專利名稱：：穩定的il-21組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及包括IL-21和硫酸鹽的組合物，例如藥物組合物，和穩定IL-21的方法，該方法包括向包含所述肽的溶液中加入石克酸鹽。
背景技術：
：IL-21首次公開于WO00/53761中。所述前肽為162個氨基酸殘基的肽，公開的其序列作為在所述申請中的SEQIDNo:2。為方便起見，在本申請中重復該序列作為SEQIDNo:l。最初認為所述成熟肽為由SEQIDNo:l的氨基酸no32至162組成，然而，最近(WO04/112703)已經提出所述成熟肽實際上為氨基酸no30至162。IL-21為一種能活化B細胞、T細胞和NK細胞的細胞因子，并且已經提出IL-21及其變異體和類似物已經作為有效地治療多種癌癥類型的治療劑，WO00/53761和WO03/103589。肽通常在液態經延長的時間是不穩定的，大量研究致力于提供滿足藥物組合物的穩定性需要的藥物肽的制備。提供穩定的包括肽的藥物組合物不容易，因此，仍然有發現提供包括IL-21的穩定的制劑的方法的組合物。WO04/112703公開了例如SEQIDNo:l的氨基酸30至162可以通過包括用高濃度的硫酸銨沉淀所述肽的方法分離。WO04/055168公開了用載體轉染的細胞可以在包括硫酸銨的培養基中發酵，所述載體包括編碼SEQIDNo:l的氨基酸no30至的聚核苦酸，所述聚核苦酸具有另外的N-末端Met。國際申請WO2004DK000686(/>開為WO05/35565)/>開了在功能化的PEG和功能化的IL-21之間的反應中使用硫酸銅作為催化劑以提供PEG基化的IL-21。發明概述本發明人出人意外地發現硫酸鹽離子(SOr)的存在穩定了IL-21的結構，并增加了包括IL-21的組合物的穩定性。因此，在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽離子的組合物，特別是藥物組合物，提供的任意銨離子(NH4+)在所述組合物中不能以硫酸鹽的摩爾量的兩倍摩爾量存在。在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽離子的組合物，特別是藥物組合物，提供的任意銨離子(NH4+)在所述組合物中不能以硫酸鹽的摩爾量的兩倍摩爾量存在，并且條件是所述組合物不包括銅。在一個實施方案中，本發明提供穩定包括IL-21的組合物的方法，所述方法包括向所述組合物中加入石克酸鹽。在一個實施方案中，本發明提供折疊或重折疊IL-21的方法，所述方法包括向未折疊的或部分折疊的IL-21中加入石克酸鹽。在一個實施方案中，本發明提供純化IL-21的方法，所述方法包括使色譜材料與包括IL-21和硫酸鹽的組合物接觸。在一個實施方案中，本發明提供結晶IL-21的方法，所述方法包括向包括IL-21的組合物中加入辟,酸鹽。在一個實施方案中，本發明涉及治療方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的本發明的藥物組合物。在一個實施方案中，本發明涉及IL-21和^L酸鹽在制備藥物中的用途。在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽離子的藥物組合物。圖1:結合在不同的pH的IL-21的1-苯胺萘基(Amlmonaphtalene)-8-磺酸(ANS)。所有的樣品包含0.05mg/ml(3.2^M)IL-21、10mM緩沖齊'J(其中緩沖劑和pH顯示在圖中)，和當指出時，50mM的Na2S〇4。恰在測定前加入16jiM的ANS。圖2:在pH2.0的加入或不加入50mM的硫酸鹽的磷酸鹽緩沖液中，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖3A:在pH5.3的或不加入50mM的石克酸鹽的組氨酸li沖液中，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖3B:在pH5.3的加入或不加入50mM的硫酸鹽的乙酸鹽緩沖液中，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖4:在pH6.0的加入或不加入50mM的硫酸鹽的磷酸緩沖液中，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖5:在不加入碌u酸鹽下，在pH2.0至6.0下，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖6:在加入50mM的碌^酸鹽下，在pH2.0至6.0下，IL-21的Far-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖7:在pH2.0的加入或不加入50mM的硫酸鹽的磷酸鹽緩沖液中，IL-21的Near-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖8A:在pH5.3的加入或不加入50mM的碌,酸鹽的組氨酸lt沖液中，IL-21的Near-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖8B:在pH5.3的加入或不加入50mM的石克酸鹽的乙酸鹽緩沖液中，IL-21的Near-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖9:在pH6.0的加入50mM的硫酸鹽的磷酸緩沖液中，IL-21的Near-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖10:在pH5.3的加入或不加入50mM的辟u酸鈉的組氨酸緩沖液中，IL-21的毛細管DSC。圖11:表1的數據描繪成的圖。圖12:在pH2的50mM的磷酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽和甲酸鹽緩沖液中，IL-21的Near-UV圓二色性譜。蛋白質的濃度2mgZml。定義如本文使用的化合物的"治療有效量"指足夠治愈、減輕或部分抑制給定的疾病及其并發癥的臨床表現的量。將能夠達到這一點的量定義為"治療有效量"。用于每種目的的有效量將取決于例如疾病或損傷的嚴重行以及受試者的體重、性別、年齡和身體狀況。應當理解確定適當的劑量可以使用常規實驗通過構建有價值的模型和測定模型中的不同點獲得，其都在經過訓練的醫師或獸醫的常規技術之內。如本文使用的術語"治療"指為了抗擊病癥比如疾病或障礙對患者的處理和護理。該術語指包括對于給定的病癥(患者經受該病癥)廣譜的治療，比如給藥活性化合物以減輕所述癥狀或并發癥，延遲所述疾病、障礙或病癥的發展，減輕或緩解所述癥狀和并發癥，和/或治愈或消除所述疾病、障礙或病癥，以及預防所述病癥，其中預防應當理解為為了抗擊所述疾病、病癥或障礙的目的對患者的處理和護理，并且所述預防包括給藥活性化合物以預防所述癥狀或并發癥的發作。要治療的患者優選為哺乳動物，特別是人類，但是其也可包括動物，比如狗、貓、母牛、羊和豬。盡管如此，應當認識到治療方案和預防(prophylactic或preventative)方案代表本發明的不同方面。
發明內容在此，IL-21意味著指a)具有如在SEQIDNo:l中定義的序列的肽；b)具有SEQIDNo:l的氨基酸no32-162定義的序列的肽；c)具有SEQIDNo:l的氨基酸no30-162定義的序列的肽；或d)a)、b)和c)中任一的變異體。變異體應理解為由下述獲得的化合物通過用另一種天然的或非天然的氨基酸置換IL-21序列中的一個或多個氨基酸殘基；和/或通過給IL-21序列加入一個或多個天然的或非天然的氨基酸；和/或通過從IL-21序列中刪除一個或多個氨基酸殘基，其中在這些步驟中的任一個之后可任選地進行一個或多個氨基酸殘基的進一步衍生化。特別地，在一定意義上，用來自相同組的另一個氨基酸殘基，即具有類似的性質的另一個氨基酸殘基取代一個氨基酸殘基的這樣的置換是保護性的。基于它們的性質，通常可將氨基酸分成下列幾組堿性氨基酸(比如精氨酸和賴氨酸)、酸性氨基酸(比如谷氨酸和門冬氨酸)、極性氨基酸(比如谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(比如亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、曱石克氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小的氨基酸(比如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。在一個實施方案中，所述變異體具有與a)、b)或c)至少80%,比如至少85%，比如至少90%，比如至少95%的同一性。特別地，所述變異體具有至少20%，比如至少40%,比如至少60%，比如至少80%，比如至少90%，比如至少95。/。的a)、b)或c)的活性，如在本文中測定I中確定的。如本領域已知的術語"同一性"指兩個或多個肽的序列之間的關系，如通過比較所述序列確定。在本領域，"同一性"也指肽之間的序列相關性，如通過兩個或多個氨基酸殘基4連(strings)之間的配對lt確定。"同一性"測定4交小的兩個或多個具有間隙對準(gapalignments)(如果有的話)序列之間相同配對的百分數，其是通過特定的數學模型或計算機程序(即"算法")進行。相關蛋白的同一性可以用已知的方法容易地計算出。這樣的方法包括，但不限于，在ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Parti,Griffm，A.M.,和Griffm,H.G.,eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysismMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，J.,eds.，M.StocktonPress,NewYork,1991;和Carillo等人.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)中描述的那些。測定同一性的優選的方法經設計用于*合出測定的序列之間的最大配對。測定同一性的方法為在公眾可獲得的計算機程序中描繪的。測定兩個序列之間的同一性的優選的計算機程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人.，Nucl.Acid.Res.，12:387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.),BLASTP,BLASTN和FASTA(Altschul等人.，丄Mol.Biol.,215:403-410(1990))。所述BLASTX程序為7>眾從BiotechnologyInformation(NCBI)的NationalCenter及其它來源(BLASTManual，Altschul等人，NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894;Altschul等人，supra)可獲得的。眾所周知的SmithWaterman算法也可用于測定同一't"生。例^口，<吏用i十算才幾算；去GAP(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin,Madison，Wis),定位要測定序列同一'性百分比的兩種蛋白質用于它們相應的氨基酸的最佳配對("配對跨度(matchedspan)",j口用所述算法測定)。間隙打開處罰(gapopeningpenalty)(其為計算如3次的平均斜線(averagediagonal);所述"平均斜線"為比較使用的模型的斜線的平均值；所述"斜線"為通過特定的比較模型配對的分配給每個完全的氨基酸得分數或數字)和間隙擴展處罰(gapextensionpenalty)(其為所述間隙打開處罰的通常{分數(1/10)}次數)以及比較模型比如PAM250或BLOSUM62與所述算法一起使用。所述算法也使用標準的比較模型(參見Dayhoff等人.，AtlasofProtemSequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978)forthePAM250comparisonmatrix;Hemkoff等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:10915畫10919(1992)fortheBLOSUM62comparisonmatrix)。用于蛋白質序列比較的優選的參數包括下述的算法Needleman等人,J.Mol.Biol,48:443-453(1970);比較模型BLOSUM62，來自Hemkoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919(1992);GapPenalty:12,GapLengthPenalty:4，ThresholdofSimilarity:0。所述GAP程序對上述參數有用。前述的參數為使用所述GAP算法用于肽比較(與用于末段間隙的無處罰(nopenalty)—起)的缺省參數。在一個實施方案中，通過向上述的序列a)、b)和c)中任一個累加五個氨基酸，比如一個、兩個、三個、四個或五個獲得的，特別地，加至N-末端。特別提及的為由c)(即SEQIDNo:l的氨基酸30-162)與加至其N-末端的另一個Met組成，SEQIDNo:2。本發明也包括本發明的組合物，其包括上述討論的已經進一步衍生化的IL-21變異體，所述衍生化例如通過共價連接PEG或親脂性取代基，例如如在WO05/035565中描述的。在一個實施方案中，本發明的組合物不包括以硫酸鹽的摩爾量的兩倍摩爾量存在的銨。當銨為一種酸時，其量將取決于所述溶液的pH;在高pH，所述銨將以氨(NH3)存在。應當理解在本文中，銨的量將以氨和銨的總量計。按類似的方式，硫酸鹽的量取決于pH。在低pH，硫酸鹽以質子化的形式HSCV存在。應當理解在本文中，硫酸鹽的量將以硫酸鹽和質子化的形式的總量計。在本發明的一個實施方案中，本發明的組合物不包括銨。應當理解這意味著本發明的組合物不包括高于痕量水平的銅。在本發明中使用的硫酸鹽離子可能基本上來自任何硫酸鹽。當然，某些區域或工業可對所述鹽有特定的需求，其也必須滿足這一需求。例如，制藥工業可要求磁^酸鹽為藥學可4妻受的鹽。藥學可4妻受的石克酸鹽包括金屬鹽，比如硫酸鋰、硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鈣、硫酸鉀和硫酸鎂，和烷基化的銨鹽，比如甲基銨-、二甲基銨、三曱基銨-、乙基銨-、三乙基銨-、羥基乙基銨-、二乙基銨-、丁基銨-和四甲基銨硫酸鹽。上述鹽的某些以包括以包括不同量的晶體水的多于一個形式存在。在本發明中可使用這些形式中的任一個，特別提及的包括7琉酸鈉。在一個實施方案中，本發明的組合物不包括銅。應當理解這意味著本發明的組合物不包括高于痕量水平的銅。在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽的藥物組合物。在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽的藥物組合物，條件是所述氨以硫酸鹽的摩爾量的兩倍摩爾量存在。在一個實施方案中，本發明提供包括IL-21和硫酸鹽的藥物組合物，條件是所述氨以硫酸鹽的摩爾量的兩倍摩爾量存在，進一步的條件是所述組合物不包括銅。除了IL-21和硫酸鹽之外，所述藥物組合物也可包括本領域已知的其它賦形劑，比如緩沖劑、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩定劑、足夠降低所述組合物儲存期間蛋白質凝聚形成的氨基酸基質、表面活性劑、潤濕劑、乳化劑、抗氧劑、填充劑、金屬離子、油脂性賦形劑、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質)和兩性離子。這些賦形劑的用途是本領域技術人員眾所周知的，描述在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，2000中。在一個實施方案中，本發明的藥物組合物不包括銨。應當理解這意味著本發明的組合物不包括高于痕量水平的銅。本發明的藥物組合物可以以多種劑型^會藥，比如，例如溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復合乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、洗劑、膠嚢例如硬明膠膠嚢和軟明膠膠嚢、栓劑、直腸膠嚢、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑例如冷凍干燥粉末、氣霧劑、吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用洗劑、陰道栓、陰道環、陰道軟膏劑、;主射〉容'液、原、<立專爭4匕〉容液(insitutransformingsolutions)4列3口原、4立)疑月交、原位j疑結、原卩立:沉淀、原卩立結晶、*俞注溶'液和才直入物。本發明的藥物組合物可以通過幾種給藥途徑給藥至需要這樣的治療的患者，比如例如通過舌、舌下、口腔、口內、口服、胃和腸內、鼻腔、肺例如通過細支氣管和肺泡或其組合、表皮、皮膚、透皮、陰道、直腸、眼部例如穿過結膜、輸尿管和非腸道給藥。非腸道給藥可以利用注射器通過皮下、肌內、腹膜內或靜脈注射進行，所述注射器任選筆樣注射器。另外，非腸道給藥可以利用輸液泵進行。一個進一步的選擇是本發明的組合物可以是用于以鼻腔或肺噴霧形式給藥的溶液劑或混懸劑。作為更進一步的選擇，本發明的藥物組合物也可以適合于透皮給藥，例如通過無針注射或從貼劑，任選離子滲透貼劑，或經粘膜例如口腔給藥。在包括IL-21和硫酸鹽的本發明的藥物組合物中，IL-21可以按至多500mg/ml的量存在。特別地，IL-21可以^安5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml或至多其的濃度存在。IL-21在石克酸鹽濃度高于lmM,t匕3口高于5mM，比^口高于7mM,比^口高于10mM、比如高于20mM下穩定。實際上，可以存在至多500mM,比如至多150mM,比如至多75mM,比如至多50mM的石危酸鹽。所述石克酸鹽濃度的上限由選擇的硫酸鹽的溶解度確定。在本發明的許多應用中，期望地是具有等滲的或接近等滲的藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物為20%等滲至120%等滲。在一個實施方案中，所述硫酸鹽的濃度為約1至約100mM。在一個實施方案中，所述硫酸鹽的濃度為約20至約100mM。在進一步的實施方案中，所述石克酸鹽的濃度選自約1mM、約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約55mM、約60mM、約65mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM和約100mM.。本發明的藥物組合物例如也可以是非等滲的，并且可以被制成等滲的，例如通過在纟會藥前稀釋。這可以^吏銷售更濃的藥物組合物，然后，通過例如醫師或患者在給藥前制成等滲的。在本發明的一個實施方案中，將氯化物加入本發明的組合物。特別地，可以加入至多150mM的氯化物。本發明的藥物組合物的優選為2至8之間，特別提及包括具有pH為4至5之間，比如例如5.3的藥物組合物。本發明的發明的一個實例由10mg/ml的SEQIDNo:2定義的肽、10mM的Na2S04，用組氨酸緩沖至pH5.3組成。典型地，通過制備測定組合物(在本發明的組合物的情況下)和參照組合物(在相同的組合物但沒有石克酸鹽的情況下)評價特定的賦形劑對藥物組合物的穩定性的影響。然后，將這兩種組合物儲存在受控條件下，例如在4(TC下2周，在25。C下2個月或在5。C下6個月。在儲存后，在適宜的測定中測定在所述兩種組合物中感興趣的肽的剩余活性。對于包括IL-21的組合物，可以使用在本文實施例11中描述的聚集測定。也可以應用測定IL-21或降解產物的量/活性的其它測定。本發明的一個實施方案涉及硫酸鹽用于促進折疊或重折疊未折疊的或部分未折疊的IL-21中的用途。特別地，硫酸鹽離子的加入可增加折疊或固定正確折疊的速度。如果IL-21為通過特定微生物的發酵產生，所述微生物不能正確地折疊所述肽，所述肽可以表示為排除包括未折疊的或部分未4斤疊的肽的部分。在所述包涵體s皮裂后，可以在包括加入石克酸鹽離子的過程中獲得正確折疊的肽。硫酸鹽離子的存在引起IL-21的結構更緊密和穩定。這可以利用在IL-21的色譜純化中以改變所述肽的色譜洗脫特征，特別是給出更尖和更明確定義的洗脫峰。加入石克酸鹽的有益效果可以在各種色譜法，比如離子交換色譜法(陽離子交換色譜和陰離子交換色譜法)和疏水性相互作用色譜法、尺寸排阻色譜法中看到。較尖的洗脫峰在其中期望分離靠近洗脫峰的位置是有利的，但是通常當之后將所述洗脫肽收集在小體積中時，其使進一步的下游加工更加簡單和便宜。根據本發明，硫酸鹽以至少約3mM，比如至少約7，比如至少約10mM存在。實際上，預料到僅應用的硫酸鹽的溶解度限定了所述硫酸鹽濃度的上限。特別提及的包括作為；克酸鹽的來源的；克酸鈉。本發明的色譜方法的pH可以為從1至10,比如從2至9，比如從3至8，比如從4至7,比如從5至6。許多不同的色譜材料是本領域已知的，實例包括陰離子交換色譜材料、陽離子交換色譜材料、疏水性相互作用材料和尺寸排阻色譜材料。更明確定義的結構為更易于結晶的，因此，本發明也提供硫酸鹽用于改善IL-21的結晶的用途。在本文中，"改善"可以是結晶速度的增加，或者提供更適用于例如X射線衍射研究的晶體的增加。IL-21已經被提議用于治療多種癌癥或胂瘤疾病或障礙。在一個實施方案中，本發明涉及治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥治療有效量的包括IL-21和硫酸鹽的本發明的組合物。特別提及的包括轉移性惡性黑色素瘤、腎細胞癌、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、淋巴瘤和白血病。在本發明的更具體的方面，術語"腫瘤性障礙，，、"癌癥"應當理解為指各種形式的瘤細胞生長，包括膀胱瘤和實體瘤、骨骨腫瘤和軟組織腫瘤，包括良性肺瘤和惡性腫瘤，包括在肛門組織的腫瘤、膽管瘤、膀胱瘤、血細胞瘤、骨腫瘤、骨癌(繼發的(secondary))、腸(結腸&直腸)癌、腦癌、腦癌(繼發的)、乳房癌、乳房癌(繼發的)、類癌、子宮頸癌、兒童癌癥(children'scancers)、眼睛癌、食道癌(食管癌)、頭&頸癌、卡波濟(氏)肉瘤、腎癌、喉癌、白血病(急性成淋巴細胞的)、白血病(急性脊髓的)、白血病(慢性淋巴細胞的)、白血病(慢性脊髓的)、白血病(其它的)、肝癌、肝癌(繼發的)、月申癌、肺癌(繼發的)、淋巴結癌(繼發的)、淋巴瘤(霍奇金氏)、淋巴瘤(非霍奇金氏)、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卯巢瘤、胰腺癌、陰莖癌、.前列腺癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、胃癌、睪丸癌、曱狀腺癌、未知的原發胂瘤、陰道癌、外陰癌、子宮癌。軟組織肺瘤包括良性神經鞘瘤單體性、韌帶樣纖維瘤、脂肪胚細胞瘤、脂肪瘤、子宮平滑肌瘤、明細胞肉瘤、皮膚纖維肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液樣軟骨肉瘤、脂肪肉瘤粘液樣、脂肪肉瘤、高度分化的肉瘤、腺泡狀橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。特定的骨腫瘤包括非骨化性纖維瘤、單房性骨嚢、內生軟骨瘤、動脈瘤樣骨嚢腫、成骨細胞瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液纖維瘤、骨化纖維瘤和釉質瘤、巨細胞瘤、纖維發育異常、尤因肉瘤、嗜酸細胞肉芽腫、骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤和轉移癌。白血病指由骨髓生成的白細胞的癌癥。這包括，但不限于四種主要類型的白血病急性成淋巴細胞白血病(ALL)、急性成髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和慢性髓細胞白血病(CML)。而且，IL-21可用于治療各種非轉移性和轉移性階段的癌癥，比如"階段1"局限性的癌癥(限于發病器官)；"階段2"局部癌癥；"階段3"廣泛的；和"階段4"廣泛彌散性癌癥。IL-21也參與治療病毒感染，比如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷性病毒、呼吸道合胞病毒、Eppstein-Barr病毒、流感病毒、巨細胞病毒、皰滲病毒和嚴重的急性呼吸綜合征。在一個實施方案中，本發明涉及IL-21和石克酸鹽在制備治療癌癥的藥物中的用途。特別提及的包括上述列出的癌癥。在此，將本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請和專利以其全部內容引入作為參考，并且將其引入至如同每篇參考文獻被分別和特別地指出引入作為參考和在本文中全部闡述的相同程度(達到法律許可的最大程度)，不考慮在本文中別處說明的特定文件的任意分別提供的引入。在描述本發明的上下文中的使用的術語"一個"和"所述的"和類似的指示物將被解釋為包括單數和復數，除非本文中另有說明或與上下文有明顯的矛盾。例如，短語"化合物"應當理解為指本發明的多個"化合物"或特別描述的方面，除非另有說明。如，對于特定的因素或測定提供的所有精確示例'性的值可被認為也提供相應的近似測定，當適當時，用"約"修飾)。對于成分使用術語"包括"、"具有"或"包含"的本發明的任何方面的本文說明意味著提供用于本發明的類似方面"由其組成"、"基本上由其組成"或"基本上包括"那些特定成分的支持，除非另有說明或與上下文明顯矛盾(例如，本文描述的組合物如包括一種特定成分應當理解為也描述了由所述成分組成的組合物，除非另有說明或與上下文明顯矛盾)。測定1可以在適用鼠的Bafi細胞的細胞的生物測定中分析IL-21的活性，所述鼠的Baf3細胞被穩定地轉染以表達人類IL-21R和Stat-連接的熒光素酶受體構建物。Baf3細胞內源性表達活性IL-21受體絡合物的gc部分。在刺激前，將所述Baf3/hlL-21R受體細胞系在不含IL-3的培養基中受餓(starved)。使用一定范圍濃度的IL-21蛋白質可獲得計算IC50濃度的劑量-反應曲線。所述Baf3細月包描述在PalaciosR，Nature.(5964),126-31(1984)中，并且其可由在RIKENBioResourceCenter的CellBank(http:〃www2.brc.riken.jp/labZcell/detail.cgice11—no=RCB0805)獲得。實施例在下述實施例，"IL-21"指由SEQIDNo:2確定的肽。實施例1ANS熒光ANS(l-苯胺萘基-8-磺酸)結合蛋白的疏水性部位。更強的熒光強度顯示出更多的ANS分子結合所述蛋白質。這又表明結構化的分子更少，因為更少結構化的蛋白質將暴露更多的疏水性部位。較弱的熒光強度表明更緊密的蛋白質結構，其暴露了ANS可結合的較少的疏水性部位。所有的樣品包含0.05mg/ml(3.2)iM)的IL畫21、10mM的緩沖劑(其中緩沖劑和pH顯示在圖中)和當指出時50mM的Na2S04。在測定前加入16jiM的ANS。在裝有恒溫的電池(VananCarySmglecellPeltier附件)的VarianCaryEclipse熒光分光光度計上記錄ANS熒光光譜。熒光分光光度計的設置和性能如下在390nm刺激樣品。將激發波長和發射波長狹縫設置在5nm，并且將光電倍增管(PMT)和溫度分別設置在"高"和20°C。收集在400-700nm的發射光譜。對于每個樣品，收集3次光譜，計算平均值。用發射光譜值減去適當的空白值后計算一階導數來評價發射最大波長(X腿x)。圖1中的數據顯示出對于在不同pH和不同緩沖液中的IL-21的ANS光譜。該數據清楚地顯示出隨著pH增加IL-21獲得了更緊密的結構。特別地，加入硫酸鹽引起IL-21結構的緊密性明顯地增加。因此，得出硫酸鹽穩定了IL-21的結構。實施例2Far-UV圓二色性(CD)蛋白的Far-UV圓二色性譜反映出肽鍵的不對稱，其依次反映出所述蛋白質的二級結構。具有突出a-螺旋構型的蛋白質的Far-UV光譜的特征在于兩個最小的分離在208和222nm，在190-195nm部位有正峰值，從負區域至高于172nm的正區域有交叉點(cross-over)。研究了在不同pH下硫酸鹽對1L-21的二級結構的作用。在裝有溫度控制器的JascoPTC-4238分光偏振計上記錄該光譜。顯示的掃描表示三個光譜的平均值，所述光譜為在0.1nm間隔，響應時間為4秒，掃描速率為20nm/分鐘下收集資料獲得的。將所述光譜用空白校正，并且所述光譜為從180至250nm獲得。蛋白質的濃度為10mg/ml。圖2顯示了在pH2的加入或不加入硫酸鹽的磷酸鹽緩沖液中的光譜。在不含有硫酸鹽的pH2下，IL-21存在a-螺旋和隨意盤繞(coil)之間的平4軒。然而，石克酸鹽的加入明顯有助于cc螺;旋的鞏固。圖3和4顯示了特別是在pH5.3和在pH6.0，加入硫酸鹽增加了109-195nm的峰值，其顯示出a螺旋結構的量增加。圖2-4的數據也出現在圖5和6中，其中圖5顯示了在沒有辟^酸鹽的pH2-6的IL-21的far-UV圓二色性譜，而圖6顯示了在加入石克酸鹽下在相同的pH間隔IL-21的far-UV圓二色性譜。在圖5和6的比較中，其表明加入硫酸鹽使IL-21的二級結構在寬pH范圍更均勻。因此，得出向IL-21組合物加入硫酸鹽增加了在寬pH范圍下IL-21結構的a螺旋含量。實施例3Near-UV圓二色性(CD)Near-UVCD反映了蛋白質的三級結構。near-UV光譜的振幅越高，蛋白質的三級結構的量越高。在加入或不加入石克酸鹽下，在多種緩沖液中在pH2至6下獲得IL-21的near-UV光譜。在裝有溫度控制器的JascoPTC-4238分光偏振計上記錄該光譜。顯示的掃描表示三次光譜的平均值，所述光譜為通過在0.1nm間隔，響應時間為4秒，掃描速率為20nm/分鐘收集資料獲得。將所述光譜用空白校正，并且所述光譜為從250至350nm獲得。蛋白質的濃度為10mg/ml，與圖12中顯示的實驗不同，其中所述蛋白質的濃度was2mg/ml。圖7顯示了加入或不加入50mM硫酸鹽下，在pH2(磷酸鹽緩沖液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圓二色性譜。該圖清楚地表明加入石克酸鹽增加了IL-21的三級結構的量。圖8A顯示了加入或不加入50mM硫酸鹽下，在pH5.3(組氨酸緩沖液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圓二色性譜。該圖清楚地表明加入硫酸鹽增加了IL-21的三級結構的量。圖8B顯示了加入或不加入50mM石克酸鹽下，在pH5.3(乙酸鹽緩沖液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV光譜。該圖清楚地表明加入硫酸鹽增加了IL-21的三級結構的量。.顯然其形成了在圖8A和8B中描述的數據，該數據與緩沖液無關，加入硫酸鹽導致IL-21的三級結構的量增加。圖9顯示了加入或不加入50mM硫酸鹽下，在pH6.0(磷酸鹽緩沖液)下，IL-21在10mg/ml的near-UV圓二色性i普。該圖顯示出在該pH,IL-21的三l^結構的量有少量、^a明顯的增大。圖12顯示出在多種緩沖液的pH中，IL-21在2mg/ml的nearUV圓二色性譜。包含硫酸鹽的緩沖液的圓二色性譜與其它光譜明顯不同，具有從弱陰性至更加正性的CD的改變。實施例4差示掃描量熱法(DSC)差示掃描量熱法測定蛋白質的折疊溫度或解鏈溫度。界限明確的、窄峰表示蛋白質的緊密和定義結構和結構緊密性，而寬峰表示更松散的結構。用VP-DSC熱量計進4亍毛細管DSC。從10至ll(TC掃描樣品，<吏用的掃描速率為3。C/分鐘。.用作為參照的單獨的緩沖液處理所述樣品。從樣品掃描中除去緩沖液-緩沖液參考曲線以得到最終樣品的具體數據。所述樣品包含10mg/ml的IL-21、10mM的pH5.3的組氨酸，和當指出時50m丄M的Na2S〇4。圖10中的數據顯示出向IL-21加入硫酸鹽形成DSC掃描中峰的形態。這顯示出硫酸鹽增加了IL-21的結構緊密性。實施例5含有組氨酸10mM的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制劑的制將IL-212.4%(w/v)的4諸備溶液與組氨酸1.52%(w/v)的儲備溶液混合。用HCl和NaOH調節所述溶液的pH至5.3，加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22pm過濾器過濾來滅菌所述制劑，將其無菌填充到無菌小瓶中。實施例6含有組氨酸10mM和多種含量的石克酸鈉(3、10、50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的四種可溶性制劑的制備將IL-212.4%(w/v)的4諸備溶液與組氨酸1.52%(w/v)的^諸備溶液混合。加入硫酸鈉10.6%(w/v)的儲備溶液。用HCl和NaOH調節所述溶液的pH至5.3,加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22fim過濾器滅菌所述制劑，并將其無菌填充在無菌小瓶中。重復該過程四次，同時加入不同量的所述石克酸鈉4諸備溶液。實施例7含有甘露醇4.7%(w/v)和組氨酸10mM的pH5.3的IL-2110mgZml的可溶性制劑的制備將IL-212.4%(w/v)的儲備溶液與甘露醇23.6%(w/v)的儲備溶液和組氨酸1.52%(w/v)的J諸備溶液混合。用HC1和NaOH調節所述溶液的pH至5.3,加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22]dm過濾器滅菌所述制劑，并將其無菌填充在無菌小瓶中。.實施例8含有甘露醇4.7%(w/v)、組氨酸10mM和可變量的碌u酸鈉(3、10、50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制劑的制備將IL-212.4%(w/v)的儲備溶液與甘露醇23.6%(w/v)的儲備溶液和組氨酸1.52%(w/v)的儲備溶液混合。加入硫酸鈉10.6%(wZv)的儲備溶液。用HC1和NaOH調節所述溶液的pH至5.3,加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22)um過濾器滅菌所述制劑，并將其無菌填充在無菌小瓶中。.重復該過程四次，同時加入不同量的所述石危酸鈉4諸備溶液。實施例9含有組氨酸10mM、石克酸鈉50mM和和多種含量的石危酉i鈉(50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制劑的制備將IL-212.4%(w/v)的^f渚備溶液與組氨酸1.52%(w/v)的^f諸備溶液和氯化鈉4.38%(w/v)的儲備溶液混合。加入硫酸鈉10.6%(w/v)的儲備溶液。用HC1和NaOH調節所述溶液的pH至5.3，加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22pm過濾器滅菌所述制劑，并將其無菌填充在無菌小瓶中。重復該過程兩次，同時加入不同量的所述氯化鈉4諸備溶液。實施例10含有甘露醇4.7%(w/v)、組氨酸10mM和多種含量的氯化鈉(50和150mM)的pH5.3的IL-2110mg/ml的可溶性制劑的制備將IL-212.4%(w/v)的儲備溶液與甘露醇23.6%(w/v)的儲備溶液、組氨酸1.52%(w/v)的儲備溶液和氯化鈉4.38%(w/v)的儲備溶液混合。加入石克酸鈉10.6%(w/v)的儲備溶液。用HCl和NaOH調節所述溶液的pH至5.3，加入水以稀釋所述制劑至最終體積。通過使用0.22^m過濾器滅菌所述制劑，并將其無菌填充在無菌小瓶中。重復該過程兩次，同時加入不同含量的所述氯化鈉儲備溶液。實施例11儲存穩定性將包含實施例5至11的制劑的小瓶置于不同溫度下37°C、25°C、15°C、50°C、5。C和-20。C。在不同的時間點4是取用于分析的樣品。通過尺寸排阻HPLC在TSK柱上測定在IL-21制劑中的"凝聚物"的成分(包括共價二聚物及其它高分子量雜質)。凝聚物的百分比是基于在IL-21的主峰洗脫之前洗脫的峰的總面積向多于所包括的容積內的總面積。使用作為參考的實施例5中的制劑(即，不含有硫酸鹽或甘露醇的IL-21制劑)來標準化，將在37。C下儲存1個月的樣品的結果列在表1中。將其數據也描繪在圖11中。表1在37。C下一個月，在實施例5-10中描述的IL-21制劑中標準化的凝聚形成。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表l(或在圖11中描繪)的數據顯示出硫酸鹽對IL-21的儲存穩定'l"生有積極的效果。該數據也顯示出這一積極的效果取決于硫酸鹽的濃度。而且，所述數據顯示出氯化物對儲存穩定性也具有積極的效果，而且該效果也取決于所述氯化物的濃度。最后，該數據顯示出增加的穩定性效果是通過向IL-21組合物中加入硫酸鹽和氯化物獲得的。因此，確定通過在權利要求1.組合物，包括IL-21和硫酸鹽，提供的任意銨離子，如果存在，不能以硫酸鹽摩爾量的兩倍摩爾量存在。2.權利要求1的組合物，其中所述硫酸鹽的存在濃度為高于1mM。3.根據權利要求1或2的組合物，其中pH為約1至約10之間。4.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-21的序列包4舌SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。5.根據權利要求4的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。6.根據權利要求5的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。7.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。8.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l。9.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。10.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。11.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述IL-2]的序列表示為SEQIDNo:2。12.根據權利要求l-ll中任一項的組合物，其中所述組合物為藥物組合物。13.根據權利要求12的藥物組合物，其中給藥至患者的組合物是等滲的。14.根據權利要求l3的藥物組合物，其中所述藥物組合物是等滲的。15.根據權利要求1-14中任一項的組合物，其包括氯化物。銨。16.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>17.根據權利要求1-16中任一項的組合物，其中所述組合物不包括銅。18.藥物組合物，包括IL-21和硫酸鹽離子。19.根據權利要求18的藥物組合物，其中給藥至患者的組合物是等滲的。20.根據權利要求19的藥物組合物，其中所述藥物組合物是等滲的。21.根據權利要求18-20中任一項的藥物組合物，其中如果存在任意銨離子，其不能以硫酸鹽摩爾量的兩倍摩爾量存在。22.根據權利要求18-21中任一項的藥物組合物，其包括氯化物。23.根據權利要求18-22中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物不包括銨。24.根據權利要求18-23中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物不包括銅。25.組合物，包括10mg/ml的IL-21、10mM的Na2SO4，并且用組氨酸緩沖至pH5.3。26.根據權利要求25的組合物，其中所述組合物為藥物組合物。27.根據權利要求25或26的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。28.根據權利要求27的組合物，其中所迷IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。29.根據權利要求28的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo丄30.根據權利要求25或26的組合物，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。31.根據權利要求25或26的組合物為SEQIDNo:l。32.根據權利要求25或26的組合物為SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。33.根據權利要求25或26的組合物為SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。34.根據權利要求25或26的組合物為SEQIDNo:2。35.穩定包括IL-21的組合物的方法，所述方法包括向所述組合物其中所述IL-21的序歹'其中所述IL-21的序歹i其中所述IL-21的序歹'其中所述IL-22的序歹'表示中加入硫酸鹽。36.重折疊溶液中未折疊的或部分折疊的IL-21的方法，所述方法包括向所述溶液中加入石克酸鹽。37.純化IL-21的方法，所述方法包括使IL-21和硫酸鹽的溶液與色譜材料接觸。38.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:375的氨基酸no32-162。39.根據權利要求38的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。40.根據權利要求39的方法，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。41.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序歹包括SEQIDNo:2。42.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序歹為表示為SEQIDNo:l。43.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序歹表示為SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。44.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序歹表示為SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。45.根據權利要求35-37中任一項的方法，其中所述IL-21的序歹表示為SEQIDNo:2。46.治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥治療有效量的根據權利要求1-34中任一項的組合物。47.根據權利要求46的方法，其中所述癌癥選自腎細胞癌、結腸直腸癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤。48.IL-21和硫酸鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。49.根據權利要求48的用途，其中所述癌癥選自腎細胞癌、結腸直腸癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤。50.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。51.根據權利要求50的用途，其中所述IL-2]的序列包括SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。52.根據權利要求51的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:l。53.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列包括SEQIDNo:2。54.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l。55.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l的氨基酸no32-162。56.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:l的氨基酸no30-162。57.根據權利要求48-49中任一項的用途，其中所述IL-21的序列表示為SEQIDNo:2。全文摘要本發明提供包括IL-21和硫酸鹽的組合物。文檔編號A61K38/20GK101189024SQ200680019887公開日2008年5月28日申請日期2006年6月6日優先權日2005年6月6日發明者J·T·巴克林斯基,M·帕森申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司