專利名稱：一種含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及褐藻膠領域，具體為一種含有高分子量a-l，4-L-聚古羅糖醛酸的褐藻膠，及其在固定化細胞和微生物中的應用。
背景技術：
褐藻膠是由不同比例的甘露糖醛酸(M)和古羅糖醛酸(G)組成的，不同褐藻以及同一褐藻不同部位褐藻膠的結構不同，而不同結構的褐藻膠具有不同的理化性質，從而使該類多糖在食品、醫藥和化工等領域得到廣泛應用。從褐藻中制備褐藻膠的方法主要有物理法、化學法和酶法，其中:物理法主要有水提取法，化學法主要是堿提取及酸法沉淀，而酶法則主要是采用各種褐藻膠酶進行提取。大量文獻表明，利用目前提取技術，從不同種類褐藻中獲得的褐藻膠均含有高含量的甘露糖醛酸(M段)，難以得到高純度和高分子量的聚古羅糖醛酸。雖然采用酸法降解可以獲得高純度的聚古羅糖醛酸(中國專利，CN200610069060.4)，但分子量均較低，約IOkD左右，難以滿足本領域高強度褐藻膠材料所要求的特性。此外，酶法提取褐藻膠(中國專利，CN201010298858.2) 一般得到的是低聚合度褐藻膠寡糖混合物，不能滿足高分子量古羅糖醛酸及其相關產品開發的需求。
膠囊化是利用天然或合成的高分子材料對固體、液體或微生物進行包封的過程。該技術的主要特點是保護敏感物質免受環境的影響，達到屏蔽氣味、顏色和味道或降低毒性或控制釋放活性物質等目的。雖然膠囊包封的生物大分子、微生物或細胞被包裹在膠囊內部，但營養物質及小分子物質等可自由通過該包裹層，從而達到保護和緩釋作用。生物膠囊化技術已在蛋白和酶的固定化、藥物控制釋放、微生物及動植物細胞大規模培養等領域得到廣泛應用(郝紅等，現代化工，2002，22 (3):60-62)。在眾多的膠囊化技術中，用褐藻膠(海藻酸鹽)制備的膠囊具有制備簡便、易于放大、細胞活性好等優點，已被廣泛應用，然而目前褐藻膠固定化技術還存在一些問題，如褐藻膠中古羅糖醛酸含量不足及分子量低時會造成力學強度小，并且有較高的皺縮缺陷，在大粒徑的膠囊中該缺陷尤為明顯。文獻報道(Mari jnissen, WJ.et al., Biomaterials, 2002, 23:1511-1517),如果褐藻膠中的古羅糖醒酸含量超過總量的70%，就能使形成的藻酸鈣凝膠強度顯著提高、皺縮顯著降低、孔隙率高以及在一價金屬離子溶液中有較高的穩定性。發明內容
本發明的目的在于提供一種含有高純度和高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠及其應用，以滿足藥物控制釋放、蛋白和酶的固定化、微生物及動植物細胞固定化中的需要。
本發明的技術方案是:
一種含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，以成熟巨藻莖葉部為原料，將原料粉碎，經有機溶劑脫脂、熱水提取后，收集藻渣；將藻渣經熱堿提取，過濾收集上清液，經沉淀、中和、脫水和干燥后，得到含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠，聚古羅糖醛酸含量≥85mol% (摩爾百分比)，分子量≥70kD。
所述聚古羅糖醛酸含量優選為85 95mol%，分子量優選為70kD 90kD。
所述褐藻膠的具體制備步驟為:
(I)選取成熟產巨藻莖葉部烘干后，于粉碎機中粉碎、過20 60目篩得到藻粉；
(2)有機溶劑脫脂、熱水提取
將藻粉與有機溶劑以1:10 l:20g/ml的料液比例混合后，于80 85°C水浴回流攪拌提取2 3小時，棄去上層液，再重復脫脂2 3次，將脫脂藻粉干燥；將干燥脫脂藻粉與水以1:20 1:30g/ml的料液比例混合，于80 85°C攪拌提取2 3小時，棄去上清液，重復提取2 3次，過濾收集藻渣；
(3)熱堿提取、沉淀
將熱水提取后的藻渣與堿液按1:20 1:30g/ml的料液比例混合，于80 85°C下攪拌提取2 3小時，離心取上清液，重復提取2 3次，合并上清液；上清液加酸調節至體系的pH=l 3，靜置離心，收集沉淀；
(4)中和、脫水和干燥
將步驟(3)得到的沉淀用堿液中和至pH=7 8，然后加入有機溶劑進行脫水后，經烘干，得到含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠。
所述步驟(2)中，有機溶劑為乙醇、甲醇或丙酮。
所述步驟(3 )中，堿液為碳酸鈉水溶液、碳酸鉀水溶液或碳酸銨水溶液，濃度為2 10wt% ;酸為鹽酸、硝酸、甲酸、乙酸或硫酸，濃度為I 3mol/L。
所述步驟(4)中,堿液為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水,濃度為I 3mol/L ;有機溶劑為乙醇、甲醇、丙酮或異丙醇。
所述含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠的應用，含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠用于制備各種固定化細胞微膠囊，所述細胞為任何動物、植物或微生物的細胞，其中微生物為細菌、真菌或酵母。
本發明中，將褐藻膠用于細胞固定化，首先將含有細胞和氯化鈣-明膠水溶液滴入低溫固定浴中，形成小球；然后將小球加入到含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠水溶液中攪拌包衣、成膜反應、交聯形成膠囊；再將膠囊放置在增強液中，最后置于保存液中保存。
本發明中，褐藻膠水溶液的濃度為0.5wt% 3wt%,交聯時間為0.5min lOmin。
本發明中，氯化鈣-明膠水溶液中，明膠的濃度為3wt% 30wt%，氯化鈣的濃度為1.0wt% 20wt% ;低溫固定浴為10°C以下的硅油浴或植物油浴；增強液為可溶性鈣鹽，濃度I 5wt%，固化時間5 15分鐘；保存液為去離子水、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或含有可溶性鈣鹽的緩沖液，保存液溫度和PH值視膠囊細胞不同而變化。
本發明的技術特點為:
I)本發明原料的選擇上取成熟藻體莖葉部，而傳統的工藝采用全部藻體，致使所得褐藻多糖結構混雜不均一，不能獲得高純度、高分子量古羅糖醛酸，本發明有效地避免了上述情況的發生。
2)本發明采用80 85wt%乙醇脫脂工藝，不但可以除去脂溶性雜質，也利于去除其它小分子雜質；傳統工藝直接用稀堿提取，造成產品色澤深、雜質多。
3)本發明根據藻體中褐藻膠結構特點不同，運用分步提取工藝進行提取，即先用熱水提取工藝去除巖藻糖硫酸酯和高甘露糖醛酸含量的褐藻多糖，再用2 10wt%稀堿加熱攪拌提取，獲得高分子量、高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠。
4)本發明所用高分子量古羅糖醛酸、明膠等均為天然高分子，生物相容性好，囊膜厚度適宜，有利于膜內外溶質的擴散與傳遞。
5)本發明通過脫脂和熱水提取等工藝分步提取，可以有效將色素、無機小分子、巖藻聚糖及褐藻淀粉去除。
6)本發明在2wt% 10wt%堿液以及80 85°C溫度下攪拌提取，能有效的破壞藻體細胞壁，提高產品的質量和收率。
本發明的有益效果是:
1、采用本發明工藝所得高分子量聚古羅糖醛酸產品與同類產品相比，具有原料來源豐富、安全性好，結構獨特、分子量大、凝膠強度高、制備工藝簡單等特點。制得的微膠囊粒徑在0.5 5.0mm,有利于大規模制備和產品的回收,微膠囊的制備過程在全生理條件下進行，保證了細胞和微生物的生理活性。
2、本發明高純度和高分子量聚古羅糖醛酸的制備方法，能夠滿足其在食品、醫藥、化工材料等領域中應用的需求，具有重要的市場應用前景。


圖1為本發明巨藻莖葉中高純度聚古羅糖醛酸的1H-NMR圖譜。
圖2為本發明巨藻莖葉中高分子量聚古羅糖醛酸分子量分析圖。
圖3為本發明巨藻莖葉中聚古羅糖醛酸固定酵母細胞微囊圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍 。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件中所述的條件進行。除非另行定義，所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中，所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1
選取成熟智利產巨藻(Lessonia trabeculata)莖葉部烘干后，于粉碎機中粉碎、過20目篩得到藻粉。取粉碎的藻粉100g，將藻粉與80wt%乙醇以1:10 (W/V，g/ml)的比例混合后，于80°C水浴回流攪拌提取2小時，棄去上層液，再重復脫脂2次，將脫脂藻粉干燥。將干燥脫脂藻粉與水以1:20 (W/V，g/ml)的比例混合，于80°C攪拌提取2小時，棄去上清液，重復提取2次，過濾收集藻渣。向熱水提取后的藻渣中加入料液比為1:30 (ff/V,g/ml)的2wt%碳酸鈉水溶液，于85°C下提取3h，離心取上清液，重復提取3次，合并上清液。上清液經2mol.Γ1鹽酸中和后調到pH=l，靜置離心，收集沉淀。沉淀經2mol.Γ1氫氧化鈉中和至pH=7.5，加入乙醇脫水后烘干，得高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠(LTPG)，得率30%，分子量78kD，經過1H-NMR分析，聚古羅糖醛酸含量91mol%。
將大腸桿菌在40°C下與明膠-氯化鈣水溶液(明膠濃度為20wt%，氯化鈣濃度為2wt%)均勻混合,滴入5°C娃油中冷卻IOmin,形成小球,用100目篩網過濾收集小球。再在攪拌下將小球加入1.5wt%由本發明制得的褐藻膠(LTPG)水溶液中攪拌包衣、成膜反應2min，交聯形成膠囊。將膠囊在攪拌下于2wt%氯化鈣水溶液中固化IOmin增強膜的強度。篩網過濾，經Tris緩沖液清洗后，于Tris緩沖液中37°C恒溫處理，制得含有大腸桿菌的微膠囊。
實施例2
選取成熟智利產巨藻(Lessonia trabeculata)莖葉部烘干后，于粉碎機中粉碎、過60目篩得到藻粉。取粉碎的藻粉100g，將藻粉與85wt%甲醇以1:20 (W/V，g/ml)的比例混合后，于85°C水浴回流攪拌提取2小時，棄去上層液，再重復脫脂2次，將脫脂藻粉干燥。將干燥脫脂藻粉與水以1:20 (W/V，g/ml)的比例混合，于85°C攪拌提取3小時，棄去上清液，重復提取2次，過濾收集藻渣。向熱水提取后的藻渣中加入料液比為1:20 (W/V,g/ml)的10wt%碳酸銨水溶液，于85°C下提取2h，離心取上清液，重復提取3次，合并上清液。上清液經2mol.Γ1鹽酸中和后調pH=3，靜置離心，收集沉淀。沉淀經2mol.Γ1氫氧化鈉中和至pH=8，加入丙酮脫水后烘干，得含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠，得率33%，分子量81kD，經過1H-NMR分析，聚古羅糖醛酸含量92mol%。
將酵母細胞在40°C下與明膠-氯化鈣水溶液(明膠濃度為25wt%，氯化鈣濃度為1.5wt%)均勻混合,滴入3°C娃油中冷卻IOmin,形成小球,用100目篩網過濾收集小球。再在攪拌下將小球加入2wt% 由本發明制得的褐藻膠(LTPG)水溶液中攪拌包衣、成膜反應3min，交聯形成膠囊。將膠囊在攪拌下于3wt%氯化鈣水溶液中固化Smin增強膜的強度。篩網過濾，經Tris緩沖液清洗后，于Tris緩沖液中37°C恒溫處理，制得含有酵母細胞微膠囊。
本發明中，所述的乙醇可改用甲醇、丙酮或異丙醇；所述的鹽酸可改用硝酸、甲酸、乙酸或硫酸；氫氧化鈉可改用氫氧化鉀或氨水。
參照Grasdalen 等方法(Grasdalen H.et al.，Carbohydr.Res, 1979, 68:23-31),將聚古羅糖醛酸樣品用稀鹽酸輕微解聚，經中和，D2O交換3次，在超導核磁共振波譜儀(ECP600MHZ)于80°C測定。從圖1可知，所得產品聚古羅糖醛酸含量較高(>90mol%)。單體古羅糖醒酸(G)的異頭氫質子信號Gl為5.0lppm,表明其為α I — 4鏈接；單體G第五位碳上的質子G5為4.40ppm ;當G左右兩邊分別與G和M連接時，其Hl化學位移為4.70ppm(記為GgiM),當G兩邊均與M相鄰時，其Hl化學位移為4.67ppm (記為Μ￡Μ)。單體M的異頭質子當與M相鄰時，其Ml化學位移為4.62ppm(記為電)，當與單體G相連時，其Ml化學位移為4.65ppm (記為MG)。1H-NMR數據表明，從巨藻莖葉部能得到高分子量聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠。
根據Grasdalen的計算公式，結合1H-NMR數據，可以得到單糖(Fm和Fe)，二糖片段(F.、Fmg> Fgm和三聚片段(F— Fggm, Fmgm, Fmgg)含量，從而反映出多糖的嵌段細微結構，相關數據見表I。由表I可知，采用本發明工藝所得樣品的古羅糖醛酸單糖(Fe)含量均90mol%以上，古羅糖醛酸二糖(FGG)均85mol%以上，表明該工藝所得樣品是以均聚古羅糖醛酸為主的褐藻膠。
表I不同工藝提取的巨藻多糖細微結構比較
權利要求
1.一種含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，以成熟巨藻莖葉部為原料，將原料粉碎，經有機溶劑脫脂、熱水提取后，收集藻渣；將藻渣經熱堿提取，過濾收集上清液，經沉淀、中和、脫水和干燥后，得到含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠，聚古羅糖醛酸含量> 85mol%，分子量> 70kD。
2.根據權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，聚古羅糖醛酸含量為85 95mol%，分子量為70kD 90 kD。
3.根據權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，褐藻膠的具體制備步驟為: (1)選取成熟產巨藻莖葉部烘干后，于粉碎機中粉碎、過20 60目篩得到藻粉； (2)有機溶劑脫脂、熱水提取 將藻粉與有機溶劑以1: 10 1: 20g/ml的料液比例混合后，于80 85°C水浴回流攪拌提取2 3小時，棄去上層液，再重復脫脂2 3次，將脫脂藻粉干燥；將干燥脫脂藻粉與水以1:20 1: 30g/ml的料液比例混合，于80 85°C攪拌提取2 3小時，棄去上清液，重復提取2 3次，過濾收集藻渣； (3)熱喊提取、沉淀 將熱水提取后的藻洛與堿液按1:20 1: 30g/ml的料液比例混合,于80 85°C下攪拌提取2 3小時，離心取上清液，重復提取2 3次，合并上清液；上清液加酸調節至體系的pH=l 3，靜置離心，收集沉淀； (4)中和、脫水 和干燥 將步驟(3)得到的沉淀用堿液中和至pH=7 8，然后加入有機溶劑進行脫水后，經烘干，得到含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠。
4.根據權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，步驟(2)中，有機溶劑為乙醇、甲醇或丙酮。
5.根據權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，步驟(3)中，堿液為碳酸鈉水溶液、碳酸鉀水溶液或碳酸銨水溶液，濃度為2 10wt% ;酸為鹽酸、硝酸、甲酸、乙酸或硫酸，濃度為I 3 mol/L。
6.根據權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠，其特征在于，步驟(4)中，堿液為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水，濃度為I 3 mol/L ;有機溶劑為乙醇、甲醇、丙酮或異丙醇。
7.按照權利要求1所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠的應用，其特征在于，含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠用于制備各種固定化細胞微膠囊，所述細胞為任何動物、植物或微生物的細胞。
8.按照權利要求7所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠的應用，其特征在于，將褐藻膠用于細胞固定化，首先將含有細胞和氯化鈣-明膠水溶液滴入低溫固定浴中，形成小球；然后將小球加入到含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠水溶液中攪拌包衣、成膜反應、交聯形成膠囊；再將膠囊放置在增強液中，最后置于保存液中保存。
9.按照權利要求8所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠的應用，其特征在于，褐藻膠水溶液的濃度為0.5wt% 3wt%,交聯時間為0.5 min 10 min。
10.按照權利要求8所述的含有高分子量聚古羅糖醛酸的褐藻膠的應用，其特征在于，氯化I丐-明膠水溶液中，明膠的濃度為3wt% 30wt%,氯化I丐的濃度為1.0wt% 20wt% ;低溫固定浴為10°C以下的硅油浴或植物油浴；增強液為可溶性鈣鹽，濃度I 5wt%，固化時間5 15分鐘；保存液為去 離子水、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或含有可溶性鈣鹽的緩沖液，保存液溫度和PH值視膠囊細胞不同而變化。
全文摘要
本發明涉及褐藻膠領域，具體為一種含有高分子量a-1,4-L-聚古羅糖醛酸的褐藻膠，及其在固定化細胞和微生物中的應用。以成熟巨藻莖葉部為原料，將原料粉碎，經有機溶劑脫脂、熱水提取后，收集藻渣；將藻渣經熱堿提取，過濾收集上清液，經鹽酸沉淀、中和、脫水和干燥后，得到含有高分子量高聚古羅糖醛酸含量的褐藻膠，聚古羅糖醛酸含量≥90mol%，分子量≥70kD。本發明原料來源豐富、安全性好，結構獨特、分子量大、凝膠強度高、制備工藝簡單。制得的微膠囊粒徑在0.5～5.0mm，有利于大規模制備和產品的回收，微膠囊的制備過程在全生理條件下進行，保證了細胞和微生物的生理活性。
文檔編號C12N11/04GK103183742SQ20131008176
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者于廣利, 孫學超, 劉亞男, 吳建東, 從大鵬, 單鑫迪 申請人:中國海洋大學