專利名稱：：穩定的注射液組合物和方法
技術領域：
：本發明的
背景技術：
準備注射的疫苗或藥物溶液本來就不穩定，需要冷藏。傳統的制藥工業是通過將藥物進行冷凍干燥來克服這種不穩定的問題的。這樣做很浪費、不方便并且固有地具有一定的危險性，這是因為干燥藥物的錯誤重構可能導致劑量發生錯誤或可能導致溶液發生污染。在過去的一個世紀，已經進行了許多努力來研制濃的、穩定的、備注射的液體制劑，但可惜的是沒有成功。僅僅天生堅固的小分子藥物可以存在于水性溶液中并具有有用的儲存期。在疫苗工業中這種問題尤其尖銳。到2005年時，預計全世界所使用的疫苗劑量會達到36億。世界衛生組織(WHO)已經聲明不可能使用在所有的時候都需要冷藏的標準疫苗制劑(“免疫法的變革”(RevolutionizingImmunizations)，JodarL.，AguadoT.，LloydJ.和LambertP-H.GeneticEngineeringNews1998年2月15日)。目前使用的是冷藏器的“低溫運輸系統(coldchain)”，其可以從疫苗工廠中將其運送到發展中世界的城鎮中。對于疫苗企業和非政府性的健康組織而言，利用低溫運輸系統進行免疫活動的花費是巨大的。WHO預計該低溫運輸系統的維護費用每年在2億美元以上。此外，免疫活動僅僅能抵達這些居住在該低溫運輸系統的最后一個環節附近的人。疫苗運動需要進行過醫學訓練的人以確保能正確的對給藥劑量進行注射并且沒有出現降解的跡象。一些疫苗如麻疹、黃熱病和BCG疫苗需要進行重構，在本領域中這也是需要十分注意的問題。必須精確地進行操作以確保劑量的正確性并且在操作的過程中還可能引入潛在的污染源，這常常會導致臨床上的災禍。此外，因為由于某些組分的化學不相容性而使之不能獲得特定的混合物或“多價”疫苗，所以在一個時期內常常需要給予一次以上的疫苗，這可能會需要進行多次注射。WHO已經通過積極鼓勵進行研究以獲得不需要冷藏并且不需要重構的下一代穩定疫苗而強調了這些問題(“預填充的單劑量注射裝置一種新疫苗的安全性標準，或一場免疫物質傳遞的變革？”(Pre-FilledMonodoseInjectionDevicesAsafetystandardfornewvaccines，orarevolutioninthedeliveryofimmunizations？)，LloydJ.和AguadoM.T.，WHO出版，1998年5月。“總方針問題可注射的固體疫苗在未來免疫法中的角色？”(GeneralPolicyissuesinjectablesolidvaccinesaroleinfutureimmunization？)，AguadoM.T.，JódarL.，LloydJ.，LambertP.H.，WHO出版物No.A59781)。這一問題的一種理想解決方案是提供一種完全穩定的備注射的制劑。該類穩定的疫苗可以被包裝在注射裝置本身中成為獨立的給藥劑量，或者，對于大量的免疫活動而言，可以以較大容量的形式被運送，然后通過一種沒有針頭的噴射注射器來進行給藥。已經有關于通過氣體噴射注射而進行干固體的經皮傳遞的描述(SarphieDF，BurkothTL，在經皮顆粒傳遞中使用密質顆粒組合物的方法。PCT公開號WO9748485(1996))，干DNA疫苗的經皮接種顯然十分有效(“PowderJect的B型肝炎DNA疫苗第一次成功的引起了人的保護免疫反應”(PowderJect’sHepatitisBDNAVaccineFirstToSuccessfullyElicitProtectiveImmuneResponseInHumans)，http//www.powderject.com/pressreleases.htm(1998))。能用于驅動這些粉末注射器的氦氣超音速沖擊波具有有限的力量，所以不能將細顆粒的劑量進行肌內傳遞。這是因為低質量的顆粒不能獲得深入滲透所需的足夠動量。雖然包覆于膠態金顆粒上的DNA疫苗的經皮傳遞足以獲得良好的免疫原性，但是用不溶性的鋁或鈣鹽進行輔助的普通疫苗會誘導不可接受的皮膚刺激。它們必須被肌內給藥。所需的是一種能在從真皮內到深入肌肉內的傳遞深度范圍內進行傳遞的柔性系統，其所能傳遞的深度類似于用現有的針和注射器技術所能達到的深度。對于大量的免疫活動而言，這已經通過研制一種能促使窄的液體流(直徑～0.15mm)進入到“液體指甲”中的液體噴射注射器而得到了解決，其使用約3,000psi的壓力。這種裝置可以通過在表皮上穿出微小的孔而無痛的將其劑量通過皮膚傳遞到深入的皮下或肌肉組織中。給該液體流提供高動量以確保其能深度滲入。迄今為止，注射的藥物和疫苗一直都是以水為基礎的，但是因為上面所討論的不穩定的問題，可用于這種技術的穩定的水性產品的范圍十分有限。現在已經認識到許多生物活性分子通過在糖玻璃上進行干燥而可被穩定化(RoserB.“蛋白質等的保護”UK專利號為2,187,191。RoserB和ColacoC.“生物學大分子物質和其它有機化合物的穩定化”PCT公開號WO91/18091。RoserB.和SenS.“新的穩定化的玻璃”PCT專利申請號為9805699.7，1998年)。這些干燥的穩定的活性物質不受不利的環境如高溫和離子輻射的影響。糖對分子的顯著穩定化機理是玻璃轉化。在將包含活性分子的糖溶液進行干燥時，當達到糖的溶解度限度時其可以結晶出來，或可以變成過飽和的糖漿。糖抵抗結晶的能力是一種良好穩定劑的重要性質。海藻糖在這方面具有良好的性質(GreenJL.&AngelCA.“糖水中的相態關系和玻璃化以及海藻糖的異常”.J.Phys.Chem.932880-2882(1989))但并不是唯一的。進一步地逐步干燥使得該糖不斷地固化，在低的殘余水含量下變成一種玻璃。該活性成分不知不覺地從水中的液體溶液變成在干的糖玻璃中的固體溶液。在玻璃中的化學擴散是可以忽略不計的，因此實際上停止了化學反應。因為變性作用是一種化學變化，其在玻璃中不能發生，所以可以將分子穩定化。倘若能滿足一種其它的條件，以這種形式存在的分子仍然沒有改變。這是一種良好穩定劑的第二個重要性質，即是化學惰性的和沒有活性的。許多玻璃不能用就是因為它們在儲存期間與產物發生反應。還原糖會發生明顯的問題，其可形成良好的物理玻璃但是然后在典型的美拉德反應中它們的醛基團會攻擊產品的氨基基團。這是許多冷凍干燥的藥物需要冷藏的主要原因。沒有活性的糖可以給出穩定的產品，根本不需要進行冷藏。被固定在糖玻璃中的生物分子在非水性的工業溶劑中也是穩定的，在這種非水的工業溶劑中這些分子本身和糖都是不溶的(ClelandJL.和JonesAJS.“用有機溶劑處理的多肽的賦形劑穩定化”專利號為5,589,167的美國專利(1994))。因為糖玻璃在非溶劑的液體中可作為非滲透性的屏障，所以在玻璃的固體溶液中的生物分子可以被保護起來不與溶劑和環境進行化學反應。如果該液體本身是穩定的，則在混懸的玻璃顆粒中的敏感產物就組成了一種穩定的兩相液體制劑。Cleland和Jones(1994)所描述的類別的工業溶劑在加熱中具有有限的實用性。代用以生物可相容的非水性液體可確保甚至最不穩定的藥物、疫苗和診斷試劑可被制備成穩定的液體制劑。設計了第一代穩定的非水性液體用于藥物或疫苗傳遞(B.J.Roser和S.D.Sen“在液體制劑中穩定的顆粒”編號為GB98/00817的PCT專利申請，其描述了包含活性成分的穩定化玻璃的粉末制劑，其被混懸于可注射的油如芝麻油、花生油或豆油中或被混懸于簡單的酯如油酸乙酯中。被混懸的糖玻璃顆粒的親水性很強而油是疏水的。因為親水相和疏水相強烈的分離趨勢，所以該糖玻璃傾向于向一起聚集。為了穩定該類“油包水”型混懸液，常常需要使用溶解于連續油相中的油溶性表面活性劑。這些低HLB值(親水/親油平衡值)的表面活性劑在親水的顆粒和油之間的界面上積聚，并且用一種兩親層對它們進行包覆，該兩親層與連續的油相更相容。因為各種糖玻璃顆粒之間被干性油分隔開，所以在顆粒之間不會發生化學的相互作用。因此，在相同的油性制劑中可有一些不同的顆粒群，各顆粒群可包含不同的可能會相互作用的分子，在該油制劑中它們不能相互作用。用這種方法可以制造出復合的多價疫苗。但是，隨后發現這種方法具有一些缺點，使其不能形成一種通用的解決辦法。缺點包括不可避免的會發生混懸顆粒的沉積，在密度較低的油性賦形劑中其一般具有約1.5g/cm3的密度。該專利承認了這種問題并且希望通過將顆粒的直徑降低到1μm以下來解決這一問題，降低顆粒的直徑是為了通過熱力學力如布朗運動而使這些顆粒保持混懸的狀態。要求所有顆粒的直徑都小于1μm對于所建議的制劑而言是一個缺點。獲得如此小的顆粒決不是一項容易的任務。改良的噴霧干燥方案可能可以做到這一點但小粒度將使得不能使用旋流型收集器并且需要一種用于產品回收的過濾系統。將顆粒減少到亞微米的大小在理論上也是可行的，在將該顆粒混懸于油中后可以用高壓微量均化裝置如微量流化器(ConstantSystemsInc.)來達到這一目標。這樣就需要進行額外的步驟，并且我們發現對噴霧干燥的糖玻璃微球進行粉碎不是很有效，這是因為這些顆粒具有球形的形狀，所以具有很高的機械強度。這就需要使其多次通過該裝置。即使如此，還可能會有很多較大的顆粒未受影響，因此隨后需要進行過濾或沉淀步驟以除去這些較大的顆粒。在通常的油性賦形劑中混懸液的高粘度也使得很難將其吸入到注射器中，并且在注射時只能緩慢的進行注射。其不能象在液體噴射注射系統中那樣快速的通過細噴嘴。還已經發現，混懸于油中的顆粒，尤其是當其包含一種低HBL值的表面活性劑時，其隨后很難被提取到一種水性環境中，即使在用水性緩沖液進行洗滌后，它們仍然令人吃驚的緊緊結合在一起，這是因為環繞在顆粒周圍的油的斥水性涂層所導致的。因此，需要進行十分強烈的振搖和混合或需要再加入更多的水溶性洗滌劑(這次具有高HBL值)以使得顆粒離開油相進入水相。當顆粒的粒度變小時，這一問題變得更為突出。最后的結果常常是一種混亂混合的乳劑而不是一種明顯分離的兩相。這種問題主要會造成活性物質的緩慢和難以預料的釋放，而不是所需的迅速和可預知的傳遞。在體外，提取到水性環境中時會使得油漂浮到包含溶解了的活性物質的水相的上面。在體外應用的某些情況中這是不可接受的，如在診斷試劑盒或自動測定系統中。最后，FDA所批準的可臨床應用的天然油中的大多數都易于遭受光降解、氧化或其它形式的損害，需要在相對較低的溫度下被仔細的儲存于黑暗的環境中。此外，它們不是完全的化學惰性，以至于它們可以與所混懸的顆粒緩慢的進行反應。Alliance制藥公司已經研究了水溶性物質的粉末在值得注意的新的非水性全氟化碳液體中的應用(KirklandWD用于傳遞活性物質的組合物和方法，專利號為5,770,181的美國專利(1995))。這篇專利主要關心的是PFC作為腸診斷成像的口服對比增強劑的功能。其中加入所列舉的水溶性粉末是為了改善可口性或PFC在胃腸道中的對比作用的增強。雖然沒有給出實施例，但是，Kirkland感知到這些液體也可以用于藥物傳遞。在該專利中僅僅特別列舉了儲存穩定的在商業上可獲得的粉末。我們現在發現，在糖玻璃微球中被穩定化的脆弱的活性物質可以用于制造出十分穩定的可用于口服和非腸道給藥的兩相PFC液體制劑。這極大地擴充了Kirkland專利的實用性，將其擴充到了用于傳遞非腸道藥物和疫苗的不需要進行任何形式冷藏的備注射的制劑中。特別有價值的是發現了PFC的低粘度、高密度和低表面張力使得這些穩定的混懸液可以通過自動裝置如液體噴射注射器來進行傳遞。這又為這種技術開辟了兩個重要的領域，即大量的免疫活動以及自我注射。全氟化碳(PFC)是由某些有機化合物的完全氟化而獲得的新型的、十分穩定的液體。不能將其歸為親水或親脂，因為它們實際上與除其它的PFC外的油和水或其它任何極性或非極性的溶劑基本都不能相混(KrafftMP&RiessJG.的綜述“高氟化的兩親物和膠體體系，以及它們在生物醫學領域中的應用。一點貢獻。”Biochimie)。此外，它們既沒有參與與油的疏水性相互作用，又沒有參與與水或親水性物質的親水性相互作用。作為一種總的相分離的結果，所看到的親水顆粒塊在油中的強烈結合在PFC中一般不會發生。其可不需要表面活性劑就能制造穩定的混懸液，但是可以使用氟代烴(FHC)表面活性劑(Krafft&Riess1998)并且其在PFC液體中在很低的濃度下就具有活性。在這些非常低的濃度下，FHC表面活性劑可以確保某些顆粒能形成完美的單分散體系，其中所說的顆粒在不存在FHC表面活性劑時表現出聚集的傾向。該PFC液體本身是完全沒有化學反應性的，并且低分子量型的這種揮發性的液體在機體中不會累積，最后僅僅是隨著呼吸被呼出。因為是氣體的極佳的溶劑，所以PFC一直被大量用于的非常特別的臨床應用。它們用二氧化碳交換溶解氧的能力優于血紅蛋白的能力。這首先在R.P.Geyer，1968年的“無血大鼠”中得到了證實(GeyerRP，MonroeRG&TaylorK.“完全用全氟化碳-清潔劑制劑灌注的大鼠的存活情況”，OrganPerfusionandPreservation，J.VNorman，JFolkman，L.E.Hardison，L.ERidolf和F.J.Veith編輯.Appleton-Century-Crofts，紐約，85-95(1968))。目前對在某些手術過程中作為人血液輸血的供替代的選擇的水包PFC型乳劑形式的商品名為OxygentTM(AlliancePharmaceuticalCorp.)的全氟辛基溴化物進行了評估。液體形式的PFC已經通過吸入被吸入到肺中用于治療早產嬰兒的呼吸窘迫綜合征。還發現它們的高密度以及化學惰性很有價值。用商品名為VitreonTM(VitrophageInc.)的全氟菲來預防在手術期間眼囊的萎陷，并且其還可使得脫離的視網膜復位。PFC還已經被用作磁共振成像(MRI)的造影劑，并且對于這種目的而言，還已經報道了可以將親水性的粉末混懸于其中以改善其成像性或使其更適口。(KirklandW.D.“傳遞活性物質的組合物和方法”專利號為5,770,181的美國專利，1998)。這篇專利還暗示了PFC作為傳遞微粒狀水溶性藥物的連續相的應用。因為以干粉末狀態存在的在室溫下穩定的非腸道藥物的數目是有限的，所以這篇專利對于大多數可注射的藥物不適用。但是，在Roser和GarciadeCastro(1998)中描述的藥物在糖玻璃的微球粉末中的穩定化與可注射的PFC結合，使得這項技術適用于基本上所有的非腸道藥物和疫苗。本發明的概述本發明使用一種兩相體系作為藥物傳遞制劑，在混懸液中用PFC作為連續相，其包含一種不連續的玻璃相。以全氟化碳為基礎的制劑的主要優點在于可以將不同的PFC進行混合從而獲得密度范圍為約1.5至2.5g/cm3的最終混合物。這使得微粒可以被制備成密度匹配的混懸液體以便于這些微粒不會漂浮在表面上或沉積到容器的底部而仍然可以保持穩定懸浮的形式。因此，與以油為基礎的制劑不同，這種制劑不需要將微粒亞微米化來防止沉積作用，這種制劑中的微粒在大小上可以變化很大。僅僅是為了制劑的目的才對最終顆粒的直徑進行控制。想要用于針注射或噴射注射的制劑可以包含0.1至100微米的顆粒，或優選1至10微米。這樣做可以極大的簡化顆粒的制造方法并且避免了通過研磨來制造十分細小的顆粒的必要性。可以通過常規的噴霧干燥或冷凍干燥之后進行簡單的干法或濕法研磨來制備顆粒。當在混懸液中需要有高固體含量時，希望顆粒的形狀為球形。形狀不規則的顆粒“結合”到一起的趨勢更強從而會抑制自由流動，而球形的顆粒具有固有的“潤滑性”，從而確保固體含量可以達到20％以上。該類顆粒可以很容易的通過噴霧干燥、噴霧冷凍干燥或乳劑固化來進行制備。如果制備恰當的話，該混懸的粉末不需要表面活性劑就能制造出穩定的混懸液，當用水進行振搖時該糖玻璃顆粒幾乎立即溶解。如果將少量的聚集看作一個問題，則可以在將該穩定粉末進行混合前或進行混合后向該PFC液體中有益的加入少量的如Kraft和Riess(1998)所述的FHC表面活性劑。與PFC相似，這些FHC本來的惰性就十分強并且沒有反應性。因此，沒有顆粒的溶劑化作用并且在混懸的顆粒和PFC相之間沒有化學反應。因為該糖玻璃顆粒和PFC液體在環境中都是穩定的，所以不會由于光、高溫、氧等等而發生降解。其具有在體內或體外都可以忽略不計的毒性并且已經被管理的權威機構深入測試和批準可作為血液的替代品大量的輸注到動物和人體內。雖然已經有報道稱高分子量的PFC會在肝中積聚，但是在本發明應用中所用的低分子量的實例最后都在呼氣時從機體排出。它們的低表面張力和低粘度確保了它們非常易于通過在皮下注射器的針、自動系統或液體噴射注射器中所會遇到的狹窄的孔。PFC是極佳的電絕緣體，因此易于獲得帶有相同的低表面靜電荷的顆粒的單分散混懸液。它們是干燥的，并且是完全非吸濕性的液體。它們的極低的水含量保持了混懸粉末的干燥性，防止了摻雜在其中的活性物質的溶解或降解。它們獨特的溶劑特性缺乏性使之成為混懸親水或疏水顆粒的理想物質，即最終的混懸液實際上可以與容器或傳遞裝置中所用的任何物質相容。這與以油為基礎的制劑相反，以油為基礎的制劑可造成注射器的嚴重阻塞，例如由活塞上的橡膠封口膨脹而造成阻塞。可以獲得各種密度、蒸汽壓和揮發性的PFC，(表I)。它們的高密度使得它們在大多數常用的緩沖液中下沉，使之易于與溶解于漂浮在頂部的水相中的該產品顆粒分離。因此，這促進了其在體外的應用如診斷學的應用。本發明詳細描述表I一些PFC的性質全氟-MW密度粘度表面張力蒸汽壓(Kg/L)(mPas)(mN/m)(mbar)己烷3381.6820.65611.1294正-辛烷4381.751.2716.9852十氫萘4621.9175.1017.68.8菲6242.0328.419＜1在Kirkland(1995)中已經暗示了PFC作為傳遞藥理學物質或生物活性物質的賦形劑的應用。這篇專利僅僅列舉了天生穩定的可商業獲得的調味或泡騰粉末等等。其沒有包含任何穩定化的生物活性物質如疫苗或藥物的實例。此外，其并沒有考慮通過用PFC作為活性顆粒的混懸賦形劑而制備一種可注射(非腸道)制劑的可能性。為了獲得一種具有長儲存期的用PFC作為非水性賦形劑的本生脆弱生物分子的穩定制劑，優選地將該顆粒制備成包含能穩定所摻雜的活性物質的玻璃成形劑的形式。可以使用各種糖，包括在編號為WO91/18091的PCT申請中所描述的海藻糖、乳糖醇、異麥芽糖醇(palatinit)等等或更優選在申請號為9820689.9的UK專利申請中所描述的其它更有效的單糖糖醇或玻璃成形劑。為了防止顆粒漂浮在密質PFC相上面，有益的在該顆粒中加入一種密度調節劑。其可以是可溶性的鹽如氯化鈉或氯化鉀或硫酸鈉或硫酸鉀，或更優選地是一種不溶性的物質如硫酸鋇、磷酸鈣、二氧化鈦或氫氧化鋁。優選不溶性的無毒物質，這是因為在機體內大量離子鹽的釋放可造成相當大的局部疼痛和刺激作用。在一些情況中，如在疫苗制劑中，該不溶性的物質可以是該活性制劑的一部分如佐劑。該密度調節劑可以以在糖玻璃顆粒中的固體溶液形式存在或可以以一種混懸于糖玻璃中的不溶性顆粒物質的形式存在。當進行恰當的制備時，該糖玻璃顆粒的密度可以大約與PFC液體的密度相配，浮力適中，并且既不漂浮又不沉降而是仍然不結塊的穩定混懸體。因為PFC液體是良好的電絕緣體，電阻率一般高于1013ohm.cm，所以在混懸顆粒上的微小表面電荷對于混懸液的穩定性具有重要的影響。為了防止混懸顆粒由于弱的短距離力而發生的聚集，其優選地被制備成包含能為該干顆粒提供弱的殘余靜電荷的賦形劑如賴氨酸或天門冬氨酸的形式。這樣做可以通過確保顆粒的電荷排斥力來防止聚集作用，這與在穩定的膠體中所觀察到的相似。或者，可以有益地將少量的FHC表面活性劑如全氟癸酸溶解于PFC中形成分散的混懸液，優選地形成單分散的混懸液。這些顆粒可以用各種方式來進行制備，包括風干、噴霧干燥或冷凍干燥，這些顆粒不需要特別小，而可以是一種直徑為0.1μm至100μm的顆粒的異質混合物。對于一些應用而言，甚至可以使用毫米大小的顆粒。這些穩定的混懸液的應用既不僅限于上面所列舉的非腸道的應用，又不僅限于如Kirkland(1995)中所列舉的口服應用。因為PFC液體賦形劑是無毒并且無反應活性的，所以其是一種適用于粘膜的理想的賦形劑，包括可用于肺內、鼻內、眼內、直腸內和陰道內給藥。這篇專利所提供的能制造穩定的、無菌并且無刺激性的可用于甚至非常不穩定的藥物或疫苗的粘膜傳遞的制劑的能力是相當先進的。因為微生物在缺乏水的情況下不能生長，所以在長期儲存和間歇應用期間，該非常干燥的并且完全非吸濕性的PFC液體還十分有助于維持這些制劑的無菌性。因為長期以來揮發性的全氟代烴和含氯氟烴一直在吸入劑中被用作推進劑用于使藥物能夠傳遞到肺的深處，所以這里所描述的該穩定的PFC制劑是用于制備肺內傳遞液體STASIS小滴細霧的理想物質。對于這種應用而言，在PFC小滴中組成不連續的被混懸相的顆粒的大小很重要并不應超過1至5μm，優選0.1至1μm的直徑。對于傳遞至鼻和眼中的其它粘膜表面而言，粒度大小的重要性稍微差一些，并且可以高至100μm的直徑，甚至可以達到幾個mm的直徑。圖1堿性磷酸酯酶(SigmaAldrichLtd.)被以甘露醇33.3％、乳酸鈣33.3％和降解的明膠33.3％(BycoC，CrodaColloidsLtd.)為基礎的玻璃所穩定化，被噴霧干燥成微球，并且以干粉末或在全氟萘烷中的穩定混懸液的形式被存儲于55℃。該活性仍然為約100％標記值(20天為103％，30天為94％)。未被混懸于PFC中的干粉末沒有更大的損失(仍然有約80％的活性)圖2通過在20％海藻糖溶液中加入磷酸鈣來將一種商品化的破傷風類毒素疫苗(由EvansMedevaplc友情提供的#T022)制備成密度匹配的粉末。用兩個流體噴頭將其噴到液氮中來冷凍干燥，然后，將該凍干的微球粉末在Labconco干燥器中進行冷凍干燥，在最初的干燥期間初始的擱板溫度為-40℃。在注射了相同劑量的用鹽水緩沖劑重構或作為油或PFC中的無水制劑的ASSIST穩定化破傷風類毒素疫苗后4、8和12星期時，測定六組豚鼠的抗體反應，每組有10只豚鼠。對于所有干燥制劑的反應低于新鮮的疫苗對照的反應(未表示出來)，這表明噴霧干燥的制劑顯著喪失了免疫原性。正如用捕獲的ELISA所測定的那樣，干燥過程并沒有改變該類毒素的抗原性。這表明在干燥時需要做更多的工作來改善氫氧化鋁佐劑的保存。對于用磷酸鈣進行了密度匹配的STASIS疫苗的反應(組3)基本上與作為對照的用水性緩沖劑進行重構的疫苗和在油包粉末型疫苗中(組2)的反應相同，而僅僅用非水性賦形劑進行注射的對照動物(組4和5)并沒有表現出反應。優選實施方案的描述實施例1在PFC中的噴霧干燥的顆粒顆粒是用LabplantSD1型噴霧干燥機，用糖和其它的賦形劑，通過將水性溶液進行噴霧干燥來進行制備的。典型的制劑是A.甘露醇15％w/v乳酸鈣15％w/v在水中B.海藻糖15％w/v磷酸鈣15％w/v在水中用具有0.5mm內徑的液體孔的兩個流體噴頭來制備該顆粒。發現最大噴嘴氣流量的一半是最佳的，并且在135℃的入口溫度和70-75℃的出口溫度的條件下來對干燥室進行操作。用玻璃旋流來收集顆粒，并且通過在4小時內將溫度逐漸升至80℃而在真空中將其進行第二次干燥。一旦冷卻，用超聲將其混懸于PFC中。發現在MSEMK2超聲室中用鈦探針在約75％的功率下進行操作以提供30秒鐘突發的超聲能量或浸入到DeconFS200Frequency清掃超聲浴中進行高至10分鐘的操作就足夠了。所得的混懸液是單分散的并且通過顯微鏡觀察，其由約0.5至30μm粒度范圍的球形玻璃顆粒所組成，其平均粒度約為10μm。甘露醇/乳酸鈣顆粒在幾分鐘內就升至該PFC層的頂端，但是通過輕輕地振搖其就可以很容易的被重新分散。海藻糖/磷酸鈣顆粒的密度基本與PFC相配并且形成了穩定的混懸液。以1、10、20和40％w/v的濃度將糖玻璃顆粒的噴霧干燥的粉末混懸于全氟己烷、全氟萘烷和全氟菲中。發現它們都能獲得幾乎不會發生聚集情況的單分散的混懸液。向該PFC中加入0.1％的全氟癸酸可以抑制在表面上所發生的任何輕微的聚集趨勢。發現這些混懸液通過吸入或噴出可以容易的通過25g針。實施例2在PFC中玻璃穩定化的酶的混懸液的穩定性如上所述的那樣用Labplant機器來噴霧干燥堿性磷酸酯酶(SigmaAldrichLtd.)。該制劑包含甘露醇33.3％w/w、磷酸鈣33.3％w/w和降解的明膠(BycoC，CrodacolloidsLtd.)33.3％。將該干燥的酶以干粉末的形式或在全氟萘烷中的混懸液的形式儲存在55℃下。在55℃下放置的時間高于30天時，所制備的這些微球中的酶表現出的酶活性仍然接近100％，其中所說的微球由被混懸于全氟萘烷中的以甘露醇為基礎的玻璃所組成(圖1)。實施例3體內效力與國家生物標準品和對照品協會(經過了世界衛生組織認可的實驗室)一起進行了類似制劑的臨床前試驗，其中所說的類似制劑包含臨床破傷風類毒素疫苗(由Medevaplc友情提供)。該試驗的結果表明該穩定的STASIS制劑使豚鼠免疫形成保護性的血清抗體反應的能力完全等于以水為基礎的液體疫苗(圖2)。這證實在PFC中的混懸液可形成一種在體內具有與常規的與水為基礎的液體制劑相同的生物利用度的備注射的制劑。實施例4噴霧冷凍干燥的顆粒該顆粒也通過將液體小滴噴入到液氮中，然后將該冷凍的粉末在真空中進行干燥來進行制備。這些顆粒比噴霧干燥的顆粒的密度低一些，并且在濃度高于20％w/v時在PFC中形成糊狀物。在較低的濃度下，它們在超聲后可形成單分散的混懸液。所用的典型制劑是物質終濃度w/wA.海藻糖100％B.海藻糖50％磷酸鈣49.5％氫氧化鋁0.5％實施例5研磨的疏水顆粒當從熔化狀態驟冷或從氯仿或二氯甲烷的溶液中被快速干燥時，疏水的糖衍生物蔗糖八醋酸酯和海藻糖八醋酸酯易于形成玻璃。已經對它們作為藥物傳遞的控釋基質的應用進行了描述(Roser等人“用于其中所加入的分子的控釋的固體傳遞系統以及其制備方法”公開號為WO96/03978的PCT申請，1994)。海藻糖八醋酸酯粉末可以通過在馬弗爐中進行熔化然后在不銹鋼板上將該熔化物驟冷來進行制備。用研棒和研缽將所得的玻璃片進行研磨，然后用高速勻漿機對其進行處理以將其制備成一種細粉。以1和10％w/v的濃度將該粉末混懸于全氟己烷、全氟萘烷和全氟菲中。發現它們都可以給出分散良好的混懸液。發現這些混懸液可以很容易的通過23g針。實施例6在水性環境中的重構因為可溶性糖玻璃顆粒的本性和PFC的性質，可預見到在這些混懸液中的活性成分在機體內將會迅速釋放。為了證明所包含的活性成分的完全釋放，將顆粒制備成包含海藻糖20％w/v乳酸鈣20％w/v賴氨酸0.5％w/v媒染劑Blue9染料1％w/v用如上的方法將該制劑進行噴霧干燥，然后將其加入到全氟菲和全氟萘烷中制成20％w/v的深藍色不透明的混懸液。在加入與混懸液體積相等的水并進行振搖后，發現實際上所有的藍色染料都被釋放到了水相中，形成了一種漂浮在幾乎無色的PFC上的澄清的藍色層，二者之間具有十分清楚的明顯介面。實施例7在混懸液中的顆粒間不具有反應活性因為在PFC混懸液中的各個微球在物理上是與所有其它的顆粒相互隔離的，所以可能會發生反應的物質可以共存于相同混懸液的不同顆粒中而不會有任何相互作用的危險。當該糖玻璃被溶解時，這些分子可以碰面，發生反應。為了證明這一點，制備一種包含兩種類型顆粒的混懸液，一種(a)為酶——堿性磷酸酯酶，另一種(b)為其無色的底物，磷酸對硝基苯。制劑是a)海藻糖10％w/v硫酸鈉10％w/v堿性磷酸酯酶20U/ml在5mMTris/HCl緩沖劑(pH7.6)中b)海藻糖10％w/v硫酸鈉10％w/v磷酸對硝基苯0.44％w/v在包含1mM氯化鋅和1mM氯化鎂的100mM甘氨酸緩沖劑(pH10.2)中發現包含10％w/v的粉末“a”和10％w/v的粉末“b”的全氟萘烷中粉末混懸液在37℃下放置3星期時沒有形成任何顏色反應，而仍然是白色的混懸液。加入水并進行振搖后，則該粉末溶解于上面的水相中。在幾分鐘內發生酶反應，出現對-硝基苯酚的正黃色，在新制備的樣品中和在37℃下放置3星期的樣品中都會出現這種情況。實施例8在“組織空間”模型中的產品釋放為了解釋當注射到體內時PFC混懸液可能會發生的行為，制備一種模型——透明的水合組織空間，這種模型是通過在聚苯乙烯小瓶子中移堆0.2％的瓊脂糖凝膠來進行制備的。將0.1ml實施例5的全氟萘烷混懸液用25g針注射到該瓊脂糖凝膠中。這樣就形成了一個扁平的混懸液的白色的球。在接下來的5-10分鐘，該白色從球的底部開始變得澄清，向上進行，之后剩下一個澄清的PFC球。因為酶和底物由于該玻璃顆粒的溶解而被釋放出來，所以它們彼此進行反應而產生了黃色的對硝基苯酚，然后在接下來的1小時中其在整個瓊脂糖內進行擴散。實施例9密度匹配通過兩種常規的干燥法中的任何一種方法所獲得的糖玻璃顆粒(即海藻糖)一般具有約1.5g/cm3的密度。我們所測試的全氟化碳的密度一般為1.68至2.03g/cm3(表I)。為此，當被制備成混懸液時，糖玻璃顆粒傾向于漂浮到PFC層的上面，這樣就會產生一種活性成分不能均勻分布的制劑。但是，為了制備出一種在PFC中的穩定的混懸液，可以對粉末進行改性，在這種混懸液中這些粉末具有適中的浮力，既不下沉又不上浮。其可以通過在顆粒形成之前向其中加入高密度的物質來實現。這些高密度的物質可以是水溶性的或水不溶性的。非水溶性物質密度為3.14g/cm3的正磷酸三鈣被批準用作疫苗的佐劑并且實際上不溶于水。所制備的包含約50％磷酸鈣的粉末表現出密度增加，其密度約為2g/cm3，并且以20％的固態量在全氟菲中形成穩定的混懸液。在PFC中，在20％的固體量時形成穩定的混懸液的粉末的實例包括1在全氟萘烷中物質終濃度w/wA.海藻糖50％磷酸鈣50％B.海藻糖47.5％乳酸鈣10.0％磷酸鈣42.5％2在全氟菲中物質終濃度w/w甘露醇18.2％肌醇18.2％乳酸鈣18.2％磷酸鈣45.4％一直被用于增加密度的其它的非水溶性物質包括硫酸鋇和二氧化鈦。可以使用任何具有適宜密度的無毒并不溶的物質。水溶性物質水溶性鹽如具有2.7g/cm3密度的硫酸鈉也可以被用作密度增強劑。下面的粉末在全氟萘烷中可形成穩定的混懸液物質終濃度w/w海藻糖50％硫酸鈉50％還可以使用其它無毒的高密度的水溶性物質。已經發現這些制劑在對豚鼠進行皮下注射后可以造成不適，這可能是因為高濃度的離子鹽的迅速溶解所造成的。實施例10密度匹配對混懸液中的活性物質的作用某些疫苗被制備成吸附到作為佐劑的不溶性凝膠或顆粒上的形式。氫氧化鋁和磷酸鈣被廣泛的用于這種目的。這些不溶性的佐劑它們本身就可以被用于增加被混懸的顆粒的密度。在這種情況中，高密度的物質不是完全惰性的，而是實際上可以從溶液中吸附活性高分子。必須證明這種吸附不足以改變該活性。為了對這一點進行試驗，用堿性磷酸酯酶作為模型的活性物質/疫苗。制備如下的溶液佐劑等級的磷酸鈣10％w/v(SuperphosKemia/s)海藻糖10％w/vZnCl21mMMgCl21mM堿性磷酸酯酶20U/ml在5mMTrisHCl緩沖液(pH7.6)中然后將該溶液在37℃下充分混合10分鐘以使得該堿性磷酸酯酶被吸附到磷酸鈣上。通過將磷酸鈣進行離心，對上清液進行取樣，在405nm的波長下用底物——磷酸對硝基苯來測定其酶動力學來測定每分鐘的吸收度改變值。將該溶液進行噴霧干燥，獲得一種細粉。用上述方法，在上清液中對該粉末再水化后該酶的任何解吸作用進行測定。以20％w/v的濃度將該粉末混懸于全氟菲中，發現可以形成一種穩定的混懸液。試驗樣品d吸收度/分鐘(405nm)初始溶液(25μl)0.409如上所得的上清液(25μl)0.034再水化的粉末(25μl，20％w/v，在水中)0.425如上所得的上清液(25μl)0.00420％w/v的在全氟萘烷中的粉末(25μl)0.430該實驗證明通過包含輔助的磷酸鈣，顆粒的密度可以與PFC載體的密度相匹配。在制劑過程中沒有發生顯著的解吸或酶活性損失。實施例11將實施例1的甘露醇基玻璃的STASIS制劑混懸于全氟萘烷中，然后將其填充到一種手術上清潔的、泵作用的聚丙烯噴霧器中，這種噴霧器在臨床上通常被用來傳遞羥甲唑啉鼻用減充血劑(Sudafed，WarnerLambert)。將該混懸液的兩股噴霧分別傳遞到人類志愿者的兩個鼻孔中，已要求這些志愿者對不適感的程度進行評估。志愿者報告根本沒有不適。給藥后沒有觀察到副作用。權利要求1.一種用于將穩定的生物活性化合物傳遞給個體的組合物，其包含第一種組分和第二種組分，其中所說的第一種組分包含一種含有所說生物活性物質的糖玻璃、金屬羧酸鹽玻璃或磷酸鹽玻璃的微粒，其中所說的糖玻璃、金屬羧酸鹽玻璃或磷酸鹽玻璃任選包含玻璃成形促進劑化合物，并且其中所說的第二種組分由至少一種生物相容的液體全氟化碳所組成，所說的第一種組分是不溶于該液體全氟化碳且分散其中，其中所說的液體全氟化碳任選包含表面活性劑。2.如權利要求1所述的組合物，其中所說的糖玻璃是由選自如下的糖所組成的海藻糖、蔗糖、綿子糖、水蘇糖、吡喃葡萄糖基山梨醇、吡喃葡萄糖基甘露醇、異麥芽糖醇、乳糖醇、單糖醇或通過引入疏水的側鏈而被改性的糖分子，其中所說的疏水的側鏈選自蔗糖八醋酸酯或海藻糖八醋酸酯。3.如權利要求1所述的組合物，其中所說的磷酸鹽玻璃或羧酸鹽玻璃是由二價金屬的磷酸鹽或金屬羧酸鹽的混合物所制造出來的。5.如權利要求1所述的組合物，其中所說的任選包含的玻璃成形促進劑選自肽、蛋白質、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、硼酸鹽離子、乳酸鈣、多磷酸鈉、以及硅酸鹽或醋酸鹽。6.如權利要求1所述的組合物，其中所說的糖玻璃微粒的直徑為約0.1至約100微米。7.如權利要求6所述的組合物，其中所說的直徑范圍為1至10微米。8.如權利要求1所述的組合物，其中所說的微粒具有不高于4％的水含量并且該水含量優選地低于2％并且理想地低于1％。9.如權利要求1所述的組合物，其中所說的第一種組分被單分散于所說的第二種組分中。10.如權利要求1所述的組合物，其中在所說的第二種組分中的所說第一種組分的濃度為約1％至約40％重量。11.如權利要求10所述的組合物，其中所說的濃度范圍為10％至15％。12.如權利要求1所述的組合物，其中在所說的第二種組分中的所說表面活性劑的濃度為約0.01％至約10％。13.如權利要求12所述的組合物，其中所說的濃度為約1％。14.如權利要求1所述的組合物，其還進一步的包含加入有無機鹽的第一種組分的微粒，所述無機鹽的量對于使所說的微粒具有與第二種組分液相相匹配的密度是有效的。15.如權利要求1所述的組合物，其還進一步的包含向所說的微粒中混入賦形劑以使所說的微粒具有弱的殘余靜電荷以使所說的微粒彼此排斥。16.如權利要求15所述的組合物，其中所說的賦形劑是一種氨基酸。17.如權利要求1所述的組合物，其中所說的全氟化碳選自全氟己烷、全氟萘烷和全氟菲。18.如權利要求1所述的組合物，其中所說的生物活性化合物是疫苗、藥物、酶或診斷試劑。19.一種給個體患者傳遞生物活性物質的方法，該方法包括的步驟有(a)制備如權利要求1所述的第一種組分的微粒；(b)將所說的微粒混懸于如權利要求1所述的第二種組分全氟化碳中；和(c)將所說的混合物給藥于所說的患者。全文摘要一種用于將穩定的生物活性化合物傳遞給個體的組合物，其包含第一種組分和第二種組分，其中所說的第一種組分包含一種含有生物活性物質的糖玻璃或磷酸鹽玻璃的微粒。該糖玻璃或磷酸鹽玻璃可包含或不包含一種玻璃成形促進劑化合物，并且其中所說的第二種組分由至少一種生物相容的液體全氟化碳所組成，所說的第一種組分不溶于該液體全氟化碳并分散于其中。其中所說的液體全氟化碳可包含或不包含表面活性劑。文檔編號A61K47/16GK1527699SQ00819965公開日2004年9月8日申請日期2000年10月13日優先權日2000年10月13日發明者布魯斯·約瑟夫·羅澤,阿爾卡迪奧·加西亞德卡斯特羅,詹姆斯·梅基,梅基,布魯斯約瑟夫羅澤,迪奧加西亞德卡斯特羅申請人:劍橋生物穩定性有限公司