專利名稱：：用作疫苗的融合抗原的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種融合抗原。更具體而言，本發明涉及一種用作T-細胞疫苗的融合抗原。
背景技術：
：細胞介導的免疫反應依賴T-淋巴細胞與載有T-細胞識別抗原的細胞之間的直接交互作用。在受感染的體細胞中，病毒利用細胞本身的合成機制在細胞內復制，而T-細胞則識別受病毒感染的體細胞。然而，在病毒復制過程中所產生的抗原會出現在受感染細胞的表面(MHCI類)，被殺傷性T-細胞(CD8+T-細胞)識別，殺傷性T-細胞可在病毒復制完成前殺死細胞以控制感染。用于預防病毒感染的疫苗通常為活體減毒生物，其致病性雖已減弱，但可剌激保護性免疫。當病毒復制形成內源性加工肽時，用作減毒活疫苗的活病毒的外源蛋白在抗原呈遞細胞(APC)的內質網(ER)腔中被識別與加工。上述加工過程包括抗原修飾以及適度消化。然而，減毒活疫苗，尤其是RNA病毒，具有強烈的毒性和毒力恢復的傾向。例如，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的疫苗與減毒株兩者皆有毒性恢復的情形。此外，病毒必須經歷多次傳代。因此其喚起免疫反應的能力受到質疑。開發減毒活疫苗是一項費時的工程。為防止減毒活疫苗恢復毒性，正在開發如假狂犬病疫苗、gl基因缺失疫苗以及PRV標記疫苗等基因缺陷疫苗。使用牛痘或禽痘的病毒或細菌作為攜帶抗原基因載體。通過DNA重組技術，可縮短優良疫苗的研發時間，且可同時取得同一疫苗的多種血清型。這些疫苗的實例為禽痘病毒及沙門氏菌載體系統及美國的SyntroVet基因重組疫苗。另一方面，在使用微生物，尤其是RNA病毒，作為載體疫苗時，這些微生物會衍生新品種或新菌株。這些載體疫苗的安全性再次受到挑戰。此外，傳統重組亞單位疫苗對于觸發細胞介導的免疫反應通常效果不彰。重組亞單位疫苗為外源性抗原，會被攝入巨噬細胞、樹突狀細胞與B-淋巴細胞內。這種來自外源性抗原且帶有免疫原表位的肽是在抗原透過液相胞飲作用或膜結合受體而內化至APC之后產生。然后在APC的內體區室中產生肽，并通過空的MHCII類分子將其分類，從而基于MHCII類分子與肽間的親合性，形成肽-MHCII類復合物。肽-MHCII類復合物然后易位至APC表面，以便被CD4+T-細胞識別。然而，由CD8+T-細胞識別的亞單位型蛋白并不能成為有效的疫苗，因為其一旦施用，便被內化至內體區室內，且可能于該處大幅降解或無法與MHCI類途徑產生交互作用。此外，CD4+細胞(Th細胞)可分別通過Thl與Th2輔助T-細胞激活體液免疫反應與細胞介導的免疫反應。Thl與Th2細胞可彼此調節以達到體液免疫與細胞介導的免疫反應的平衡。可感染如T-細胞、B-細胞、樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞的免疫細胞的病毒已有相關發現與研究。這種感染豬的病毒的實例為豬生殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)與II型環狀病毒，以及感染人的病毒的人免疫缺陷病毒。這些病毒在抗原呈遞細胞中關閉識別作為抗原的外源蛋白的能力。當免疫細胞無法喚起免疫反應并載運病毒時，已被這些類型病毒感染的動物極易受到其它病原體的二次感染。不幸的是，目前仍缺乏可針對感染病毒的免疫細胞產生作用的有效疫苗。尤其，豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)每年皆對畜牧業造成高額損失。該病毒感染巨噬細胞(肺泡及脾臟內)、腦部小膠質細胞及單核細胞，并存在于被感染動物的血液及器官中。抗體對此病毒的效果不大，甚至剌激病毒突變。在抗體依賴性增強作用(ADE)的機制中，抗體的使用反而引發更嚴重的感染。大約50%至80%的豬受到該種病毒感染。通常，被該病毒感染的動物無明顯癥狀，但被感染動物的免疫力降低。由于二次感染，這導致增重率降低與死亡率升高。PRRSV為一種RNA病毒。除了豬，鴨類亦可能感染PRRSV。目前已有用于抵抗PRRSV的減毒活疫苗問世。然而，病毒于活體疫苗中的突變經常發生。所幸近期的HIV疫苗研發報告已明確指出殺傷性T-細胞(CTL)為控制HIV感染所必須(HanneG-Setal.，2000，Journalofvirology,volJ4，No.4.p.l694-1703)。開發一種安全有效的PRRS疫苗實為當務之急。因此，如何解決現有技術的缺失與不足，尤其是研發可抵抗病毒感染的T-細胞疫苗，已是產學界刻不容緩之要務。
發明內容在一個技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORFlb。在另一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于綜合征PRRSVORFlb。在又一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在又一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含4具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。圖IA說明PRRSVORFlb亞克隆片段Nspll(核苷酸10805核苷酸11297，上半部)與蛋白片段Nsp10及Nspll加K13的對應的氨基酸序列(下半部)。圖IB說明圖1A中蛋白片段對應的三字母氨基酸序列(SEQIDNO:1)。圖2說明M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。圖3說明質粒pPE-K13圖譜，其中PE代表PE(AIII)。圖4說明質粒pPE-M12-K13圖譜，其中PE代表PE(AIII)。圖5說明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾細胞中誘發抗原特異性IFNY的分泌。圖6說明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾細胞中誘發抗原特異性TNFa的分泌。具體實施例方式本說明書通篇所用術語，其在本發明范圍內及在本說明書特定上下文中的解釋大致均依照各術語于本領域中的通常涵義。本說明書中用以描述本發明之特定用語將于下文中或于本說明書他處加以說明，以利業界人士了解本發明的相關說明。為便于閱讀，特定用語可能以斜體字和/或引號等格式特別標示。使用特別標示并不影響該用語的范圍及意涵。這些用語不論是否經特別標示，其在相同上下文中之范圍及意涵仍為相同。在本文中，相同之文意可能以不同方式表達。因此，本文所述之用語皆可以其替代用語及同義詞代替，且一用語是否在本文中經詳細說明或討論，并無任何特別意義。在此將提供特定用語的同義詞。各同義詞的使用不應視為對其他同義詞的排除。本說明書所用的實例，包括在此所討論的任一用語的范例，僅供說明之用，而非用以限制本發明或任何示例用語的范圍與意涵。同樣地，本發明亦不限于在此所舉之實施例。除非另行定義，否則在此所用的所有技術與科學用語的意涵均與熟習本發明相關領域人士所普遍了解的相同。若有相互沖突之處，則以本說明書及其中所提供之定義為解釋依據。在此所述的"大約"、"約略"或"概為"一般指給出的數值或范圍的百分之二十以內，較理想地為百分之十以內，更理想地為百分之五以內。在此所提供的數量為約略值，意指即便"大約"、"約略"或"概為"等用語未有書明之處，亦包含此等用語的涵義。本發明提供一種靶細胞特異性融合抗原，其包含抗原部分；配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及羧基末端部分，其使該融合抗原留存于該靶細胞的內質網(ER)膜內。在此所用術語"融合抗原"指可在動物體內喚起免疫反應的重組蛋白。較佳地，該融合抗原包含用于直接喚起免疫反應的表位以及用于增強免疫反應(例如媒介傳遞、轉運、加工及呈遞)或用于提供多重功能的其它部分。較佳地，該靶細胞為抗原呈遞細胞。更佳地，該靶細胞選自由T-細胞、b-細胞、樹突細胞、單核細胞與巨噬細胞組成的組中。在此所用術語"抗原部分"指可喚起免疫反應的肽片段。在本發明的一個實施方式中，該抗原部分為表位。根據本發明，該抗原部分為致病物種的蛋白，其可高度激活免疫反應。例如，這些蛋白質包括但不限于外殼蛋白、核蛋白或細胞膜蛋白。該抗原部分可為直接從致病物種克隆的肽以及由本領域技術人員修飾以增強免疫反應喚起能力的肽，從而成為方便制造與運送的重組蛋白。較理想地，該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、II型環狀病毒或人免疫缺陷病毒。較理想地，該抗原部分可為PRRSV0RF1、lb、2、3、4、5、6或7。在本發明的一個較佳實施方式中，該抗原部分為PRRSVORFlb或M12冠狀區。為喚起更強烈的免疫反應，該抗原部分包含至少一個抗原單位，且以橋接區連接相鄰的抗原單位。根據本發明，該橋接區可為一小片段的肽，其喚起的免疫反應微小至免疫系統無法辨別其存在的程度。在此所用術語"配體部分"一般指能夠與靶細胞上的受體進行反應、識別該受體或者與該受體結合的所有分子。這些受體的實例包括但不限于抗體受體、生長因子受體、淋巴因子受體、細胞因子受體、激素受體等等。在本發明的一些實施方式中，與配體部分結合的受體選自以下組成的組中TGFa受體、IL2受體、IL4受體、IL6受體、IGF1受體、CD4受體、IL18受體、IL12受體、EGF受體、LDL受體與a2-巨球蛋白受體。該配體部分具有與靶細胞的細胞膜結合以將該融合抗原定位于所述靶細胞的能力。免疫系統系通過融合抗原與靶細胞上的受體結合而啟動。較佳地，該配體部分為假單胞菌外毒素A結合域I。假單胞菌外毒素A(PE)是由613個氨基酸組成的單一多肽鏈。PE分子的X光結晶學研究與突變分析顯示PE由三個區域組成氨基末端細胞受體結合域(區域I);中間易位結構域(區域II);以及羧基末端活性域(結構域III)(參見美國專利第5,705,163號，于此合并參照)。在此所用術語"假單胞菌外毒素A結合域I"指與假單胞菌外毒素A的氨基末端細胞受體結合域具有相同序列或者具有功能相當片段的肽片段。假單胞菌外毒素A的氨基末端細胞受體結合域包含兩個亞域，分別命名為區域Ia及區域Ib。區域Ia及區域Ib的構造可與細胞表面上的LDL受體或a2-巨球蛋白受體結合。在此所用術語"假單胞菌外毒素A結合域II"指與假單胞菌外毒素A的中間易位結構域具有相同序列或具有功能相當片段的肽片段。假單胞菌外毒素A易位結構域II具有將融合抗原易位至靶細胞的細胞質的功能。融合抗原在附著于靶細胞膜之后，易位至靶細胞中。在此所用術語"使融合抗原留存于靶細胞內質網(er)膜內的羧基末端部分"指可使融合抗原與ER膜結合并將其留存于ER腔內以實現醣基化作用并且使該融合抗原看來更接近外源蛋白的肽片段。在本發明的一個實施方式中，該羧基末端部分包含以下氨基酸殘基，其沿從氨基端至羧基端的方向依序為R、r2-R3-R4-(R5)11其中W為帶正電的氨基酸殘基；r2為帶負電的氨基酸殘基；R3為帶負電的氨基酸殘基；R4為L;R5為帶正電的氨基酸殘基；且n為0或1。較佳地，該羧基末端部分為KDEL家族蛋白中的成員。在此所用術語"KDEL家族蛋白"指一組蛋白質，其具有與細胞ER膜結合的相似羧基端，并進一步具有可將該蛋白質留存于ER腔中的能力。通常，該羧基端之長度介于416個殘基之間。如美國專利第5,705,163號(在此合并參照)所述，位于KDEL家族蛋白羧基端上的氨基殘基，尤其是最后五個氨基酸中的氨基殘基，占有十分重要的地位。根據針對存在于不同分子中且可執行特定生物機能的相似序列所做的研究顯示，一種可在內質網中留存新形成蛋白的序列為LysAspGluLeu(KDEL)(SEQIDNO:9)。此發現說明根據本發明的融合抗原的羧基端上的序列可作為某種類型的識別序列，協助融合抗原從內吞區室易位至ER內并將其留置于腔中。在一個較佳實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL的序列(SEQIDNO:9)。在一更理想的實施方式中，該羧基末端部分包含KKDL-RDEL-KDEL的序列(SEQIDNO:5)、KKDELRDELKDEL的序列(SEQIDNO:6)或KKDELRVELKDEL的序列(SEQIDNO:7)或KKDEL-RXEL-KDEL的序列，其中R為D或V。本發明的特征在于羧基末端部分的設計，其使融合抗原能夠在靶細胞的ER內被加工以與MHCI類分子結合，并由T-細胞加以識別。本發明的融合抗原具有觸發細胞介導的免疫反應的功效。根據本發明，該融合抗原用于動物免疫。本發明的目的之一在于提供一種藥物組合物，其包含本發明的融合抗原與可藥用載體。較理想地，該藥物組合物為T-細胞疫苗。在此所用術語"T-細胞疫苗"指可通過激活細胞介導的免疫反應來保護受試者免受感染的疫苗。殺傷性T-細胞(亦稱為殺傷性T-淋巴細胞、CD8+T-細胞和CTL)與記憶T-細胞(T。m及U為T-細胞疫苗的關鍵角色。本發明亦提供一種使動物免疫的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種靶細胞特異性融合抗原，其包含抗原部分；配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及羧基末端部分，其使該融合抗原留存于該靶細胞的內質網(ER)膜中；以及(b)將該融合抗原接種于所述動物體內。在本方法的步驟(b)中，可以本領域技術人員已知的任何方式對動物進行接種。例如，可經由注射或以口服疫苗的形式投送該融合抗原。并可視需要進行后續補強疫苗注射。較理想地，在感染發生前進行預防性接種。亦可對新生動物，甚至是胚胎，進行此融合疫苗的接種以助其提升免疫性。根據本發明，免疫反應過程包括以下動作(C)靶細胞膜與配體部分結合，從而將融合抗原定位于靶細胞；(d)融合抗原通過假單胞菌外毒素A易位結構域II易位至靶細胞的細胞質中；(e)靶細胞的ER膜與融合抗原的羧基末端部分結合，從而將融合抗原留置于ER腔中；7[OO53](f)抗原部分在ER腔中被加工；(g)加工后的抗原部分與MHCI類分子結合；(h)加工后的抗原部分由該MHCI類分子載運至靶細胞表面；(i)由該MHCI類分子載運的加工后的抗原部分經CD8+T-細胞識別以取得免疫信息；以及(j)記憶T-細胞儲存該免疫信息以使該動物免疫。在動作(c)中，融合抗原的配體部分引導融合抗原與靶細胞膜上的受體結合，以便將融合抗原定位于靶細胞。在動作(d)中，融合抗原由假單胞菌外毒素A易位結構域II易位至靶細胞細胞質中。此易位引導融合抗原進入靶細胞。在動作(e)中，融合抗原的羧基末端部分與靶細胞的ER膜結合，從而將融合抗原留存于ER腔中，以便加工融合抗原。在動作(f)中，抗原部分在ER腔中接受加工。所謂加工包括但不限于在ER腔中進行如醣基化和由酶適度消化的抗原修飾。在動作(g)中，加工后的融合抗原可與MHCI類分子結合。MHCI類分子本身即為一種不完全折疊蛋白并且與許多伴侶蛋白結合。加工后的融合抗原與肽結合槽裂進行結合以完成折疊，且促進伴侶蛋白的釋放。在動作(h)中，處理后的抗原部分通過MHCI類分子呈現于靶細胞表面。折疊后的MHCI類分子與加工后的抗原部分被送至細胞表面。在動作(i)中，由MHCI類分子所載運的加工后的抗原部分經CD8+T-細胞識別以取得免疫信息，該免疫信息系用于殺傷性T-細胞的識別且該免疫信息系存入記憶T-細胞中。記憶T-細胞之實例為Tcm以及Tem細胞。在動作(j)中，免疫信息被存入記憶T-細胞以使動物免疫。當已接受該融合抗原免疫的動物再次感染相同抗原時，記憶T-細胞可在短時間內喚起更強烈的免疫反應。T-細胞疫苗提供內源加工抗原，其可在靶細胞的ER腔內加工。在一個技術方案中，本發明提供一種靶細胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在又一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在又一技術方案中，本發明涉及一種靶細胞特異性融合抗原，其主要由以下部8分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(C)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在本發明的一個實施方式中，該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORFlb。該抗原部分可包含具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的多肽。在本發明的另一實施方式中，該抗原部分包含多肽，該多肽是包含SEQIDNO:2所述的核苷酸序列的DNA片段的翻譯產物。在本發明的又一實施方式中，該抗原部分源于PRRSVNsplO與Nspll。在本發明的一個實施方式中，該配體部分為假單胞菌外毒素A結合域I。在本發明的另一實施方式中，該羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。該羧基末端部分可經由限制酶切位點接頭而與該抗原部分連接。在另一技術方案中，本發明還涉及一種藥物組合物，其包含如上所述的融合抗原以及可藥用載體。在本發明的一個實施方式中，該藥物組合物包含第一融合抗原，其中第一融合抗原包含(a)源于PRRSVORFlb的抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該藥物組合物可進一步包含靶細胞特異性第二融合抗原，其中第二融合抗原包含(a)源于PRRSVORF7的抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；(c)假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技術方案中，本發明再涉及一種在動物體內誘發免疫反應以對抗病原體感染的方法。該方法包括以下步驟(a)提供上述之一種藥物組合物；以及(b)將該融合抗原接種于所述動物體內，其中該免疫反應針對所述病原體，所述抗原部分源于該病源體。在本發明的一個實施方式例中，本方法提供一種包含融合蛋白的組合物，該融合蛋白以抗原呈現細胞為特定標靶。例如，該靶細胞可選自由T-細胞、B-細胞、樹突細胞、單核細胞與巨噬細胞組成的組中。實施例以下所述者僅為根據本發明實施例所提供之例示用設備、器材、方法與相關結果，不應視為本發明的限制。各實施例的標題或子標題僅為方便閱讀之用，亦不應視為本發明之限制。此外，只要本發明系據其本身實施，不論基于任何特定學說或實行方案，均不受在此所敘及的特定學說的限制，且與所述學說正確與否無涉。材料及方法質粒構建pPE-M12-K13。質粒pPE-M12-K13包含作為抗原部分的冠狀區M12;作為配體部分的PE(AIII)與易位部分；以及作為羧基末端部分的K13。該M12區序列位于PRRSVORFlb基因中。該PRRSVORFlb序列是從EMBL/GenBank核苷酸序列數據庫登錄碼第M96262號中選取。亞克隆M12片段源于PRRSVNsplO(C末端區序列)與Nspll(N末端區序列)。抗原部分PRRSVM12(或ORFlb亞克隆片段)是以表一所列的特定引物合成。為了產生質粒pPE-M12-K13，通過AatII與EcoRl位點插入將PRRSVORFlbDNA片斷nt1080511297亞克隆至pPE-K13質粒中。圖1A顯示M12加K13的蛋白片段，其中限制酶切位點以粗體字表示。圖1A中蛋白質片段所對應的三字母氨基酸序列則顯示于圖1B中(SEQIDNO:1)，其中K13序列以下方劃線的粗體字表示，而限制酶切位點以及Xhol與K13序列間的短橋則以粗體斜字表示。圖2顯示包含M12(亦即PRRSNsp10加Nspll基因)及K13的M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。圖3顯示質粒pPE-K13，而圖4則顯示包含M12區(亦即冠狀區)的質粒pPE-M12-K13。pPE-K13。質粒pPE-K13包含作為配體部分加易位部分的PE(AIII);以及作為羧基末端部分的K13(圖3)。該PE(AIII)(在圖3中標示為PE)包含假單胞菌外毒素A結合區域I與易位結構域II。質粒pPE(AIII)是根據美國專利公開案第2004/0247617號所述方法構建而成，該專利公開案的全文在此以引用的方式并入本文。該K13羧基末端部分包含肽序列KKDELRVELKDEL(SEQIDNO:7)，其由該K13片段是以上開美國專利公開案的方法稍加修改而制成，該專利公開案的全文系以引用的方式并入本文。簡言之，通過連續的聚合酶鏈式反應(PCR)合成編碼SalI位點-KKDELRVELKDEL-終止密碼子-XhoI-EcoRI序列的多核苷酸。該等PCR-擴增的DNA片段以Sail及EcoRI使其切開，再以凝膠電泳及電洗脫純化。純化后的SalI-EcoRIDNA片段與pPE連接即形成質粒pPE-K13。pPE-DgD-K13。該編碼PE-DgD-K13的質粒是以美國專利申請第10/457,574號所述的方法稍加修改而制成。簡言之，以PstI及XhoI消化兩種質粒pET15-H6-PE(AIII)PRRS7-DgD與pPE-K13，從而分別產生包含PE(AIII)PRRS7-DgD的片段與包含羧基末端部分的片段。繼而將兩種片段純化，再通過T4連接酶進行連接，即形成pET23-H6-PE(AIII)-DgD-K13(名為pPE-DGDK13或pPE-DgD-K13)。質粒pET23-K3、pET-K13或pPE(AIII)-K13皆包含KDEL序列。pPE-ORF5-K13。此可編碼PE-ORF5-K13的質粒根據上述方法制成。簡言之，將PRRSVORF5基因插入pPE(AIII)-K13以構建pPE-ORF5-K13。融合抗原的表達與純化。在37t:含有100500ppm氨芐青霉素的LuriaBertani培養液中培養用融合抗原質粒轉化以表達融合蛋白PE-ORF5-K、PE-DgD-K13或PE-M12-K13的大腸桿菌(BL21(DE3)pLys細胞)。在大腸桿菌培養達到對數期前期(A600=0.10.4)后，在培養物中加入終濃度為0.5mM的異丙基-1-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以發揮誘發作用。誘發兩小時后收獲細胞并立即儲存于零下7(TC。利用前人已披露的尿素粹取技術(Liao等人，1995，Appl.MicrobiolBiotechnol.43:498-507)，將融合抗原部分純化。將包含6組胺酸標記(6Histag)的融合抗原分子完全曝露于變性條件下，以加強其與eNi-NTA基質(Ni-NTA瓊脂糖；QiagenInc.CA)的結合。因此通過降低非特異性性結合的可能性，使純化作用達到最大效率。以下將說明如何在變性條件下為來自大腸桿菌細胞培養的6組胺酸標記融合抗原進行分批純化。將1毫升50%Ni-TNA漿加入4毫升溶胞產物中，并且室溫下以輕搖方式(如200rpm)混合60分鐘以形成溶胞產物-樹脂混合物。將該溶胞產物-樹脂混合物小心裝入仍附有底蓋的空管柱中，然后移除底蓋以收集從中流過的溶液。以4毫升洗滌緩沖液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0)沖洗兩次。利用0.5毫升、pH5.9的洗脫緩沖液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH5.9)洗脫蛋白質四次，接著再以0.5毫升、pH4.5的洗脫緩沖液(100mMNaH.sub.2PO.sub.4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH4.5)進行洗脫四次。將收集的級分集中在一起，并以SDS-PAGE凝膠電泳進行分析。利用標準BAS蛋白進行定量分析。表二引物SEQIDNO:序列M12-F1105，-TGGCCGGTGGTGTCAACCCAGAACAATGAAAAGTGGCCGGATCGTCTG-3'M12-F25'^CAGTTTGCCAAACTCCCAATAGAACTTGCACCACACTGGCCGGTGGTGTCA-3'M12-F3125'國AACTTGGGTTTTTATTTTTCACCTGAGTTGACACAGTTTGCCAAACTC-3'M12-F4135'-GGGTCGAGCTCTCCGCTCCCGAAGGTCGCACACAACTTGGGTTTTTAT-3'M12-F5145，-TCTCTCCGCGCCATTTGTGCTGATCTGGAAGGGTCGAGCTCTCCG-3'M12-F6IS5'-GATAAATTTCGTGCCACAGACAAGCGTGTTGTAdATTCTCTCCGCGCCATT-3'M，2-F75'-ACGGTTGCTCAGGCTCTGGGCAACGOGGATAAATTTCGTGCC-3'Mi2-FS175'-CCCCCCGACGTCAATAACAAAGAATGCACXJGTTGCTCAGGCT-3'謹2-Rl185，-GCGGCTGTATTTGTCGAGAGGGCGAAGGCTGGCAACCAGACGATCCGGCCA-3'M12-R2S，-AGGGCCCACCATATAGCCGGCACCGATGCACGCGCGGCTGTATTTGTC-3'M12-R3205'-GTATGACACGACCCCTGGAGTGCCCAGAAACACCGAAGGGCCCACCATATA-3'M12"R45'-AGCCTCGCCCTTAACAAACTTTGTGAGATAGTATGACACGACCCC-3'M12-R5225，-TCGGCCGGTACTGAAGACCGTTTCC衡AAGCACTTGAGCCTCGCCCTTAAC-3'滅12-R6235'-GATATTCACGGCAGTCTACCTCAATTTOGOCGGTACTGAA-3'M12-R7245，-ACGCAGCAACTTCTCGCTCACGATCATCAAGATATTCACGGCAGTC-3'M12-RS255，-TTTTTTCTCGAGGAATTCGTGTGGGAGGGA^_CGCAGCAACTTCTCG-3'_':M12-F1及M12-R1分別代表第一對正向引物與反向引物；M12-F2及M12-R2分別代表第二對正向引物與反向引物，以此類推。實施例1由PRRSV融合抗原誘發細胞介導的免疫反應本發明旨在發現PRRS病毒蛋白中可誘發動物體內細胞介導的免疫反應的抗原或表位部位，并利用那些抗原生產作為疫苗的融合抗原以使動物免疫，誘發免疫系統產生足量的IFNY及TNFa，并激活T-細胞免疫與殺傷性T-細胞路徑。本發明披露可誘發細胞介導的免疫機制的融合抗原PE-DgD-K13(或PE-PRRSV0RF7)以及PE-M12-K13。在免疫小鼠實驗模型中，發現PE-DgD-K13和/或PE-M12-K13可誘發脾細胞的細胞免疫機11制。分別接種PE-M12-K13與PE-DgD-K13的小鼠與對照組的小鼠相比較，均產生IFNY與TNFa分泌增加的情形。由ORF5及ORF6N-端-K13組成的融合抗原PE-PQGAB-K13對于誘發IFNY與TNFa分泌的效果不大(圖5及圖6)。ORFlb基因在病毒細胞增殖前的之復制過程中起重要作用。融合抗原PE-DgD-K13或PE-DgD-K3及PE-M12-K13或PE-M12-K3為PRRSV疫苗最重要的主要成份。根據先前的PRRSV攻擊研究與血液樣本測試結果，發現PE-DgD-K3能夠激活幼豬免疫保護，預防幼豬感染病毒血癥。實施例2PRRS融合抗原的劑量幼豬于一周、兩周及五周大時分別施用l毫克抗原，總共免疫接種三次。最后一次免疫接種之后兩周，測量特異性抗體IgG、IgA與IgM的滴定度。發現，抗體的滴定度在兩次免疫接種后到達高峰。三次免疫接種后的抗體滴定度相較于兩次接種后并未產生明顯變化。若對幼豬施以0.050.5毫克，而更理想地為0.10.3毫克含有融合抗原PE-M12-K13的疫苗組合物，在二次免疫接種后發生顯著的抗體反應，且抗體在三次免疫接種后到達高峰。實施例3以PE-M12-K13與其它融合抗原混合調配而成的疫苗組合物針對PRRS病毒攻擊的預防動物。豬只取自無特定病原體(SPF)的農場的畜群，該農場定期以RT-PCR技術檢測PRRSV，且已知無此病毒。實驗前，SPF農場的母豬已確認無病毒血癥。此外，SPF農場母豬的Index-RRRS診斷試劑測試結果亦呈陰性。RNA提取。為檢測動物體內是否存有PRRSV，收集動物血漿成分并利用NUCLEOSPINRNA11頂試劑盒提取RNA以進行RT-PCR檢測(Macherey-NagelGmbH&Co.KG，德國)。簡言之，將350微升RAl溶液與3.5iUI3-巰乙醇加入100iU血漿成分中。在粘度降低并經過濾使溶胞產物澄清后，將溶胞產物與350iU的70X乙醇混合。以離心方式將RNA吸附于NucleospinRNA管柱中，之后加以洗滌。將95微升的DNA酶溶液加入管柱中進行DNA消化。重復洗滌與離心作業數次后，再以60iU不含RNA酶的水洗脫出RNA。病毒的RT-PCR檢領U。利用OnestepRT-PCRKit(QiagenInc.,美國加州)進行RT-PCR來檢測動物體內是否存有PRRSVRNA。提供正向引物5'-CCAGCCAGTCAATCAGCTGTG-3'(SEQIDNO:3)與反向引物5'-GCGGATCAGGCGCAC-3'(SEQIDNO:4)以合成293-bp的片段。以瓊脂糖凝膠電泳進行RT-PCR的檢測極限約為10個拷貝的PRRSV(TCID5。/毫升)。免疫作用。從SPF農場中挑選三至四只母豬所產的新生幼豬，分別標定身分、稱重及判定性別。將幼豬隨機分為六組，每組包括來自各母豬的共五或六只幼豬。以含有一種或多種融合抗原(亦即混合或未混合)的疫苗組合物或載體對幼豬以體重分層的標準進行接種。分別在哺乳階段中4天大與至8天大時，以肌肉注射方式免疫接種2ml疫12苗組合物，共接種兩次，其中該疫苗組合物含有l毫升乳化于lmlISA206(SEPPIOD，法國)中的融合抗原(50100yg每抗原成分/劑)。對照組則未接種，如常飼養。在斷奶階段時(約三至四周齡)，將各組幼豬移往設有空調與通風設備的單獨的隔離室。PRRSV攻擊。最后一次接種之后兩周，分別利用氯胺酮(Ketamine)(100mg，IM注射)與2^利多卡因(Lidocaine)(lml，鼻腔滴注)對幼豬進行鎮靜及咳嗽反射抑制，而后透過鼻腔進行PRRSV攻擊。將lml包含PRRSVMD-1新鮮病毒株(其每毫升50%組織培養感染劑量(TCIDJ為1X10"的接種物，經由鼻腔路徑施用于每組中五只幼豬。病毒攻擊后的RT-PCR。為檢測病毒攻擊后血液中PRRSV的水平，在第二次免疫接種的兩周后以RT-PCR法檢測幼豬的血液白血球樣本(從全血中層析而得)。在攻擊后第三、七及十四天分別取幼豬的血液白血球樣本再次進行PRRSV的RT-PCR檢測。結果。在病毒攻擊前，所有幼豬的RT-PCR血液樣本測試結果均呈PRRSV陰性。因此，在PRRSV攻擊前，對照組并未發生病毒血癥。在PRRSV攻擊的五天后(DPI-5)，對照組幼豬的血液樣本開始出現病毒血癥的征象。在PRRSV攻擊大約兩周后，對照組所有幼豬皆出現病毒血癥(表二，BK-1中五只全數患病，BK-2中六只全數患病)。明顯的病毒血癥癥狀持續一段時間。幼豬血液樣本在PRRSV攻擊兩周后是否出現病毒血癥為評估疫苗效力的重要指標。若未測得病毒血癥，表示疫苗發揮作用。詳言之，在接種含有PE-M12-K13、PE-ORF5-K13與PE-DgD-K13混合物的疫苗組合物的組中共有六只幼豬，僅一只的血液樣本呈PRRSV陽性反應。部分接受PE-M12-K13疫苗接種的組在病毒攻擊后第十四天(DPI-14)開始呈現病毒血癥清除反應，如表二所示。表二顯示動物組在PRRSV攻擊后的檢測結果。接受PE-M12-K13疫苗接種的幼豬于PRRSV攻擊后之第七天，三只中即有一只攻擊出現病毒血癥，但病毒血癥在攻擊后第21天已被清除。在接種含有PE-M12-K13、PE-DgD-K13與PE-ORF5-K13混合物的疫苗組合物的組中，六只中有一只于PRRSV攻擊后的第7天出現病毒血癥，而病毒血癥在攻擊后第21天也已被清除。因此，可能PE-DgD-K13(或-K3)及PE-M12-K13(或-K3)對于動物的病毒感染保護有其效果，但PE-ORF5-K13(或-K3)在此條件下并未能提升保護效果。表二SPF幼豬模型中PRRSV攻擊后的病毒血癥測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>'"BK"代表未接種疫苗的對照組。實施例4由PRRSV攻毒所引致之肺部病變以變異數分析法(ANOVA)判定接種與未接種疫苗的動物組在間質性肺炎指標差異的統計顯著性。統計分析顯示，接種以單一PE-PRRSV融合抗原PE-M12-K13構成的疫苗組合物的動物，其肺部組織切片呈現輕微的間質性肺炎嚴重度。就含有一種以上單一PRRSV融合抗原的疫苗組合物而言，含有PE-DgD-K13與PE-M12-K13混合物的疫苗組合物對于肺病癥狀具有有效的防護作用。從接受PE-DgD-K13與PE-M12-K13疫苗接種的幼豬所取得的肺部組織切片，其間質性肺炎的嚴重度較輕。歸納上述實驗結果，可證實包含PE-M12-K13的疫苗組合物具有以下功效L產生有效的病毒血癥清除反應。II.不含其它PRRSV結構蛋白的疫苗組合物有效減少可能由PRRS病毒所引發的副作用。III.具有誘發細胞免疫機制的效用。利用ORFlb，可產生融合蛋白抗原PE-M12-K13，并有效誘發動物產生INFY與TNFa細胞因子，發揮清除病毒感染的作用。本案所參照的所有前案，其全文均以引用的方式并入本文。以上說明為本發明的實施范例，其作用僅在于說明，其所揭示者并未窮盡本發明之所有可能型態，且本發明的實施亦不限于所述型態。依據以上教示，可能實現本發明的多種修改及變化。此處所述實施方式與實施例的選用及敘述為闡明本發明的原理與這些原理的應用，以便使本領域技術人員利用本發明及依據實際需要以不同實施方式或各種領域修改實現本發明之技術。本領域技術人員可在不違本案精神之情況下，輕易想見多種替代實施例。因此，本發明的范圍應取決于所附權利要求書，而非由上述實施例加以界定。序列表<110>生寶生物科技股份有限公司財團法人臺灣動物科技研究所<120>用作疫苗的融合抗原<130>TI08-1898-XC37<140>200810178914.1<141>2008-ll-27<150>US11/948,327<151>2007-ll-30<160>25<170>PatentInversion3.3<210>1<211>186<212>PRT<213>人工序列<220>14<223>PRRSVORFlbM12區(部分NsplO和Nspll)加K13的氨基酸序列<400>1AspValAsnAsnLysGluCysThrValAlaGinAlaLeuGlyAsnGly151015AspLysPheArgAlaThrAspLysArgValValAspSerLeuArgAla202530lieCysAlaAspLeuGluGlySerSerSerProLeuProLysValAla354045HisAsnLeuGlyPheTyrPheSerProAspLeuThrGinPheAlaLys505560LeuProlieGluLeuAlaProHisTrpProValValSerThrGinAsn65707580AsnGluLysTrpProAspArgLeuValAlaSerLeuArgProLeuAsp859095LysTyrSerArgAlaCyslieGlyAlaGlyTyrMetValGlyProSer100105110ValPheLeuGlyThrProGlyValValSerTyrTyrLeuThrLysPhe115120125ValLysGlyGluAlaGinValLeuProGluThrValPheSerThrGly130135140ArglieGluValAspCysArgGluTyrLeuAspAspArgGluArgGlu0ValAlaAlaSerLeuProHisGluPheLeuGluTyrLeuLysLysAsp165170175GluLeuArgValGluLeuLysAspGluLeu180185<210>2<211>549<212>DNA<213>人工序列<220><223>PRRSVORFlbM12區(部分NsplO和Nspll)加K13的核苷酸序列:0169]<400>2:0170]gacgtcaataacaaagaatgcacggttgctcaggctctgggcaacggggataaatttcgt60:0171]gccacagacaagcgtgttgtagattctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcg120:0172]agctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttatttttcacctgacttgaca180:0173]cagtttgccaaactcccaatagaacttgacccacactggccggtggtgtcaacccagaac240:0174]aatgaaaagtggccggatcgtctggttgccagccttcgccctctcgacaaatacagccgc300:0175]gcgtgcatcggtgccggctatatggtgggcccttcggtgtttctgggcactccaggggtc36015<400>11c敏ttgccaaactcccaatagaacttgcaccacactggccggtggtgtca<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F3<400>12aacttgggtttttatttttcacctgacttgacacagtttgccaaactc<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F4<400>13gggtcgagctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttat<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F5<400>14tctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcgagctctccg<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F6<400>15gataaatttcgtgccacagacaagcgtgttgtagattctctccgcgccatt<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F7<400>16acggttgctcaggctctgggcaacggggataaatttcgtgcc42<210>17<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F8<400>17ccccccgacgtcaataacaaagaatgcacggttgctcaggct42<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R1<400>18gcggctgtatttgtcgagagggcgaaggctggcaaccagacgatccggcca51<210>19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R2<400>19agggcccaccatatagccggcaccgatgcacgcgcggctgtatttgtc48<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R3<400>20gtatgacacgacccctggagtgcccagaaacaccgaagggcccaccatata51<210>21<211>45<212>DNA<213>人工序列19]<220><223>反向引物M12-R4<400>21agcctcgcccttaacaaactttgtgagatagtatgacacgacccc<210>22<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R5<400>22tcggccggtactgaagaccgtttccggaagcacttgagcctcgcccttaac51<210>23<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R6<400>23gatattcacggcagtctacctcaattcggccggtactgaa40<210>24<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R7<400>24acgcagcaacttctcgctcacgatcatc^gatattcacggc紹tc46<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R8<400>25ttttttctcgaggaattcgtgtgggagggacgcagcaacttctcg4520權利要求一種靶細胞特異性融合抗原，包含a.抗原部分；b.配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；c.假單胞菌外毒素A易位結構域II；以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽；其中，所述抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF1b。2.如權利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分源于PRRSVNsplO與Nspll。3.如權利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含具有SEQIDNO:l所述氨基酸序列的多肽。4.如權利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含多肽，該多肽是具有SEQIDNO:2所述核苷酸序列的DNA片段的翻譯產物。5.如權利要求1所述的融合抗原，其中，所述羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。6.如權利要求1所述的融合抗原，其中，所述配體部分為假單胞菌外毒素A結合域I。7.—種靶細胞特異性融合抗原，包含a.抗原部分；b.配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；C.假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽；其中，所述抗原部分源于選自由馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。8.如權利要求7所述的融合抗原，其中，所述羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。9.一種藥物組合物，其包含權利要求l所述的融合抗原以及可藥用載體；其中，含有PRRSVORFlb的融合抗原為第一融合抗原。10.如權利要求9所述的藥物組合物，其進一步包含靶細胞特異性第二融合抗原，其中，第二融合抗原包含a.抗原部分，其源于PRRSVORF7;b.配體部分，其能夠與所述靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合；c.假單胞菌外毒素A易位結構域II;以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。全文摘要本發明關于一種用作疫苗的融合抗原。該融合抗原包含配體部分、假單胞菌外毒素A易位結構域II、抗原部分以及羧基末端部分。該配體部分能夠與靶細胞上的受體反應、識別該受體或者與該受體結合。該羧基末端部分包含具有KDEL序列的多肽。該抗原部分源于選自由PRRSV、馬動脈炎病毒、II型環狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。本發明還公開了使用該融合抗原的藥物組合物與使用該融合抗原誘發免疫反應的方法。文檔編號A61P37/02GK101691405SQ20081017891公開日2010年4月7日申請日期2008年11月27日優先權日2007年11月30日發明者廖朝暐,章修綱,翁仲男申請人:生寶生物科技股份有限公司;財團法人臺灣動物科技研究所