專利名稱：治療用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制活性的化合物的治療用途。
本發明特別涉及這樣的化合物抑制正常細胞向癌細胞轉化的用途，即所述化合物是癌癥化學預防藥物。
近年來發現由于其DNA的一部分向癌基因即激活時導致惡性腫瘤細胞形成的基因的轉化，細胞可以變成癌細胞(Bradshaw，誘變(Mutagenesis)，1986，1，91)。幾種這樣的癌基因導致了是生長因子受體蛋白質的產生。該生長因子受體復合體接著導致細胞增殖的增加。已知，例如，幾種癌基因編碼酪氨酸激酶并且一些生長因子受體也是酪氨酸激酶(Yarden等，生物化學年度綜述(Ann.Rev.Biochem.)，1988，57，443；Larsen等，藥物化學年度報告(Ann.Reports in Med.Chem.)1989，第13章)。
受體酪氨酸激酶在引發細胞復制的生物化學信號的傳遞中是重要的。它們是跨越細胞膜的大的酶并且具有對生長因子例如表皮生長因子(EGF)的胞外結合域和作為對蛋白質中磷酸化酪氨酸氨基酸的激酶發揮功能的胞內部分，因此影響細胞增殖。在結合不同受體酪氨酸激酶的生長因子家族的基礎上已知各類受體酪氨酸激酶(Wilks，癌癥研究進展(Avances in Cancer Research)，1993，60，43-73)。分類包括I類受體酪氨酸激酶，包括EGF家族的受體酪氨酸激酶，例如EGF，TGFα，NEU，erbB，Xmrk，HER和let23受體，II類受體酪氨酸激酶，包括胰島素家族的受體酪氨酸激酶，例如胰島素，IGFI和胰島素-相關受體(IRR)受體和III類受體酪氨酸激酶，包括血小板衍生的生長因子(PDGF)家族的受體酪氨酸激酶，例如PDGFαa，PDGFβb和集落刺激因子1(CSF1)受體。
已知I類激酶例如EGF家族的受體酪氨酸激酶常常存在于普通的人上皮癌癥例如乳腺癌(Sainsbury等，大不列顛癌癥雜志(Brit.J.Cancer)，1988，58，458；Guerin等；癌基因研究(Oncogene Res.)，1988，3，21和Klijn等，乳腺癌研究與治療(Breast Cancer Res.Treat.)，1994，29，73)，非小細胞肺癌(NSCLCs)包括腺癌(Cerny等，大不列顛癌癥雜志(Brit.J.Cancer)，1986，54，265；Reubi等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)，1990，45，269；和Rusch等，癌癥研究(Cancer Research)，1993，53，2379)和肺鱗狀細胞癌(Hendler等，癌癥細胞(Cancer Cells)，1989，7，347)，膀胱癌(Neal等，柳葉刀(Lancet)，1985，366)，食道癌(Mukaida等，癌癥(Cancer)，1991，68，142)，胃腸癌例如結腸癌、直腸癌或胃癌(Bolen等，癌基因研究(Oncogene Res.)，1987，1，149)，前列腺癌(Visakorpi等，組織化學雜志(Histochem.J.)，1992，24，481)，白血病(Konaka等，細胞(Cell)，1984，37，1035)和卵巢癌、支氣管癌或胰腺癌(EP-A-0400586)。隨著對其它人腫瘤組織測試EGF家族的受體酪氨酸激酶，預期將確立其廣泛流行于其它腫瘤例如甲狀腺癌和子宮癌。更近一些時候證明(W J Gullick，Brit.Med.Bull.，1991，47，87)具有酪氨酸激酶活性的EGF受體在很多人類癌灶中過量表達，例如在腦、肺鱗狀細胞、膀胱、胃、乳腺、頭和頸、食管，婦科和甲狀腺腫瘤中。
因此認識到受體酪氨酸激酶的抑制劑應該具有作為上皮癌細胞生長的選擇性抑制劑的價值(Yaish等，科學(Science)，1988，242，933)。
從EP-A-0566226和國際專利申請WO-A-96/33980和WO-A-97/30034已知一些在4-位具有苯胺基取代基的喹唑啉衍生物具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性并且是癌組織增生的抑制劑。
進一步從國際專利申請WO-A-96/30347和WO-A-97/38983得知一些在4-位具有苯胺基取代基的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。
接下來已經證明很多其它4-苯胺基喹唑啉衍生物及其結構相關的化合物具有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。任何具有該活性和適當的生物利用度的這樣的化合物適合在本發明中使用。
曾陳述過的具有強的EGFR酪氨酸激酶抑制活性的特定化合物包括N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(下文用編號ZD1839表示)；N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(下文用編號CP358774表示)；6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(下文用編號PD0183805表示)，公開于，例如，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)，1999，42，1803-1815；和吡咯并嘧啶(下文用編號PKI 166(CGP75166)表示)。
所有上述化合物都涉及全癌細胞的治療。因此，相信這樣的EGFR酪氨酸激酶抑制劑操作抑制ER-癌細胞中EGFR向下游傳遞信號并且從而抑制這樣的細胞增生。
對于正常細胞，已知EGF在于培養基中生長的各種沒有轉化的上皮細胞中可能具有致有絲分裂作用(Carpenter等，生物化學年度綜述(Annual Reviews in Biochemistry)，1979，48，193)，包括來自小鼠乳腺的細胞，但是EGF在某些細胞系中和在小鼠天然增殖乳腺組織中也具有生長抑制作用(Coleman等，高等生物學(Developmental Bioloqy)，1990，137，425)。
我們發現EGFR酪氨酸激酶抑制劑不僅對轉化的上皮癌細胞的生長有影響而且還對正常上皮細胞的組成型生長也有影響。例如，在正常女性乳腺上皮組織中，雌激素刺激正常生長并且誘導黃體酮受體的表達。
這使得在乳腺上皮中介導第二性甾體的激素作用。例如乳腺上皮細胞的組成型生長包括隨著婦女年齡而降低和更年期之后的細胞非雌激素依賴性基準轉換。
因此，使用涉及在無胸腺的BALB/c nu/nu小鼠中人正常乳腺組織和原位乳腺癌的移植和生長的異種移植模型(Holland等，國家癌癥研究所雜志(J.National Cancer Institute)，(1997)，89，1059和Gandhi等，癌癥研究(Cancer Research)，(2000)，60，4284-4288)，我們現在發現EGFR酪氨酸激酶抑制劑對絕經期之前良性和惡性前[原位導管癌(Ductal Carcinoma In Situ)(DCIS)]乳腺上皮的組成型和雌激素-刺激增殖有影響。對組成型和雌激素-刺激生長的抑制影響提供了一種抑制正常細胞轉化為癌細胞的方法，即婦女化學預防治療的基礎，特別是那些有著發生惡性乳腺癌高度危險的那些婦女。
因此可以使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑來降低優選抑制上皮細胞特別是乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態。
假設已知EGF對某些細胞系和小鼠天然增殖乳組織能夠具有生長抑制作用，大概是通過其生長受體，令人驚奇的是實際上阻斷這樣的生長接受的化合物(EFGR抑制劑)也應該減少增殖。
因此，不象有效操作阻斷雌激素對雌激素受體的作用并且降低細胞產生EGF/TGFα的常規抗雌激素例如他莫昔芬，并且與先前提到的EGFR抑制劑對ER癌細胞的操作機理(也與EGFR阻斷相關)相反，相信當體內對良性乳腺上皮癌或體內對非侵襲性乳腺癌(或者ER+或者ER-)施用時，EGFR抑制劑是通過直接阻斷酪氨酸激酶的細胞增殖作用而工作的。因此，通過直接阻斷EGFR酪氨酸激酶，細胞的激素敏感性性質變得無關；即，藥物通過非激素機理發揮作用。
更詳細地，首先關于乳腺中的細胞生長，大多數生長細胞是EGFR+和ER-。在沒有EGFR抑制劑存在下，雌激素(只)刺激ER+細胞，其分泌EGF產生，其接著作用于ER-細胞以旁分泌方式誘導增殖。本發明的EGFR TK抑制劑直接結合ER-細胞上的EGFR來抑制這樣的增殖。
另一方面，通過來自組織基體和生長因子的存活信號防止細胞死亡(編程性細胞死亡)。胰島素樣生長因子(IGFI)通過IGFI受體傳遞信號來防止乳腺中細胞死亡。
Roudabush等人的近期工作(生物化學雜志(J.Biol.Chem)，(2000)，275，22583-22589)證明IGFR誘導的IGFR刺激作用導致在細胞外分泌一種EGF家族成員，其接著對細胞本身和鄰近細胞的EGFR起作用。因此本發明中的EGFR TK抑制劑阻斷乳腺中的EGFR，因而導致體內和體外乳腺上皮中的細胞死亡(編程性細胞死亡)。
令人驚奇地，EGFR TKI不僅能直接作用于ER-細胞上表達的EGFR，而且還獨立地作用于ER+細胞。
R B Clarke等，在癌癥研究(Cancer Research)(1997 574987-4991)中證明，正常ER+/EGFR-上皮乳腺細胞不增殖，而鄰近ER-/EGFR+細胞增殖，這表明存在兩種增殖機理，即下面兩種細胞的雌激素刺激(1)ER+細胞和(2)EGF和由ER+細胞分泌的相關配體，這樣旁分泌刺激鄰近EGFR+/ER-細胞。
通過用EGFR TKI抑制TK，防止鄰近ER-/EGFR+細胞增殖。
另外，我們的數據證明EGFR TKI也防止雌激素誘導的黃體酮受體在ER+細胞中的表達并且減少ER+細胞轉換。
因此，雌激素誘導在正常ER+細胞中的甾體化合物激素受體和蛋白質合成，使得細胞增殖和生長和激素反應性，并且分泌作用于鄰近ER-乳腺上皮細胞的生長刺激因子(例如，EGF)。
另外，EGFR TK抑制劑防止雌激素在ER+細胞中誘導黃體酮受體，因此降低乳腺上皮的激素敏感性和刺激并且防止正常組織向癌組織的轉化。
在沒有達到絕經期前雌激素水平的正常乳腺組織中降低至大約5％的黃體酮受體標記指數(PRLI)在施用雌激素時提高至15％(I JLaidlaw等，內分泌學(Endocrinology)(1994)，136，164-171)。使用ZD 1839拮抗雌激素刺激消除了該提高，從而導致10％的PRLI。
另外，可以對上皮組織特別是乳腺上皮組織使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其已經發展至正常上皮特別是正常乳腺上皮和惡性侵入上皮特別是惡性侵入乳腺上皮之間的非侵入中間階段，或者防止這樣的細胞增殖或者引起上皮組織這樣的細胞實質上恢復至正常狀態。
這樣的中間階段細胞的例子是與乳腺管和/或腔中存在的非典型的管增生、小葉瘤形成和非侵入原位癌細胞相關的那些細胞。乳腺癌高危發生患者體內可能存在這樣的細胞。
根據本發明的第一方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于降低、優選抑制沒有侵入乳腺癌的人特別是婦女體內上皮細胞特別是乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的藥物的用途。
根據本發明的第二方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于降低、優選抑制沒有侵入乳腺癌的人特別是婦女體內上皮細胞特別是乳腺上皮細胞從如上定義的中間狀態轉化為惡性狀態的藥物的用途。
根據第一和第二方面的本發明特別應用于乳腺癌高危發生患者，稱之為“高危”患者。已知在稱之為Gail Risk的模型上將高危患者分類作為具有至少1.5分的患者，Gail Risk模型是評價乳腺癌危險度可接受的計算機生成的程序(參見M.H.Gail等，J.Natl.CancerInst.，(1989)，81，1879-1886)。增加發生乳腺癌危險度的因素包括存在與非典型的增生(包括直系親屬確實有乳腺癌的歷史)、小葉瘤形成、非侵入原位癌相關的中間細胞或者存在突變體BRCAI基因(參見D.L.Page等，BMJ，(1994)，309，61-64)。
因此，本發明特別應用于中間細胞的處理。
在上述本發明第一方面的優選方案中，提供了選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的藥物的用途。
在本發明該方面的更優選的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839在制備用于抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的藥物的用途。
在上述本發明第二方面的優選方案中，提供了選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的藥物的用途。
在本發明該方面的更優選的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839在制備用于抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的藥物的用途。
根據本發明的第三方面，提供了降低、優選抑制沒有侵入乳腺癌的人特別是婦女上皮細胞特別是乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該第三方面的優選方案中，提供了抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該方面的更優選的方案中，提供了抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839。
根據本發明的第四方面，提供了降低、優選抑制沒有侵入乳腺癌的人特別是婦女上皮細胞特別是乳腺上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該第四方面的優選方案中，提供了抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該方面的更優選的方案中，提供了抑制人特別是婦女乳腺上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839。
在本發明第一和第二方面情況下，本發明的這些第三和第四方面特別應用于高危患者并且用于治療如前定義的中間細胞。
根據本發明的第五方面，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑制備用于引起上皮組織特別是乳腺上皮組織從如上定義的處于正常上皮特別是正常乳腺上皮和惡性侵入上皮特別是惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質逆轉回正常狀態的藥物的用途。
在本發明該第五方面的優選方案中，提供了選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于引起乳腺上皮組織從處于正常乳腺上皮和惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質逆轉回正常狀態的藥物的用途。
在本發明該第五方面的更優選的方案中，提供了EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839制備用于引起乳腺上皮組織從處于正常乳腺上皮和惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質上逆轉回正常狀態的藥物的用途。
根據本發明的第六方面，提供了引起上皮組織特別是乳腺上皮組織從處于正常上皮特別是正常乳腺上皮和惡性侵入上皮特別是惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質上逆轉回正常狀態的方法，包括對沒有侵入乳腺癌的人特別是婦女施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該第六方面的優選方案中，提供了引起乳腺上皮組織從處于正常乳腺上皮和惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質上逆轉回正常狀態的方法，包括對人特別是對婦女施用有效量的選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
在本發明該第六方面的更優選的方案中，提供引起乳腺上皮組織從處于正常乳腺上皮和惡性侵入乳腺上皮之間的中間狀態實質上返回正常狀態的方法，包括對人特別是婦女施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839。
使用中，可以單獨施用EGFR酪氨酸激酶抑制劑或者以含有藥學可接受賦形劑的組合物形式施用。優選地，以片劑形式施用。
一般以給予有效的無毒劑量施用。劑量的大小自然根據選擇的具體EGFR酪氨酸激酶抑制劑和給藥途徑而不同。一般可以使用每種EGFR酪氨酸激酶抑制劑的常規劑量。特別地，對于EGFR酪氨酸激酶抑制劑CP358774、PD0183805和PKI 166，可以根據關于這些化合物的出版物的常規劑量進行使用。更具體地，對于EGFR酪氨酸激酶抑制劑ZD1839，以例如大約10mg至5g、優選大約10mg至1000mg、更優選大約10mg至500mg(即大約0.2mg/kg至100mg/kg體重、優選大約0.2mg/kg至20mg/kg體重、更優選大約0.2mg/kg至10mg/kg體重)范圍的日劑量施用，如果需要，分次給藥。
上文定義的細胞轉化的抑制作用可以作為單獨治療施用或者除了EGFR酪氨酸激酶抑制劑例如ZD1839之外，可以涉及一種或多種其它物質和/或治療。通過同時、依次或間歇施用治療的各成分可以實現這樣的聯合治療。例如，對于有發生乳腺癌平均危險度以上的婦女，當使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑來抑制乳組織轉化為乳腺癌時，一般情況下可以使用不同形式治療的組合。這樣的聯合治療的其它成分可以包括抗雌激素例如他莫昔芬、fulvestrant(ICI 182，780faslodex)或雷洛昔芬。例如采用大約1-6個月的第一治療期，在這段時間期間施用常規劑量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑例如ZD1839，接著是大約1-6個月的第二治療期，在這段時間期間施用常規劑量的抗雌激素例如他莫昔芬、fulvestrant或雷洛昔芬，這樣的持續治療可能是有益的。從而允許通過這樣一個時期允許乳腺組織一定的組成型生長以使組織萎縮程度最小。
或者聯合治療可以包括連續施用抗雌激素例如他莫昔芬、fulvestrant或雷洛昔芬，并且間歇地施用EGFR酪氨酸激酶抑制劑例如ZD1839。EGFR酪氨酸激酶抑制劑間歇性治療可以包括例如兩個月一周期的治療，其包括涉及用EGFR酪氨酸激酶抑制劑例如ZD1839給藥大約一個月時間的第一部分和接著的涉及不施用EGFR酪氨酸激酶大約一個月的第二部分。此后可以給予又一個兩個月一周期的這樣的治療。
現在參照下面的實施例和附圖將更詳細地描述本發明的實施方案，其中

圖1對于實施例2詳細說明ER-/EGFR+和ER+/EGFR-DCIS上皮中增殖(Ki67 LI)和編程性細胞死亡(AI)；以及圖2對于實施例3詳細說明(a)DCIS和(b)正常乳腺中的ZD18389劑量響應。
實施例1利用涉及在雌性無胸腺BALB/c nu/nu小鼠中人正常乳腺組織和原位乳腺癌的移植和生長的異種移植模型(Holland等，國家癌癥研究所雜志(J.National Cancer Institute)，(1997)，89，1059和Gandhi等，癌癥研究(Cancer Research)，(2000)，60，4284-4268)，測定本發明EGFR酪氨酸激酶抑制劑的作用。對雌性小鼠以異種移植植入來自接受治療手術的婦女的正常乳腺組織和原位導管癌(DCIS)組織。14天后，以10至200mg/kg每天給藥ZD1839，持續14天。在第0、14、21和28天對異種移植組織切片。在第二套實驗中(使用正常乳腺異種移植)在第14天對對照和治療小鼠皮下植入17β-雌二醇(2mg)小丸，并且使用常規Ki67免疫染色評價上皮增殖(Ki67是對細胞中一種標記物的單克隆抗體)。
得到下面的結果
實施例2方法概述在每個實驗中，將來自接受DCIS手術的16名婦女的乳腺組織植入16-20只免疫抑制小鼠(8個異種移植物/小鼠)。移植后2星期開始治療，并且包括每日管飼10-200mg/Kg的ZD1839持續14-28天；存在適當對照物。在第14、21、28和42天取出異種移植物，然后通過Ki67免疫染色評價增殖(LI)，通過形態學評價編程性細胞死亡(AI)。
材料和方法患者這項實驗的參與者是在1998年11月至2000年1月期間在Nightingale Breast Screening Assessment Centre或theSymptomatic Breast Clinic at the University Hospital of SouthManchester，U.K.就診的婦女。如果其乳房X線照片表明DCIS廣泛微鈣化或者細胞病理學或組織病理學證實了診斷，則這樣的婦女包括在該項研究中(n＝16)。所有的組織樣品在治療性切除DCIS時獲得。the South Manchester Medical Research Ethics Committee批準從這些病理樣品取出組織。
動物從Paterson癌癥研究所飼養中心獲得完整的、成年的、雌性、8-10周齡、無胸腺裸鼠(BALB/c nu/nu)。在常規情況下圈養，在頂部置濾網的籠中給與12-小時光暗周期(暗期從7PM至7AM)。它們自由進食照射過的飼料和過濾過的水并且在飼養期間照射褥草。在實驗期間使用正常食物、水、和褥草。根據Home Office Regulations and the UKScientific Procedures(1986)Act小心照料動物并且進行手術過程。對所有的手術使用氟烷吸入麻醉(2-4％氧上的氟烷；HalovetVapouriser，International Market Supplies，Congleton，U.K.)。
組織樣品的處理為了制備用于移植給小鼠的組織樣品，在手術時從主要樣品取出包含微鈣化的1-2cm3乳腺組織切片。將該新鮮組織剝離過量脂肪并且立即在無菌條件下分成3或4小份，并且在對小鼠移植之前在室溫下置于Dulbecco’s Modified Eagle培養基(DMEM)，其中有4.5g/L葡萄糖并且沒有丙酮酸鈉(Gibco Life Technology，Paisley，Scotland，UK)中。在實驗室中，將組織置于無菌培養皿中的新鮮DMEM中，并且用解剖刀片小心將組織切成2-mm×2-mm×1-mm的樣品。根據可獲得的組織的體積，從培養皿隨機選擇5至20片并且不植入小鼠，但是取而代之的是用于組織學分析。立即在緩沖的福爾馬林(4％-甲醛)中將這些沒有植入(第0天)的移植物的一半固定24小時，另外一半在Carnoy’s固定液中固定1小時，然后將所有的樣品保存在70％乙醇中。至少24小時之后，分別將固定的組織樣品置于組織盒中(Tissue Tek 111；Bayer Diagnostics Ltd.，Basingstoke，UK.)并且保存在70％乙醇中直到用石蠟包埋。將這些代表從每一位患者切下的DCIS的樣品標記為“第0天”的樣品，并且預留用于組織學觀察、免疫染色、和編程性細胞死亡。將剩下的異種移植物移植給裸鼠。
異種移植物移植給裸鼠和在實施例1中一樣，將每一名患者的樣品分給10至32只小鼠(取決于組織的體積和可獲得的小鼠數目；中值，16)。從患者取出組織的90分鐘內完成對小鼠的異種移植物的移植。在背部皮膚上交叉切兩個小的中線皮膚切口，通過該切口對稱放入8片組織(每邊4片)。在需要再次麻醉小鼠的合適的時間點提取回這些異種移植物，并且使用利刃解剖切除每一個移植物。然后處理移植物用于如上對第0天樣品所述的組織學分析。對于100-200mg/kg ZD1839實驗，在第14、21和28天取出移植物；以較低劑量(10-75mg/kg)，在第14、28和42天取出移植物。在每個期中時間點從每一只小鼠取出兩個異種移植物，并且在每個終時間點取出4個異種移植物。
處理在取出頭兩個異種移植物之后第14天開始或者用ZD1839(10-200mg/kg)或者用賦形劑對小鼠管飼14-28天。ZD1839(4-(3-氯-4-氟苯基胺)-7-甲氧基-6(3-(4-嗎啉基)喹唑啉)是口服活性的選擇性EGFR-TKI，由AstraZeneca Pharmaceuticals饋贈。賦形劑(對照)是0.5％多乙氧基醚。
異種移植物的組織學評價將所有的第0天樣品和每一個異種移植物包埋在石蠟塊中。由一名有經驗的乳腺病理學家對來自每一塊的H & E染色的3-μm切片檢查是否存在DCIS；如先前所述對含有DCIS的那些評價編程性細胞死亡和Ki67抗原免疫原性(作為上皮增殖的標記物)。
也對所有的第0天樣品確定核級(nuclear grade)以及存在或不存在粉刺-壞死。另外，對第0天樣品免疫組織化學評價ER，c-erbB-2，EGFR狀態。
編程性細胞死亡的評價使用光學顯微鏡對H & E-染色的DCIS樣品切片檢查編程性細胞死亡的形態學證據。用來鑒定編程性細胞死亡的標準是認識充分的，并且包括在核緣處開始的染色質的濃縮；胞質的濃縮(嗜染性)；從周圍細胞分離，由垂死細胞周圍特征性白色暈圈的存在所指示；并且胞質發育形成與膜結合的片段(編程性細胞死亡體)。為了獲得Al，使用Zeiss顯微鏡以×400放大倍數計數至少1000個細胞，并且顯示出編程性細胞死亡形態學的細胞數表示為總計數的百分比。ER和Ki67核抗原的免疫組織化學測定使用ER和Ki67免疫組織化學方法。這些先前都描述過(Gandhi等，大不列顛癌癥雜志(Br.J.Cancer.)(1998)，78，785-794)。ER和Ki67染色主要是核，有少量胞質攝入。染色強度是不同的，但是這不分開評價，對細胞判斷為陽性或陰性。從計數1000個上皮細胞最小值計算Ki67標記指數(LI)，并且將陽性染色細胞核數表示為總計數的百分比。還計數1000個細胞確定ER狀態，如果對于ER陽性染色＞5％細胞，則認為是損傷ER+。
c-erbB-2，EGFR和pErk1/Erk2的免疫組織化學測定從每一個樣品切下石蠟切片(3μm厚)，在APES(3-氨基丙基乙氧基甲硅烷)包被的載玻片上固定，在對c-erbB-2、EGFR和磷酸化(p)Erk1/Erk2免疫化學染色之前脫蠟和水合。通過微波方法(650W)使抗原恢復30分鐘(min)。通過在磷酸緩沖鹽水(PBS)中在過氧化氫[對于EGFR和c-erbB-2是1.5％(v/v)以及對于pErk1/Erk2是3％(v/v)]中溫育15分鐘來封閉內源過氧化物酶活性。對于c-erbB-2和EGFR抗原，在使用10％正常兔血清之前在TBS中洗滌載玻片來阻斷特異性結合，然后對于EGFR(小鼠單克隆抗人，NCL-EGFR；Novocastra labs，Newcastle upon Tyne，UK)以1∶20的稀釋度，對于c-erbB-2(小鼠單克隆，MAB4022，Chemicon，Harrow，UK)以1∶40的稀釋度，在室溫下與第一抗體溫育1小時。使用生物素化兔抗-小鼠免疫球蛋白(E413，Dako，High Wycombe，UK)作為第二抗體(1∶350稀釋度，溫育30分鐘)，接著對于c-erbB-2和EGFR在室溫下與標準三層鏈霉抗生物素-抗生物素蛋白-生物素辣根(K0377，Dako)溫育30分鐘。
對于pErk1/Erk2抗原檢測，在用以1∶20的稀釋度使用多克隆兔抗-人pMEK，pErk1/Erk2，pElk1第一抗體(9101L，New EnglandBiolabs，UK)之前用20％正常人血清封閉切片15分鐘。施用1∶100(Euro/DPC，Llanberis，UK)稀釋度的Biogenex Multil Link為第二抗體1小時。使用抗生物素蛋白/生物素復合物免疫組織化學試劑盒程序(Biogenex Concentrated Label，Euro/DPC)。
施用發色團二氨基聯苯胺(Sigma，Poole，UK)5分鐘，然后施用蘇木精作為復染劑5分鐘。
使用陰性(小鼠屬IgG，X0931，Dako)和陽性對照(對于EGFR是A431細胞的切片，對于c-erbB-2和pErk1/Erk2是先前表現出強陽性的DCIS組織)。
對于c-erbB-2和EGFR主要是膜染色，但是也有胞質和細胞核攝入。相對于陽性和陰性對照載玻片，將這些評分為正(等級為1-4)或負。對于pErk1/Erk2是細胞核和胞質染色，并按照前述方法(Gee等，Int.J.Cancer(1995)，64，269-273)根據細胞核和胞質成分中染色的強度來評分。
由對處理組不知情的研究人員進行所有的組織學評價。由同一研究人員評價計數的再現性，對用Ki67抗體染色的10個載玻片重新評分，開始的評價之后幾個月對10個H & E載玻片評價編程性細胞死亡。通過回歸分析表明這樣獲得的兩套結果相關性很好(r＝0.95，P＜0.001)正常小鼠腸中上皮增殖用于Ki67評價的腸組織的取出和處理以及計分方法都如前所述(Potten和Grant，大不列顛癌癥雜志(Br.J.Cancer)，(1998)，78，993-1003)。
統計方法由Paterson癌癥研究所的計算機和生物數學CRC部使用SPSS軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)進行統計學分析。對于表現出正常乳腺上皮或DCIS的每一種情況，在各評價時間點上，在從ZD1839處理的和對照小鼠得到的樣品之間進行比較。認為兩個研究組中每個測評時間獲得的組織樣品有統計學依賴性并且利用Mann Whitney U檢驗比較。所有的統計顯著性檢驗都是兩面的(two-side)，使用常規的5％的統計顯著性水平。在證明所有劑量下作用的最初分析后折算出(collapse)來自各ZD1839劑量的數據。利用Pearson’s相關系數來檢查測量變數之間的相關度。通過比較隱窩中個上皮細胞位置中值對腸上皮中增殖進行統計學分析。
結論接受手術的婦女的中值年齡是n＝范圍(絕經狀態)。
異種移植物植入和取回DCIS手術時發現16個含有DCIS的乳腺組織樣品中，13(81.3％)個產生含有DCIS的第0天樣品，其中11個免疫組織化學表達EGFR+，中值分數是2(范圍1-3)，并且2個是EGFR-。其中有11例EGFR+情況，7例是ER-/c-erbB-2陽性(都是高核級)，并且3例ER+/c-erbB-2陽性(1例高級，2例中間級)，以及1例ER+/c-erbB-2陰性(低級)。13個乳腺組織樣品給出共273個第0天樣品，其中44例(16.1％)含有DCIS病灶。共植入1904個異種移植物，其中1858個(97.5％)成功取回。在1858個取回的異種移植物中，329個(17.7％)含有DCIS。每項實驗DCIS的中值取回是預期的71％(范圍14-91.3％)。在第14、21、28天取回DCIS，在所有13個實驗中共取出42個異種移植物。
正常乳腺在對于DCIS經手術取出的所有16個樣品中都發現組織學正常的乳腺組織。取回了大部分(97.6％)植入的異種移植物，其中22.4％含有正常乳腺。100％所有的實驗中所有的時間點都取回了正常乳腺。所有16種情況都是中值分數是1(范圍1-2)的ER+和EGFR+，并且2也是弱c-erbB-2陽性。
正常乳腺(表1)表1顯示不同時間點ZD1839(10-200mg/kg[折算數據(collapseddata)])相對賦形劑處理的(a)正常乳腺(b)DCIS上皮中EGFR+增殖(LI)和編程性細胞死亡(AI)。括號中的數字代表四分位數的間距(interquartile range)**p＜0.01，***p＜0.001相對對照物。
正常乳腺異種移植物中值Ll從第0至14天降低(4.9[IQR4.0-5.7]對3.8[IQR2.7-5.1]，p＜0.05)，其然后對其它時間點保持不變(第21、28、和42天)。與對照物相比ZD1839處理組中的中值Ll降低，第21天(2.3[IQR1.0-3.8]對4.1[IQR2.8-5.2])，第28天(2.2[IQR1.7-3.3]對4.1[IQR2.4-5.4])，以及第42天(1.7[IQR1.1-2.6]對2.8[IQR2.3-5.1])(均為p＜0.01).
Al發現與上面DCIS處理的異種移植物的發現相似。從第0天至第14天，沒有觀察到中值Al的降低(0.20[IQR0.17-0.29]對0.18[IQR0.10-0.21]，p＝0.90)。第21天，與對照相比，ZD1839處理的異種移植物中的中值Al有所增大(0.36[IQR0.23-0.53]對0.18[IQR0.10-0.25，p＜0.001]。處理14天之后(第28天)，中值Al平衡到對照物水平(ZD1839 0.19[IQR0.10-0.28]對對照0.18[IQR0.10-0.20]，p＝0.35)。表1正常乳腺和DCIS上皮上的ZD1839對增殖和編程性細胞死亡的影響第0天第14天 第21天 第28天中值對照 ZD1839 對照ZD1839Ll正常乳腺 4.9 3.8 4.12.3**3.4 2.2**(4.0-5.7)(2.7-5.1) (2.8-5.3) (1.0-3.8)(2.4-5.4)(1.7-3.3)DCIS 13.9 12.611.2 4.6**13.15.1**(11.9-15)(9.1-14.1) (9.7-12.9) (3.2-7.2)(11.8-15.8) (3.2-10.6)Al正常乳腺 0.20 0.180.18 0.36**0.180.19(0.18-0.29) (0.10-0.21) (0.10-0.25) (0.23-0.53) (0.10-0.20) (0.10-0.28)DCIS 1.07 0.790.72 1.47**0.460.64(0.89-1.21) (0.53-1.19) (0.55-0.91) (1.25-2.18) (0.34-0.85) (0.38-1.15)Ll/Al正常乳腺 23.9 25.715.9 3.9***33.88.5***(18.3-43.3)(13.4-33.3) (8.0-26.3) (1.6-5.2)(21.4-70.6) (5.8-17.4)DCIS12.1 12.117.7 2.7***29.74.4***(8.4-15.8) (8.2-19.9) (12.7-22.0) (2.2-3.6)(13.1-40.2) (2.7-6.9)
EGFR+DCIS(圖1)圖1分別顯示ER-/EGFR+(1a和1c)和ER+/EGFR+(1b和1d)DCIS中ZD1839誘導的LI and AI的變化。從第14天開始給予ZD1839或賦形劑。第0和14天的值來自未處理的小鼠。處理7和14天之后在ER-/EGFR+和ER+/EGFR+DCIS兩者中在ZD1839組中都見到AI的升高和LI的降低(*p＜0.05，**p＜0.01相對對照物)。括號中的數字代表對特定時間點和對于那個組觀察的次數。粗水平線表示中值，方框代表四分位數的間距。
在ER/EGFR+DCIS的7種情況中第0天樣品的中值Ll和Al分別比ER+/EGFR-DCIS的4種情況高(14.0[IQR13.0-15.3]對7.8[IQR6.5-11.2]，和1.3[IQR1.0-1.6]對0.79[IQR0.6-1.0]，兩者p＜0.05)。
與賦形劑對照組相比ZD1839-處理組中的ER-/EGFR+DCIS中值Ll降低，第21天(4.7[IQR2.6-17.2]對11.6[IQR10.7-15.1]，p＝0.19)，第28天(8.3[IQR2.7-10.9]對13.5[IQR12.0-16.3]，p＜0.01))和第42天(11.4[IQR10.8-11.8]對13.0[IQR12.0-14.8]，p＜0.05)(圖1a)。
從第0-14天ER-/EGFR+DCIS中值Al沒有變化(1.3[IQR1.0-1.6]對1.0[IQR0.8-1.44]，p＝0.14)。處理7天之后(第21天)，與賦形劑對照組相比，ZD1839-處理組中值Al顯著提高(2.1[IQR1.0-2.3]對0.7[IQR0.5-1.1]，p＜0.01)，但是處理14天之后(第28天)，中值Al恢復至對照水平(ZD1839 1.1[IQR0.8-1.2]對對照物1.2[IQR 0.5-1.5]，p＝0.44)(圖1b)。
第14天明顯可見ER+/EGFR+DCIS(圖1b和1d)中的LI和AI的相似變化，第14天(ZD1839 4.6(IQR 3.9-5.2％)對11.2對照物(IQR 9.2-15.55)有明顯的下降并且編程性細胞死亡增加(ZD18391.5(IQR 1.3-1.6)對對照物(IQR 0.6-0.9％)。
EGFR+中的K167 LI(圖2)圖2顯示用不同劑量的ZD1839(10-200mg/kg)或賦形劑對照物管飼2周之后(第28天)在EGFR+(a)DCIS和(b)正常乳腺異種移植物中上皮增殖速度(Ki67 LI)。括號中的數字代表對特定時間點和對那個組觀察的次數。粗水平線表示中值，方框代表四分位數的間距。
漸增劑量的ZD1839與ER-/EGFR+和ER+/EGFR+DCIS中上皮增殖的遞降有關，但是在正常乳腺中不是這樣(圖2)。
增殖與編程性細胞死亡的相關關系我們前面已經證明DCIS中Ll與Al的正相關關系。正常乳腺中和ZD1839(即第0天，第14天，和賦形劑對照物情況)沒有處理的DCIS中(分別是r＝0.10、p＝0.02和r＝0.25，p＜0.01)，Ll表現與Al正相關。
利用中值Ll/AI比(作為細胞反轉的比例)比較細胞群，揭示在DCIS和正常乳腺中的ZD1839處理明顯抑制細胞反轉，第28天(分別是4.4[2.7-6.9]對29.7[13.1-40.2]，和8.5[5.8-17.4]對33.8[21.4-70.6]，p＜0.001)。
EGFR TKI處理的DCIS和正常乳腺中pErk1/2的負調節為了測定EGFR酪氨酸激酶抑制對MAP激酶信號傳導途徑是否有影響，對用ZD1839或賦形劑處理的DCIS和正常乳腺異種移植物的第0天和第42天切片進行磷酸化(p)ErK1/Erk2的免疫組織化學檢測。中值第0天DCIS和正常乳腺核H評分是30(IQR12-45)和22(IQR12-34)。在DCIS中，28天處理之后，與對照相比較，ZD1839處理組中核H評分降低(8[IQR5-18]對25[IQR8-30]，p＜0.05)。正常乳腺中有類似差別(7[IQR3-17.5]對18[IQR8-32]，p＜0.01)。
pErK1/Erk2的核H評分與DCIS和正常乳腺中的Ki67 Ll相關(兩者都是r＝0.52，p＝0.05)。
討論ER-DCIS過量表達c-erbB-2癌基因，據報道50％情況下表達EGFR。我們發現ER-DCIS的11個中有10個(90％)在相同細胞群上雙重表達兩個受體。ER-DCIS具有高增殖速度，在預處理樣品中其與MAP激酶信號轉導酶的高表達相關。
因此我們假設EGFR/c-erbB-2異二聚體的形成是高增殖速度和MAP激酶表達的原因，并且利用EGFR-TKI肽、ZD1839，我們驗證了我們的理論。用ZD1839處理時，觀察到的上皮增殖的延長降低和激活的MAP-激酶表達的降低以及早期編程性細胞死亡的增加證實我們的假設。已知EGFR產生致有絲分裂的信號并且與侵入乳腺癌中增殖和腫瘤倍增相關，對該途徑的抑制導致DCIS異種移植物中Ki67標記指數的降低。
處理7天之后看到DCIS和正常乳腺上皮中編程性細胞死亡的增加。盡管相信胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在細胞存活中是重要的，但是最近Roudabush等的工作(生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，(2000)，275，22583-22589)指明了IGF-1受體刺激導致胞外分泌肝素結合-EGF并且促進EGF受體的反式激活。因此，與先前認識的相比，在正常乳腺中EGFR對細胞存活可能更重要。因為上皮增殖與正常乳腺中編程性細胞死亡相關，預計增殖的降低與編程性細胞死亡的減少相關。ZD1839處理組7天之后編程性細胞死亡開始增加之后，標記指數的降低(增殖)導致14天編程性細胞死亡的減少。但是，DCIS和正常乳腺中ZD1839處理組中總Ll/Al比例降低，表明EGFR-TK抑制減少總的細胞反轉。此外，細胞反轉總的減少表明EGFR TKI對正常乳腺的潛在的化學預防作用。
據報道廣泛局部切除術之后，ER-高級別DCIS容易復發，復發時至少50％變成侵入高級乳腺癌，并且涉及結或遠端轉移。防止復發和發展成為侵入癌癥需要抑制增殖或增加編程性細胞死亡的物質，描述的EGFR-TKI符合該標準。
與編程性細胞死亡增加結合的正常乳腺上皮增殖的抑制表明EGFR-TK抑制劑作為有乳腺癌增加危險的婦女的化學預防藥物的潛力。
相信在細胞增殖、成活和分化中EGFR MAP激酶途徑是重要的。DCIS和正常乳腺中pErk1/Erk2與Ki67標記指數的顯著性正相關關系提示MAP-激酶信號傳導對在乳腺上皮中介導細胞增殖中是重要的。ZD1839處理組中pErk1/Erk2的降低與增殖減少相關，并且通過該途徑的EGFR信號和MAP激酶改變有可能預示藥物反應。
實施例3利用實施例1的方法，其中操作步驟在實施例2中更完全地描述，測定了ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮增殖的影響(Ki67 LI)。表2給出了結果。
在正常乳腺上皮中，第0天，即對小鼠植入的這天，Ki67 LI值是4.1，并且在第14天降低至2.6。然后單獨用雌激素處理對照小鼠，同時用雌激素和ZD1839處理試驗小鼠。施用的雌激素的量相當于絕經前水平；即17-β-雌二醇小丸(2mg)(參見Holland等，參見實施例1)。
21天之后，對照小鼠的Ki67 LI值高達6.5高，而試驗小鼠的值大大降低至1.4的值。28天之后，對照小鼠的Ki67 LI值是5.4，而對于試驗小鼠，該值持續降低至1.1這樣低的水平。
表2ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮增殖(Ki67 LI)的影響
括號中的數代表四分位數的間距*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001對對照物實施例4再次利用實施例1的方法，測定ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮編程性細胞死亡(AI)的影響。表3給出了結果。
在正常乳腺上皮中，第0天，即對小鼠植入的這天，AI值是0.3，并且在第14天降低至0.2。然后單獨用雌激素處理對照小鼠，同時用雌激素和ZD1839處理試驗小鼠。施用的雌激素的量相當于絕經前水平。21天之后，對照小鼠的AI值高達0.5，而對于實驗小鼠，該值甚至更高，是0.7的值。28天之后，對照小鼠的AI值是0.6，而對于實驗小鼠該值保持在0.7水平。
表3ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮編程性細胞死亡(AI)的影響
括號中的數代表四分位數的間距**p＜0.01相對于對照物實施例5利用和實施例1相同的實施方案，測定ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮中黃體酮受體表達(PR LI)的影響(黃體酮受體增強細胞的激素響應)。表4給出了結果。
在正常乳腺上皮中，第0天，即對小鼠植入的這天，PR LI值是11.8，并且在第14天降低至5.8。然后單獨用雌激素處理對照小鼠，同時用雌激素和ZD1839處理試驗小鼠。施用的雌激素的量相當于絕經前水平。21天之后，對照小鼠的值PR LI升至高達17.2，而對小鼠，該值只是10.4。因此ZD1839抑制PR表達的雌激素誘導。因此，性甾族化合物黃體酮和雄激素的激素作用(正常下通過黃體酮受體介導)被抑制。
表4ZD 1839對雌激素刺激的正常乳腺上皮PR表達(PR LI)的影響
圓括號中的數代表四分位數的間距 **p＜0.01對對照物從上面這些結果可以看到，如上文所述，對正常乳腺細胞組織組成型生長的抑制作用和對正常乳腺細胞組織死亡的促進作用提供了一種抑制正常細胞轉化為癌細胞的方法，即對婦女、特別是具有較高的發生惡性乳腺癌危險的那些婦女化學預防性治療的基礎。
對正常乳腺上皮的研究表明激素替代治療(HRT)提高了黃體酮受體的表達(參見Hargreaves等，大不列顛癌癥雜志(Br.J Cancer)，(1998年10月)，78(7)，945-949和Hofscth等，臨床內分泌代謝雜志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)，(1999年12月)，84(12)，4559-4565)并且結合的HRT(雌激素和黃體酮)提高乳腺上皮增殖的程度顯著大于只用雌激素時的HRT(參見Hofstch，上文)。長期使用結合的HRT與只用雌激素的HRT相比提高了乳腺癌的誘導比率(參見Persson等，Cancer Causes Control，(1999年8月)，10(4)，253-260；Colditz，婦女健康雜志(J.Womens Health)，(1999年4月)，8(3)，347-357；和Magnusson等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)，(1999年5月5日)，81(3)，339-344)。通過抑制黃體酮受體的誘導，黃體酮不能發揮其作用，并且乳腺癌發生率降低。
另外，對雌激素刺激的正常乳腺組織的抑制作用表明，EGFR酪氨酸激酶抑制劑即使在高水平雌激素存在下也單獨工作即對絕經前婦女提供化學預防作用。
因此，EGFR-TK抑制作用提供了治療和預防癌癥的一個新的途徑而不用考慮ER狀態，并且提供了一種有潛力的新的化學預防方法，特別是對高危乳腺癌家族的成員。
權利要求
1.EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從正常轉化為惡性狀態的藥物的用途。
2.EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的中間狀態轉化為惡性狀態的藥物的用途。
3.EGFR酪氨酸激酶抑制劑制備用于引起上皮組織從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的一種中間狀態實質上逆轉回正常狀態的藥物的用途。
4.EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備用于引起上皮組織從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的中間狀態實質上逆轉回正常狀態的藥物的用途。
5.根據任一項前面權利要求的用途，其中所述上皮組織是乳腺上皮組織。
6.根據任一項前面權利要求的用途，其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制劑選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166。
7.根據權利要求6的用途，其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制劑是ZD1839。
8.降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從正常狀態轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
9.降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從中間狀態轉化為惡性狀態的方法，該方法包括施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
10.引起上皮組織從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的一種中間狀態實質上逆轉回正常狀態的方法，該方法包括對沒有侵入乳腺癌的人施用有效量的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
11.根據權利要求10的方法，其中所述上皮組織是乳腺上皮組織。
12.根據權利要求8-11任一項權利要求的方法，其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制劑選自ZD1839、CP358774、PD0183805和PKI 166。
13.根據權利要求12的方法，其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制劑是ZD1839。
全文摘要
本發明涉及EGFR酪氨酸激酶抑制劑在制備在下面用途中使用的藥物中的用途(a)降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從正常轉化為惡性狀態;和/或(b)降低沒有侵入乳腺癌的人上皮細胞從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的中間狀態轉化為惡性狀態;和/或(c)引起上皮組織從處于正常上皮和惡性侵入上皮之間的一種中間狀態實質上逆轉回正常狀態。
文檔編號A61P43/00GK1387437SQ00815290
公開日2002年12月25日 申請日期2000年11月1日 優先權日1999年11月2日
發明者N·J·邦得萊德 申請人:曼徹斯特大學