專利名稱：從紫杉的胚胎培養物中產生紫杉酚和塔三烷的方法
技術領域：
本發明涉及從體細胞胚和/或培養基中生產紫杉酚及其衍生物的方法，特別是涉及培養合子胚或體細胞胚以得到體細胞多胚或胚發生愈傷組織的方法。
紫杉酚是一種已從紫杉屬植物中分離的生物堿，并對包括B16黑素瘤在內的多種腫瘤細胞系表現有顯著的抗腫瘤活性。已知紫杉酚主要含在短干紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮中，約為其克干重的0.02%。
雖然已證明紫杉酚的總合成方法是成功的，但這種方法因成本高而似乎不適于商業規模生產。此外，也使用漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ成功地半合成了紫杉酚樣化合物(例如taxotere)。但這種方法也同樣存在上述問題。
因此，只能從這種稀有天然來源，例如收獲的紫杉的粗原料得到紫杉酚。因為紫杉樹中紫杉酚的含量很低，所以為生產1kg紫杉酚必須伐倒2000至4000棵樹，并且，天然來源生產足夠需要的紫杉酚將會導致森林經濟體系的嚴重破壞。因此，試圖從紫杉種的細胞和組織培養物中生產紫杉酚及其相關化合物。
例如，美國專利5，019，504號公開了一種在營養培養基中培養紫杉種的樹皮、形成層、針葉和根組織以產生愈傷組織或懸浮細胞培養物，然后從中回收紫杉酚或紫杉酚樣生物堿的方法。但上述方法從1升細胞懸浮培養基中產生1.0-3.0mg紫杉酚。上述專利述及，紫杉樹樹皮能直接得到最佳產率的紫杉酚，并可通過培養這些組織以誘導未分化的細胞團(愈傷組織)和/或從增殖的愈傷組織構成細胞懸浮培養物而產生紫杉酚。
迄今，上述使用各種紫杉組織的方法尚未商業化，其部分原因是由于相關細胞的紫杉酚產率低，或者由于未能充分建立大規模生產次級目的代謝物的工藝。
國際專利WO92-13961號公開了培養紫杉屬植物的組織，特別是其雌性配子母細胞并從愈傷組織或由之得到的懸浮培養細胞中回收紫杉酚。該方法可得到占懸浮培養細胞干重0.05%的紫杉酚。
這些方法不能以工業規模生產足夠量的紫杉酚，迄今仍有待改善紫杉酚生產能力。這些事實提示，需要提供一種增加細胞和/或培養基中紫杉酚含量及篩選高紫杉酚生產細胞系的改良方法，以適應工業規模生產的最終目的。
在這些情況下，本發明人為建立一種工業規模生產紫杉酚的方法而進行了深入地研究。結果，我們第一次不可預見地發現合子胚比迄今報導的含紫杉酚的其他組織含有更大量的紫杉酚(基于同樣干重)。
因為胚胎本身對于發展工業規模生產紫杉酚的方法來說其體積太小，故本發明人為提供一種增加胚胎質量的方法而作了進一步的探索。結果，我們令人驚奇地發現當將胚胎培養在營養培養基上以誘導體細胞胚或胚發生愈傷組織時，胚胎質量可比原來大小增加幾十萬倍。
基于上述發現而完成了本發明。
因此，本發明的一個目的是通過提取紫杉的組織生產紫杉酚的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
本發明的另一個目的是提供一種培養紫杉的組織并從愈傷組織或培養基中回收紫杉酚以產生紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
本發明的再一個目的是提供一種生產紫杉酚或其衍生物的方法，該方法包括下述步驟(a)從紫杉屬植物提供活的合子胚并消毒之;
(b)在培養基上培養已消毒的胚胎以從胚胎產生愈傷組織;
(c)培養步驟(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產生體細胞胚;
(d)培養步驟(a)中得到的消毒的胚胎或步驟(c)中得到的體細胞胚以產生胚胎發生愈傷組織;
(e)液體培養步驟(c)中得到的體細胞胚或步驟(d)中得到的胚發生愈傷組織;以及(f)從培養基中和從細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
本發明有別于上面列舉的現有技術在于它是基于發現合子胚不可預見地含有大量紫杉酚，并通過誘導體細胞胚或胚發生愈傷組織而進一步增加胚胎的質量，并且因為它使液體培養體細胞胚或胚發生愈傷組織以工業規模生產紫杉酚成為可能而優于現有技術。
通過下列描述，本領域技術人員將很容易了解本發明的其他特征和應用。


圖1(A)是標準品塔三烷(taxane)的HPLC層析圖。
圖1(B)是得自實施例7的純化之培養基的HPLC層析圖。
圖2(A)顯示實驗實施例1中沒有處理的大鼠腫瘤細胞的照片。
圖2(B)是顯示實驗實施例中用實施例7的提取物處理的大鼠腫瘤細胞的照片。
圖3(A)是ELISA數據的標準曲線。
圖3(B)是實驗實施例2中所得ELISA數據的曲線。
圖4是顯示實施例8中生產培養基對紫杉酚生產之影響的圖解。
本發明人分析了種植在韓國國家林地的24，000株東北紫杉(Taxus cuspidata)的紫杉酚含量。雖然每棵樹的含量有明顯的不同，但發現收集自優良樹的100g干胚中含有5g紫杉酚。而從同樣量干樹皮和針葉則分別得到4.5mg和2.0mg紫杉酚。
因此，本發明的第一個目的是提供一種從紫杉屬的胚胎中提取紫杉酚的生產紫杉酚的方法。對紫杉樹木的種類沒有限制，只要是屬于紫杉屬的，任何樹木均可利用，但優選利用的是東北紫杉。
對從胚胎中生產紫杉酚的提取方法沒有限制。然而，一般可用在醇，特別是甲醇中浸漬冷凍干燥的胚胎粉末的方法從胚胎中提取紫杉酚。
不幸的是，合子胚的體積很小且胚胎中含有90%以上的水。須用很大量的胚胎才只生產出小量的紫杉酚，而且從經濟角度看從胚胎中直接提取紫杉酚是不利的。
因此，本發明人已進行了深入地研究，以提供一種以經濟方式生產紫杉酚而沒有上文認定的問題的方法，而且作為其結果可因使用組織培養技術，特別是通過誘導體細胞胚和胚發生愈傷組織而使胚胎質量增加幾十萬倍。因此，本發明的第二個目的是提供一種通過從紫杉屬的合子胚誘導體細胞胚或胚發生愈傷組織，使用搖瓶或生物反應器在液體培養基中培養所說的體細胞胚或胚發生愈傷組織，并從培養基和細胞中回收紫杉酚以生產紫杉酚或其衍生物的方法。
本發明的一個特征是本發明可通過誘導體細胞胚或胚發生愈傷組織以使胚胎的質量增加數萬至數十萬倍，而從除胚胎以外的各種組織簡單地進行愈傷組織誘導則難以達到這樣一個擴增效果，這可能是由所用分生組織的細胞分化能力不同。具體地說，誘導胚發生愈傷組織有可能使胚胎質量增加幾十萬倍，因此是很重要的。
下文將描述從合子胚誘導體細胞胚或胚發生的愈傷組織并生產紫杉酚的方法。
為了無菌培養胚胎，應將8至11月份從紫杉樹上收集的種子消毒或作表面除菌。可使用常規技術進行表面除菌消毒。例如，將種子在70%乙醇中浸沒30-60秒種，用無菌水洗2或3次并用1-3%(v/v)次氯酸鈉溶液除菌24小時。用無菌水將表面除菌的種子淋洗5次并分離胚胎。
可按上述提取技術從胚胎中提取紫杉酚。
也可將胚胎放在固體培養基上以由之誘生愈傷組織。可用PEDC(前胚胎發生決定細胞)或IEDC(誘導的胚發生決定細胞)程序進行體細胞胚的誘導。
按下述步驟使用PEDC方式誘導體細胞胚將胚胎培養在添加有1-萘乙酸(以下稱為“NAA”)、激動素和愈傷組織誘導用之2.4-D的固體培養基上。一旦誘導了愈傷組織，即將愈傷組織的小片再培養在含有適當濃度主營養素、微量營養素及維生素的培養基上使之增殖。
為了誘導和增殖愈傷組織，可使用常規植物組織培養基而沒有什么限制。例如，可使用mB5(改進的Gamborg氏B5培養基)、Durzan，MS((Marashige和Skoog培養基)、WPM(Lloyd & McCown)、DKW(Driver-Kuniyuk-Walnut)、GD(Gresshoff &Doy)、SH(Schenk & Hildebrandt培養基)或LP(Quoirin & Lepiover)。
當然可以對這些培養基進行改動，如加入除去不同的成分，或改變比例。其中優選的是mB5或Durzan。作為體細胞胚發生的一個中間步驟，可使用與用于迅速增殖愈傷組織的培養基相同或不同的培養基進行誘導。從可得到最大數目體細胞胚的角度看，應優先使用mB5培養基。
因為上述的大多數培養基都是可從商業途徑得到的或已很成熟的，所以公眾可以很容易地取得。因此，確定和/或最佳選擇用于誘導和迅速增殖愈傷組織的培養基是本領域技術人員力所能及的。例如，優先用于本發明的mB5培養基是稍加改動的Gamberg′s B5培養基，且其組成如表1所示。

此外，可在另外加有不同的植物生長激素的上文列舉的培養基中培養胚胎，以完成生產體細胞胚的IEDC方法。
對于初始培養，加入2-4ppm的2，4-D。當從胚胎表面生成愈傷組織并且細胞團增加10-20倍時，通常使用加入半量濃度植物生長素的同樣培養基進行再培養。
因為可能從未繁殖的細胞中分泌酚化合物，而使大多數愈傷組織失去其生長能力，所以要摻入0.5%(w/v)活性碳或1-2%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷。在沒有生長調節劑的培養基上再培養愈傷組織2-4個月，以從愈傷組織的分生組織生成體細胞胚。
如此生成的體細胞胚含有大量的紫杉酚或紫杉酚衍生物(下文稱為“塔三烷”(“taxanes”))并且可將其用以提取塔三烷。可使用常規方法，特別是下文所述方法從體細胞胚中提取塔三烷。但為了進一步增加細胞質量最好使用體細胞胚誘生胚發生的愈傷組織。
根據本發明，可以經提取胚發生的愈傷組織及如上產生的體細胞胚而制得相對高比例的塔三烷。可經培養以上述PEDC或IEDC方法得到的體細胞胚或合子胚來產生胚發生的愈傷組織。生產胚發生的愈傷組織的方法如下所述在添加了1.0-4.0ppmNAA和0.5-2.0ppm激動素，較好添加2.0ppm NAA和10ppm激動素的適于培養愈傷組織的固體培養基中將消毒的胚胎或體細胞胚培養2-4個月。可向培養基中加入1-4ppm 2，4-D以代替NAA加激動素。然后在添加1-5ppm細胞分裂素如芐胺嘌呤、N-異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養基中將被誘導的愈傷組織培養1-2個月，以在愈傷組織的表面上形成胚狀體，并將此胚狀體放在添加2-10ppm，2，4-D的同樣培養基上，于26℃及16/8小時(光照/黑暗)條件下培養2-3個月。該培養能夠以很大量，即高達原胚組織質量數十萬倍的量得到胚發生的愈傷組織。胚發生的愈傷組織可顯示廣泛的顏色，例如從黃色、褐色到綠色。
為了誘生和增殖胚發生的愈傷組織，可沒有限制地使用任何一種可用于常規植物細胞和組織培養的培養基。
如上產生的胚發生的愈傷組織含有大量的紫杉酚并可直接用以提取紫杉酚和塔三烷。
可用常規技術，特別是下文所述的方法提取胚發生的愈傷組織。
為了以工業規模擴增胚發生愈傷組織的質量，將胚發生愈傷組織剪切成單個細胞或小的細胞聚集物。為建立細胞懸浮培養物，將10%(V/V)的這些細胞接種到含有50ml添加了2ppm 2，4-D之液體培養基的250ml錐形瓶中。為便于進行連續培養最好使用氣升式或葉輪型生物反應器。
可使用兩種不同的培養基進行生物反應器培養一種是用于細胞生長的(生長培養基)，另一種是用于產生塔三烷的(生產培養基)。生長培養基較好是添加2-4ppm 2，4-D的mB5培養基，生產培養基較好是添加2-10ppm NAA的MS培養基。
具體地說，生產培養基較好含有誘發劑以增加紫杉酚生產。誘發劑可選自真菌誘發劑、雌性配子母細胞提取物(1-5ml/l)、苯丙酸(50-300mM)和GA3(0.5-1.0ppm)、真菌誘發劑包括由Cytospora abietis ATCC No.38688和Penicillium minioluteum(Dierckx)NRRL18467經粉碎和一系列提取而得到的提取物。另外，也可優先選擇和培養Pestalotiopsis的真菌，并將其提取物以0.5-1.0ml/L的量加到培養基中。
紫杉酚存在于細胞中以及分泌到培養基中。因此，培養后可用已知技術培養物或培養基中回收紫杉酚和塔三烷。可用離心法(例如1000xg，5-10分鐘)或傾析法從培養基中分離細胞。如果利用后一種技術進行分離，可將培養液放置約24小時以沉淀細胞并傾去培養基。使用吸管經真空抽吸除去仍保留在收集的細胞中的培養基。
可用醇或甲醇與二氯甲烷的1∶1混合物提取體細胞胚或胚發生的愈傷組織以及培養基，以從中回收紫杉酚。可使用超聲波粉碎器(Branson 250)破碎離心期間形成的沉淀物，并進行提取。
根據本發明，回收紫杉酚本身及各種紫杉酚衍生物。紫杉酚衍生物包括10-脫乙酰漿果赤毒素Ⅲ、漿果赤霉素Ⅲ、10-脫乙酰紫杉酚、cephanolmanin和7-表-10-脫乙酰紫杉酚(參見圖1(B))。紫杉酚衍生物可以如此使用，或者必要時以半合成法轉化成紫杉酚。
可用HPLC、細胞毒性試驗及使用由NCI提供的作為標準品的紫杉酚及六種(6)紫杉酚衍生物進行的ELISA鑒定由體細胞胚和來源于合子胚的胚之胚發生愈傷組織產生的塔三烷。
下面借助非限制性實施例更詳細地描述本發明。
實施例1從紫杉的合子胚中回收紫杉酚從優良的東北紫杉樹上收獲種子。在約40℃的真空烘箱中干燥胚胎組織3天至水含量少于10%并稱重。然后用液氮冷凍胚胎并粉碎之。將粉碎的胚在約含有100倍重量甲醇的約28℃恒溫箱中浸大約7天。通過濾膜(孔徑0.2um)過濾所得提取物，并使用HPLC方法分析紫杉酚的含量。
處理從同一樹上收集的樹皮和針葉并按上述同樣方法分析紫杉酚含量。結果示于表2中。
表2組織 干組織(100g)中的紫杉酚含量胚胎 5g樹皮 4.5mg針葉 2.0mg實施例2使用PEDC方式從胚胎產生體細胞胚。
將從東北紫杉的選擇的基因型得到的種子在70%乙醇和2%過氯酸鈉中分別浸泡50秒和24小時，并在各步驟終止后用無菌蒸餾水淋洗3至5分鐘。
使用添加2.0ppm NAA、0.5ppm激動素和0.5ppm 2，4-D的mB5培養基(具有如上文表1中所示的成分和組成)。在調整到26℃的生長室中體外培養8周。
在前8周培養期間，胚胎增大并從大多數胚的表面誘生了愈傷組織。切掉愈傷組織中的綠色斑點并使之在沒有任何生長調節劑的mB5培養基中培養3個月以誘生體細胞胚。
實施例3使用IEDC方式從合子胚產生體細胞胚。
按實施例2中方法消毒東北紫杉的種子并從中分離胚胎。胚胎在添加2ppm 2，4-D的Durzan培養基中23-28℃培養2周。培養2周后，所有胚胎都被從中誘生的愈傷組織完全包被。培養4周后愈傷組織的質量達到原來質量的幾十倍。
為了避免因其分泌的酚抑制愈傷組織生成或選成死亡，使用補充約1%聚乙烯聚吡咯烷酮的同樣培養基再培養愈傷組織。8周培養后，當愈傷組織的平均直徑達到1-1.5cm時將愈傷組織移入不含植物生長調節劑的mB5培養基中，愈傷組織在其生長以誘生體細胞胚。某些胚中觀察到根的分化。
實施例4為了誘導胚發生的愈傷組織培養物，用實施例2中滅菌的合子胚和實施例3與4中的體細胞胚作為起始材料。
將上述材料在補充2.0ppm NAA和1.0ppm激動素的mB5培養基中23-28℃培養約2.5個月以誘導愈傷組織。完成愈傷組織誘導后，使用加有3ppm玉米素的同樣培養基進行亞培養約6周，以得到綠色到帶黃色的胚狀體。
在16/8(光照/黑暗)小時條件下，將胚狀體在含有3ppm 2，4-D的同樣培養基中26℃培養2個月，以產生質量達原胚幾十萬倍的胚發生愈傷組織。所得到的胚發生愈傷組織在形態學上與來源于各種類型紫杉組織的正常愈傷組織差不多，且有時產生合子胚的相似外觀。
然而，胚發生愈傷組織的表面由多種不同色澤范圍的顏色構成，包括紅、黃、暗綠、淺褐、深褐及黑色。用刀片將各個帶顏色的細胞團塊切成片以得到小的細胞聚集體，然后亞克隆到液體培養基中培養2-4周。從液體培養物中除去大的細胞團后，將單個細胞和/或小的細胞聚集體接種到有20ml培養基的塑料平皿上。摻入的方法是在培養4周后進行液體鋪板并選擇不同的帶顏色細胞系。經常規肉眼選擇得到不同的帶顏色細胞系。
實施例5于25℃干燥實施例2或3得到的體細胞胚或實施例4中得到的胚發生愈傷組織，并溶解在1μ二氯甲烷中。加入1μl蒸餾水并將此混合物攪拌10秒鐘，然后離心(25，000xg)。于25℃干燥沉淀物，溶解在50μl甲醇中并通過0.2μm濾膜過濾以得到提取物。
用裝有反相微孔柱進行HPLC，使用外部標準品的標準曲線(校正系數0.999)分析提取物。HPLC結果顯示，標準塔三烷的峰和含有上述提取物中的塔三烷的峰在同一滯留時間(14.3分鐘)出現。
實施例6按下述方法提取實施例2和3中得到的體細胞胚和實施例4中得到的胚發生愈傷組織，以產生塔三烷將實施例2和3中的體細胞胚和實施例4中的胚發生愈傷組織各0.5g放在離心管中，并加入2μl已烷。用玻璃棒充分混合該混合物并在-20℃保存12小時，然后于25℃，25，500xg離心20分鐘。
向沉淀物中加入甲醇氯化乙烯的混合溶液，用使用超聲波粉碎器(Branson 250)進行超聲處理。離心(25，000xg)所得溶液并于60℃干燥所得沉淀物，得到干燥的提取物。
分離提取的紫杉酚含量并得到下列結果實施例2的體細胞胚的提取物含有0.21-0.27mg/每克干細胞(總紫杉酚含量為0.5-1.2mg);實施例3的體細胞胚的提取物含有0.20-0.27mg(總紫杉酚含量為0.55-1.1mg);且實施例4的胚發生愈佃組織的提取物含有0.23-0.28mg(總紫杉酚含量為0.6-1.4mg)。
實施例7使了大量生產胚發生愈傷組織，使用葉輪型生物發生器培養實施例4的胚發生愈傷組織。
將實例4的胚發生愈傷組織以10%PCV(堆積細胞體積)接種于含有50ml液體mB5培養基(其中加有2ppm的2，4-D)的250ml培養瓶中。當在無菌條件下于25-28℃培養18天時達到靜止期。
將培養物放在含有MS生產培養基(補充有2ppm NAA)的5升葉輪型生物反應器中。在通氣條件下將培養物于25-28℃保持30天。培養30天后，將培養液放置24小時以沉淀細胞，并從培養基中分離出細胞。用吸管從細胞中徹底除去培養基。
按實施例5中所述的同樣方法提取如此分離的細胞和培養基以得到紫杉酚及其衍生物。
HPLC結果顯示標準品紫杉酚和其衍生物的峰(圖1(A))與含在上述提取物中的紫杉酚和其衍生物的峰(圖1(B))出現在同一滯留時間，表明這些化合物是相同的。
已計算出每克干細胞含有0.09mg紫杉酚，而培養基每升約含8mg紫杉酚。
實施例8為了檢測不同類型培養基對紫杉酚生產的影響，將實施例7的培養物接種在各種不同的培養基如MS、mB5、WPM、DKW、Durzan、White、LP、GD、B5、DCR或SH培養基上。所有被試培養基均補加2.0ppmNAA，并平衡調整包括微環境條件在內的其他因素。培養周期減少到20天。
結果示于圖4中。從圖中可以看出，培養基的類型對紫杉酚的產生有很大影響，而且可見MS和mB5可給出最高的紫杉酚產量。
實施例9可在生產培養基中加入各種誘發劑以增加紫杉酚和塔三烷生產量。按下述方法估計誘發劑時紫杉酚產生的影響(1)為本發明目的，在培養基中加入作為紫杉酚之誘發劑的出現在紫杉中之真菌Pestalotiopsis sp.的提取物。
將植物組織如種子和內層樹皮浸在70%乙醇中，使用15%H2O2表示消毒15分鐘后再次浸入70%乙醇中。用無菌蒸餾水將組織淋洗4次或4次以上以除去余留的試劑。將如此表面消毒的組織放在培養基上麥芽提取物瓊脂培養基(麥芽提取物20.0g、胨5.0g、瓊脂15.0g和蒸餾水1升)、生長瓊脂培養基(葡萄糖40g、bacto soyton 10g、乙酸鈉1g、苯甲酸鈉50mg、瓊脂20.0g和蒸餾水1升)及水培養基(瓊脂20.0g和蒸餾水1升)，并維持在12/12(光照/黑暗)小時光照設備的恒溫控制的生長室中。
當Pestalotiopsis sp.真菌在培養后3天內顯現時，將真菌進一步在麥芽提取物和生長瓊脂培養基(酵母浸膏3g、bacto soyton 5g、MgSO40.5g、葡萄糖5g、蔗糖10g/L)培養4天。收獲時，離心培養物以從培養基中分離出細胞。干燥細胞后，粉碎并用甲醇提取以得到碳水化合物部分。
將如此得到的Restalotiopsis sp.的碳水化合物提取物加到生產培養基中至1ppm濃度、并按實施例7中所述方法進行培養和分析。結果示于表3中。
(2)向生產培養基中加入作為誘發劑的雌性配子母細胞提取物2ml/L、苯丙氨酸100mM和赤霉酸1ppm，重復實施例7的方法。結果示于表3中。

實驗實施例1使用大鼠腫瘤細胞進行細胞毒性試驗，從驗證得自紫杉樹脂胚胎培養物的紫杉酚。
通常基于紫杉酚能夠選擇性地殺死處于細胞分裂中間的腫瘤細胞這一事實，而使用大鼠腫瘤細胞進行細胞毒性試驗以證實紫杉酚的活性。將由Central Research and Development Center of Pacific Corporation，Kyounggi-do，Korea提供的大鼠腫瘤細胞培養在含有動物細胞培養基的塑料培養瓶中。在培養的早期階段，當發生細胞分裂時，向一個瓶中加入1滴實施例7的提取物(處理)，而不向另一個瓶內加提取物(對照)。然后檢查各腫瘤細胞的細胞分裂和存活性。結果示于圖2(A)和圖2(B)中。
如可從圖2(A)和2(B)中看到的，對照組顯示腫瘤細胞的旺盛生長(圖2(A))，而處理組則顯示腫瘤細胞死亡(圖2(B))。在處理后3小時顯現有腫瘤細胞死亡，并在其后約24小時完全死亡。因此，不需要檢測細胞分裂或存活性。
實驗實施例2還按下述方法使用單克隆抗體的ELISA方法(酶聯免疫吸附法)鑒定得自紫杉樹胚胎培養物的塔三烷本實驗中使用購自Hawaii Biotechnology Group的對紫杉酚起特異反應的TA01藥盒和對塔三烷起特異反應的TA03藥盒。用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)將紫杉酚和塔三烷稀釋100倍，并將各100μl稀釋液分加于ELSA板小井中。25℃保溫1小時后，用TBS-7(洗滌緩沖液)溶液將平板至少洗4次，并向其中加入50μl PBST(磷酸鹽緩沖鹽水-吐溫)。將紫杉酚標準品、塔三烷標準品或實施例7的提取物以連續三倍稀釋方式分配到小井中。
用PBST將紫杉酚抗體和塔三烷抗體分別稀釋100倍和1000倍，并分配各50μl稀釋液。25℃保溫1小時后，用洗滌緩沖液洗平板4次。將用PBST稀釋2000倍的100μl HRP(辣根過氧化物酶)分配到小井中并于25℃保溫1小時，然后用洗滌緩沖液洗4次。加入200μl OPD(鄰苯二胺)并于25℃保溫1小時以顯色。使用ELISA讀數器測出490nm吸光率。圖3(A)中所示的紫杉酚的檢測結果和圖3(B)中所示的實施例7之培養基的檢測結果證明了紫杉之胚胎培養物的紫杉酚活性。
應明確的是，上文的詳細描述只是以舉例說明的方式給出的，顯然可以在不背離本發明精神和范圍的情況下對發明作出改動和改變。
權利要求書按照條約第19條的修改1.(刪除)2.培養紫杉的組織并從愈傷組織或培養基中回收紫杉或其衍生物以生產紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
3.根據權利要求2的方法，其中該方法包括以下步驟(a)從紫杉的種子提供活的合子胚并消毒之，(b)培養接種至培養基中的所說的消毒的胚胎以由胚胎產生愈傷組織；(c)培養(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產生體細胞胚；(d)培養(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的體細胞胚以產生胚發生的愈傷組織；(e)液體培養(c)中得到的體細胞胚或(d)中得到的胚發生的愈傷組織；以及(f)從培養基中和細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根據權利要求3的方法，其中步驟(c)是利用PEDC(前胚發生決定細胞)或IEDC(誘導的胚發生決定細胞)程序誘導體細胞胚而完成的。
5.根據權利要求3的方法，其中液體培養(e)由使用生長培養基的生長階段和使用生產培養基的紫杉酚生產階段組成。
6.根據權利要求5的方法，其中生長培養基是改動的含2－5ppm，2，4－D的Gamborg B5(mB5)培養基，且生產培養基是添加1－2ppm NAA的MS或mB5培養基。
7.根據權利要求5的方法，其中生產培養基含有作為誘發劑的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母細胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生產能力。
8.根據權利要求7的方法，其中真菌是pestatotiopsis sp.。
9.根據權利要求3的方法，其中步驟(d)是經在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激動素的固體培養基中培養步驟(b)中的胚胎或步驟(c)中的體細胞胚以由之誘生愈傷組織、在含有1－5ppm細胞分尿素、芐胺嘌呤、N－異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養基中培養愈傷細胞以在愈傷組織表面上形成胚狀體，并在含有2－10ppm、2，4－D的同樣培養基中培養胚狀體以產生胚發生的愈傷組織。
10.根據權利要求3的方法，其中提取步驟(c)中的體細胞胚以產生紫杉酚或其衍生物。
11.根據權利要求3的方法，其中提取步驟(d)中的胚發生的愈傷組織以產生紫杉酚或其衍生物。
12.根據權利要求2的方法，其中紫杉種是東北紫杉。
13.(刪除)14.(刪除)
權利要求
1.提取紫杉的組織以生產紫杉酚的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
2.培養紫杉的組織并從愈傷組織或培養基中回收紫杉或其衍生物以生產紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
3.根據權利要求2的方法，其中該方法包括以下步驟(a)從紫杉的種子提供活的合子胚并消毒之，(b)培養接種至培養基中的所說的消毒的胚胎以由胚胎產生愈傷組織;(c)培養(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產生體細胞胚;(d)培養(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的體細胞胚以產生胚發生的愈傷組織;(e)液體培養(c)中得到的體細胞胚或(d)中得到的胚發生的愈傷組織;以及(f)從培養基中和細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根據權利要求3的方法，其中步驟(c)是利用PEDC(前胚發生決定細胞)或IEDC(誘導的胚發生決定細胞)程序誘導體細胞胚而完成的。
5.根據權利要求3的方法，其中液體培養(e)由使用生長培養基的生長階段和使用生產培養基的紫杉酚生產階段組成。
6.根據權利要求5的方法，其中生長培養基是改動的含2-4ppm，2，4-D的Gamborg B5(mB5)培養基，且生產培養基是添加1-2ppm NAA的MS或mB5培養基。
7.根據權利要求5的方法，其中生產培養基含有作為誘發劑的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母細胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生產能力。
8.根據權利要求7的方法，其中真菌是pestalotiopsis sp.。
9.根據權利要求3的方法，其中步驟(d)是經在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激動素的固體培養基中培養步驟(b)中的胚胎或步驟(c)中的體細胞胚以由之誘生愈傷組織、在含有1-5ppm細胞分裂素、芐胺嘌呤、N-異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養基中培養愈傷細胞以在愈傷組織表面上形成胚狀體，并在含有2-10ppm、2，4-D的同樣培養基中培養胚狀體以產生胚發生的愈傷組織。
10.根據權利要求3的方法，其中提取步驟(c)中的體細胞胚以產生紫杉酚或其衍生物。
11.根據權利要求3的方法，其中提取步驟(d)中的胚發生的愈傷組織以產生紫杉酚或其衍生物。
12.根據權利要求2的方法，其中紫杉種是東北紫杉。
13.來自紫杉種之合子胚分離塊的體細胞胚培養物，其為在權利要求3的步驟(c)中得到的。
14.來自紫杉種之合子胚分離塊的胚發生的愈傷組織培養物，其為在權利要求3的步驟(d)中得到的。
全文摘要
本發明公開了通過提取紫杉的組織或其細胞培養物生產紫杉酚和塔三烷的方法。經提取紫杉的組織和/或培養基生產紫杉酚及其衍生物的方法特征在于所說的組織是合子胚。可經誘導體細胞胚或胚發生的愈傷組織來進行紫杉合子胚的細胞培養。
文檔編號C12R1/91GK1111911SQ94190464
公開日1995年11月15日 申請日期1994年7月6日 優先權日1993年7月6日
發明者李輔植, 孫圣鎬 申請人:大韓民國山林廳林木育種研究所