專利名稱：一種測定蘇云金芽孢桿菌毒蛋白Cry1Ac的方法
技術領域：
本發明涉及一種測定蘇云金芽孢桿菌毒蛋白CrylAc的方法，特別是基于Fe3O4OAu納米粒子的電化學發光免疫傳感器的研制及蘇云金芽孢桿菌毒蛋白CrylAc測定的方法。
背景技術：
納米粒子具有大的比表面積、高表面活性、表面活性中心多、催化效率高，因此可以增加生物活性物質的穩定性和吸附量。Fe3O4納米粒子具有超順磁性、低毒性、制備工藝簡單的特性。但是，單獨的Fe3O4納米粒子在儲存過程中易氧化和團聚。在納米粒子表面包覆一層無機膜可以克服上述缺點。Fe3O4納米粒子表面包覆納米Au形成核殼型結構，既可以防止Fe3O4被氧化，又可以增強其穩定性和生物相容性。核殼型Fe3O4OAu納米粒子具有高靈敏性、電極表面易更新等優點。CrylAc蛋白是由蘇云金芽孢桿菌HD-73菌株產生的。從食品安全的角度來說，需要建立一種轉基因植物中的CrylAc毒蛋白的高靈敏檢測的分析方法。目前，已經建立了很多檢測轉基因Bt毒蛋白CrylAc的方法，如免疫PCR技術、電化學方法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、毛細管電動色譜法等。然而，已經建立的轉基因產物的檢測方法耗時、耗力、操作復雜、準確性低。電化學發光免疫分析結合了高靈敏的電化學發光檢測技術和特異性免疫反應，因此具有靈敏度高、選擇性好、特異性強的優點。然而，電致化學發光免疫傳感器檢測轉基因植物蛋白，尤其是基于核殼型Fe3O4OAu納米粒子檢測轉基因Bt毒蛋白CrylAc的傳感器未見報道。
發明內容
本發明的目的在于制作一種基于Fe3O4OAu納米粒子的電化學發光免疫傳感器,并且對蘇云金芽孢桿菌毒蛋白CrylAc進行測定的方法。構思如下:研究發現一抗接到Fe3O4OAu納米粒子表面,與抗原、葡萄糖氧化酶標記二抗特異性免疫反應形成三明治結構復合物。葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖生成H2O2 ;在工作電極上加電壓激發魯米諾氧化；魯米諾氧化物和H2O2反應產生電化學發光信號；隨著葡萄糖氧化酶濃度的增大，電化學發光信號顯著增強，在一定范圍內可以用來檢測蘇云金芽孢桿菌毒蛋白CrylAc的濃度。本發明涉及基于Fe3O4OAu納米粒子的電化學發光免疫分析技術；當轉基因CrylAc蛋白抗原濃度改變時，葡萄糖氧化酶標記二抗的濃度隨之改變，檢測到的電化學發光強度發生改變，電化學發光信號與CrylAc蛋白抗原的濃度在O到6 ng/mL范圍內成線性關系。具體步驟為:
(I)磁控玻碳電極(GCE)的制作:
截取內徑2.5 6.0 mm的玻璃管，把鐵棒兩端磨平并清洗干凈；將玻碳放入玻璃管一端，然后將鐵棒插入玻璃管并緊貼玻碳；鐵棒周圍用熔融的固體石蠟固定；電極表面在麂皮上分別用粒徑1.0,0.3和0.05 Mm的氧化鋁粉拋光，清洗后待用。(2 )化學共沉淀法合成Fe3O4核:在N2保護下，在50 ° C、劇烈攪拌條件下，將5 50 mL摩爾濃度為2 mol/L的NaOH溶液加入I 10 g FeSO4WH2O與0.29 2.9 g FeCl3的混合物中，反應過程中保持pH為10不變，繼續加熱至80 ° C熟化I小時，用外加磁鐵分離得到黑色沉淀物，用二次蒸餾水反復清洗干凈至上清液成中性，得Fe3O4核。(3)核殼型Fe3O4OAu納米粒子的合成:
將0.29 2.9 g檸檬酸鈉溶解在100 mL二次蒸餾水中，在攪拌下加熱到90 ° C，立即加入50 100 mg Fe3O4和2 10 mL摩爾濃度為0.01 mol/L HAuCl4的混合溶液，繼續加熱10 20分鐘，移去熱源繼續攪拌15 20分鐘，冷卻至室溫，通過外加磁力分離核殼型磁性納米粒子，用二次蒸餾水清洗，重新分散在10 30 mL 二次蒸餾水中，得核殼型Fe3O4OAu納米粒子。(4) Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制備:
將2.0 mL步驟(3)制得的核殼型Fe3O4OAu納米粒子，攪拌下加入I mL摩爾濃度為10mmol/L的硫脲溶液反應2小時，用磁鐵分離后，加入2 mL質量百分比濃度為99%的戊二醛反應I小時，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液徹底清洗干凈，加入50 μ 濃度為0.1 mg/mL的ant1-CryIAc溶液,定容至2 mL,4 ° C緩慢攪拌下反應10小時,得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu納米粒子溶液置于冰箱中密閉保存。(5)雙抗夾心法制作免疫傳感器:
將步驟(I)制得的電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取10 30 μ 步驟(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au納米粒子懸浮液滴到電極表面,使其分散,為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比為1%的牛血清白蛋白溶液中，接著將修飾電極浸入6 ng/mL CrylAc蛋白中孵化20 40分鐘,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應20 40分鐘 ，形成三明治結構免疫復合物，未鍵合的多余的抗體用0.1mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈，免疫傳感器不用時，置于4 ° C儲存。(6)檢測方法:
使用MP1-E型電化學發光分析系統，在10 mL包含0.6 mmol/L魯米諾和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液中，Tris-HCl緩沖溶液pH為8.5，進行ECL信號檢測，掃描范圍:-0.3 ^ 0.6 V (vs.SCE);掃速:100 mV/s ;光電倍增管高壓:800 V，采樣速率:10 T/S，放大倍數:4，測量時間:90秒，免疫傳感器不用時置于冰箱(4 ° C)中保存；
(7)標準工作曲線的繪制:
將步驟(I)制得的電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取10 30 μ 步驟(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au納米粒子懸浮液滴到電極表面,使其分散,為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比為1%的牛血清白蛋白溶液中，接著將修飾電極浸入不同濃度的CrylAc蛋白中孵化20 40分鐘,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應20 40分鐘，形成三明治結構免疫復合物，未鍵合的多余的抗體用0.1mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈；電化學發光強度J在CrylAc濃度C為O 6 ng/mL范圍內成線性關系；線性回歸方程為/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，線性相關系數r=0.9991ο本發明靈敏度高，檢測限低，應用廣泛，為可靠地、超靈敏檢測轉基因植物的檢測提供了廣闊的應用前景。
圖1為本發明實施例免疫傳感器的CV和ECL響應圖。圖2為本發明實施例免疫傳感器對CrylAc的電化學發光響應圖。
具體實施例方式實施例:
(I)磁控玻碳電極(GCE)的制作:
截取3 cm的鐵棒(直徑2.55 mm)和2 cm玻璃管(直徑3 mm),兩端磨平并清洗干凈；將玻碳放入玻璃管一端，然后將鐵棒插入玻璃管并緊貼玻碳，鐵棒周圍用熔融的固體石蠟固定，電極表面在麂皮上分別用粒徑1.0,0.3和0.05 μ 的氧化鋁粉拋光，清洗后待用。(2)化學共沉淀法合成Fe3O4核:
在N2保護下，在50 ° C、劇烈攪拌條件下，將15 mL摩爾濃度為2 mol/L的NaOH溶液加入2 g FeSO4.7Η20與0.58 g FeCl3的混合物中；實驗過程中保持pH為10不變；繼續加熱至80 ° C熟化I小時；用外加磁鐵分離得到黑色沉淀物，用二次蒸餾水反復清洗干凈至上清液成中性，得Fe3O4核。(3)核殼型Fe3O4OAu納米粒子的合成:
將2.29 g檸檬酸鈉溶解在100 mL 二次蒸餾水中，在攪拌下加熱到90 ° C ;立即加入80 mg步驟(2)制得的Fe3O4和5 mL摩爾濃度為0.01 mol/L的HAuCl4溶液，繼續加熱15分鐘，移去熱源繼續攪拌20分鐘，冷卻至室溫；通過外加磁力分離核殼型磁性納米粒子，用二次水蒸餾清洗，重新分散在20 mL 二次蒸餾水中，得核殼型Fe3O4OAu納米粒子。(4) Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制備:
將2 mL步驟(3)制得的核殼型Fe3O4OAu粒子,攪拌下加入I mL摩爾濃度為10 mmol/L硫脲溶液反應2小時，用磁鐵分離后，加入2 mL質量百分比濃度為99%的戊二醛反應I小時；用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液徹底清洗干凈，加入50 PL濃度為0.1 mg/mL的ant1-CrylAc溶液，定容至2 mL,4 ° C緩慢攪拌下反應10小時，得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu納米粒子溶液置于冰箱中密閉保存。(5)雙抗夾心法制作免疫傳感器:
將步驟(I)所得電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取20 μ ant1-CrylAc/Fe304iAu納米粒子懸浮液滴到電極表面，使其分散；為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比為1%的牛血清白蛋白溶液中；接著將修飾電極浸入6 ng/mL的Cry I Ac抗原中孵化30分鐘；最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應30分鐘,形成三明治結構免疫復合物；未鍵合的多余的抗體用0.1 mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈，得免疫傳感器；免疫傳感器不用時，置于4 ° C儲存。(6)檢測方法:
實驗中使用MP1-E型電化學發光分析系統,在10 mL包含0.6 mmol/L魯米諾和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液中，Tris-HCl緩沖溶液pH為8.5，進行ECL信號檢測；掃描范圍:-0.3 - 0.6 V (vs.SCE);掃速:100 mV/s ;光電倍增管高壓:800 V，采樣速率:10 T/S，放大倍數:4，測量時間:90秒；免疫傳感器不用時置于冰箱(4 ° C)中保存。(7)標準工作曲線的繪制:
將步驟(I)所得電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取20 μ ant1-CrylAc/Fe304iAu納米粒子懸浮液滴到電極表面，使其分散；為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比含量為1%的牛血清白蛋白溶液中；接著將修飾電極浸入不同濃度的CrylAc抗原中孵化30分鐘,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應30分鐘,形成三明治結構免疫復合物；未鍵合的多余的抗體用0.1 mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈；電化學發光強度/在CrylAc濃度C為O 6 ng/mL范圍內成線性關系；線性回歸方程為J = 520.81 + 1862.27 CXng/mL)，線性相關系數r=0.9991 ;轉基因CrylAc蛋白抗原濃度與ECL信號關系如圖2所示。(8)實際檢測應用:
用步驟(5)免疫傳感器分析檢測了大豆轉基因Bt提取物CrylAc蛋白，將實驗結果與紫外可見分光光度法測量得到的數據進行了比較，并用標準加入法驗證了結果的準確度。取100 g新鮮轉基因大豆葉(HD-73)，加入50 mL緩沖溶液a( 10 mmol/L Tris-HClpH 7.5,2 mmol/L巰基乙醇和I mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0)，磨碎；通過乙醚脫月旨，再加入400 mL緩沖液a中，4。C攪拌2小時，10000 rpm冷凍離心15分鐘，取上清；力口入質量百分比含量為50%的(NH4)2SO4使蛋白沉淀，靜置30分鐘，10000 rpm離心10分鐘，棄上清，加入20 mL緩沖液a使沉淀溶解,在10倍體積的緩沖液a中4 ° C透析過夜。透析后的液體，10000 rpm離心10分鐘，取上清，經過緩沖溶液a平衡過的Sephadex G-25柱分離，用400 mL緩沖溶液a洗脫并部分收集。將收集液在10倍體積的緩沖溶液a中4 ° C透析，過夜；10000 rpm離心10分鐘，取上清；將上清液經過緩沖溶液a平衡過的DEAE-Toyopearl柱子進行分離，分別用200mL緩沖溶液a、100 mL緩沖溶液a和100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，收集高濃度轉基因Bt毒蛋白CrylAc部分。電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取20 ant1-CrylAc/Fe304@Au納米粒子懸浮液滴到電極表面，使其分散；為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比含量為1%牛血清白蛋白溶液中；接著將修飾電極浸入含有CrylAc蛋白抗原的大豆轉基因Bt提取物中孵化30分鐘，最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應30分鐘，形成三明治結構免疫復合物；未鍵合的多余的抗體用0.1 mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈:然后選用M P1-E型電致化學發光分析系統，采用三電極系統進行測試，并測定ECL的強度，根據/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，計算出大豆轉基因Bt提取物CrylAc蛋白抗原的濃度，結果如表I所示:
權利要求
1.一種測定蘇云金芽孢桿菌毒蛋白CrylAc的方法，其特征在于具體步驟為: (1)磁控玻碳電極即GCE的制作: 截取內徑2.5 6.0 mm的玻璃管，把鐵棒兩端磨平并清洗干凈；將玻碳放入玻璃管一端，然后將鐵棒插入玻璃管并緊貼玻碳；鐵棒周圍用熔融的固體石蠟固定；電極表面在麂皮上分別用粒徑1.0,0.3和0.05 Mm的氧化鋁粉拋光，清洗后待用； (2)化學共沉淀法合成Fe3O4核: 在N2保護下，在50 ° C、劇烈攪拌條件下，將5 50 mL摩爾濃度為2 mo I/L的NaOH溶液加入I 10 g FeSO4WH2O與0.29 2.9 g FeCl3的混合物中，反應過程中保持pH為10不變，繼續加熱至80 ° C熟化I小時，用外加磁鐵分離得到黑色沉淀物，用二次蒸餾水反復清洗干凈至上清液成中性，得Fe3O4 ； (3)核殼型Fe3O4OAu納米粒子的合成: 將0.29 2.9 g檸檬酸鈉溶解在100 mL 二次蒸餾水中，在攪拌下加熱到90 ° C，立即加入50 100 mg Fe3O4和2 10 mL摩爾濃度為0.01 mo I/L HAuCl4的混合溶液，繼續加熱10 20分鐘，移去熱源繼續攪拌15 20分鐘，冷卻至室溫，通過外加磁力分離核殼型磁性納米粒子，用二次蒸餾水清洗，重新分散在10 30 mL 二次蒸餾水中，得核殼型Fe3O4OAu納米粒子；(4)Ant1-CrylAc/Fe304iAu 的制備: 將2.0 mL步驟(3)制得的核殼型Fe3O4OAu納米粒子，攪拌下加入I mL摩爾濃度為10mmol/L的硫脲溶液反應2小時，用磁鐵分離后，加入2 mL質量百分比濃度為99%的戊二醛反應I小時，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液徹底清洗干凈，加入50 μ 濃度為0.1 mg/mL的ant1-CryIAc溶液,定容至2 mL,4 ° C緩慢攪拌下反應10小時,得到的ant1-CrylAc/Fe3O4OAu納米粒子溶液置于冰箱中密閉保存； (5)雙抗夾心法制作免疫傳感器: 將步驟(I)制得的電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取10 30 μ 步驟(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au納米粒子懸浮液滴到電極表面,使其分散,為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比為1%的牛血清白蛋白溶液中，接著將修飾電極浸入6 ng/mL CrylAc蛋白中孵化20 40分鐘,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應20 40分鐘，形成三明治結構免疫復合物，未鍵合的多余的抗體用0.1mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈，免疫傳感器不用時，置于4 ° C儲存； (6)檢測方法: 使用MP1-E型電化學發光分析系統，在10 mL包含0.6 mmol/L魯米諾和I mmol/L葡萄糖的0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液中，Tris-HCl緩沖溶液pH為8.5，進行ECL信號檢測，掃描范圍:-0.3 ^ 0.6 V (vs.SCE);掃速:100 mV/s ;光電倍增管高壓:800 V，采樣速率:10 T/S，放大倍數:4，測量時間:90秒，免疫傳感器不用時置于4 ° C保存； (7)標準工作曲線的繪制: 將步驟(I)制得的電極倒置并用磁鐵吸住中心鐵棒，首先吸取10 30 μ 步驟(4)制得的anti_CrylAc/Fe304@Au納米粒子懸浮液滴到電極表面,使其分散,為封閉非特異性吸附，將電極浸入質量百分比為1%的牛血清白蛋白溶液中，接著將修飾電極浸入不同濃度的CrylAc蛋白中孵化20 40分鐘,最后浸入21 ng/mL葡萄糖氧化酶標記ant1-CryIAc溶液中免疫反應20 40分鐘，形成三明治結構免疫復合物，未鍵合的多余的抗體用0.1mol/L磷酸鹽吐溫緩沖溶液清洗干凈；電化學發光強度J在CrylAc濃度C為O 6 ng/mL范圍內成線性關系；線性回歸方程為/ = 520.81 + 1862.27 C (ng/mL)，線性相關系數r=0. 9991ο
全文摘要
本發明公開了一種測定蘇云金芽孢桿菌毒蛋白Cry1Ac的方法。結合轉基因Bt毒蛋白Cry1Ac一抗的Fe3O4@Au納米粒子修飾于磁控玻碳電極表面，然后與抗原、GOD標記二抗特異性免疫反應形成三明治結構復合物。研制出電致化學發光免疫傳感器用于檢測轉基因Bt毒蛋白Cry1Ac的濃度。GOD催化氧化葡萄糖生成H2O2。在工作電極上加電壓激發luminol氧化。Luminol氧化物和H2O2反應產生電化學發光信號。電化學發光響應隨著GOD濃度的增大而增強。電化學發光信號與轉基因Bt毒蛋白Cry1Ac的濃度在0~6ng/mL范圍內成線性關系。本發明靈敏度高，檢測限低，應用廣泛，為可靠、超靈敏地檢測轉基因植物的毒蛋白提供了廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/569GK103175962SQ20131008588
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者李建平, 徐倩, 魏小平 申請人:桂林理工大學