專利名稱：治療用粘質沙雷氏菌菌苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及用粘質沙雷氏菌制備的藥物及其用途。
本研究室從蜚蠊內臟中分離純化出一株粘質沙雷氏菌S311株。該菌株為革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，有動力，無莢膜及芽胞，該菌在一般需氧條件下，37℃普通培養基上生長良好，在普通瓊脂平板上，菌落光滑濕潤，凸起，邊緣整齊，呈圓形，生化反應能發酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、苦杏仁甙，產酸不產氣。不發酵鼠李糖、阿拉伯糖、密二糖。能產生胞外脫氧核糖核酸酶。菌種編號CGMCCNO.0744，分類命名粘質沙雷氏菌Serratia marcescens.
粘質沙雷氏菌具有抗腫瘤作用，采用分離動物腸道細菌，對有抑瘤作用的細菌比較篩選發現，腸道菌中粘質沙雷氏菌有直接殺傷腫瘤細胞的作用。粘質沙雷氏菌滅活后的菌苗仍然保持有中等的直接細胞毒。粘質沙雷氏菌苗或者粗提物(細胞膜性結構及其核糖體等)可以制成抗腫瘤的免疫調節劑。用粘質沙雷氏菌制備的治療藥物或免疫制劑的治療范圍包括抗腫瘤、治療癌性胸腹水、免疫調節、輔助放化療治療、升高白細胞、治療牛皮癬、治療尖銳濕疣、治療紅斑狼瘡發熱及皮膚紅斑、治療白塞氏綜合癥。
1.粘質沙雷氏菌苗是很好的免疫誘導劑1.1對脾臟的激活作用S311菌苗主要對網狀內皮系統有免疫促進作用，能引起免疫小鼠脾臟腫大。小鼠腹腔一次性給藥250億/kg(8mg/kg)，3天起脾指數開始增加，7-14天達最高峰，(見表1)。
表1 S311菌苗免疫天數與脾指數的關系免疫天數 脾重(mg)/體重(g) 脾指數P對照組實驗組3 5.75±0.538.52±0.751.48 ＜0.057 3.87±0.428.05±0.632.08 ＜0.0510 4.75±0.679.35±0.881.97 ＜0.0514 4.08±0.586.65±0.551.63 ＜0.0520 4.50±0.686.22±0.721.38 ＜0.051.1.2 對巨噬細胞吞噬功能的作用S311菌苗可以增強小鼠巨噬細胞吞噬功能。按125億/kg(4mg)/kg體重，腹腔一次給藥，7天后C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力增加6.31倍，與對照組比較呈非常顯著性差異(P＜0.01)，不同給藥劑量與吞噬指數的關系見表2。
表2 S311對C57BL/6小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響藥物劑量 動物數腹腔巨噬細胞數細胞吞噬劑量吞噬指數億/kg(只) ×104/ml ug/5×104細胞NS 0.5ml10102.0±25.3 0.118±0.196S31131.2510120.0±27.8 0.370±0.175**3.14S31162.5 10143.5±32.1 0.540±0.196**4.58S311125 10178.1±29.9 0.745±0.177***6.31S311250 10168.0±25.1 0.660±0.180***5.59注釋與對照組比較**P＜0.05***P＜0.011.2誘導腫瘤壞死因子(TNF)的作用S311菌苗可以體外誘導小鼠巨噬細胞TNF-α的產生。在C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞培養上清液中加入5×106菌數/ml，誘導TNF殺傷活性最高，與基因重組TNF-α樣品比較，相當于2000U/ml劑量范圍。經S311菌苗刺激3小時的巨噬細胞上清液即可測出TNF的殺傷活性，12小時產生的活性最高，以后隨時間增加活性不再增加，反而逐漸下降，見

圖1。
1.3誘生小鼠干擾素的結果S311菌苗具有較強的誘導小鼠脾細胞產生干擾素的能力。體內試驗，將S311菌苗免疫4天的小鼠脾細胞體外培養，干擾素活性出現，免疫7天達高峰(7.47log2U±0.31log2U/ml)，以后逐漸下降。體外試驗，正常小鼠脾細胞體外培養，加0.1億菌苗/ml，12小時可以測出干擾素活性，48小時達到高峰(8.23log2U/ml±0.30log2U/ml)。
1.4 對造血系統影響的研究小鼠升白試驗按中國生物制品規程2000年版暫行規定，第20頁金黃色葡萄球菌濾液制劑制造及檢定規程附錄3《升白細胞試驗》進行。結果環磷酰胺對照組與正常對照組比較白細胞下降，統計學有非常顯著性差異，S311菌苗給藥組與環磷酰胺對照組比較，給藥組白細胞上升，統計學有非常顯著性差異，連續2批小白鼠試驗結果一致。
2 粘質沙雷氏菌苗有抗腫瘤作用2.1 抑瘤試驗
2.1. 體外腫瘤細胞增殖抑制試驗對人體腸癌M7609、小鼠白血病P388、人體肺腺癌LAX、髓性白血病K562、人體卵巢癌ao10/17，IC劑量(半數致死劑量)分別為3.94億(126μg/ml)、3.3億(105.55μg/ml)、5.5億(176.63μg/ml)、5.2億(168.68μg/ml)、及7.8億(250.4μg/ml)。結論粘質沙雷氏菌苗對腫瘤細胞有中等療效的直接細胞毒作用。
2.2.1 體內抑瘤試驗粘質沙雷氏菌苗按62.5億/kg、125億/kg、187.5億/kg三個劑量隔日給藥5次，三種瘤譜的三次重復試驗結果如下2.1.2 對艾氏腹水癌的抑制生命延長率分別為46.28％±2.83％；54.17％±5.66％；57.71％±6.02％。按死亡抑制率計算，腹腔給藥的抑制率為90％。靜脈給藥抑瘤效果不顯著。
2.1.3 對P388白血病腹水癌的抑制腹腔給藥生命延長率為48.72％±8％；60.00％±11.4 4％；61.3 6％±4.74％。靜脈給藥效果不顯著。
2.1.4 對B16黑色素瘤肺轉移的抑制；腹腔給藥生命延長率分別為46.08％±5.27％；51.68％±6.00％；57.73％±3.18％。靜脈給藥生命延長率分別為50.39％±6.51％；58.25％±8.01％；65.03％±7.48％。
2.1.5 腹腔內給藥對小鼠肝癌HCA脾接種肝轉移生命延長率分別為42.6％、49％、56.8％。
2.1.6 小鼠取脾接種HCA肝癌細胞，采用定量逆轉錄-聚合酶鏈反應技術(reverse transcriptase-polymerase chain reaction RT-PCR)檢測粘質沙雷氏菌苗給藥組與生理鹽水對照組nm23基因、Tiam-1基因的表達水平。結果粘質沙雷氏菌苗可明顯抑制小鼠肝癌HCA腫瘤轉移相關基因nm23-1和Tiam-1的表達。S311菌苗給藥組與生理鹽水對照組小鼠比較，腫瘤原發灶及轉移灶nm23-1癌轉移相關基因表達的抑制率分別為45.2％、46.1％。Tiam-1基因表達的抑制率分別為29.1％、28.7％。表明粘質沙雷氏菌苗對小鼠HCA肝轉移的抑制作用與nm23-1、Tiam-1癌基因的表達抑制有關。
3、臨床研究3.1 由上海醫科大學附屬腫瘤醫院、江蘇省腫瘤醫院、浙江省腫瘤醫院、天津室腫瘤醫院、北京市腫瘤醫院、中山醫科大學附屬腫瘤醫院、北京胸部腫瘤醫院開展的粘質沙雷氏治療癌性胸水250例臨觀察，有效率92.1％，高于目前現有治療癌性胸水的藥物。
3.2 南京鼓樓醫腦外科采用Omaya化療囊瘤內注射粘質沙雷氏菌苗的治療惡性神經膠質瘤的人體實驗證明，采用粘質沙雷氏苗苗療效非常顯著，隨訪術后1～4年的18例患者，13例存活，其中3例存活3.5年，4例存活4.5年，其中惡性程度很高的9例II～III級和IV級患者，隨訪8例存活，而同等級同期對照組腫瘤患者1年內無一例存活(附圖)。惡性神經膠質細胞是一種常見的預后不良的嚴重疾病，防治效果難以令人滿意，死亡率高。粘質沙雷氏菌苗的局部應用，為惡性神經膠質細胞瘤的治療提供了一種新的提高手術存活率的有效方法。
3.3 南京鼓樓醫院化療介入科用粘質沙雷氏菌苗治療癌性腹水10例，有效率(CR+PR)8例。治療后9例病人KPS評分升高，生活質量得到改善。其中5例病人腹腔化療失敗者，經S311抗癌菌苗治療后1例CR，1例PR。用粘質沙雷氏菌苗瘤內注射治療實體瘤9例，腫瘤完全消退1例，腫瘤縮小50％以上4例，腫瘤縮小50％以內2例。
3.4 上海中醫大學附屬岳陽醫院腫瘤科，用粘質沙雷氏菌苗治療晚期腫瘤病人16例，有效率7例，其中一例病人肺癌肝轉移灶5枚2枚消失。
3.5 海軍401醫院用粘質沙雷氏菌苗治療銀屑病42例，總有效率90.5％，治療前后IgG、IgA、IgM有顯著差異。結果表明，粘質沙雷氏菌苗治療銀屑病與免疫功能增強有關。
3.6 湖北荊門第二人民醫院血免科，用粘質沙雷氏菌苗治療紅斑狼瘡56例，證明粘質沙雷氏菌苗有消退紅斑狼瘡皮膚紅斑和治療紅斑狼瘡高熱的作用。并且在治療干燥綜合癥及白塞氏綜合癥上取得療效。
3.7 海寧市性病檢測中心用粘質沙雷氏菌苗治療尖銳濕疣10例，痊愈有8例，有效2例，總有效率100％。目前南京中科院皮膚病研究所用粘質沙雷氏菌苗做免疫誘導劑，正在探討粘質沙雷氏菌苗治療尖銳濕疣的機理。
本發明具有創新性，其特點是該項研究成果獲得國家生物制品一類新藥證書，編號國藥證字(2000)S-05號。
用粘質沙雷氏菌苗研究成功治療癌性胸腹水及腫瘤的藥物，產品具有創新性。治療用粘質沙雷氏菌菌苗對銀屑病、紅斑狼瘡皮膚紅斑、紅斑狼瘡性高熱、尖銳濕疣、白塞氏綜合正、干燥綜合癥有治療作用，該研究結果，不僅為上述疾病的治療提供了新方法，而且為這些疾病的研究提供了新思路。
粘質沙雷氏菌苗生產工藝簡單。該研究結果除了部分已經發表論文外，大部分內容沒有公開發表。
權利要求
1.治療用粘質沙雷氏菌制備的藥物或免疫制劑，水針劑主要成分為粘質沙雷氏菌菌苗和溶劑或溶液；凍干粉針劑主要成分為粘質沙雷氏菌菌苗和賦形劑，其特征是藥物中含粘質沙雷氏菌。
2.根據權利要求書1所述，其特征是給藥途徑包括注射、口服、滴鼻。
3.根據權利要求書1所述，其特征是用途包括治療癌性胸腹水、腫瘤、升高白細胞、輔助放化療治療、可以作為免疫調節劑，治療銀屑病、尖銳濕疣、白塞氏綜合癥、干燥綜合癥、感冒、紅斑狼瘡皮膚損害和發熱。
全文摘要
本發明治療用粘質沙雷氏菌菌苗，用于抗腫瘤及調節免疫功能。該藥物可以治療癌性胸腹水和腫瘤，對一些免疫性疾病有輔助的治療作用。粘質沙雷氏菌是一種具有抗腫瘤作用的菌種，其抗腫瘤作用誘導內原性抗腫瘤免疫因子，菌種本身對腫瘤細胞有中等強度的直接細胞毒。研究資料提供了粘質沙雷氏菌菌苗治療與免疫功能密切相關的一些疾病療效，粘質沙雷氏菌抗原有抗過敏作用，有提高細胞免疫及體液免疫的功能，有廣泛藥用開發前景。
文檔編號A61K35/74GK1465353SQ0211199
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月5日 優先權日2002年6月5日
發明者靳小青, 何曉文, 鈕燕, 陸翠琴 申請人:靳海, 中國人民解放軍海軍醫學研究所, 靳 海