專利名稱：抗原蟲疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及原蟲病的免疫療法。更具體地，本發明涉及次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine guanine xanthinephosphoribosyl transferase)蛋白或其肽片段作為有效抵抗原蟲病的疫苗中的免疫原的用途，原蟲病如瘧疾和巴貝蟲病(babesiosis)。本發明的令人驚奇之處在于用次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶蛋白或其肽片段免疫接種，誘導了對血液階段瘧疾的T細胞免疫。因此，本發明提供可廣泛地應用于原蟲病包括瘧疾的蛋白的和DNA的瘧疾疫苗以及產生T細胞介導的免疫應答的預防和治療性免疫接種的方法。
背景技術：
通常，原蟲病嚴重地影響人類和動物的健康和生存，特別是家畜和寵物。病原體包括那些在人類中導致瘧疾的(瘧原蟲(Plasmodium spp.))，感染家畜的牛巴貝蟲(Babesis bovis)、二聯巴貝蟲(Babesia bigemina)和分歧巴貝蟲(Babesia divergens)，感染狗的犬巴貝蟲(Babesia canis)，感染人的果氏巴貝蟲(Babesia microti)和分歧巴貝蟲(Babesia divergens)。由其他原生動物引起的主要疾病包括，如人和動物、特別是家畜中的錐蟲病(岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)、剛果錐蟲(T.congolense)、克氏錐蟲(T.cruzi)及其他種類)，各種利什曼病(杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、熱帶利什曼原蟲(L.tropica)、巴西利什曼原蟲(L.brasiliensis)、墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana))，賈第鞭毛蟲病(蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia))，弓形體病(鼠弓形體(Toxoplasma gondii))。此外，雞中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)導致的動物產品的球蟲病造成嚴重的經濟影響。
瘧疾是人類發病率和死亡率的主要引因，特別是在不發達國家中。瘧疾威脅全世界40-50億人，每年導致超過200萬人死亡(Murray et al.，1995，Manual of Clinical Microbiology(6th ed.)ASM Press，Washington D.C.)。
瘧疾是由瘧原蟲屬的原生動物寄生引起。感染人的有四種，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)和卵形瘧原蟲(P.ovale)。瘧原蟲具有復雜的生活周期，其包括在脊椎動物宿主的紅細胞中發生無性繁殖的血液階段。
自由寄生蟲(裂殖子)識別、附著和侵入紅細胞。一旦侵入，寄生蟲復制、形成裂殖體，新形成的裂殖子從被感染的紅細胞中釋放到血漿，裂殖子在血漿中感染其他紅細胞。
對藥物和殺蟲劑的抗性不斷增加，日益成為已有的預防或治療方法，包括應用于人以殺死寄生蟲的藥物和用于殺死蚊子載體的殺蟲劑，難以解決的問題。
瘧疾疫苗是對于現有的地方性瘧疾控制項目的一個重要補充，對于短期暴露于瘧疾的旅行者也是重要的。
開發瘧疾疫苗的嘗試已經集中于確定起始適當的宿主免疫應答的合適瘧原蟲蛋白。但是，瘧原蟲的復雜生活周期使得這種蛋白的確定成為一項艱巨的任務。
雖然有很好的證據表明，過繼免疫系統的不同效應子成分可介導對血液階段的瘧原蟲的免疫(Freeman & Parish，1981；Grun & Weidanz，1983；Brake et al，1988；Seixas & Langhorne，1999)，但主要成分的目標抗原、效應子CD4+T細胞還未被確定。至今，僅抗體的目標抗原被確定，這些目標是在克隆中具有變化能力的變體，或者是表明具有等位基因多態性(Good，2001)。
發明概述本發明廣泛地涉及次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白和/或其免疫原性片段作為能夠引起對原生動物的免疫應答的免疫原的用途。
優選地，HGXPRT蛋白、其免疫原性片段或其編碼核酸分離自瘧原蟲屬或巴倍蟲屬。
第一個方面，本發明提供一種包含次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白的至少一種免疫原性片段的分離的蛋白質，其中所述分離的蛋白質不是全長的HGXPRT。
在一個具體的實施方案中，所述分離的蛋白質包含選自SEQ IDNO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ IDNO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；或SEQID NO24的一種氨基酸序列。
優選的氨基酸序列示于SEQ ID NO6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24中。
更加優選的氨基酸序列示于SEQ ID NO17和21中。
在另一個具體的實施方案中，本發明提供一種包含多個HGXPRT蛋白的免疫原性片段的分離的蛋白質。
本發明的這個方面還包括前述的HGXPRT片段和分離的蛋白質的變體和衍生物。
第二個方面，本發明提供編碼第一方面的分離的蛋白質的分離的核酸。
在一個具體的實施方案中，分離的核酸包含序列選自SEQ ID NO25；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ IDNO30；SEQ ID NO31；SEQ ID NO32；SEQ ID NO33；SEQ ID NO34；SEQ ID NO35；SEQ ID NO36；SEQ ID NO37；SEQ ID NO38；SEQNO39；SEQ ID NO40；SEQ ID NO41；SEQ ID NO42；SEQ ID NO43；SEQ ID NO44；SEQ NO45；SEQ ID NO46；SEQ ID NO47；或SEQ IDNO48的一種核苷酸序列。
第三方面，本發明提供一種免疫治療組合物，其包含分離的次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白，或至少一種其免疫原性片段和免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
第四方面，本發明提供一種免疫治療組合物，其包含編碼次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白或至少一種其免疫原性片段的分離的核酸，和免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
優選地，免疫治療組合物是疫苗。
優選地，HGXPRT蛋白，其免疫原性片段或編碼核酸分離自或來自致病的原生動物。
優選地，HGXPRT蛋白，其免疫原性片段或各個免疫原性片段或編碼核酸分離自瘧原蟲屬或巴倍蟲屬。
在一個實施方案中，所述免疫治療組合物還包括一或多種來自除HGXPRT以外的一或多種蛋白質的B淋巴細胞表位，或其編碼核酸。
第五個方面，本發明提供識別HGXPRT蛋白表位的分離的淋巴細胞。
優選地，淋巴細胞是T淋巴細胞。
更加優選地，T淋巴細胞是CD4+T淋巴細胞。
優選地，T淋巴細胞是產生一或多種細胞因子的CD4+T淋巴細胞，所述細胞因子包括但不限于白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。
第六個方面，本發明提供一種用HGXPRT蛋白或至少一種其免疫原性片段免疫的非人類的動物。
優選地，非人類動物是小鼠、奶牛、狗或雞。
第七個方面，本發明提供一種抗原蟲病的免疫方法，所述方法包括將HGXPRT蛋白或至少一種其免疫原性片段施用給動物的步驟。
第八個方面，本發明提供一種抗原蟲病的免疫方法，所述方法包括將編碼HGXPRT蛋白或其免疫原性片段的分離的核酸施用給動物的步驟。
第九個方面，本發明提供一種結合HGXPRT蛋白的免疫原性片段的抗體。
優選地，抗體結合包含示于SEQ ID NO1-24中任何一種氨基酸序列的肽。
從前述可以了解，本發明涉及采用HGXPRT蛋白作為免疫原來治療多種原蟲病的免疫療法，原蟲病包括但不限于人的瘧疾(Plasmodiumspp.)，感染家畜的牛巴貝蟲、二聯巴貝蟲和分歧巴貝蟲，感染狗的犬巴貝蟲，感染人的果氏巴貝蟲和分歧巴貝蟲，人和動物特別是家畜的錐蟲病(岡比亞錐蟲、剛果錐蟲、克氏錐蟲等)，各種利什曼病(杜氏利什曼原蟲、熱帶利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲)，賈弟蟲病(蘭伯賈第蟲)，弓形體病(鼠弓形體)和雞的球蟲病(柔嫩艾美耳球蟲)和邊蟲病。
在本說明書中，除非另外指出，“包含”(comprise、comprises、comprising)作為開放式使用，而不是作為封閉式使用，使得指明的組分或組分組可以包括一或多種未指出的組分或組分組。


圖1A T細胞系的特異性。T細胞系對不同抗原的增殖反應。結果為三個孔的ΔCPM平均數±SD。F-、J-、pRBC-、E-和卵清蛋白特異性T細胞系的背景CPM分別是2630±151、560±83、2573±325、3330±403和274±46。
圖1B 寄生蟲特異性和卵清蛋白T細胞系的免疫分型和細胞因子特征。對于各種細胞系來說，細胞比例是來自兩個24孔平板的細胞的代表性結果。
圖2 SCID小鼠(5只/組)的寄生蟲血癥的水平。給小鼠輸入5×106的抗原特異性T細胞。一天后，在用105pRBC靜脈注射攻擊感染之前，對小鼠進行兩個感染-治療的循環。
圖3 將F集合(pool)的蛋白級份純化為單條帶的蛋白質。用考馬斯蘭染色制備SDS-PAGE梯度凝膠(6-18％)來顯示被切取用于分析的單條帶蛋白質。蛋白質標記的相對分子量被顯示在左邊。箭頭指示雙條帶16的位置。
圖4A 用于分析單條帶蛋白質的SCID小鼠的寄生蟲血癥的水平。給小鼠過繼輸入用單條帶特異性T細胞(5×106/小鼠)，這些T細胞已經用F級份抗原進行一次體外刺激一靜止培養循環。轉化后24h，在用寄生蟲化的紅細胞(105pRBC/只)靜脈攻擊感染之前，對小鼠進行兩個感染-治療的循環來體內擴增T細胞。
圖4B 用于分析單條帶蛋白質的SCID小鼠的寄生蟲血癥水平。在進行兩個感染-治療的循環前，給小鼠輸入F級份特異性T細胞(106/小鼠)，然后用CFA/IFA中的單條帶蛋白質免疫(總共5μg/只小鼠)。
圖5A 保護性約氏瘧原蟲(P.yoelii)17XNL條帶16(P1)-標記的淋巴結細胞對活性形式的重組惡性瘧原蟲HGXPRT(PfX抗原)的增殖反應。小鼠用保護性SDS-PAGE凝膠提取的條帶16(P1)免疫。10天后，收集淋巴結細胞，用緊鄰P1的正下方的條帶(P2)(圖3)和PfX刺激。不相關的100kDa寄生蟲蛋白(A)被用于檢測特異性。完整約氏瘧原蟲寄生蟲抗原(pRBC)、PPD和con-A用作為對照。結果為三個孔的CPM平均數±SD。背景CPM為2551±396。
圖5B 用惡性瘧原蟲HGXPRT(PfHGXPRT)免疫的BALB/c小鼠中的寄生蟲血癥水平。包括用卵清蛋白和PBS免疫的小鼠作為對照。
圖6 來自瘧原蟲屬、人和小鼠的HGXPRT序列以及肽CS17和CS21的比較。暗灰色陰影表示相同；淺色陰影表示保守取代。預測的CS17和CS21的免疫原性氨基酸用粗體表示。
圖7 (A)(來自惡性瘧原蟲株FCR3和惡性瘧原蟲株3D7)HGXPRT的肽序列(稱為CS-1到CS-24)和(B)編碼肽CS-1到CS-24的核苷酸序列。稱作CS-1到CS-24的肽分別對應于SEQ ID NO1-24。編碼CS-1到CS-24的核苷酸序列分別對應SEQ ID NO25-48。
圖8 從用重組PfHGXPRT(rPfHGXPRT)免疫的BALB/c小鼠獲得的淋巴結細胞的增殖反應。結果為三個孔的平均數。用衍生自PfHGXPRT的肽(稱作為CS-1到CS-24)或者全長的重組HGXPRT分子(rPfHGXPRT)體外刺激淋巴結T細胞。T細胞還用感染了各種瘧原蟲株的人和小鼠紅細胞來刺激。用純化的蛋白質衍生物(PPD)、正常的小鼠紅細胞(NMRBC)和正常的人紅細胞(NHRBC)刺激的T細胞作為對照。
關鍵詞rPfHGXPRT；重組惡性瘧原蟲HGXPRT；Pf-pRBC(3d7)；用惡性瘧原蟲，3d7株感染的人紅細胞；Pb-pRBC；用柏格氏鼠瘧原蟲(P.berghei)，ANKA株感染的小鼠紅細胞；P.ch AS-pRBC；用P.chabaudi，AS株感染的小鼠紅細胞；Py 17XNL-pRBC；用約氏瘧原蟲，17XNL株感染的小鼠紅細胞；Py YM-pRBC；用約氏瘧原蟲，YM株感染的小鼠紅細胞；Pv-pRBC；用P.vinckei感染的小鼠紅細胞。
圖9 來自用A.集合的(pooled)肽CS 1-8；B.集合的肽CS 9-16或C.集合的肽CS 17-24免疫的B10.BR小鼠的淋巴結細胞的增殖反應。用PfHGXPRT、PPD、ConA(作為對照)，或者如指定的各種濃度(30、10和3ug/ml)的各種肽體外刺激淋巴結細胞。
圖10 當用感染了不同瘧原蟲株的紅細胞體外刺激時，來自用A.集合的肽CS 1-8；B.集合的肽CS 9-16或C.集合的肽CS 17-24免疫的B10.BR小鼠的淋巴結細胞的增殖反應。參見圖3中關鍵詞。
圖11 rPfHGXPRT肽特異性免疫應答來防止B10.BR小鼠感染柏格氏鼠瘧原蟲ANKA的能力。B10.BR小鼠用肽16、17、21，集合的肽16、17和21或者磷酸緩沖液生理鹽水(PBS；對照)免疫，然后用柏格氏鼠瘧原蟲ANKA攻擊。
圖12 來自用A.集合的肽CS1-8；B.集合的肽CS9-16或集合的肽CS 17-24免疫的BALB/c小鼠的淋巴結細胞的增殖反應。用PPD、ConA(作為對照)或不同濃度(30、10和3ug/ml)的用于免疫小鼠的肽的集合的各種肽體外刺激淋巴結細胞。
圖13 當以用不同株的瘧原蟲感染的紅細胞體外刺激時，來自用A.集合的肽CS1-8；B.集合的肽CS9-16或集合的肽CS 17-24免疫的BALB/c小鼠的淋巴結細胞的增殖反應。
圖14 rPfHGXPRT肽對防止BALB/c小鼠被約氏瘧原蟲17XNL感染的特異性免疫應答的能力。BALB/c小鼠用肽1、17、21，肽9、10和11的集合，肽1、9、10、11、17和21的集合，或者PBS免疫，然后用約氏瘧原蟲17XNL攻擊。
圖15 rPfHGXPRT肽對防止BALB/c小鼠受柏格氏鼠瘧原蟲ANKA感染的特異性免疫應答的能力。BALB/c小鼠用肽1、17、21，肽9、10和11的集合，肽1、9、10、11、17和21的集合，或者PBS(對照)免疫，然后用柏格氏鼠瘧原蟲ANKA攻擊。
具體實施例方式
本發明產生自將分離自瘧疾寄生蟲的HGXPRT施用給小鼠時誘導免疫應答的意外發現。更加驚奇的是，免疫應答介導的保護作用主要是由T細胞引起，并可能涉及“Th1”細胞因子如白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的生成。而且，根據被免疫的小鼠抵抗隨后的瘧疾寄生蟲的攻擊的能力，斷定這種免疫應答具有保護性。本發明還提供確定的產生自瘧疾HGXPRT的免疫原性肽，可以用于誘導保護性免疫應答。因此，本發明可合乎邏輯地擴展到抗多種寄生蟲病的動物免疫接種。特別地，本發明提供用免疫原免疫人類來抵抗瘧疾，這種免疫原是人類保護性T細胞介導的免疫的主要的、有效的誘導劑。
HGXPRT的免疫原性片段一個方面，本發明提供分離的原生動物HGXPRT的免疫原性片段和包含一或多種該免疫原性片段的分離的蛋白質。
為了實現本發明的目的，“分離的”是指物質從其天然狀態中被取出的或經過人為處理的。被分離的材料可能基本上或實質上不含有通常在自然狀態下與其相伴的成分，或者被處理以和通常在自然狀態下與其相伴的成分一起處于人工狀態。分離的物質可以是天然的或重組形式。
“蛋白質”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸，D型或L型氨基酸，這在本領域是熟知的。氨基酸范圍內還包括本領域熟知的化學修飾的或衍生的氨基酸。
“肽”是具有少于50個氨基酸的蛋白質。
“多肽”是具有50個或更多氨基酸的蛋白質。
分離自瘧原蟲的HGXPRT蛋白質在本領域是已知的，對技術人員來說容易獲得。來自瘧原蟲屬、小鼠和人的HGXPRT蛋白質序列示于圖6。
次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)常見于哺乳動物、原生動物和細菌中。例如，對可以得到的數據庫進行BLAST序列檢索，表明在碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、杜氏利什曼原蟲、克氏錐蟲、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、鼠弓形體和柔嫩艾美耳球蟲中可以檢測到HGXPRT。例如，鼠弓形體中的酶與惡性瘧原蟲的酶具有51％序列相同性(sequence identity)和70％的氨基酸相似性(similarity)，而柔嫩艾美耳球蟲的部分氨基酸序列與惡性瘧原蟲的酶具有44％序列相同性和65％序列相似性。
還應當指出，黃嘌呤是瘧原蟲、弓形蟲和毛滴蟲的HGPRT酶的額外底物，因此，有時它們的酶簡稱為HGXPRT。這表示底物特異性的差異較小，與對抗原的免疫應答無關。
為了說明的目的，所有次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶都簡稱為HGXPRT。
在本發明的上下文中，HGXPRT蛋白質的“免疫原性片段”是存在于HGXPRT蛋白質中的任何氨基酸序列(而不是完整的HGXPRT氨基酸序列)，當被施用給動物特別是人時，能夠引起免疫應答。
“表位”是指能夠被至少一個T細胞或B細胞克隆型(clonotype)體內或體外識別的連續或不連續的氨基酸序列。
本發明的分離的蛋白質可能包括至少一個本文描述的免疫原性片段，任選地，和其他氨基酸殘基。
根據前述的教導，可以理解本發明包括分離的蛋白質，其包括多個本文描述的免疫原性片段，任選地，和其他氨基酸殘基。
示于SEQ ID NO1-24的分離的蛋白質的例子包括至少一個來源于或存在于瘧原蟲HGXPRT蛋白質中的氨基酸序列，在特別的實施方案中，還有其他氨基酸殘基。一般通過與哺乳動物如小鼠和人中的HGXPRT蛋白質不同源的最小區域來選擇至少一個氨基酸序列。這些最小的非同源區可能是保護性T細胞的優選靶點。
本發明特別有效的分離的蛋白質列舉在SEQ ID NO6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24中。
本發明更加有效的分離的蛋白質列舉在SEQ ID NO17和21中。
如圖6所示，免疫原性肽CS17(SEQ ID NO17)和CS21(SEQ ID NO21)與人和小鼠蛋白質的高度同源區形成一致的比對，是一個令人驚奇的結果。原本預期的結果是，這些免疫原性片段可能與非同源區形成一致的比對。
預測的CS17和CS20的免疫原性氨基酸顯示在圖6中，不過這不應該被視為說明了這些氨基酸是免疫原性殘基，或者在CS17和CS20中沒有其他免疫原性殘基。
確定存在于HGXPRT的其他T細胞表位，可以由技術人員根據本文提供的充分公開來實現。對此，可以參考Tian et al，1998，其中提供一個表位作圖方法的例子，可以被用于描繪HGXPRT的T細胞表位。
本發明還包括仍然保持免疫原性的變體和/或衍生物或其他被修飾的HGXPRT蛋白質和免疫原性片段。實際上，可以預期，SEQ ID NO1-24不是完全來自相應的HGXPRT序列，而是包括其他氨基酸，因此，對于相應的HGXPRT序列來說是“變體”。
一般地，可以引入保守氨基酸取代或者實質上保持免疫原性的HGXPRT蛋白質。可選擇地，可以引入非保守氨基酸取代，按期望地改變免疫原性。
還可以預期，T細胞的計算機輔助分析可以被用于構建HGXPRT免疫原性片段或肽的變體，采用的方法如在Dressel et al，1997或Michielinet al，2000中被描述，雖然不限于此。
根據前述，在特定實施方案中，本發明的免疫原性蛋白質的變體可能包括與SEQ ID NO1-24任何之一具有至少70％，優選至少80％，或更加優選至少90％和有利地至少95％序列相同性的氨基酸序列。
序列相同性可以在“比較窗”中確定，比較窗具有至少6個氨基酸、優選至少12個氨基酸、更優選至少20個氨基酸和有利地在基本上完整的全長參比氨基酸序列上確定。
還可以預期，HGXPRT蛋白質及其片段可以化學交聯到載體蛋白質(如BSA或甲狀腺球蛋白)。對特定氨基酸的其他類型的化學修飾在本領域是熟知的，技術人員參考CURRENT PROTOCOLS IN PROTEINSCIENCE Eds.Coligan et al.John Wiley & Sons NY USA(1995-2001)第15章來獲得更加詳細的與蛋白質的化學修飾相關的方法學。
還可以預期，按照本發明的免疫治療組合物，可能還包括來自HGXPRT外的一或多種原生動物抗原的一或多種B細胞表位。例子包括MSP1或頂膜抗原1(Apical membrane Antigen 1)的羧基末端作為B細胞表位，但不限于此。
應當理解，優選的免疫應答是保護性T細胞介導的抗人的瘧疾的應答。
HGXPRT蛋白、由此衍生的免疫原性肽和其他蛋白質或疫苗的肽成分(如B細胞表位)可以通過重組DNA技術或通過本領域熟知的固相或液相化學合成來制備。
重組蛋白質表達在本領域是熟知的，表達系統可以從細菌(如大腸桿菌DH5α)、昆蟲(如Sf9)和酵母細胞中獲得。
至于例子，技術人員可以分別參考CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John Wiley & Sons NY USA(1995-2001)的第15和18章來獲得分別用于重組蛋白表達和化學合成的技術。
可選擇地，用蛋白酶如endoLys-C，endoArg-C，endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化HGXPRT蛋白質來制備肽。消化的片段通過例如高效液相層析(HPLC)技術來純化。
為了表達重組HGXPRT蛋白，增加融合配偶體來輔助純化。作為例子，融合配偶體包括聚組氨酸標記、麥芽糖結合蛋白(MBP)、蛋白質A和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)。還可以預期，蛋白質裂解位點(如因子Xa和凝血酶位點)可能存在于HGXPRT蛋白和融合配偶體之間，以便后來去除融合配偶體。
HGXPRT核酸和核酸疫苗在一種形式中，本發明提供編碼原生動物HGXPRT，優選瘧疾HGXPRT的一或多種免疫原性片段的分離的核酸。
瘧原蟲HGXPRT核酸序列在本領域是熟知的，而且可以參考NCBIEntrez登錄號M88110(惡性瘧原蟲)和AB021413(柏格氏鼠瘧原蟲)。
編碼SEQ ID NO1-24的肽的優選核酸序列分別示于SEQ IDNO25-48和圖7B中。
本發明還提供免疫治療性組合物，其包括編碼HGXPRT或其一或多種免疫原性片段的核酸，優選是DNA疫苗形式。
所述核酸還編碼來自除HGXPRT以外的一或多種瘧疾抗原的一或多種B細胞表位。
因此，包括多表位構建體的DNA疫苗也被包括在本發明中，采用方法如Boyle et al，1998或Hanke et al，1999中所描述。
本文所用的術語“核酸”是指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA和DNA-RNA雜合體。
“多核苷酸”是具有80或更多連續核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”是具有少于80個的連續核苷酸。
“探針”是單鏈的或雙鏈的寡核苷酸或多核苷酸，適當地被標記用于在例如Northern或Southern印跡中檢測互補序列。
“引物”通常是單鏈的寡核苷酸，優選具有15-50個連續核苷酸，其能夠退火結合核酸“模板”，并通過DNA聚合酶如Taq聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶或SequenaseTm的作用以模板依賴的方式延伸。
本發明還包括在本發明的核酸中使用被修飾的嘌呤(例如，次黃嘌呤核苷、甲基次黃嘌呤核苷和甲基腺苷)和被修飾的嘧啶(硫尿嘧啶和甲基胞嘧啶)。
本發明還包括HGXPRT的編碼核酸，通過利用密碼子序列冗余來修飾。在特別實施例中，改進密碼子選擇來優化核酸在特定生物體或細胞類型中的表達。在這一點上，已經證明在DNA疫苗中，密碼子優化可能增強被表達的瘧疾抗原的免疫原性(Narum et al，2001)。
本發明還包括修飾的核酸，其編碼各種上文定義的HGXPRT的免疫原性片段。
被修飾的核酸例如與SEQ ID NO25-48任何之一具有至少60％、優選至少70％、更加優選至少80％和有利地至少90％核苷酸序列相同性。
序列相同性可以通過“比較窗”測定，其具有至少12個核苷酸、優選至少20個核苷酸、更加優選至少50個核苷酸和有利地在基本上完整的全長參比核苷酸序列上測定。
對于核酸疫苗可以采用表達構建體，其包含在表達載體中可操作地連接到一個或多個調控序列上的分離HGXPRT編碼核酸。
存在于表達載體中的調控核苷酸序列(如增強子、啟動子、剪接供體/受體信號、終止子和聚腺苷酸序列)在本領域是熟知的，便于嵌合受體的表達。無論是對于選擇轉化的細菌(例如bla、kanR和tetR)還是轉化的哺乳動物細胞(如潮霉素、G418和嘌呤霉素)選擇性標記也是有用的。
組成型和誘導型的啟動子可以用于表達本發明的嵌合受體。誘導型啟動子的例子是本領域已知的金屬硫蛋白誘導的或四環素抑制系統。
還包括組織特異性啟動子，其便于標記DNA疫苗的表達，從而增強編碼的免疫原的加工和呈遞。
技術人員將可以預期，DNA接種將成為日益被使用的抗瘧疾的接種模式。充分討論所用的表達載體和檢測的瘧疾抗原不在本說明書的范圍內。但是，技術人員可以參考Kumar et al，2002和Doolan & Hoffman，2001來獲得抗瘧疾DNA疫苗總體現狀。
免疫治療組合物和疫苗本發明提供免疫治療性組合物，優選疫苗，其中的免疫原性成分是分離的HGXPRT蛋白或其一或多種片段。
“免疫治療性組合物”是指能夠對組合物的一或多種免疫原性成分或者對獲得所述一或多種免疫原性成分的生物體產生免疫應答的組合物。
本文所用“疫苗”是產生保護性的免疫應答的免疫治療性組合物。
可以預期，免疫治療性組合物和疫苗可被治療性地用于處理瘧疾或可以預防性地用于防止或降低原生動物感染的嚴重程度。
本發明的治療性組合物包括HGXPRT蛋白、肽，而核酸治療方法可以任意多種形式和施用路徑來施用。
可以預期，免疫治療性組合物，如本發明的疫苗，包括免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其有時可以是一種佐劑。但是，還可以預期，免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑可以是一種物質，如水、生理鹽水、酒精、有機聚合體或其他免疫學上惰性載體，其僅僅通過適當懸浮的和/或穩定的疫苗成分來輔助呈遞疫苗。
在本領域可以理解，“佐劑”是指由一或多種增強疫苗組合物的免疫原性和效率的物質組成的組合物。非限定的合適的佐劑例子包括鯊烷和鯊烯(或動物來源的其他油)；阻斷共聚物；去垢劑如Tween-80；QuillA，礦物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；棒狀桿菌來源的佐劑如小棒桿菌(Corynebacterium parvum)；丙酸桿菌屬(Propionibacterium)如瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acne)來源的佐劑；牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(Bacille Calmette-Guerin或BCG)；白細胞介素如白細胞介素2和白細胞介素12；單核因子如白細胞介素1；腫瘤壞死因子；干擾素如干擾素γ；組合物如皂角苷-氫氧化鋁或Quil-A氫氧化鋁；脂質體；ISCOM和ISCOMATRIX佐劑；分支桿菌細胞壁提取物；合成糖肽如胞壁酰二肽或其他衍生物；順式水八角苷；脂質A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或具有磷酸鋁；羧基聚亞甲基如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳劑如Neocryl A640(例如美國專利5,047,238)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒顆粒佐劑如霍亂毒素或它們的混合物。
任何安全的施用路徑可以被用于施用本發明的免疫治療組合物。例如，可以采用口服的、直腸的、胃腸外的、舌下的、口腔的、靜脈的、關節內的、肌肉內的、真皮內的、皮下的、吸入的、眼內的、腹膜內的、腦室內的、經皮的等。肌肉內的和皮下的注射是特別合適如用于施用免疫治療性組合物如蛋白質的和DNA的疫苗。
抗體本發明還提供抗體，其結合HGXPRT的免疫原性片段，例如示于SEQID NO1-24的肽序列或其變體。
本發明的抗體可以是單克隆的或多克隆的。應用于抗體制備、純化和使用的熟知方法可見于如Coligan et al，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(John Wiley & Sons NY，1991-1994)的第2章和Harlow，E.& Lane，D.AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，ColdSpring Harbor Laboratory，1988中。
特別地，制備單克隆抗體可以采用標準方法如在Kohler &Milstein，1975，Nature 256，495的文章中描述的，在此引入作為參考，或者通過其最近的改進，如描述在Coligan et al，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，同上文，通過無限增殖來自生產品種的脾細胞或其它制備抗體的細胞，生產品種已經用一或多種本發明的多肽、片段、變體或衍生物接種。
本發明的范圍內還包括包含上述單克隆或多克隆抗體的Fc或Fab片段的抗體。可選擇地，抗體可以包括抗本發明的BSP蛋白的單鏈Fv抗體(scFvs)。這種scFvs可以按照分別在美國專利5,091,513、歐洲專利239,400或Winter & Milstein，1991，Nature 349 293的文章中描述的方法來制備，在此引入作為參考。
標記可以與本發明的抗體或抗體片段結合，可以選自包括發色團、催化劑、酶、熒光團、化學發光分子、稀土離子如銪(Eu34)、放射性同位素和直接可視標記的組。在為直接可視標記時，采用膠體金屬的或非金屬顆粒、染色顆粒、酶或底物、有機聚合體、乳膠顆粒、脂質體、或其他含有單一的制備物的囊泡等。
大量可用作標記的酶被公開在美國專利說明書US4,366,241、US4,843,000和US4,849,338中，全部在此引入作為參考。用于本發明的酶標包括，如堿性磷酸酶、山葵過氧化物酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。酶標記可被單獨使用或在溶液中與第二種酶結合使用。
熒光團可以是，如異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITL)、別藻藍素(APC)、德克薩斯紅、Cy5、Cy3或R-藻紅素(RPE)，這在本領域是熟知的。
為了更加詳盡地理解本發明，技術人員可以參考如下非限制性的實施例。
實施例實施例1鑒定HXGPRT是約氏瘧原蟲中的免疫原1.材料與方法小鼠4-6周齡的正常BALB/c小鼠、無胸腺BALB/c裸鼠和BALB/c SCID小鼠購自Animal Resources Center(Perth，WA，澳大利亞)，并在無特異性病原體條件(specific-pathogen-free)下飼養在QIMR的動物裝置(animalfacility)中。到了6-8周齡時被用于試驗。
寄生蟲嚙齒類瘧原蟲約氏瘧原蟲17XNL通過腹膜內路徑(i.p)在被感染和未被感染的小鼠之間進行106寄生蟲感染的紅細胞(pRBC)/小鼠的交替傳代來維持。在傳代3或4次后，然后穩定的寄生蟲被冷凍和保存在液氮中。冷凍保存物在用于試驗性攻擊感染前進行三次交替傳代。從心臟穿刺和斷尾獲得的血液中收集寄生蟲，并用于制備寄生蟲抗原和薄層血液涂片來確定寄生蟲血癥。
寄生蟲血癥的確定通過斷尾從被感染的小鼠收集一滴血液，制備載玻片上的薄層血液涂片。風干涂片并用Diff-Quick染色試劑(Lab Aids Pty Ltd，Narrabeen，澳大利亞)染色。總共計數約300-500紅細胞(RBC)來估計寄生蟲血癥百分率；但是計數至少103RBC來確定小于或等于1％的寄生蟲血癥。
制備寄生蟲抗原制備完整寄生蟲抗原(pRBC)當寄生蟲血癥在30-50％之間時，通過心臟穿刺將被感染小鼠的血液收集到抗凝的無菌試管中。然后在溫熱的PBS中洗滌血液，并確定pRBC的濃度。然后PBS中的pRBC立即用于感染小鼠或者通過37℃下在紅細胞溶解緩沖液(0.17M tris-羥甲基氨基甲烷、0.16M氯化銨；pH7.2)中，溫育10min來裂解pRBC。然后寄生蟲至少冷凍-解凍3次，超聲波處理、等分試樣，并在-70℃下保存直到被用于體外細胞培養。
制備可溶性寄生蟲抗原(sAg)當寄生蟲血癥在50-60％之間時，通過心臟穿刺將血液收集到抗凝試管中。然后血液在PBS中洗滌兩次。存在蛋白酶抑制劑時，37℃下在0.01％皂角苷/PBS中溫育血液20min來溶解RBC。然后在pRBC用4℃的冷PBS超聲波處理之前，用皂角苷/PBS緩沖液再洗滌血液一次。
在超聲波處理后，溶解產物在4℃下以100,000xg離心30min。然后收集上清液，在4℃下更換PBS三次來透析。蛋白質濃度通過二喹啉甲酸分析確定，寄生蟲抗原在-70℃下保存直到使用。
體外生成T細胞系用50ul乳化在完全Freund佐劑(CFA)(Sigma，St.Louis，MO，美國)中的抗原在后腳掌皮下免疫小鼠。7-10天后，在無菌條件下將腹股溝和腿彎部的淋巴結收集到Eagle′s minimal essential medium with Earle′s Salts(EMEM)(Trace，Biosciences，澳大利亞)中。然后如先前描述(Amante &Good，1997)，采用刺激和靜止交替循環來制備細胞系。
淋巴細胞增殖分析靜止期后，取出T細胞懸浮液，與被照射的不含RBC的同基因型脾細胞混合(1∶3)，在96平孔的微量滴定板(Corning Incorporated，Corning)以2×106細胞/ml完全培養液，在含有5％CO2的濕潤培養箱中37℃下培養4天。細胞在僅培養液(陰性對照)、結核菌素純化蛋白質衍生物(PPD)(CSL Ltd，Parkville，VIC，澳大利亞)或伴刀豆球蛋白-A(con-A)作為陽性對照、或各種濃度檢測抗原的三個或四個孔中，來評價在24、48和/或72h時的增殖和/或培養上清液中的細胞因子含量。
通過對用0.25uCi/孔3H-胸苷(Amersham Biotech，UK)培養至少16-18h進行脈沖調制來測定增殖，將各個孔中的內含物收集到玻璃纖維薄氈(glass fiber mat)上，風干后用平板閃爍計數器測定3H-TdR的結合。
過繼轉移和感染治療方案在靜止期收集的活T細胞通過在Ficoll-Hypaque(Pharmacia)中離心來純化。在EMEM中以300xg RT洗滌后，細胞再懸浮在PBS中，200ul含有適當數量細胞通過側面尾靜脈被靜脈注射灌注到各種免疫缺乏的小鼠中。灌注后24h，通過105pRBC/小鼠靜脈注射感染來體內擴增T細胞。兩天后，用乙嘧啶腹膜內處理小鼠3天(劑量0.2mg/0.2ml PBS/小鼠/天)。在攻擊感染(105pRBC/小鼠)之前，重復感染-治療方案循環，然后測定寄生蟲血癥和血清。再感染之前，小鼠有3周的間隔期來完全代謝藥物。
細胞因子ELISA從細胞培養物中收集上清液，立即分析或者等分并冷凍保存在-70℃下直到使用。根據Sander等(1993)的方法，通過酶聯免疫分析測定IL-4和IFN-，分別使用重碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)中的單克隆抗體BVD4-1D11(5ug/ml)和R4-6A2(2ug/ml)(PharMingen，San Diego，USA)在37℃下包被96-U型孔平板2h。然后連續滴定未稀釋的上清液，平板包裹在鋁鉑中，室溫下(RT)在濕潤的培養箱中溫育過夜。
洗滌平板6次，每次順序在0.05％Tween-20/PBS、PBS和水中，輕拍干燥。加入含有生物素酰化BVD6-24G2克隆抗小鼠IL-4(1∶2000)或XMGl.2大鼠抗小鼠IFN(1.0ug/ml)(PharMingen)單克隆抗體的阻斷緩沖液(0.05％Tween-20、1％FCS、0.1％脫脂奶粉溶解在PBS中)，室溫下溫育平板2h。洗滌后，加入鏈霉抗生物素-HRP-偶聯劑(Vector，Burlingame，CA，USA)(1∶1600)來檢測，接著在加入酶底物2，2-azinobis3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)(Sigma)之前，在室溫下再溫育2h。在415nm下讀取吸收值，以1h后490nm的值為參照。重組細胞因子(IL-4和IFN；Sigma)和完全培養液分別作為陽性和陰性對照。超過陰性對照值至少3個SD的定義為陽性上清液。陽性對照被用于建立滴定曲線。
細胞內的細胞因子染色活的靜止T細胞系通過Ficoll Paque(Pharmacia Biotech)離心純化，再懸浮在完全培養液中。然后按照生產商的說明，在存在莫能菌素(monensin)(GolgiStopTM，PharMingen)時，37℃下在含有5％CO2的濕潤培養箱中用40ng/ml乙酸肉寇佛波醇(PMA)(Sigma)和2uM鈣離子載體(Sigma)刺激6h。細胞在FACS緩沖液(0.1％BSA，0.1％疊氮化鈉/PBS)中以300xg，4℃洗滌5min兩次，在黑暗中冰浴上用1∶50 FITC-偶聯的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體(Mab)(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，USA)以2×107細胞/ml FACS緩沖液染色30min。洗滌兩次后，細胞充分地再懸浮，并4℃下在冰冷的4％多聚甲醛中固定30min。洗滌兩次，細胞進一步被固定，并按照生產商的說明，4℃下在cytofix/cytospermTM(PharMingen)中溫育20-30min來滲透。細胞在滲透緩沖液中洗滌兩次，以2×107細胞/ml cytofix/cytospermTM再懸浮，并且約106個細胞分散到FACS管中。細胞在4℃下黑暗中染色30min，分別用1∶50 PE-偶聯的大鼠抗小鼠IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4單克隆Mab(PharMingen)來染色IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4。作為對照，采用未染色的細胞樣本和PE標記的非特異性IgGl和IgG2b Mab(PharMingen)。在滲透緩沖液中洗滌兩次后，細胞再懸浮在200ul FACS緩沖液中，用于直接流動細胞計數評價。
用裝備了CELLQuestTM軟件的FACScalibur流動細胞計數器(BectonDickinson，CA，USA)測定熒光。對于各種細胞因子，計數10,000個細胞，在修正自身熒光和非特異熒光后，確定陽性細胞的比例。
細胞表面表型分析染色細胞來確定表面表達如下分子CD3、CD4、CD8、CD25、CD19、NK1.1、TCR和/或TCR，如先前的描述(Xu等，2000)。
免疫接種和攻擊感染3-5只小鼠的組用乳化在完全Freund佐劑(CFA)(Sigma)中的抗原在后腳掌上皮下注射免疫接種。在4和6周后，用相同含量的乳化在不完全Freund佐劑(IFA)(Sigma)中的抗原腹部皮下和腹腔內注射來加強免疫。與佐劑混合的PBS作為對照抗原。
最后一次免疫的10天后，小鼠用約氏瘧原蟲17XNL寄生蟲感染的RBC進行靜脈注射攻擊。
ELISA血清分析寄生蟲特異性抗體如先前描述進行(Xu等，2000)。
考馬斯染色凝膠中的蛋白質通過在0.5％w/v考馬斯蘭溶液(含有25％v/v甲醇，10％v/v乙酸)中溫育凝膠1h并緩慢地攪動來染色SDS-PAGE分離的蛋白質。然后變換三次脫色液(具有相似成分但是沒有考馬斯蘭染料的溶液)來脫色凝膠過夜。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)Laemmli(1970)描述的標準方法略加改進。凝膠用丙烯酰胺二丙烯酰胺(29∶1)浸泡。蛋白質樣本與樣本緩沖液(200mM Tris，pH6.8；30％v/v甘油，6％w/v SDS，0.2％w/v溴酚蘭)混合(4∶1)，并且裝載前在95℃下溫育5min。當需要還原蛋白質時，往樣本緩沖液中加入p-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。裝載后，凝膠以恒定電壓(60V)電泳約1.5h。然后以Rabilloud等(1988)的方法用考馬斯亮蘭R-250(Sigma)染色或銀染來可視化蛋白質。
制備等電聚焦(IEF)來分級可溶性寄生蟲蛋白質在Multiphor IITM(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)上按照生產商的說明制備寬范圍(WR)和窄范圍(NR)的等電聚焦(IEF)。簡而言之，按照生產商的說明，Zwittergent3-12可溶性材料在寬范圍的等電聚焦(WR-IEF)上分離。也就是，將18ml AmpholineTMpH3.5-10.0(AmershamPharmacis Biotech，Uppsala)和1.35g Zwittergent3-12與MQW混合到最終體積，逐步加入16.0g UltrodexTM粒狀凝膠(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)來充分地膨脹。制備平床凝膠(19cm×24cm×0.5cm深)，IEF在12W和10℃下預聚焦1500Vh。1.36ml Ampholine pH3.5-10.0和約1.0gUltrodexTM粒狀凝膠與19.0ml Zwittergent3-12可溶性物質結合。在低pH端(最終pH范圍～4.0-4.3)將樣本裝載到預聚焦的IEF凝膠上，在12W和10℃下聚焦1200Vh。接著進行電泳，級份用2ml含有0.2％Zwittergent3-12和50μM AEBSF的MQW洗脫2次。記錄各個級份的pH，并用1.0ml的1.0M Tris-HCl pH-7.4的緩沖液調節樣本pH為7.4。在SDS-PAGE上顯示IEF級份的蛋白質成分。
從SDS-PAGE凝膠上被動洗脫蛋白質考馬斯染色的凝膠在水中洗滌30min。將凝膠放置在玻璃平板上，用無菌解剖刀將單條帶切成小立方體，然后將它們放入含有提取緩沖液(100mM乙酸鈉、0.1％SDS、10mM DTT)的試管中，在37℃下溫育過夜。收集上清液，并通過SDS-PAGE分析來確定純度，隨后轉移到PVDF膜上。
PVDF膜電印跡和N末端測序在SDS-PAGE上分離蛋白質并用電泳池Multiphor IITM(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)印跡到PVDF膜上，以225毫安(1毫安/cm2)通過預先浸泡在印跡緩沖液(0.02％w/v SDS、0.3％w/v糖膠、0.15％v/v乙醇胺)的印跡紙1.25h。然后在水中洗滌該紙，接著在甲醇中洗滌，再用考馬斯蘭(0.05％w/v考馬斯蘭、40％v/v甲醇、1％v/v乙酸)染色5min。然后更換三次50％v/v甲醇來脫色PVDF膜5min，接著在水中洗滌兩次。將膜放在37℃培養箱中干燥，切取期望的條帶，通過Edman降解法(Edman and Begg，1967)在N末端的氨基酸測序儀(Procise-HTTM；Applied Biosystems，Fostercity，CA，USA)上測序。
2.結果制備約氏瘧原蟲感染的RBC的可溶性制備物，然后根據電荷(charge)將其分餾成30個級份，分組成12集合(A-L)。然后將這些各種級份乳化在完全Freund佐劑中，被用于免疫小鼠。8天后，取出引流(Draining)淋巴結，接著連續循環抗原刺激和靜止，生成多克隆T細胞系。僅在E、F和J成功地建立細胞系。檢測該細胞系對各個級份、可溶性寄生蟲制備物和寄生蟲感染的RBC的應答能力。被證實抗原特異性(圖1A)和表達CD3、CD4和αβT細胞受體和生成細胞因子(IL2、IFN-γ、TNF-α，但不是IL4)的細胞系統一稱為“Th1”或促炎細胞(圖1B)。然后將細胞系施用給無胸腺的裸BALB/c小鼠，然后用活寄生蟲感染攻擊小鼠。基于這些結果，選擇被證明最有效的抗寄生蟲活性的細胞系用于進一步的分析(級份F細胞系)。但是，應當指出，如同其他細胞系的受體，級份F特異性T細胞的受體在攻擊后死亡(低寄生蟲血癥)。
因此，調整試驗操作來使細胞在最后攻擊前在宿主中成熟更長的時間。有證據表明，對瘧原蟲的天然免疫應答隨時間而變化，這與較少病理學相關(Brown et al，1990；Langhorne et al，1989；Baird，1995)。雖然瘧原蟲特異性T細胞系是否會變化是未知的，但是可能細胞數量會改變，并且其在整個受體宿主內的分布將會變化成更加有效的結構。因此，T細胞被施用給免疫缺乏的BALB/c SCID小鼠(缺乏T細胞和B細胞)，然后小鼠暴露于兩次感染，攻擊后2天用抗瘧疾的化學療法來降低感染，兩次感染之間間隔3周。選用SCID小鼠，使得隨后產生任何保護作用是來自被感染的T細胞。對照小鼠不接受T細胞或接受特異于不相關抗原卵清蛋白(OVA)的T細胞，它們具有相同表型特征(CD4+、Th1)。在兩次感染后，然后小鼠接受不用化學治療消弱的最后攻擊。接受OVA特異性T細胞的SCID小鼠都死于與天然小鼠相似攻擊的時間。但是，五只接受F級份特異性的T細胞的小鼠中有兩只存活，所有的受體被證實在整個感染中具有顯著低的寄生蟲密度(圖2)。有意思的是，接受F-特異性T細胞的小鼠存活的比接受特異于完整寄生蟲的T細胞的小鼠多。
為了確定保護性T細胞系的抗原特異性，級份F以及具有相似pI的鄰近級份通過窄范圍等電聚焦(pH5-7)來分級，隨后根據大小在SDS-PAGE上對蛋白質分級。然后選擇17個單獨的條帶用于進一步研究(圖3)。接著進行兩種方法，在第一種方法中(A)，通過用各個條帶免疫天然小鼠來制備新的T細胞系，然后用級份F體外擴增細胞。然后檢測這些新的T細胞系的體外特異性和體內功效(如上述)。在第二種方法中(B)，特異于級份F的T細胞被施用給SCID小鼠，該小鼠接著用各個條帶免疫。然后用活的感染物來攻擊小鼠。這兩種方法的結果示于圖4中，從中可以看出在兩種方法中，特異于條帶16的T細胞能夠減緩體內寄生蟲的生長，并在方法A和B分別100％和50％地保護受體。
具有相似的分子量的兩個分離條帶(“16”)，然后每個與保護作用相關的條帶被測序，采用N末端氨基酸測序的Edman降解法，得到如下序列MKIPNNPGAGELGYEPVMI(SEQ ID NO49)和MKIPN(SEQ IDNO50)。從瘧原蟲數據庫的檢索中，確定這些序列存在于嘌呤拯救酶、次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)中。重組的惡性瘧疾HGXPRT是可以獲得的(Keough et al，1999)并檢測其激活保護性條帶特異性T細胞的能力。這些結果(圖5A)表明保護性T細胞在體外不對重組蛋白應答。
然后用重組惡性瘧疾HGXPRT免疫正常的BALB/c小鼠，然后活的感染物攻擊。對照小鼠用OVA或PBS免疫，采用相同的佐劑配方和呈遞方案。在攻擊后8天，被免疫的小鼠的平均寄生蟲血癥是3.6％，相比于OVA免疫的小鼠的43.2％(P＜0.0001)和PBS-免疫的小鼠的47.8％(P＜0.001)。五只HGXPRT免疫的小鼠中的兩只能夠完全地抵制感染。ova-免疫的小鼠和PBS免疫的小鼠之間沒有差異(P＝0.545)。
本研究確定嘌呤拯救酶、HGXPRT作為保護性T細胞的靶點抗原。T細胞的功效不同于抗體，通過T細胞適應性地將抗性轉移到SCID小鼠中。用HGXPRT免疫正常小鼠，必然地引起抗HGXPRT的抗體應答，但是由于該酶位于裂殖子膜的內表面(Shahabuddin et al，1992)，難以想象這些抗體能夠對寄生蟲生長產生作用。轉化SCID小鼠的HGXPRT-特異性T細胞和免疫的正常小鼠的HGXPRT在所有受體中控制寄生蟲生長的能力似乎是由于激活的CD4+T細胞介導的作用而產生。確切地說，寄生蟲特異性CD4+T細胞如何控制寄生蟲生長是未知的，但是許多研究已經證明，這種T細胞(具有未知特異性)能夠控制寄生蟲生長(Brake et al，1988；Taylor-Robinson et al，1993；Amante & Good，1997)，并且許多研究表明IFN-γ和TNF-α下游的炎癥介質如一氧化氮(Taylor-Robinson et al，1993；Rockett et al，1991)和可能氧自由基(Clark & Hunt，1983；Wozencraft et al，1984)是重要的。
人中的這些免疫性表現為誘導寄生蟲特異性Th1-型T細胞應答和上調可誘導的一氧化氮合酶，但是完全缺乏任何可測定的抗體應答。在樹枝狀細胞加工抗體后，T細胞可以被寄生蟲抗原激活，但是來自被激活的T細胞的效應分子和巨噬細胞可能在RBC和脾中殺死寄生蟲(Favila-Castillo et al，1996)。因此，細胞激活是特異性的，但是效應子的功能是非特異性的。激活寄生蟲特異性T細胞的副作用可能是免疫病理學的(Hirunpetcharat et al，1999)，這可能解釋了既便在所有小鼠中寄生蟲濃度顯著降低時，并非所有接種的或T細胞灌注的受體都存活的原因。
本發明人已經研究特異于裂殖子表面蛋白片段MSP119的T細胞是否能夠保護小鼠(Tian et al，1998)。盡管事實上MSP119能夠產生高水平的保護作用，結果一致地是否定的。這種保護作用在攻擊時依賴于高抗體滴度。令人好奇的是，非保護性的MSP119特異性T細胞具有與本試驗中研究的HGXPRT特異性保護性T細胞相同的表型特征(CD4+，Th1)。由于T細胞僅識別被加工后的抗原，具有一種特異性的T細胞具有保護作用而具有不同特異性的T細胞不具有保護作用的原因是不清楚的。一種可能的解釋停留在抗原定位。HGXPRT存在于裂殖子的電子密集顆粒中，這些顆粒類似于高等真核細胞的分泌顆粒，HGXPRT還存在于被感染的紅細胞的細胞質中和寄生泡的外部(Shahabuddin et al，1992)。可能抗原沉積在紅細胞的細胞質中，抗原豐度在激活的效應子T細胞中是關鍵因素。
如果保守分子如HGXPRT能夠誘導降低寄生蟲密度的T細胞，那么至于在初次暴露后在小孩不能較快地產生天然免疫的原因也是奇怪的。通常需要5年地方性暴露來產生臨床免疫性(Greenwood et al，1987)。不過，具有這種特異性的T細胞產生一定程度免疫性是可能的。還值得指出的是，已知寄生蟲感染會導致人單核細胞(Toure-Balde et al，1996)的凋亡和甚至嚙齒類系統中體內的寄生蟲特異性CD4+T細胞的凋亡(Hirunpetcharat & Good，1998)。因此，人T細胞對HGXPRT的應答可能被感染抑制，不能自然地產生；但是對于這種人的T細胞應答是一無所知的。本發明人認為T細胞免疫性的這種抑制可能會導致目標抗原被保守，降低免疫壓力來選擇變體或多態性序列(Good，2001)。
HGXPRT是設計寄生蟲疫苗中考慮的新免疫原，是疫苗開發的新途經。HGXPRT抗原單獨地用作免疫原，或者作為一種與其他疫苗分子連接或混合的理想成分，目前所有這些成分被設計來刺激保護性抗體應答。與單一地添加變體抗原來擴展一種免疫應答類型的特異性相反，通過增加其他類型的免疫應答，很可能將極大地提高開發一種成功疫苗的機會。
實施例2繪制HGXPRT的T細胞表位實施例1中數據已經確定瘧原蟲HGXPRT可能在調節預防瘧疾感染中起作用。由于哺乳動物也表達HGXPRT，哺乳動物的HGXPRT與寄生蟲HGXPRT十分同源(圖6)，重要的是確定蛋白質的最小非同源區域，其可能是保護性T細胞的靶點。這些區域可能被用作瘧疾疫苗候選。
至此，橫跨HGXPRT的24種線性重疊肽被設計來定義含有保護性T細胞表位的蛋白質區域(圖7)。各種品系的小鼠用全長的惡性瘧原蟲HGXPRT蛋白(PfHGXPRT)或者來自PfHGXPRT的肽集合免疫，來確定產生增殖的T細胞應答的蛋白質區域。在此之后，這些區域(對應于肽)隨即被用于免疫小鼠來確定相應的T細胞是否能夠保護小鼠免受瘧疾感染。不同的H-2同品系小鼠(近交系小鼠，僅缺乏MHC基因)被用于這些試驗，來確定MHC基因在影響對該蛋白質的免疫應答中的作用。
1.方法淋巴細胞增殖分析小鼠用肽集合(20ug各種肽)或者乳化在完全Freunds佐劑(CFA)中的15ug重組PfHGXPRT蛋白在后腳掌免疫。7到9天后，取出引流的腿彎部和腹股溝的淋巴結。制備細胞并以2×106細胞/ml懸浮在溶液中，并被加到96孔的平板中。37C、5％CO2下用各種濃度抗原或分裂素培養細胞72h。往平板中加入(3H)-胸苷，并在18-24h后通過β-發射光譜測定放射性標記的結合。
肽合成如所述(Houghten，1985)，采用茶葉袋技術通過QIMR肽單位來合成肽。
肽免疫接種和攻擊操作按照如下操作，用PfHGXPRT肽免疫小鼠。20ug的各種肽被乳化在CFA中，并在第0天被皮下輸入。然后在第21天，用不完全Freund佐劑(IFA)中20ug各種肽加強(皮下注射)小鼠，并在第42天和第56天腹膜內加強。然后在第71天，用1×104柏格氏鼠瘧原蟲或約氏瘧原蟲17XNLpRBC攻擊小鼠。在攻擊后的每兩天從尾部采集血液樣本來確定寄生蟲血癥(寄生蟲化的紅細胞，pRBC的數量)。
2.結果如在此所用，方便起見，肽1-24對應于SEQ ID NO1-24。
參照圖6-8，取自用PfHGXPRT免疫的BALB/c小鼠的淋巴結細胞在體外對大量來自PfHGXPRT的肽產生應答。最顯著的增殖反應是對肽6、7、8、9、10、11、12、15、17、18、21、22、23和24的反應。基于這些結果，對應于上述肽的rPfHGXPRT區域可能含有被BALB/c(H-2d)小鼠識別的T細胞表位。還存在對被惡性瘧原蟲和不同嚙齒類瘧原蟲感染(柏格氏鼠瘧原蟲、P.chabaudi AS、約氏瘧原蟲YM、約氏瘧原蟲17XNL和P.vinckei)的紅細胞的反應，表明不同瘧原蟲表達的之間具有一定程度的同源性。
在圖9A中，來自用肽1-8的集合免疫的小鼠的淋巴結細胞顯示對肽3和8的強烈增殖反應。觀察到對肽6和7的低水平增殖。參見圖9B，來自用肽9-16的集合免疫的小鼠的淋巴結細胞顯示對肽12和16的強烈增殖反應。觀察到對集合中的所有其他肽的較低水平增殖。來自用肽17-24的集合免疫的小鼠的淋巴結細胞顯示對肽17和21的強烈增殖反應(圖9C)。觀察到對肽22的較低水平增殖。總之，PfHGXPRT中對應于上述肽的區域含有被B10.BR(H-2k)小鼠識別的T細胞表位。
來自用不同肽集合免疫的小鼠的淋巴結細胞不僅對于用惡性瘧原蟲感染紅細胞(RBC)，而且對不同嚙齒類瘧原蟲感染的RBC具有不同增殖水平(圖10)。這表明不同種類的HGXPRT之間可能具有序列同源性。但是，來自用CS9-16免疫的小鼠的細胞對用約氏瘧原蟲和P.vinckei感染的細胞的反應顯著高于正常小鼠RBC。
用柏格氏鼠瘧原蟲ANKA感染的天然小鼠通常死于稱作腦型瘧疾的疾病綜合癥。用肽16或17免疫的小鼠具有類似于用PBS免疫的小鼠的寄生蟲血癥(或腦型瘧疾)的進程。但是，從圖6中看出，用肽21或肽16、17和21的集合免疫的小鼠免受與柏格氏鼠瘧原蟲感染相關的致死性大腦癥狀。這些數據表明，瘧原蟲酶HGXPRT的區域(肽21和肽16、17和21的組合)已經被確定，其含有能夠在B10.BR小鼠中產生抗柏格氏鼠瘧原蟲ANKA寄生蟲的保護性免疫應答的T細胞表位。
從用收集的肽CS1-8免疫的小鼠獲得的淋巴結細胞具有對肽3、6和7的強烈的增殖反應(圖12A)。觀察到對肽8的低水平增殖反應。從用收集的肽9-16免疫的小鼠獲得的淋巴結細胞具有對肽9、10、11和16的強烈的增殖反應。觀察到對肽13和15的低水平增殖反應(圖12B)。對于12C，從用收集的肽17-24免疫的小鼠獲得的淋巴結細胞具有對肽17、18和24的強烈的增殖反應。總之，對應于具有增殖反應的上述肽的PfHGXPRT區域含有被BALB/c(H-2d)小鼠識別的T細胞表位。
從圖13中可以明顯地看出，從用不同的肽的集合免疫的BALB/c小鼠獲得的淋巴結細胞不僅對用惡性瘧原蟲感染的紅細胞(rbc)，而且對于用不同的嚙齒類的瘧原蟲感染的rbc具有不同增殖水平。這表明在不同種類中，可能存在HGXPRT的序列同源性。
在圖14中，雖然一只來自各組的小鼠受攻擊時死亡，肽1、17或21以治療性方式起作用，給受約氏瘧原蟲17XNL攻擊的小鼠帶來一定程度保護作用。收集的肽9、10和11以及收集的肽1、9、10、11、17和21不能使小鼠免受約氏瘧原蟲17XNL的致死性攻擊。這些數據表明瘧原蟲酶HGXPRT的區域(肽1、17和21)已經被確定含有能夠在BALB/c小鼠中產生抗約氏瘧原蟲17NXL寄生蟲的保護性免疫應答的T細胞表位。
在圖15中，用肽1，收集的肽9、10和11，肽17，收集的肽1、9、10、11、17和21免疫的小鼠免受與柏格氏鼠瘧原蟲ANKA感染的致死性腦部癥狀。這些肽能夠產生抗病的免疫應答。用肽21免疫的小鼠和用PBS免疫的對照小鼠不被保護，受攻擊時死亡。這些數據表明瘧原蟲酶HGXPRT的區域(肽1、17，肽9、10、11的組合以及肽1、9、10、11、17和21的組合)被確定，含有能夠在BALB/c小鼠中產生抗柏格氏鼠瘧原蟲ANKA寄生蟲的保護性免疫應答的T細胞表位。
在進一步試驗中，目的在于研究MHC限制性，BALB/b小鼠(H-2b)對肽1、7、8、10、15、17、18、19、20、21、22、23和24應答；B10小鼠(H-2b)對肽4、5、6、7、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24應答；B10.D2小鼠(H-2d)對肽1、2、3、4、7、8、9、10、11、15、16、17、18、22和24應答；BALB/c小鼠(H-2d)(參見圖12)對肽3、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17、18和24應答；BALB/k小鼠(H-2k)對肽3、4、5、6、7、8、12、15、16、17、21和22應答；和B10.BR小鼠(H-2k)對肽3、6、8、10、11、12、15、16、17、21和22應答。
本發明得出，MHC基因可能影響對一些衍生自HGXPRT的肽的免疫應答。MHC之外的區域也可能起作用。對此還需要進行進一步工作來澄清。
此外，來自用不同肽集合免疫的BALB/k小鼠、B10小鼠、B10.D2小鼠和BALB/b小鼠的淋巴結細胞不僅對受惡性瘧原蟲感染的紅細胞(rbc)，而且對受不同嚙齒類瘧原蟲感染的rbc具有不同增殖水平。這表明在不同種類之間可能具有HGXPRT的序列同源性。
總結用衍生自惡性瘧原蟲的HGXPRT的重疊肽進行試驗，各種品系的近交小鼠已經確定了作為T細胞靶點的HGXPRT的區域。此外，已經證明這些蛋白的小區域(對應于特定的肽)產生能夠控制被檢測的嚙齒類寄生蟲株(約氏瘧原蟲17XNL和柏格氏鼠瘧原蟲ANKA)的生長和與嚙齒類瘧疾感染相關的疾病癥狀的免疫應答。對應于肽CS17和CS21的區域能夠在多種小鼠品系中產生抗不同嚙齒類寄生蟲的免疫應答，是特別有意義的。這些肽被認為是瘧疾疫苗的候選。
在整個說明書中，目的在于描述本發明的優選實施方案，而不是將本發明限制在任何一種實施方案或特定的特征組合。在不脫離本發明的廣闊的精神和范圍的前提下，可以對在此所描述和闡明的實施方案進行各種改變和修正。
在本說明書中參考的所有計算機程序、算法、專利和科技文獻在此全文引入作為參考。
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權利要求
1.一種分離的蛋白質，其包括至少一種次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白的免疫原性片段，其中該分離的蛋白質不是全長的HGXPRT。
2.權利要求1的分離的蛋白質，其包括選自SEQ ID NO1；SEQ IDNO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
3.權利要求1的分離的蛋白質，其包括選自SEQ ID NO6；SEQ IDNO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
4.權利要求1的分離的蛋白質，其包括示于SEQ ID NO17或SEQID NO21的一種氨基酸序列。
5.一種分離的蛋白質，其包括多個次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白的免疫原性片段，其中該分離的蛋白質不是全長的HGXPRT蛋白。
6.一種免疫治療性組合物，其包括一種分離的次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白或一或多種分離的蛋白質，和免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，每一種所述分離的蛋白質包括至少一種次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白的免疫原性片段。
7.權利要求6的免疫治療性組合物，其中該或每一種分離的蛋白質包括選自SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
8.權利要求6的免疫治療性的組合物，其中該或每一種分離的蛋白質具有選自SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
9.權利要求6的免疫治療性的組合物，其中該或每一種分離的蛋白質具有示于SEQ ID NO17或SEQ ID NO21的一種氨基酸序列。
10.權利要求6的免疫治療性的組合物，還包括一或多種B細胞表位。
11.權利要求10的免疫治療性的組合物，其中所述一或多種B細胞表位來自MSP1的羧基末端或頂膜抗原1。
12.一種編碼權利要求1的分離的蛋白質的分離的核酸。
13.權利要求12的分離的核酸，其包括選自SEQ ID NO25；SEQID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ IDNO30；SEQ ID NO31；SEQ ID NO32；SEQ ID NO33；SEQ ID NO34；SEQ ID NO35；SEQ ID NO36；SEQ ID NO37；SEQ ID NO38；SEQ ID NO39；SEQ ID NO40；SEQ ID NO41；SEQ ID NO42；SEQ ID NO43；SEQ ID NO44；SEQ ID NO45；SEQ ID NO46；SEQ ID NO47或SEQ ID NO48的一種核苷酸序列。
14.一種多表位構建體，其包括編碼多種權利要求1的分離的蛋白質的分離的核酸。
15.一種免疫治療性組合物，其包括編碼次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白或至少一種其免疫原性片段的分離的核酸，和免疫學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
16.權利要求15的免疫治療性組合物，其中所述分離的核酸編碼選自SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ IDNO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
17.權利要求15的免疫治療性組合物，其包括選自SEQ ID NO25；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31；SEQ ID NO32；SEQ ID NO33；SEQ ID NO34；SEQ ID NO35；SEQ ID NO36；SEQ ID NO37；SEQ ID NO38；SEQ ID NO39；SEQ ID NO40；SEQ ID NO41；SEQ ID NO42；SEQ ID NO43；SEQ ID NO44；SEQ ID NO45；SEQ ID NO46；SEQ ID NO47或SEQ ID NO48的一種核苷酸序列。
18.權利要求6或權利要求15的免疫治療性組合物，其引發抗致病性原生動物的免疫應答。
19.權利要求18的免疫治療性組合物，其中原生動物是瘧原蟲屬的原生動物。
20.一種分離的T淋巴細胞，其識別HGXPRT蛋白的免疫原性片段。
21.權利要求20的分離的T淋巴細胞，其是CD4+T淋巴細胞。
22.一種用分離的HGXPRT蛋白或至少一種其免疫原性片段免疫的非人類動物。
23.一種抗原生動物疾病的免疫方法，所述方法包括將HGXPRT蛋白或至少一種其免疫原性片段施用給動物的步驟。
24.一種抗原生動物疾病的免疫方法，所述方法包括將編碼HGXPRT蛋白或至少一種其免疫原性片段的分離的核酸施用給動物的步驟。
25.權利要求23或24的方法，其中該或每一種免疫原性片段包括選自SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ IDNO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
26.權利要求25的方法，其中該或每一種免疫原性片段包括選自SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO15；SEQID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ IDNO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
27.權利要求28的方法，其中該或每一種免疫原性片段包括示于SEQ ID NO17或SEQ ID NO21的一種氨基酸序列。
28.權利要求23或24的方法，其引發抗致病性原生動物的免疫應答。
29.權利要求28的方法，其中原生動物是瘧原蟲屬的原生動物。
30.權利要求23或24的方法，其中所述動物是哺乳動物。
31.權利要求30的方法，其中所述哺乳動物是人。
32.一種抗體，其結合次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGXPRT)蛋白的免疫原性片段。
33.權利要求32的抗體，其結合選自SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ IDNO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23或SEQ ID NO24的一種氨基酸序列。
全文摘要
本發明提供通過使用次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶蛋白或其肽片段作為有效抗原蟲病如瘧疾和巴倍蟲病的疫苗的免疫原來免疫治療原蟲病。具體地，用次黃嘌呤鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉移酶蛋白或其肽片段免疫接種，誘導產生對血液階段的瘧疾的T細胞免疫。在具體的實施方案中，本發明提供可廣泛地應用于包括瘧疾在內的原蟲病的蛋白質的和DNA的瘧疾疫苗以及引發T細胞介導的免疫應答的預防性和治療性免疫接種的方法。
文檔編號A61K39/00GK1649890SQ03809826
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年3月1日
發明者莫里斯·馬克邦戈, 喬治·艾爾弗雷德·賴丁, 彼得·維拉德森, 邁克爾·古德 申請人:昆士蘭醫學研究所理事會