取的技術方案是:
miR-425作為腫瘤檢測、治療、預后靶點的應用。
[0012]一種腫瘤檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測miR-425的試劑。
[0013]進一步的，上述試劑盒中含有實時熒光定量檢測miR-425的引物序列。
[0014]進一步的，上述試劑盒中含有實時熒光定量檢測miR-425的引物序列，包括miR-425 逆轉錄引物:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GTCAACGGG ；miR-425 PCR檢測引物序列:ACGATCACTCCCGTTGACT ;以及 PCR 通用引物序列:ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
[0015]進一步的，上述腫瘤為肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、頭頸部鱗癌、腎癌、前列腺癌和卵巢癌。
[0016]一種腫瘤的預后試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測miR-425的試劑。
[0017]進一步的，上述試劑盒中含有實時熒光定量檢測miR-425的引物序列。
[0018]進一步的，上述試劑盒中含有實時熒光定量檢測miR-425的引物序列；包括miR-425 逆轉錄引物:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GTCAACGGG ；miR-425 PCR檢測引物序列:ACGATCACTCCCGTTGACT ;以及 PCR 通用引物序列:ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
[0019]—種腫瘤治療藥劑，該藥劑中含有miR-425的措抗劑antagomir。
[0020]進一步的，上述腫瘤為肺癌、肝癌。
[0021]本發明的有益效果是:
發明者發現miR-425在多種腫瘤如肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、頭頸部鱗癌、腎癌、前列腺癌和卵巢癌中表達顯著上調。目前用于腫瘤臨床輔助診斷技術尚不完善，而miR-425在腫瘤中的表達較正常組織中的表達是明顯上調的，這提示miR-425具有成為腫瘤輔助診斷標記物的潛能。
[0022]本發明通過一系列體內、體外功能實驗發現:在肺癌細胞和肝癌細胞中miR-425的高表達與腫瘤細胞的增殖、轉移和抗凋亡密切相關。而通過抑制miR-425在癌細胞和組織中的表達水平，可以有效抑制肺癌細胞和肝癌細胞的增殖和轉移，增強化療藥物順鉑誘導細胞凋亡的敏感性。以上實驗數據均足以證明抑制內源性miR-425可顯著降低細胞增殖、轉移及藥物抵抗能力，這提示了 miR-425具有成為腫瘤治療有效靶點的潛能。miR-425抑制劑在制備治療肺癌及肝癌的藥物組合物上極具臨床應用價值，為肺癌和肝癌的有效治療提供了新的藥物和方法。
[0023]發明者同時發現miR-425高表達與肺癌和肝癌患者5年總生存率及無病生存率顯著負相關，miR-425高表達明確指示較差的生存預后。這提示了 miR-425具有成為肺癌和肝癌患者生存預后指標的潛能。
【附圖說明】
[0024]圖1為miR-425在多種腫瘤中的表達情況；顯不為miR-425在肺癌、肝癌、膀脫癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、頭頸部鱗癌、腎癌、前列腺癌和卵巢癌病人組織樣品中表達上調；
圖2顯示在164例肺癌臨床腫瘤樣品中miR-425高表達與患者5年總生存率(Overallsurvival, OS)顯著負相關(a);在214例肝癌臨床腫瘤樣本中miR-425高表達與患者5年總生存率(OS)及無病生存率(Disease-free survival, DFS)顯著負相關(b);
圖3為體外實驗中的各組細胞生長實驗，MTT的含量檢測(a)、平板克隆形成實驗(b)和軟瓊脂克隆形成實驗(c)顯示高表達miR-425能促進肺癌細胞和肝癌細胞的生長，而沉默miR-425 (antimiR-425)能抑制肺癌細胞和肝癌細胞的生長；
圖4為裸鼠皮下成瘤實驗顯示高表達miR-425增強了肺癌細胞和肝癌細胞的體內成瘤能力，而沉默miR-425的表達減弱了肺癌細胞和肝癌細胞的體內成瘤能力；其中a為各組小鼠體內的成瘤情況，b為各組小鼠體內腫瘤的體積大小；
圖5為通過免疫熒光檢測實驗檢測顯示高表達miR-425能夠減少肺癌細胞和肝癌細胞的細胞凋亡，然而沉默miR-425能夠增強順鉑對肺癌細胞和肝癌細胞的誘導凋亡能力；其中a、b分別為各組小鼠體內肝癌、肺癌腫瘤體積的大小及TUNEL檢測瘤組織中細胞凋亡的情況；
圖6為裸鼠體內腫瘤轉移模型實驗顯示高表達miR-425促進肺癌細胞和肝癌細胞在肺器官的腫瘤細胞定殖及克隆形成能力，而antimiR-425顯著降低肺癌細胞和肝癌細胞在肺器官中的腫瘤形成能力，從而延長了小鼠了的生存時間；其中a和c表示活體熒光成像儀檢測各組小鼠體內腫瘤形成情況，b和d分別用苦味酸染色和H&E方法進一步鑒定各組小鼠肺器官中腫瘤結節數的檢測情況；
圖7為TargetScan網站預測結果顯示miR-425可能通過作用于PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2和PPP2R2A這5個基因mRNA的3’ UTR發揮功能(a)和免疫印跡實驗結果表明高表達miR-425可明顯下調靶基因PTPRJ、PTEN、PHLPPU PHLPP2和PPP2R2A的蛋白表達水平，沉默miR-425可明顯上調這些蛋白的表達水平(b);
圖8中a圖為miRNPs免疫共沉淀實驗檢測高表達miR-425是否促進RISC復合體(RNA-1nduced silencing complex)與靶基因 PTPRJ、PTEN、PHLPPl、PHLPP2 和 PPP2R2A 的mRNA結合；b圖為雙熒光素酶活性檢測結果表明miR-425通過作用于靶基因PTPRJ、PTEN、PHLPPU PHLPP2和PPP2R2A的mRNA的3’UTR元件抑制熒光素酶的表達。
【具體實施方式】
[0025]miR-425作為腫瘤檢測、治療、預后革E點的應用。
[0026]一種腫瘤檢測試劑盒，該試劑盒中含