專利名稱：：兔出血性疾病疫苗及抗原的制作方法兔出血性疾病疫苗及抗原本申請是申請日為2001年8月30日，申請號為01818133.3，發明名稱為"兔出血性疾病疫苗及抗原"的發明專利申請的分案申請。發明領域本發明涉及到在植物中進行的對來自兔出血性疾病病毒的結構抗原VP60或其片段的生產以及這些抗原作為一種抗兔出血性疾病病毒的重組亞基疫苗的應用，這些抗原的生產使用一種基于李痘病毒的病毒栽體。
背景技術：
：兔出血性疾病(RHD)是成年動物的一種急性致死的感染。被感染的兔通常在感染后48到72小時內死于壞死性肝炎。該疾病的致病物兔出血性疾病病毒(RHDV)為嵌杯狀病毒科的一個成員(Ohlingeretal.，1990.J.Virol64，3331-3336;Parra&Prieto，1990,JVirol64，4013-4015)。由于目前沒有允許所述的病毒進行復制的容許穩定細胞系，等抗RHD的現有疫苗產生自經實驗感染RHDV的SPF兔的脾臟或肝臟等。近年來，VP60，RHDV的主要結構蛋白，已經在多種異源系統中進行了生產(B5rcenaetal.，2000.J.Virol74，1114-1123;Bertagnolietal.，1996.JVirol70，5061-5066;Bogaetal.，1994.JGenVirol75，2409-2413;Bogaetal.，1997.JGenVirol78，2315-2318;Fischeretal.，1997.Vaccine15，90—96;Laurentetal.，1994.JVirol68，6794-6798;Marfnetal.，1995.VirusResearch39，119-128;Nageshaetal.，1995，ArchVirol140，1095-1108;Plana-Durdnetal.，1996.ArchVirol141，1423—36;Sibiliaetal.,1995.JVirol69，5812-5815)，包括在轉基因植物中進行的生產(Castafi6netal.，1999.JVirol73，4452-4455)。在所有的情況下，所獲得的重組的VP60蛋白質經顯示能夠保護兔免受RHDV的致死性侵襲。目前，植物實驗著眼于開發用于產生目的生物疫苗的新系統。植物提供了多個相對于其它表達系統的優勢。特別地，它們提供了一種安全、簡便并且經濟的手段用于在無需昂貴的擴大設備的情況下獲得目的蛋白，并且它們可以替代被消耗的傳統作物。特別具有利益的是通過植物進行的具有藥學價值的蛋白和可被用作為亞基疫苗的蛋白質的生產。在植物中生產目的分子主要有兩種策略(i)對植物核基因組的遺傳轉化以產生轉基因植物，以及(ii)對植物病毒基因組的操作(Arntzen,1997.NatBiotechnol15，221-222),后一策略提供的優勢允許植物在其發育周期的特定點產生相對較大量的所需產物，并且病毒原種可在不經植物傳代的情況下長時間保持，一些系統已被開發用于通過DM基因組病毒和RNA基因組病毒表達異源蛋白(Scholthofetal.，1996.AnnRevPhytopathol34,299-323)。在本發明的開發中，我們使用了一種PPV-NK表達載體.這種載體構建自一種李痘病毒PPV(Fern^ndez-Fern5n(iez,DoctoralDissertation"Plumpoxvirusasanexpressionvectorinplants.，，DepartmentofMolecularBiology.CollegeofSciences.UniversityofMadrid(April1999))并且該栽體是西班牙專利申請No.P9900698(Fer"ndez-Ferr^ndezetal.,1999)的對象，該申請描述了一種重組DNA的構建，該DNA包含有PPV病毒基因組的cDNA，一個插入于NIb和CP蛋白的編碼序列之間的外源序列，以及兩種限制性酶(Nael和KpnI)的識別靶點，并且該載體可用于一種異源蛋白表達栽體在植物體內的構建.該PPV病毒為感染植物的馬鈴薯y病毒組的一個成員，螺旋狀的PPV毒粒由一個被2，000以上個拷貝的單殼體蛋白(CP)包圍的信使腿分子組成(Riechmannetal.,1992.JGenVirol73，卜16),該RNA分子在其5，-末端共價連接有一種稱作VPg的病毒蛋白并在3，-末端具有一個聚腺苷酸尾，該多病毒基因組的表達策略包括翻譯成為一種大型多蛋白，該蛋白由病毒蛋白酶進行加工以得到最終的病毒蛋白產物。發明概述總體上，本發明涉及到提供一種抗兔出血性疾病病毒的重組疫苗的問題，特別是生產一種可被用作為抗所述的疾病的疫苗的抗原。本發明所提供的解決方案基于RHDVVP60結構抗原或其片段在植物中的生產，該生產使用一種基于PPV病毒的病毒載體，具體來說是一種PPV-NK表達載體。這些抗原的產生在實施例1中闡示，而所獲得的這些抗原在兔體內誘導抗RHDV的致死性侵襲的保護的能力在實施例2中闡示。基于PPV病毒的載體的應用所遵循的表達策略基于一種多蛋白的產生，該多蛋白隨后經病毒蛋白酶的加工而產生最終的病毒蛋白產物，該栽體的應用所提供的優勢在于所有的蛋白，包括異源蛋白以相同的量進行合成，并且積累水平上的差異完全取決于它們在被感染的植物體內或者植物細胞內的穩定性。因此，本發明的一個主題是一種方法，該方法用于RHDVVP60結構抗原或其片段在可被PPV病毒感染的植物體內或者植物細胞內的生產；這包括了構建基于PPV病毒的RHDVVP60結構抗原或其片段的表達載體的步驟，該載體包含有編碼RHDVVP60抗原或其片段的核苷酸序列，該序列插入于編碼PPV病毒的NIb和CP蛋白的核苷酸序列之間。RHDVVP60抗原或其片段的這種基于PPV病毒的表達栽體也是本發明的另一個主題。本發明的另一個額外的主題是一種可被PPV病毒感染的植物題或者植物細胞，該PPV病毒包含所述的基于PPV病毒的RHDVVP60抗原或其片段的表達載體.本發明的另一個主題為一種抗兔出血性疾病的重組亞基疫苗，該疫苗包含所述的在植物中使用所述的基于PPV病毒的表達栽體而獲得的RHDVVP60抗原或其片段。所逸的重組亞基疫苗的生產過程為本發明的另一個主題.附圖簡迷圖1所示為使用抗RHDV60蛋白多克隆血清進行的對來自于Nicotianaclevelandii植物的提取物的蛋白印跡測試，該植物被接種以PPV-M-VP60(泳道1-15)或者野生型的PPV(泳道16).在泳道3、5、8和14的植物無癥狀(數據未出示)，在泳道3和8中的條帶可能是由于相鄰孔內的溢出所致，所使用的分子量標記(BioRad)在該板邊側顯示。發明詳述本發明提供了RHDVVP60抗原或其片段的一種基于PPV病毒的表達載體，稱之為本發明的表達栽體，該載體包含-一個啟動子-一個重組MA序列，該序列包含有PPV基因組的全長cDNA以及一個編碼RHDVVP60蛋白或其片段的DM序列，該序列插入于編碼PPV的蛋白質Nib與CP的核苷酸序列之間，以及-一種克隆載體在本說明書中所使用的術語"RHDVVP60抗原(或者蛋白)或其片段"指的是一種蛋白質，該蛋白質包括來自任何一種分離林RHDV的全部或者部分的VP60,該VP60能夠與T細胞受體或者抗體進行特異性的結合。在一個特定的實施方案中，所述的蛋白能夠激發接受該蛋白給藥的動物體內的免疫應答。術語"全長"指的是一種完整基因組序列，并且RHDVVP60的變體在能夠激發該免疫應答的情況下被包含于在該定義中，這些變體因氨基酸的添加、取代或者缺失而有別于天然蛋白，啟動子啟動子或者轉錄啟動子序列為一種定位于5，-末端并且直接在PPV病毒的cDNA的1號核苷酸之前的DNA序列，RNA聚合酶同其相結合以起始RNA轉錄，所述的啟動子可能為-一種用于cDNA通過相應的UNA聚合酶進行體外轉錄的適當的啟動子，例如噬菌體啟動子，如T7噬菌體；或者-植物中的某種功能基因的啟動子，適用于病毒RNA的體內轉錄，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子.重組DNA序列重組DNA序列存在于本發明的表達栽體中，該DNA序列包含一個PPV病毒基因組的全長cDNA以及一個編碼RHDVVP60蛋白或其片段的DNA序列，該序列插入于編碼PPV病毒的NIb與CP蛋白質的核苷酸序列之間，以使由所述的RHDVVP60蛋白或其片段的編碼序列所編碼的產物在相應的宿主中通過形成PPV多蛋白中所述的Nib和CP蛋白之間的部分而表達，同時在病毒蛋白質中不產生任何變化，從而對病毒功能造成盡可能小的千擾。天然的蛋白酶NIa負責將RHDVVP60蛋白或者片段同病毒產物的其余部分相分離。通過對PPV病毒的全長cDNA克隆進行操作可獲得重組DNA序列，該重組DNA序列包含一個PPV病毒基因組的全長cDNA以及一個編碼RHDVVP60蛋白或其片段的DNA序列，該序列插入于編碼PPV的蛋白質Nib與CP的核苷酸序列之間，所述的PPV病毒全長cDNA根據西班牙專利申請號No.P9800623的描逸通過對PPV基因組進行反轉錄而獲得。為輔助編碼RHDVVP60蛋白或者其片段的DNA序列在PPV病毒的cDNA適當位置的插入，來自PPV病毒的全長cDNA克隆可通過傳統的遺傳工程技術進行操作從而向NIb和CP病毒蛋白的編碼核酸序列之間引入一個核苷酸序列，該序列由以下元件組成，這些元件按照以下的次序可操作地連接(根據編碼鏈的5，—3，方向)a)—種核苷酸外源序列，該序列選自i)一種18個核苷酸的外源序列，該序列組成了NIb蛋白的編碼序列的最后18個核苷酸并且該序列編碼了來自PPV的NIa蛋白酶的識別七肽的前6個氨基酸，以及ii)一種21個核苷酸的外源序列，該序列編碼PPV的NIa蛋白酶的識別七肽；b)—種核苷酸序列，該序列具有第一種限制性酶的單一的識別位點；c)由至少3個任意類型的核苷酸組成的笫二個間隔序列，以便促進該限制性酶的錨定以及增強其效率；以及d)—種核苷酸序列，該序列具有第二種限制性酶的單一的識別位點。根據這一建構，在PPV病毒的Nib和CP蛋白的順反子之間具有兩個核苷酸序列，該序列編碼PPV的NIa蛋白酶的識別七肽，并且在這兩個核苷酸序列之間具有第一種限制性酶的靶點以及第二種限制性酶的靶點，它們均為單一位點.該外源七肽可以是，例如，七肽NVVVHGA，其為PPV的NIa蛋白酶的一個位于PPV的Nib和CP蛋白之間的識別位點。在一個特定的實施方案中，所述的PPV的NIa蛋白酶的外源識別序列由以下的組合形成(i)18個核苷酸的外源序列，該核苷酸序列構成編碼Nib蛋白的最后18個核苷酸并且編碼PPV的NIa蛋白酶的識別七肽的前6個氨基酸，以及(ii)笫一種限制性酶的識別序列的前3個核苷酸，它們編碼了所述的PPV的NIa蛋白酶的識別七肽的最后一個氨基酸，而編碼所述的PPV的NIa蛋白酶的識別序列的其它核苷酸序列如下形成(i)緊鄰于編碼CP蛋白的核香酸序列的18個核苷酸，它們原本對應于編碼PPV的Nib蛋白的羧基末端的最后6個氨基酸的最后18個核苷酸，該序列組合于(ii)CP蛋白編碼序列的前3個核苷酸，它們編碼了所述的PPV的NIa蛋白酶的識別七肽的最后一個氨基酸。在另一個特定的實施方案中，所述的PPV的NIa蛋白酶的識別序列由所述的21個氨基酸的外源序列形成，該外源序列編碼PPV的NIa蛋白酶的識別七肽，而編碼所述的PPV的NIa蛋白酶的識別序列的另一個核苷酸序列如下形成(i)緊鄰于編碼CP蛋白的核苷酸序列的18個核苷酸序列，該序列原本對應于編碼PPV的Nib蛋白的羧基末端的最后6個氨基酸的最后18個核苷脧，該序列組合于(ii)CP蛋白編碼序列的前3個核苷酸，它們編碼了所述的PPV的NIa蛋白酶的識別七肽的最后一個氨基酸。在本發明的一個特定的和優選的實施方案中，編碼PPV的NIa蛋白酶的兩種識別序列的核苷酸序列是不同的，并且它們在一個或者多個核香酸上有所差異，其目的在于防止或者減少同源序列之間的可能的重組現象，該現象可導致編碼異源蛋白的核苷酸序列的丟失。在一個特定的實施方案中，所述的核苷酸序列編碼位于Nib和CP蛋白之間的PPV的NIa蛋白酶的識別七肽，并且它們在各個三聯體中至少有一個核苷酸的差異。兩種限制性酶識別靶點或者序列向PPV病毒的全長cDNA克隆中的引入允許了編碼RHDVVP60蛋白或其片段的的克隆。一般情況下，所述的笫一種和第二種限制性酶可為任何限制性酶，在一個特定的實施方案中，笫一種限制性酶的靶點為Nael酶的靶點，該靶點緊鄰于編碼PPV的NIb蛋白的羧基末端的序列。在另一個特定的實施方案中，第二種限制性酶的乾點為不同于所述的笫一種限制性酶的靶點，例如KpnI酶的靶點.為獲得鑒定為pUC18-NK和pICPPV-NK的克隆而進行的對PPV病毒的cDNA全長克隆的操作在先前有所描述(上文給出的Fern癥ndez-Fer由dez,19")*克隆栽體克隆載體為一種MA分子，該分子具有復制起點并因此而能夠在適當的細胞中復制。本發明的表達栽體的獲得本發明的表達栽體可通過一種過程而獲得，該過程包括以限制性酶消化來自PPV病毒的全長cDNA(經操作處理以向編碼PPV病毒的Nib和CP蛋白的核苷酸之間引入前述的核苷酸序列a)-d)),該限制性酶的識別位點位于所述的被操作的cDM克隆之中，該過程還包括將編碼RHDVVP60或其片段的序列進行連接并且將所迷的PPV的重組DNA序列插入一種克隆栽體之中，該重組DNA序列含有RHDVVP60或其片段，該序列任選處于一種適當的啟動子的控制之下。實施例1描述了一種基于PPV病毒的RHDVVP60抗原的表達栽體的構建。本發明還在本發明的一個進一步的程序中提供了一種方法，該方法用于在可被PPV感染的植物體內或者植物細胞內獲得RHDVVP60蛋白或其片段，該方法包括1)以本發明的表達栽體對所述易感于PPV感染的植物體或者植物細胞進行接種；2)在所述的植物體或者植物細胞內表達處于病毒多蛋白中的所述的RHDVVP60蛋白或其片段；并且，任選，3)通過對所述的多蛋白進行蛋白水解加工而從病毒多蛋白中分離所述的RHDVVP60蛋白或其片段.下文給出了一些可被PPV感染的植物種類的非限制性示例清單1.核果扁湘&、P.amygdalo-persica、杏、歐洲甜櫻桃、櫻桃李、歐洲酸櫻桃、P.cistena、歐洲李、圓葉櫻桃、梅、桃、黑刺李、毛櫻桃、榆葉梅。2,草本植物a)藜科Chenopodiumcapitatum、菊葉香蓁、球花藜、C.quinoab)菊科絨櫻菊、粘毛千里光、歐洲千里光、百日草c)唇形科寶蓋草、L.purpureum、Galeopsissegetumd)蝶形花科Yiciasativassp.angustifolia、豌豆e)西番蓮科Passiflorafoetidaf)毛萊科田野毛策、R.sardousg)玄參科Linariacymbalariah)癡科假酸漿、Nicotianaaffinis、N.auriculata、N.clevelandii、N.debneyi、N.exigua、N,gigantea、N.glutinosa、N.knightiana、N.langsdorfii、N.longiflora、N.maritima、N.megalosiphon、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.paniculata、白花丹葉煙草、煙草、Solanumcornatum、S.luteum、S.miniat咖、龍葵、S.nudifloru邁、S.rostratum、S.sinaicum、S.sodomaeum、S.villosum、Petuniahyvrida、Physalisfloridana。以本發明的表達栽體對易感于PPV感染的植物或者植物細胞進行的接種可通過任何傳統方法實現，例如機械手段或者使用Helios"基因槍，，方法(BioRad),或者以任何其它適用于基因物質向植物內的轉移的技術.在本發明的方法的另一個特定的實施方案中可能使用本發明的一種表達載體，在該栽體中，含有編碼RHDVVP60或其片段的重組DNA序列處于適當的啟動子之下以進行DNA的體外轉錄，在該情況下使用一種適當的RNA聚合酶來獲得該RNA轉錄物，例如來自T7細菌噬菌體的RNA聚合酶。如果需要，RHDVVP60蛋白或其片段一旦通過對病毒多蛋白的蛋白水解加工而從中分離便可從培養基中分離，如果需要可以通過傳統的方法純化。如果完整的植物被用于RHDVVP60蛋白或其片段的產生，本發明的表達栽體在優選的情況下應缺失經蚜蟲轉播的能力以防止所述的重組載體向其它植物的傳播。這可通過使昆蟲轉播所必需的病毒成分失活而實現.例如，在馬鈴薯y病毒的CP蛋白的氨基末端區域有對于通過蜂蟲進行的病毒傳播十分關鍵的氨基酸三聯體DAG(天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸)，被稱為NAT(非圻蟲傳播)的PPV病毒的天然突變體已被描述(Maissetal.，1992.JGenViro173，709-713;L6pez-Moyaetal.，1995.JGen.Virol76,2293-2297)。這些突變體在CP蛋白的氨基末端具有15個氨基酸的缺失，包括了將甘氨酸從DAG三聯體中去除，該氨基酸對于對蟲的傳播十分關鍵.未自PFV的完整cDM具有一種稱為pGPPV-NAT的構建體，該構建體中具有一個等價于NAT突變體中的突變(Feri^ndez-Fern^idezetal.，1998.FEBSLett.427,229-235)，通過該構建體可合成在植物中感染的轉錄本，其感染特征與野生轉錄本相同.在一個特定的實施方案中，為進行本發明的表達栽體的大規模應用，所述的載體攜帶該突變，這將使該栽體具有生物安全性，因此，在特定的實施方案中，存在于本發明的表達栽體中的來自PPV的cDNA序列具有一種NAT型的缺失以防止圻蟲將該重組病毒栽體向其它植物傳播。一個示例型的非限定實施例描述了來自RHDV的VP60在Nicotianaclevelandii植物中的生產(實施例1)，該植物經表達栽體pICPPV-VP60的感染。本發明還提供了可被PPV感染的植物細胞，這些細胞含有本發明的能夠表達RHDVVP60蛋白或其片段的一種表達栽體。本發明還提供了一些可被PPV所感染的植物，這些植物經本發明的表達栽體進行接種，該表達栽體能夠表達并且積累RHDVVP60蛋白或其片段。通過本發明的方法所獲得的結構抗原RHDVVP60或其片段能夠在兔體內誘導抵抗RHDV的致死負荷的保護，如實施例2所示'因此，本發明提供了一種抵抗兔出血性疾病病毒的重組亞基疫苗，該亞基疫苗從此為本發明的疫苗，該疫苗包含有一種治療有效量的通過本發明的方法過程而獲得的RHDVVP60結構抗原或者其片段，該疫苗任選可同一種佐劑和/或一種稀釋劑組合.在一種特定的實施方案中，本發明的疫苗含有佐劑，例如由Marcol-52、Simulsol-5100和Montanide-m的混合物組成的油性佐劑。本發明的疫苗可以以任何適當的給藥方式給予宿主，如兔。在一種特定的實施方案中，將本發明的疫苗給予所述動物是通過胃腸外途徑，例如皮下注射而實現的.在另一種特定的實施方案中，將本發明的疫苗給予所述動物是通過口服途徑實現的.本發明的疫苗可以通過包括以下步驟的方法獲得U)通過本發明的加工過程獲得RHDVVP60結構抗原或者其片段，(b)分離一種提取物，該提取物包括含有所述RHDVVP60結構抗原或者其片段的抗原相，并任選(c)將所述抗原相與佐劑和/或稀釋劑混合，通過本發明的加工過程而對MDVVP60結構抗原或者其片段的獲取包括對易感于PPV或者本發明的表達栽體的植物或者植物細胞進行接種，在所述的植物或者植物細胞內對所述的RHDVVP60蛋白或者其片段進行表達，該蛋白或者片段包含于病毒多蛋白中，RHDVVP60抗原或者其片段通過對該多蛋白的蛋白水解過程而從該多蛋白中分離，含有RHDVVP60結構抗原或者其片段的抗原相的分離可通過傳統方法而實現，這些方法包括在液體介質中對所述的植物或者細胞部分進行勻漿，該液體介質的例子如一種含水的液體介質，這些方法還包括為獲得所述的抗原相而進行的對細胞碎片的分離，該抗原相含有RHDVVP60結構抗原或者其片段.在一個特定的實施方案中，我們對表達RHDVVP60抗原或者其片段的植物葉片或者細胞在存在一種磷酸鹽緩沖液(PBS)的情況下進行了勻漿并且通過離心實現了對細胞碎片的分離，我們獲得了一種含有RHDVVP60抗原或者其片段的抗原相，其隨后同一種油性佐劑進行了混合。實施例2描述了經作為抗原來源的本發明的表達栽體進行感染的植物的制備、疫苗的制劑化以及所述的抗原進行的兔的免疫以及兔的免受RHDV致死負荷的保護。實施例1pICPPV-NK-VP60表達載體的構建1-1'PICPPV-M-VP60表達載體的構建使用一種低錯誤率的聚合酶(Expand"High-fidelity，BoehringerMannheim)通過PCR對編碼MDVVP60結構抗原的序列進行了擴增(從一個含有其pUC-VP60序列的質粒中(RiveraTorres,1998，AlternativestoclassicvaccinationagainstmyxomatosisandhemorrhagicdiseaseintheEuropeanrabbit(Oryctotaguscuniculus).InMolecularBiology,Madrid:UniversityofMadrid),在擴增中所使用的寡聚脫氧核糖核苷酸的標識為SEQIDNo.l和SEQIDNo.2。在擴增之后從瓊脂糖凝膠中純化的PCR產物經T4DNA聚合酶的處理以使該片段的末端銑化，隨后以限制性酶Kpnl處理該產物，這是由于在擴增中所使用的標識為SEQIDNo.2的寡聚核苷酸在擴增片段末端產生了一個所述的靶位點.我們使用了中間質粒pUC18-NK(上文給出的Ferndndez-Ferr^ndez，1999)以輔助嵌合體構建過程.以限制性酶NaeI和KpnI對該質粒進行了消化，并且在處理之后以經上述處理的含有VP60基因的PCR產物對該質粒進行連接。所產生的質粒稱為pUC18-NK-VP60,通過以Xhol酶作為第三種酶而使用三聯體連接將pUC18-NK-VP60質粒的EcoRV-KpnI片段引入pICPPV-NK克隆(上文給出的FeriUndez-Feri^ndez，1999)以產生完全的嵌合體pICPPV-NK-VP60克隆，該克隆保藏于CECT[見微生物保藏部分]。PPV的完整cDNA基因組定位并克隆于pICPPV-NK中，處于花椰菜花葉病毒的啟動子35S的控制之下(L6pez-Moya&Garcia,2000.VirusResearch68，99-107)，這允許了在以DNA直接接種的植物中的體內病毒轉錄物的產生，1.2.植物的接種將存在于構建自pICPPV克隆的質粒(野生型或者突變體)的全長cDNA稀釋至濃度250ng/ng，并且以lOfil的該稀釋物對這些植物進行接種，每植物接種3片葉，事先以金剛砂(碳化硅)對葉片進行了噴灑.或者，可使用Helios"基因槍"(BioRad)方法進行該植物的接種，該接種所使用的量可低至10ng每植物(L6pez-Moya&Garcia,2000,同上文)。以pICPPV-NK-VP60克隆進行接種的植物受到了感染，感染的過程和癥狀類似于經野生型pICPPV克隆進行接種的植物。1.3.蛋白印跡分析來自于感染植物的樣品經5mM磷酸鈉緩沖液，p!H.S的勻漿后通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離.根據在(Garciaetal.，1992.Virology188,697-703)中描述的方案，這些樣品被轉移至硝酸纖維素膜上并且以一種抗RHDVVP60的多克隆抗體進行孵育.所使用的二抗為山羊抗兔IgG,該抗體同過氧化物酶相偶聯(JacksonImmunoresearchLaboratories),以ECl/"試劑盒對該過氧化物酶反應進行顯色(AmershamPharmaciaBiotech),蛋白VP60在接種后15天(d.p.i.)易于被蛋白印跡測試檢出；最高水平的積累達到了21d.p.i.(圖1).15d.p.i.時，通過以抗VP60抗體進行的蛋白印跡測試不能檢測出除完整蛋白外的其它條帶(數據未出示)，但是，在21d.p.i.條帶在抗VP60蛋白印跡測試中很明顯，遷移率對應于約38kDa(植物1)、44kDa(植物9)以及46和33kDa(植物15)的截短蛋白(圖1)。盡管我們不能排除這些條帶中的一些對應于降解蛋白的可能性，但是有可能大多數所述的條帶是嵌合基因組的特定不穩定性的結果.通過對病毒cDNA片段中異源基因的部分缺失的檢出而證實了該假設，該cDNA片段通過免疫捕獲多聚酶鏈反應而從被感染組織中擴增(數據未出示)。在任何情況下，完整的RHDVVP60蛋白在多數植物體內是主要的形式，這表明該系統有效地表達具有實用的特定大小蛋白的能力。實施例2抗RHD的重組亞基疫苗2.1.疫苗的制劑化將來自于經野生型PPV或者PPV-NK-VP60[產生自表達栽體pICPPV-NK-VP60的嵌合體(病毒)]感染的植物的葉片在PBS中進行勻漿(以l:l或者l:2w/v的比例)并且通過離心除去細胞碎片，將抗原相(葉片提取物)同一種油性佐劑以53:47(v/w)的比例進行混合直至形成雙水/油/水乳液，如此而制劑化成疫苗。油相由Marcol-52、Simuso1-5100以及Montanide-888的混合物組成.我們制備了4種不同的基于植物的疫苗.我們將一種滅活的商業疫苗(CYLAPHVD，FortDodgeVeterinaria)同油性佐劑一起使用以作為實驗對照，該疫苗可用于防止兔出血熱.這些疫苗通過皮下注射而進行胃腸外給藥。2.2,以來自經PPV-NK-VP60感染的植物的提取物對兔進行的免疫，以及對RHDV侵襲的保護我們研究了RHDVVP60蛋白在RHDV的天然宿主兔中的免疫原性，該蛋白以栽體PICPPV-NK-VP60在植物中進行表達，在該抗原的第一次給藥27天后通過HI測試分析血清樣品中特異性抗體的存在(見表1)(該測試包括兔血清中抗RHDV抗體水平的測定，該測定通過人類紅血球凝集抑制試驗而進行)。組I(經來自于表達完整蛋白VP60的PPV-NK-VP60感染植物的提取物的接種)中，10只兔中的9只表現出具有不同滴度的特異性VP60抗體，其范圍介于1/20到1/320之間，在III組(接種所用的提取物除完整VP60蛋白外還積累了一種約44kDa的缺失形式)中也觀察到了類似的抗體滴度.組II(接種所用的植物除完整的VP60蛋白外積累一種38kDa的缺失形式)的4只兔中的3只產生了較低的血清學反應(滴度介于1/20到1/40之間)。在經商業疫苗CYLAPHVD(FortDodgeVeterinaria)接種的動物體內(組V)，抗體反應較高并且更為均一(動物顯示出介于1/320到1/640之間的滴度)。正如預期，以來自于野生PPV感染的植物的提取物進的特異性抗體.初始免疫33天后(D33)，對所有的動物均進行了加強。在第67天(D76)通過HI測試的方法分析抗體滴度并且對這些動物接種以致死的RHDV侵襲.對照組(IV和VI)保持陰性，而在其它接種組中血清學的反應提高，以CYLADHVD和完整VP60蛋白進行接種的組中(組V和I)再次檢測出了最高的滴度，隨后是以還積累VP60蛋白的缺失形式的植物進行接種的組(組iii好于組n),侵襲是充分的，這是因為在以野生型PPV病毒感染的植物進行接種的組以及未接種的組中RHDV造成的死亡率為100%,并且在它們的肝臟中檢測到了RHDV(表1).在以毒性RHDV進行的實驗性感染期間，除一只外其它所有的對照組IV和VI的動物在侵襲后3天內死亡(另一只此后5天死去)，而在以CYLADHVD(組V)或者以PPV-N￡-VP60感染的植物進行接種(組I、II和III)的動物體中未觀察到臨床癥狀.侵襲兩周之后，存活的動物被放血并且殺死.總體上，根據HI測試的測定，存活動物體內的抗體滴度在侵襲兩周之后變高(表l).在存活動物的肝臟內未檢測到RHDV病毒.因此，我們可以得出結論，以只表達完整形式VP60蛋白或者同時還表達缺失形式的VP60的植物提取物進行接種的動物發展出一種特異性體液免疫應答并且受到保護免于遭受RHDV的致死侵襲。結論1.RHDVVP60結構蛋白已經在PPV-NK表達載體中表達，該栽體在編碼PPV的蛋白NIb和CP的順反子之間表達了編碼所述的目的蛋白的序列。2.嵌合體PPV-NK-VP60與野生病毒具有相同的感染特征.3.以來自于經PPV-NK-VP60嵌合體感染的植物的提取物對兔進行的免疫(RHDV天然宿主)在它們體內誘導出一種特異性的并且有效的抗RHDV的抗體反應.這些動物被保護不受RHDV的致死侵襲,表1抗RHDV及致死侵襲的抗體滴度結杲<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>846<1/201/160S1/1280<28471/401/320S1/640<28481/201/320S1/1280<2組IIIPPV-NK-VP60A9(完整以及~44kDa的缺失形式的VP60,植物9)8391/201/320S1/640<28401/3201/1280S1/5120<28421/201/640S1/10240<28441/401/640S1/2560<2組IVPPV-wt(無插入，植物16)900<1/20<1/20DY+324096809<1/20<1/20DY+324096813<1/20<1/20DY+3S4096816<1/20<1/20DY+324096組VCYLAP,(FortDodge疫苗)8511/3201/5120S1/10240<28531/3201/2560S1/5120<2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>'這些植物根據圖l進行編號b這些兔在第0天(D0)被接種，在第27天被放血(D27).它們在第33天(D33)被加強接種，在第67天(D67)被再度放血，并且在同一天(DY)被侵襲。存活的動物(S)在侵襲后兩周(DY+15)被放血并且宰殺。cHI測試抗HHDV的抗體在兔血清中的水平通過人類紅血球凝集抑制測試進行檢測。在DO這些兔對于RHDV呈血清陰性(HI滴度<l/20).dHA測試通過人類紅血球凝集測定了RHDV的存在。滴度<2被視為陰性。微生物的保藏含有質粒pICPPV-NK-VP60的大腸桿菌DH5ot的細胞在2000年八月8日保藏于西班牙典型培養物保藏中心(CECT)，Burjasot，Valencia(西班牙)，其對應于保藏號CECT5348。序列表(1)常規信息(1)申請人:(1)名稱BOARDOFSCIENTIFICRESEARCH(2)街道113Serrano(3)城市馬德里H)省份馬德里C5)國別ES(6)郵政編碼28006")電話915855000(8)傳真914413077申請人(i)名稱FORTDODGEVETERINARIA，S丄(2)街道CarreteradeCamprod6ns/n"LaRiba"(3)城市VaildeBianya(4)省份GironaC5)國別ES")郵政編碼17813(7)電話972290001(8)傳真972290102(2)發明名稱兔出血性疾病疫苗及抗原U)序列數2H)SEQ.ID.NO.1的信息(1)序列特征(1)長度18堿基(2)類型核酸C3)鏈數單鏈(4)拓樸構型線性(2)分子類型核酸(xi)序列描述SEQID.NO.1:ATGGAGGGCAAAGCCCGC(2)SEQ.ID.NO.2的信息序列特征長度23堿基(2)類型核酸(3)鏈數羊鏈(4)拓樸構型線性(2)分子類型核酸(xi)序列描述:SEQID,NO.2:CAGGTACCGACATAAGAAAAGCC。權利要求1.一種抗兔出血性疾病病毒的重組亞基疫苗，該疫苗包含治療有效量的RHDVVP60結構抗原或其片段，任選還包含佐劑和/或稀釋劑。2.權利要求l的疫苗，其包含佐劑。3.權利要求2的疫苗，其中所述的佐劑為一種由Marcol-52、Simuso卜5100以及Montanide-888的混合物組成的油性佐劑。4.權利要求1的疫苗，該疫苗經制備而用于通過胃腸外途徑對RHDV的宿主動物進行給藥。5.權利要求4的疫苗，該疫苗經制備而用于通過皮下途徑對RHDV的宿主動物進行給藥。6.權利要求l的疫苗，該疫苗經制備而用于通過口服途徑對RHDV的宿主動物進行給藥。7.—種用于獲得權利要求1的重組亞基疫苗的方法，該方法包括(a)獲得RHDVVP60結構抗原或其片段，(b)分離包含一種抗原相的提取物，該抗原相含有所述的RHDVVP60結構抗原或其片段，并且任選(c)將所述的抗原相與佐劑和/或稀釋劑混合。8.權利要求7的方法，其中所述的包含一種含有所述RHDVVP60結構抗原或其片段的抗原相的提取物的分離包括，在一種液體介質中對表達RHDVVP60結構抗原或其片段的植物部分或者植物細胞進行勻漿，并且分離細胞碎片。9.權利要求8的方法，其中勻漿在一種含水的液體介質中進行。10.權利要求8的方法，其中所述的細胞碎片的分離通過離心而實現。全文摘要本發明涉及兔出血性疾病疫苗及抗原。使用一種基于李痘病毒(PPV)的病毒載體可在植物中獲得兔出血性疾病病毒(RHDV)的VP60結構抗原或其片段，該載體包含一個啟動子、一個重組DNA序列以及一個克隆載體，該重組DNA序列包含有PPV病毒基因組的全長cDNA和編碼RHDV的VP60蛋白或其片段的DNA序列，該序列插入于該PPV病毒編碼NIb和CP蛋白的核苷酸序列之間。所獲得的抗原能夠在兔中誘導抗RHDV的致死侵襲的保護，并且可被用作抗兔出血性疾病病毒的重組亞基疫苗。文檔編號A61K39/00GK101385854SQ20081012838公開日2009年3月18日申請日期2001年8月30日優先權日2000年9月1日發明者F·羅德里格斯,J·A·加西亞阿爾瓦雷斯,J·普拉納杜蘭,J·里韋拉托雷斯,M·D·費爾南德斯,M·穆里諾申請人:康斯喬最高科學研究公司;福特.道奇.維特林納里亞股份有限公司