專利名稱：降血脂藥用2，3，5，4＇-四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有藥用價值的天然化合物，特別是具有降血脂作用的二苯乙烯苷類化合物2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。
背景技術：
大量的流行病學調查和研究資料表明，高脂血癥是動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病、膽石癥等多種疾病的重要危險因素。高脂血癥的預防與治療是目前醫藥研究的熱點。目前的降(調)血脂藥物，主要有非諾貝特為代表的苯氧乙酸類、辛伐他汀為代表的他汀類合成藥，也有月見草和特制紅曲(血脂康)等中藥復方制劑。而中國藥典則收載了血脂寧等含有何首烏的降血脂中藥成方。何首烏(蓼科蓼屬植物Polygonummultiflorum Thunb.的塊根)具有較為肯定的降血脂作用，所含的四羥基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷達1％以上；另外還含有蒽醌類物質如大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等。前人已證實了二苯乙烯苷類物質在脂質代謝方面的作用。包括虎杖根中的二苯乙烯類成分白藜蘆醇(resveratrol)與云杉新苷(piceid)能夠抑制鼠肝中的甘油三脂和膽固醇的沉積與合成。何首烏的主要成分就是2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，現有技術中有用乙醇提取何首烏，醇提物用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯提取部分，以干柱層析法初步分離，洗脫劑為乙酸乙酯-甲醇(8∶2)，再用減壓層析法精制，得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，工藝較為昂貴，不利于安全的批量生產。現有技術中尚未見有對該成分單體進行的與治療高脂血癥有關的藥理實驗和臨床應用公開報道。
發明內容
本發明的目的旨在克服現有技術的不足而提供一種成本低廉、工藝簡捷、生產更安全，并可作為活性單體醫治高脂血癥的降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。
本發明的目的是這樣實現的一種降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，它從何首烏水煎劑提取后經分離純化得到，具有抑制血清總膽固醇升高、降低血清低密度脂蛋白膽固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性單體制成藥物劑型。
——所述的何首烏水煎劑是指將何首烏切片水煎煮不少于3次后，過濾、合并濾液，濃縮后加乙醇量達50-70％，放置過夜后再過濾，沉淀再加60-80％乙醇于熱水浴中加熱洗滌，過濾后，濾液與前濾液合并，減壓蒸除乙醇，加氯仿或二氯甲烷萃取1-3次除去脂溶性成份后的水層。
——所述的分離是指將上述水層用正丁醇萃取后，合并正丁醇層，減壓蒸干后得的浸膏或將上述水層蒸除氯仿，加水稀釋、過濾、濾液過大孔吸附樹脂后，先后用水、含10-80％的乙醇水溶液淋洗后減壓蒸干后的浸膏。
——所述的純化是指將浸膏用適量的乙醇-水溶解，分散到4-8倍量的硅膠，室溫干燥后，進行常壓硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(95∶5-70∶30)系統進行梯度洗脫，收集相關洗脫液，減壓回收溶劑后，重復柱層析1-2次后再以乙醇-水重結晶。
——所述的藥物劑型包括片劑、針劑、膠囊、口服液和顆粒劑。
本發明用獨特的方法進行提取和分離純化，依據是該有效成分具有良好的水溶性，適合用熱水提取。以水代醇降低了成本和提高了生產的安全性，另一明顯的優點是減少了何首烏藥材中蒽醌類脂溶性成分的溶出，利于目標成分的純化。
本發明的突出進步和顯著特征在于利用資源充足的常用中藥何首烏，制造具有良好降血脂作用的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷單體，用來作為降血脂藥物或保健食品的活性成分。
具體實施例方式
下面以實施例介紹本發明所述2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的獲得方法，特別是該化合物所表現出的良好降血脂藥理活性。所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和運用的技術手段。但是，實施例的介紹不得理解為任何意義上的對本發明權利要求的限制。
實施例12，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的制備(方法一)取藥材切片，加水煎煮3次(各2h，1h，1h)，過濾，合并濾液，濃縮，加95％乙醇使含醇量60％，放置過夜，過濾。沉淀再加70％乙醇于70℃水浴加熱洗滌，過濾，濾液與前濾液合并，減壓回收乙醇至無乙醇味，加氯仿萃取2次除去脂溶性雜質，取水層，用正丁醇萃取完全(以TLC檢測，展開劑為氯仿-甲醇(80∶20)，10％硫酸乙醇顯色，或254nm紫外光下檢視)，合并正丁醇層，減壓蒸干。得含有二苯乙烯苷為主成分的浸膏。得率3％-7％。
將浸膏用適量的乙醇-水溶解，分散到6倍量的硅膠，室溫干燥，進行常壓硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(80∶20)系統進行梯度洗脫，收集氯仿-甲醇的相關洗脫液，減壓回收溶劑，得二苯乙烯苷粗品。重復柱層析2次，得二苯乙烯苷精品，以乙醇-水重結晶，得白色二苯乙烯苷結晶性粉末，按需要可制成不同的藥物劑型。
TLC檢測無雜質斑點，HPLC測定(面積歸一化法，C18反相柱，5μm，4.6mm×250mm；25％-30％乙腈為流動相，于320nm檢測)含量98.0％-99.6％。其IR、MS、1H NMR、13C NMR數據及TLC行為均與2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品一致。
經測定，該藥品對昆明種小鼠口服的半數致死量LD50為(±)mg/kg，屬于低毒性物質。
實施例22，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的制備(方法二)取藥材切片，加水煎煮3次(各2h，1h，1h)，過濾，合并濾液，濃縮，加95％乙醇使含醇量60％，放置過夜，過濾。沉淀再加70％乙醇于70℃水浴加熱洗滌，過濾，濾液與前濾液合并，減壓回收乙醇至無乙醇味，加氯仿萃取2次除去脂溶性雜質，取水層，蒸除氯仿，加水稀釋，過濾，濾液過已經處理過的D101大孔吸附樹脂，先后用水、含30％乙醇的水溶液淋洗，直至目標成分洗脫完全(以TLC檢測)，合并含有該成分的洗脫液(以30％-50％洗脫液為主)，減壓蒸干。得含有二苯乙烯苷為主成分的浸膏。
將浸膏用適量的乙醇-水溶解，分散到6倍量的硅膠，室溫干燥，進行常壓硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(80∶20)系統進行梯度洗脫，收集氯仿-甲醇的相關洗脫液，減壓回收溶劑，得二苯乙烯苷粗品。重復柱層析2次，得二苯乙烯苷精品，以乙醇-水重結晶，得白色二苯乙烯苷結晶性粉末，按需要可制成不同的藥物劑型。TLC檢測無雜質斑點，HPLC測定含量98.0％-99.6％。
實施例3對高膽固醇血癥實驗動物血清脂質的影響[1]雄性SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、陽性藥物(非諾貝特)對照組，受試藥物(2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)小劑量組、受試藥物(2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)大劑量組(下同)。除正常組外，其余4組給予脂肪乳劑灌胃連續3周。從第2周起各組給予不同處理正常組、模型組給予生理鹽水(2ml/day)灌胃，對照組給予非諾貝特(100mg/kg·day)灌胃，受試藥物小劑量組給予80mg/kg·day灌胃，受試藥物大劑量組給予160mg/kg·day灌胃，連續2周。
測定給藥前后血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。給藥前后各組動物平均血清脂質水平見表1。
表1 高膽固醇血癥動物實驗前后血清脂質變化情況TC TG HDL-C LDL-C組別藥前藥后 藥前 藥后 藥前 藥后 藥前藥后正常組 1.65±0.33130±0.290.38±0.09 0.35±0.05 0.59±0.12 0.48±0.120.89±0.22 0.25±0.08模型組 2.86±0.52△4.45±0.98 0.73±0.42 0.24±0.02 0.61±0.10 0.63±0.091.92±0.34△1.89±0.60陽性藥物2.32±0.22△4.11±0.46 0.62±0.18 0.45±0.17 0.62±0.09 0.58±0.101.42±0.20△1.62±0.43對照組受試藥物2.54±0.44△2.68±0.62*0.53±0.22 0.32±0.09 0.64±0.07 0.57±0.071.65±0.39△0.95±0.46*小劑量組受試藥物2.72±0.37△2.86±0.73*0.55±0.10 0.46±0.21 0.62±0.06 0.57±0.061.84±0.34△1.01±0.38*大劑量組△P＜0.05(與正常組比較)，*P＜0.01(與模型組比較)；下同。
由表1可見，受試藥物兩個劑量組均具有顯著的降低血清總膽固醇和降低低密度脂蛋白膽固醇的作用，兩項指標與給藥前水平相當，與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。但是在此動物模型中對甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇沒有明顯影響。
劉明，董超仁，蘇靜怡。一種簡便實用的大鼠高脂血癥模型。中國藥理學通報，1989；5(2)119-121實施例4受試藥物對高甘油三酯血癥實驗動物血清脂質的影響。
雄性SD大鼠，隨機分為正常組，模型組，對照組，受試藥物大劑量組，受試藥物小劑量組。除正常組外，其余4組給予25％果糖飲水連續3周。從第2周起各組給予不同處理正常組、模型組給予生理鹽水(2ml/day)灌胃，對照組給予非諾貝特(100mg/kg·day)灌胃，受試藥物小劑量組給予80mg/kg·day灌胃，受試藥物大劑量組給予160mg/kg·day灌胃，連續2周。
測定給藥前后血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。給藥前后各組動物平均血清脂質水平見表2。
表2 高甘油三酯血癥動物實驗前后血清脂質變化情況TC TG HDL-C LDL-CGroup藥前 藥后 藥前 藥后 藥前 藥后 藥前 藥后正常組1.65±0.331.30±0.290.38±0.090.35±0.050.59±0.120.48±0.120.89±0.220.25±0.08模型組1.48±0.260.93±0.140.72±0.13△0.72±0.2 0.54±0.080.50±0.080.61±0.230.15±0.02陽性藥物1.58±0.401.65±0.180.74±0.23△0.74±0.280.58±0.090.36±0.090.66±0.250.48±0.11對照組受試藥物1.44±0.280.88±0.280.52±0.200.58±0.170.55±0.090.55±0.090.66±0.160.15±0.02小劑量組受試藥物1.40±0.191.06±0.250.77±0.19△0.78±0.230.55±0.060.50±0.060.50±0.130.16±0.04大劑量組△P＜0.05由表2可見，受試藥物對由于大量攝入果糖所導致的高甘油三酯血癥動物模型的甘油三酯水平無顯著性影響。
實施例5受試藥物對肝脂酶活性的影響取高甘油三酯血癥大鼠肝組織，制備肝組織勻漿，按照肝脂酶(HL)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所產品)說明書進行操作，結果見表3。
表3肝脂酶活性測定Group HL正常組0.166±0.034模型組0.086±0.019△陽性藥物0.110±0.017△對照組受試藥物0.130±0.036*小劑量組受試藥物0.109±0.019△大劑量組△P＜0.05，*P＜0.01。
由表3可見，受試藥物小劑量組動物平均肝脂酶活性顯著高于模型組(P＜0.05)，與正常組相比，已無顯著性差異。
綜上所述，受試藥物2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有良好的調節血脂作用，可以顯著抑制血清總膽固醇升高，降低低密度脂蛋白膽固醇含量，提高肝臟中肝脂酶的活性，達到促進膽固醇和甘油三酯代謝的目的。在試驗的兩種藥物劑量中，可看出80mg/kg劑量對大鼠的降血脂效果更明顯。因此，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作為活性成分，在開發新的調節血脂藥物或保健食品方面極具價值。
權利要求
1.一種降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于它從何首烏水煎劑提取后經分離純化得到，具有抑制血清總膽固醇升高、降低血清低密度脂蛋白膽固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性單體制成藥物劑型。
2.根據權利要求1所述的降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于何首烏水煎劑是指將何首烏切片水煎煮不少于3次后，過濾、合并濾液，濃縮后加乙醇量達50-70％，放置過夜后再過濾，沉淀再加60-80％7醇于熱水浴中加熱洗滌，過濾后，濾液與前濾液合并，減壓蒸除乙醇，加氯仿或二氯甲烷萃取1-3次除去脂溶性成份后的水層。
3.根據權利要求1所述的降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于分離是指將上述水層用正丁醇萃取后，合并正丁醇層，減壓蒸干后得的浸膏或將上述水層蒸除氯仿，加水稀釋、過濾、濾液過大孔吸附樹脂后，先后用水、含10-80％的乙醇水溶液淋洗后減壓蒸干后的浸膏。
4.根據權利要求1所述的降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于純化是指將浸膏用適量的乙醇—水溶解，分散到4-8倍量的硅膠，室溫干燥后，進行常壓硅膠柱層析，以氯仿—甲醇(95∶5-70∶30)系統進行梯度洗脫，收集相關的洗脫液，減壓回收溶劑后，重復柱層析1-2次后再以乙醇—水重結晶。
5.根據權利要求1所述的降血脂藥用2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其特征在于藥物劑型包括片劑、針劑、膠囊、口服液和顆粒劑。
全文摘要
本發明涉及一種降血脂藥用2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷，其特征在于它從何首烏水煎劑提取后經分離純化得到，具有抑制血清總膽固醇升高、降低血清低密度脂蛋白膽固醇和提高肝脂酶活性的功用，可以此活性單體制成藥物劑型；本發明用獨特的方法進行提取和分離純化，依據是該有效成分具有良好的水溶性，適合用熱水提取，以水代醇降低了成本和提高了生產的安全性，另一明顯的優點是減少了何首烏藥材中蒽醌類脂溶性成分的溶出，利于目標成分的純化。
文檔編號A61P3/00GK1539844SQ200310111890
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月24日 優先權日2003年10月24日
發明者胡英杰, 符林春, 高瑄, 盧元嬡 申請人:廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所