專利名稱：重組葡激酶的全dna序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組DNA序列，特別是涉及一種重組葡激酶的全DNA序列。
近年來國外如比利時、日本、德國等國家的研究人員在重組葡激酶的制備和醫療用途這方面作了大量研究工作，并進入臨床試驗研究階段。如《核酸研究》(Nucleic Acids Research)1983年第22期11卷，題為《Nucleotide sequence of the staphylokinase gene from Staphylococcus aureus》報導了一種確定了葡激酶(Sak)的核苷酸序列，推論其多肽序列有163aa，信號肽有27aa，位于NH2·未端。
本發明的目的在于提供一種不含信號肽，且DNA的第33位堿基是A，第275位堿基是T的重組葡激酶的全DNA序列。
本發明重組葡激酶的全DNA序列是TCA AGI TCA TTC GAC AAA GGA AAASer Ser Ser Phe Asp Lys Gly LysTAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTTyr Lys Lys Gly Asp Asp Als SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TATTyt Phe Glu Pro Thr Gly Pro TyrTTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTTLeu Met Val Asn Val Thr Gly ValGAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTAAsp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCTSer Pro His Tyr Val Glu Phe Pro
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本發明重組葡激酶的全DNA序列組裝表達載體，轉化入宿主菌，在宿主菌內通過轉錄，翻譯成重組葡激酶蛋白質。可用于治療心肌梗塞、腦血栓、深度靜脈血栓等血栓性疾病。
下面結合實施例詳細說明本發明制備及測定。本發明重組葡激酶的全DNA序列的制備是1)金色葡萄球菌的篩選首先把金黃色葡萄球菌(S.aurens)接入50ml的LB培養基，37℃溫度下培養8小時，然后劃線在LB-瓊脂1.5%的平板上，溫度37℃下培養過夜。挑取單菌落擴增在5ml的LB培養液中，溫度37℃下培養過夜，離心收集上清液。用發色底物法測定上清液中葡激酶(Sak)的活性，共獲得Sak活性最高的兩個單菌落作為所要篩選的金黃色葡萄球菌(S.aurens)的菌種，分別編號為S-1，S-29，其中S-29的纖溶活性更高，故為選擇對象。
2)具有纖溶活性的金黃色葡萄球菌S-29染色體DNA的提取將金黃色葡萄球菌S-29以1100的比例接種在250ml的LB培養基中，于溫度37℃，轉速250轉/分的條件下恒溫振蕩培養18小時，再加入DNAaseI和RNAase各250μg，室溫反應30分鐘，然后加入固體1.46gNacl，待溶解后置冰浴1小時，在溫度4℃、轉速11000轉/分條件下離心10分鐘，收集上清液。在上清液中加入25g聚乙二醇8000(PEG8000)，待溶解后再次冰浴1小時。然后在溫度4℃、轉速11000轉/分條件下離心10分鐘，收集沉淀。在沉淀中加入4ml的SM溶液(5.8gNacl、2gMgSO4·17H2O、50ml濃度1mmol/l、pH7.5的Tris-Hcl，2%的明膠5ml、加蒸餾水至1000ml)溶解沉淀得粗提液。在粗提液中加入等體積氯仿，混勻，溫度4℃、轉速3000轉/分條件下離心15分鐘，收集水相。再以2500轉/分的轉速離心2小時，收集沉淀。用100ml的SM溶液溶解沉淀，溫度4℃下放置過夜。然后加入蛋白酶K(prote-inase k)至該蛋白酶K終濃度為50μ/μg，同時加入10%的SDS至其終濃度為0.5%，于溫度56℃下反應小時，冷卻至室溫。分別用酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。加入1/10體積濃度為3mol/l的醋酸鈉(PH7.0)，再加入2.5倍體積的無水乙醇進行沉淀。最后用TE溶液(濃度為10mmol/l的Tris-hcl和濃度為1mmol/l的EDTA，PH8.0)溶解沉淀，得到噬菌體DNA，金葡菌噬菌體DNA圖譜如

圖1所示，于-20℃下保存備用。
3)重組葡激酶基因的擴增以噬菌體(S-phi-C DNA)為模板，通過引物1、引物2，采用PCR法擴增葡激酶基因，PCR反應液為雙蒸水 33μlμ10×PCR緩沖液 5μldNTP(2.5mmol/l) 4μl引物1(100pmol) 1μl引物2(100pmol) 1μl噬菌體S-Phi-CDNA(0.22μg/μl) 5μl混勻，溫度95℃下熱變性5分鐘，立即冰浴，加入1μl濃度為2.5u/ml的Taq聚合酶，50ml液體石蠟。
試劑盒PCR反應條件每一循環包括在溫度92℃下反應52秒;在溫度55℃下反應60秒;在溫度72℃下反應70秒;共循環30次。最后在溫度72℃下再反應15分鐘。取5μl電泳檢測，電泳檢測(1%凝膠)PCR反應產物，出現400bp左右的DNA片斷，SAK的PCR產物圖譜如圖2所示。
本發明葡激酶基因的克隆及其序列測定是將上述DNA片斷用載體M13mp19分別用限制性內切酶EcoRⅠ和BamH1酶切，酶切后的兩個片斷再用連接酶T4DNA ligase連接，連接物涂板，挑出陽性克隆，命名為pDAGI，并進行序列測定。(測定試劑盒購自Promega DNA序列分析試劑盒，接試劑盒要示操作。測序由日本金沢醫學院進行)。
測序儀器: DNA測序儀(A.L.F.DNA SegnncerTM)序列分析:
計算機軟件 A.L.F.Manager V2.5 ExperinentalCOnditions電壓 1500V電流 38mA功率 34W樣品間隔 2秒時間 360分溫度 40℃探頭功率(激光強度) 3mW克隆所用載體 puc19(ECoRI-Sakgene-BamH1-Sakgene)克隆用引物 正向引物 Puc18 primer-40反向引物 puc18 Reverse primer測序結果如圖3所示。
權利要求
1.一種重組葡激酶的全DNA序列，其序列為TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAASer Ser Ser Phe Asp Lys Gly LysTAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTTyr Lys Lys Gly Asp Asp Als SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TATTyt Phe Glu Pro Thr Gly Pro TyrTTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTTLeu Met Val Asn Val Thr Gly ValGAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTAAsp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCTSer Pro His Tyr Val Glu Phe ProATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACAIle Lys Pro Gly Thr Thr Leu ThrAAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTCLys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr ValGAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCAGlu Trp Ala Leu Asp Ala Thr AlaTAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAATyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAALeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile GluGTC ACT TAT TTT GAT AAG AAT AAGVal Thr Tyr Phe Asp Lys Asn LysAAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTCLys Lys Glu Glu Thr Lys Ser PheCCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTTPro Ile Thr Glu Lys Gly Phe ValGTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTVal Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATTLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu ILeACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAAThr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys
全文摘要
本發明提供一種重組葡激酶的全DNA序列，不含信號肽，且DNA的第33位堿基是A，第275位堿基是T，該葡激酶DNA組裝表達載體，轉化入宿主菌，在宿主菌內通過轉錄，翻譯成重組葡激酶蛋白質，用于治療心肌梗塞、腦血栓、深度靜脈血栓等血栓性疾病。
文檔編號C12N15/52GK1109508SQ9511122
公開日1995年10月4日 申請日期1995年1月23日 優先權日1995年1月23日
發明者李伯剛 申請人:成都世新藥物技術開發中心