專利名稱：高靈敏性銀染的方法
背景技術：
發明領域本發明涉及高靈敏性銀染的方法，更具體地，本發明涉及DNA銀染的改進方法，該方法包括將DNA與一種聚合物連接，并且將許多銀離子與DNA-聚合物復合物結合的步驟，所述的聚合物與DNA具有高親和性。現有技術描述通常銀染是通過利用化學或光將與感興趣靶材料連接的銀離子選擇性還原(見Beidler,J.L.等，分析生物化學，126:374(1982)；Goldman,D.和Merril,C.R.,電泳，3:24(1982))并檢測由此產生的銀顆粒的光散射色(見Merril,C.R.,美國科學院院刊，85:453(1988))。
目前使用的銀染方法大致可分為以下幾種堿法，其是將硝酸銀的二胺復合物置于含甲醛的弱酸溶液中以還原在強堿條件下形成的該復合物；酸法，其是在甲醛溶液中還原硝酸銀(見Bassam,B.J.等，應用生物化學及生物工程，42:181(1993))。
盡管銀染技術最初是開發用來檢測丙烯酰胺凝膠電泳的痕量蛋白(見Switzer,R.C.等，分析生物化學，98:231(1979))，經持續的改進，該方法已廣泛用于檢測脂多糖(見Tsai,C.和Frash,C.E.,分析生物化學，119:115(1982))和核酸(見Somerville,L.L.和Wang.K.,生物化學和生物物理研究通迅，102:54(1981))及蛋白質。
直至目前已開發了如下幾種用于檢測DNA的銀染方法二胺復合物銀染法(見Wary,W.等，分析生物化學，118:197(1981))；酸性銀染法(見Heukeshoven,J.和Dernick,R.,電泳，6:103(1985)；Gottlieb.M.和Chavco,K.,分析生物化學98:231(1979))；銅-銀法(見Switzer,R.C.等，分析生物化學，98:231(1979))，等等。然而已證明這些銀染方法仍是令人不滿意的，因為它們不能檢測納克級的DNA，并且精度和重復性不可靠。
因此，強烈需要開發一種高靈敏的檢測DNA的改進方法。發明概述本發明人基于Bassam等的DNA銀染方法(見Bassam B.J.等，分析生物化學，196:80(1991))，開發了一種改進的銀染方法，與傳統的將銀離子與DNA分子直接連接的銀染方法相比，本發明方法能以更高的靈敏性和重復性檢測DNA。
因此本發明的一個主要目的是提供一種改進的高靈敏的DNA分子銀染方法。附圖的簡要說明本發明的上述及其它目的和特征通過參照附圖的下列描述將更加清楚。


圖1(A)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過傳統的Bassam等的方法進行。
圖1(B)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過本發明方法進行。
圖2(A)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過Bassam等的方法進行。
圖2(B)、2(C)、2(D)和2(E)是硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是根據本發明用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸處理而進行。
圖3(A)是顯示用于核苷酸測序的丙烯酰胺凝膠電泳的照片，其中銀染是通過Bassam等的方法進行。
圖3(B)是顯示用于核苷酸測序的丙烯酰胺凝膠電泳的照片，其中銀染是根據本發明用0.2％(v/v)聚丙烯酸處理而進行。發明的詳細描述本發明人改善了Bassam等的用于DNA檢測的銀染方法(見Bassam,B.J.等，分析生物化學196:80(1991))的靈敏性，該銀染方法已知是一種簡便的高靈敏的方法，改進是將含DNA的凝膠浸入含一種聚合物的水溶液中，并使銀離子與DNA-聚合物復合物結合。據此將對于DNA分子具有高親和性的聚合物，優選聚丙烯酸或聚乙烯亞胺，與DNA連接以誘導銀離子顯色。水溶液(例如水)中聚合物的濃度可根據聚合物的種類而變化，但若采用聚丙烯酸，濃度范圍為0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
根據本發明的銀染方法，當將DNA以5mm直徑的圓形點到硝酸纖維素膜上時，甚至是納克級的DNA也可以較高的重復性被檢測出，而相比之下，Bassam等的方法檢測的是微克級的DNA。
本發明的銀染方法可以用于核苷酸測序和檢測痕量DNA分子。
本發明經下述實施例進一步描述，這些實施例不是限制本發明范圍。實施例1聚丙烯酸對銀染靈敏性的影響為研究聚丙烯酸對DNA銀染靈敏性的影響，將稀釋至一定濃度的λDNA以5mm直徑的圓形點到硝酸纖維素膜上。將膜置于溫度保持在65℃的干燥箱中12小時后，令其吸收0.2％(v/v)聚丙烯酸溶液10分鐘。然后根據Bassam等的方法(見Bassam等，分析生物化學，196:80(1991))進行銀染通過用聚丙烯酸處理硝酸纖維素膜并令其在含1g/L硝酸銀溶液和1.5ml/L甲醛的水溶液中吸收20分鐘而使銀離子與聚丙烯酸結合。用蒸餾水潤洗上述硝酸纖維素膜5秒鐘以除去未結合的銀離子并置于含30g/L碳酸鈉、3ml/L甲醛和2mg/L硫代硫酸鈉的顯色溶液中。然后當顯色充分后加入7.5％乙酸終止反應。另外使用根據Bassam等的方法用硝酸銀染色的DNA樣品作為對照。
圖1(A)示出了經Bassam等的方法用硝酸銀染色的硝酸纖維素膜，該方法是目前為止所報道的最好的銀染方法。圖1(B)示出了用本發明方法經聚丙烯酸處理的硝酸纖維素膜。在圖1(A)和圖1(B)中，泳道1-9分別含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、2ng、1ng和100pgλDNA。如圖1(A)和圖1(B)所示，與能檢測1μg DNA的傳統Bassam等的方法相比，采用聚丙烯酸的本發明的方法具有更高的靈敏性，能檢測1ng DNA。這些結果表明新開發的銀染方法改進了DNA檢測的靈敏性。實施例2聚丙烯酸濃度對銀染靈敏性的影響為研究最佳聚丙烯酸濃度，以與實施例1類似的方式分別用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v),0.4％(v/v)聚丙烯酸進行銀染(見圖2(A)-2(E))。圖2(A)顯示用Bassam等的方法進行銀染的硝酸纖維素膜，圖2(B)-2(E)示出分別用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸處理而進行銀染的硝酸纖維素膜。在圖2(A)-2(E)中，泳道1-9分別含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、12ng、1ng和100pgλDNA。
如圖2(B)-2(E)所示，隨著聚丙烯酸濃度的增加，靈敏性也增加，但是當濃度超過0.4％(v/v)時背景信號也增加。因此，確定了銀染的最佳聚丙烯酸濃度是約0.2％(v/v)。實施例3 DNA測序凝膠的銀染為了研究聚丙烯酸對DNA測序聚丙烯酰胺凝膠的銀染的靈敏性的影響，分別用200ng、100ng、40ng、20ng和10ng模板DNA進行DNA測序反應，在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并用硝酸銀染色。
如下所述用TopTMDNA測序試劑盒(Bioneer公司，韓國)進行DNA測序反應。首先將模板DNA(497bp PCR產物)與30pmole引物(5’-GTTTTGGCTTCCAGTTCCACC-3’)混合，用蒸餾水調至終體積為40μl。然后將10μl一份的樣品加到4個獨立的反應管中，每個反應管含TopTMDNA聚合酶、50mM Tris-HCl緩沖液(含2mMMgCl2,pH8.3),和G(20μM ddGTP/6μM dNTP),A(170μM ddATP/6μM dNTP),T(300μM ddTTP/6μM dNTP)和C(200μM ddCTP/6μM dNTP)，如下進行40輪PCR循環94℃5分鐘(預變性)，94℃30秒(變性)，55℃30秒(退火)和72℃1分鐘(延伸)。在擴增反應結束時，向每個反應管中加入4μl終止溶液，其含有98％甲酰胺，10mM EDTA,0.025％二甲苯青和0.025％溴酚藍。95℃加熱5分鐘后，在6％聚丙烯酰胺凝膠上分析每一反應。
圖3(A)和3(B)示出了用Bassam等的方法和用0.2％(v/v)聚丙烯酸處理后本發明方法對DNA測序聚丙烯酰胺凝膠進行銀染的結果。在圖3(A)和3(B)中，泳道1-5分別含有200ng、100ng、40ng、20ng和10ng的模板DNA。
如圖3(A)和3(B)所示，與能檢測100ng級DNA的傳統Bassam等的方法相反，本發明的伴有聚丙烯酸處理的方法甚至在采用10ng模板DNA時亦能檢測到DNA。因此，可以清楚地確定本發明的銀染方法也能高靈敏性和高重復性地用于DNA測序。
如以上所清楚表明的，本發明提供了具有高靈敏性的用于DNA分子的高靈敏性銀染的改進的方法，其甚至能檢測納克級的DNA分子。因此，本發明的銀染方法可以用于檢測和測序痕量DNA。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱百奧聶爾公司等(B)街道124,Cheokbuk-Ri,Namee-Myun(C)城市Cheongwon-Kun,Choongcheongbuk-Do(D)州(E)國家韓國(F)郵編363-810(G)電話0431-60-6060(H)傳真0431-60-2009(ⅱ)發明名稱高靈敏性銀染的方法(ⅲ)序列數1(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release＃1.0,Version＃1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型cDNA-mRNA(ⅶ)直接來源(B)克隆PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GTTTTGGCTT CCAGTTCCAC C
權利要求
1.一種高靈敏性銀染的方法，包括如下步驟通過將含DNA的凝膠浸入含一種聚合物的水溶液中而將DNA與該聚合物連接以形成DNA-聚合物復合物，所述的聚合物與DNA具有高親和性；以及，將銀離子與DNA-聚合物復合物結合。
2.權利要求1的高靈敏性銀染方法，其中聚合物是聚丙烯酸或聚乙烯亞胺。
3.權利要求1的高靈敏性銀染方法，其中水溶液中采用的溶劑是水。
4.權利要求1的高靈敏性銀染方法，其中聚合物在水溶液中的濃度范圍是0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
5.權利要求1的高靈敏性銀染方法，其中含DNA的凝膠是DNA測序凝膠。
6.權利要求1的高靈敏性銀染方法，其中含DNA的凝膠是用于DNA檢測。
全文摘要
本發明提供了一種改進的DNA銀染方法,該方法包括將DNA與一種聚合物連接,并將許多銀離子與DNA－聚合物復合物結合的步驟,所述的聚合物與DNA具有高親和性。本發明的銀染方法能用于檢測和測序痕量DNA。
文檔編號C12Q1/68GK1208441SQ97191718
公開日1999年2月17日 申請日期1997年12月30日 優先權日1996年12月31日
發明者樸翰浯, 金載鐘, 俞在亨 申請人:百奧聶爾公司