專利名稱：一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲dna提取液、提取方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病害的分子生物學檢測技術，特別涉及一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取液、提取方法其應用。
背景技術：
香舊穿孑L 線蟲(Radopholus similis),英文俗名 the burrowing nematode ； Blackhead or toppling disease of bananas)，又叫相似穿孔線蟲，它是一種極具毀滅性的外來入侵植物檢疫性有害線蟲，也是我國對外植物檢疫對象[58]。香蕉穿孔線蟲 (Radopholus similis)為遷移性內寄生線蟲，在全世界范圍內的熱帶及亞熱帶均有分布 [5]。它的寄主范圍也非常廣泛，已報道的寄主多達360多種，其中大多數屬偶然寄主(在罹病香蕉樹附近存在)和人工接種寄主。近年來，隨著我國加入WT0，農產品國際貿易往來迅速發展、人員交流的日益頻繁和旅游業的發展，從香蕉穿孔線蟲疫區國家或地區引進各種花卉苗木及種質材料的種類和數量迅速增加，由寄主植物攜帶而將該線蟲傳入中國的可能性和傳入風險日益劇增。近年來不斷由我國各口岸截獲香蕉穿孔線蟲，事實上香蕉穿孔線蟲已經逼近國門，入侵后將對我國農業生產帶來毀滅性的打擊和極度嚴重的損失。由于香蕉穿孔線蟲寄主范圍廣，這些寄主植物在中國廣泛分布。所以，如果香蕉穿孔線蟲一旦從中國的溫室中擴散到大田，則極易定殖和流行。這將給中國的農業生產造成嚴重危害。在香蕉穿孔線蟲的鑒定與檢測方面，往往主要以形態鑒定為主，但因為形態特征變化幅度較大及表型特征不穩定問題，傳統形態鑒定往往比較困難，導致誤診。并且傳統的形態堅定耗時、費力，往往需要專業人士操作，并且需要大量線蟲樣本，在單頭線蟲水平上不能達到要求。而在PCR技術上建立起來的分子鑒定方法的一系列研究進展克服了傳統鑒定方法上的缺陷。目前已有許多有關利用分子和生化方法鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，如 RFLP、同工酶、RAPD, PCR等主要進行系統進化分析，揭示種間、種內差異。在植物檢疫領域中，DNA分子標記是目前線蟲學研究中發展較快的一種鑒定手段。線蟲種特異性引物PCR擴增檢測或雙重PCR擴增檢測是近年重要植物線蟲分子診斷的重要進展之一。通過一次PCR 測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。基于核糖體DNA(rDNA)而構建的線蟲特異性引物進展較快，在診斷根腐線蟲、 根結線蟲中取得了突破性進展，形成了特異性診斷4種重要根腐線蟲如穿刺根腐線蟲 P. penetrans、斯克里布根腐線蟲P. scribneri、咖啡根腐線蟲P. Coffeae和盧賽根腐線蟲P. Ioosi的特異性引物，以及3種根結線蟲如戚烏得根結線蟲M. Chitwoodi、法拉克斯根結線蟲 M. fallax 和北方根結線蟲 M. Hapla(Zijlstra，C. 1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al. , 1997)的特異性引物，診斷的水平達到單條幼蟲的水平。 Mulholland et al. (1996)分別構建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一種基于rDNA-ITS區域特異性等位多重PCR技術檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑒定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復合種群。與標準的PCR途徑不同，這一技術在每個PCR反應中應用了 3個引物，通用引物5. SSrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITSl-Gr 和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功應用多重PCR技術快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的 rDNA-ITS的序列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSrf和白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引物ITS5與PITSrf可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與 PITSp4可以擴增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應中，使用 PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使復合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復合種群檢測出金線蟲。歐師琪彭德良(0u SQ, Peng DL, 2008)設計構建了大豆孢囊線蟲特異性SCAR標記引物SCNFI和SCNRI，發明了大豆孢囊線蟲的一步雙重PCR檢測方法，檢測的特異性片段長度為494bp，建立快速準確檢測和早期診斷大豆孢囊線蟲的分子生物學方法和技術規程， 可以檢測大豆孢囊線蟲單個孢囊、單頭二齡幼蟲和雄蟲，該項檢測技術獲得國家發明專利 (ZL200510012246. 1).Subbotin, Peng DL(彭德良2001)等構建了基于rDNA-ITS區域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyFl，應用兩組引物D3A和D3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl和引物rDNA2成功地對大豆孢囊線蟲進行了分子診斷研究。第一對引物D3A和D3B是證實PCR 擴增的成功性，第二對引物GlyFI和rDNA2是特異性檢測大豆孢囊線蟲。用這兩對引物進行的雙倍PCR擴增，從所有52個大豆孢囊線蟲群體都擴大豆孢囊線蟲的特異性DNA片段 (ISlbp)，而在所有測試的其他8種孢囊線蟲22群體沒有ISlbp片段。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴增出大豆孢囊線蟲種特異性片段。宛飛彭德良等(2008)根據馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區的序列特征，對我國甘薯莖線蟲兩個不同型群體各設計了一對特異性引物。A型甘薯莖線蟲特異引物為DDSl/ DDS2，特異擴增片段為252bp ；B型甘薯莖線蟲特異引物為DDL1/DDL2，特異擴增片段為 485bp ；引入線蟲通用引物D3A/D3B作內標，研究出一步雙重PCR特異性檢測甘薯莖線蟲不同類型群體的分子技術和方法，該分子檢測技術具有特異性強、方法可靠、靈敏性高、操作簡便，檢測的精確度達到單條線蟲的水平。Amiri,Subbotin 等(2002)構建了基于 rDNA-ITS 的甜菜孢囊線蟲(H. schachtii) 特異性引物SHF6。將特異性引物SHF6與通用引物AB28引物結合，同時將通用引物D2A和 D3B放在一個PCR反應體系中，從58個孢囊線蟲群體中成功地鑒定出甜菜孢囊線蟲，從36 個甜菜孢囊線蟲群體中擴增200bp特異性片段，而非甜菜孢囊線蟲(H. schachtiDDNA的樣品沒有目的片段。而基于基因組DNA的SCAR標記方面，Fullanodo, A. et. al. (1999)用隨機引物 0PG5分別擴增出區分馬鈴薯金線蟲特異性RAPD標記片段為826bp，馬鈴薯白線蟲特異性 RAPD標記片段為llOObp。對擴增出的馬鈴薯金線蟲和白線蟲的RAPD標記片段進行全序列分析，將RAPD標記轉化成SCAR標記，設計出馬鈴薯金線蟲FullGrf和FullGrr以及馬鈴薯白線蟲的SCAR特異性標記引物FulIGpf和FulIGpr，用FulIGrf和FulIGrr擴增出了 315bp 馬鈴薯金線蟲的特異性片段，用FullGpf和FullGpr擴增出798bp的馬鈴薯白線蟲的特異性片段。在香蕉穿孔線蟲的分子檢測方面也進行了相關研究。Kaplan D. Τ. et al. (1996) 根據KeSSeliR.V. (1992)的方法，篩選380個隨機引物，從基因組DNA中找到6條差異片段，克隆、測序后設計了一對24bp的特異性引物，可特異擴增Radopholus similis。Falls et al. (1996)利用PCR方法擴增rDNA片段來比較兩個ITS區及5. 8S基因。基于rDNA片段的RFLPs可用 于比較全世界不同的香蕉種植區域的10個香蕉穿孔種群。Elbadri et al. (2002)也對香蕉穿孔線蟲的rDNA-ITS做了相關研究’通過研究穿孔線蟲(R. . similis) 種內rDNA-ITS的變異，測定ITS序列并進行RFLP分析發現，香蕉穿孔線蟲種內ITS序列穩定，變異很小。但穿孔線蟲(Radopholus)屬的不同種間ITS存在差異。國外的研究表明，曾經認為是香蕉穿孔線蟲的一個來自澳大利亞種群，經過對rDNA-ITS序列特征和 RFLP分析研究，發現該群體實際上是香蕉穿孔線蟲的近緣種，最近重新命名和描述為澳洲穿孔線蟲新種(Radopholus musicola)、來自越南榴蓮和咖啡根系的兩個穿孔線蟲群體雖然與香蕉穿孔線蟲及其近似，但rDNA-ITS序列和RFLP酶譜都存在差異，分別描述為“榴蓮穿孔線蟲新種(Radopholus duriophilus)和阿拉伯咖啡穿孔線蟲新種(Radopholus arabocoffeae)。近年的分子和細胞遺傳學證據表明，香蕉穿孔線蟲與柑桔穿孔線蟲為同一個種。近年來我國也相繼開展了香蕉穿孔線蟲的分子特征的相關研究。自多次截獲香蕉穿孔線蟲以來，國內相關單位加大了對香蕉穿孔線蟲的檢疫檢驗力度，相繼開展了香蕉穿孔線蟲風險分析、培養技術及其種群繁殖力、入侵中國適生區的GIS預測等相關研究。葛建軍等根據NCBI已登錄的香蕉穿孔線蟲序列聚類比對后根據保守區域設計出穿孔線蟲屬水平上的特異性引物Rl、R2 (R1/2)和香蕉穿孔線蟲種水平上的特異性引物RSI、RS2(RSl/2) 進行雙重PCR擴增香蕉穿孔線蟲，檢測精度可達單條水平和實時熒光定量PCR檢測單頭香蕉穿孔線蟲技術。但是目前沒有見到從罹病植物組織中檢測香蕉穿孔線蟲的報道。對于從罹病植物中對香蕉穿孔線蟲的侵染情況進行早期檢測，除了香蕉穿孔線蟲特異性引物這個必要條件夕卜，首先必須能夠從罹病寄主植物中有效地提取香蕉穿孔線蟲的DNA，由于在提取過程中線蟲DNA與植物DNA的比例相當懸殊，且植物組織中的蛋白、植物酚等物質都容易導致線蟲 DNA在提取過程中降解，當檢測早期感染的植物時，由于寄生的線蟲非常少，有效提取并檢測到香蕉穿孔線蟲的DNA更是困難。

發明內容
本發明提供了一種從植物中提取微量香蕉穿孔線蟲DNA的提取液和提取方法，及該提取液和方法的應用。本發明的提取液能夠從罹病植物組織中有效地提取到PCR檢測量的香蕉穿孔線蟲DNA，可以檢測罹病植物組織中的單頭香蕉穿孔線蟲，為早檢測、早治理和早控制香蕉穿孔線蟲提供了有用的手段。一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取液，其組分及各組分的終濃度如下Tris-HC1200mM, PH 8. 0 ；NaCl 400mM ；EDTA IOmM, PH 8. 0 ；CTAB 3% (W/V) ； β-巰基乙醇 4% (V/V) ο一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA的提取方法，步驟是(1)液氮研磨待測罹病植物組織使之成粉末狀；(2)將所述粉末狀的罹病植物組織加入到預熱的植物裂解液中，并加入蛋白酶K， 混勻后抽提；(3)沉淀純化提取物；其特征在于，所述植物裂解液為上述DNA提取液。所述粉末狀的罹病植物組織與所述DNA提取液的比例為0. 1 0. 5g 500 lOOOul，所述預熱溫度為65攝氏度；加入的蛋白酶K為2mg/ml蛋白酶K溶液，加入體積為所述DNA提取液的10%。所述抽提指于65 V溫浴0. 5 2h，期間每隔15min顛倒混勻一次；4 °C下 12000rmf/min離心lOmin，上清液轉移至另一離心管中，加等體積酚/氯仿抽提直至分界面看不到白色沉淀物；4°C下12000rmf/min離心lOmin，取上清液。所述沉淀純化指向抽提操作中最后得到的上清液加入2倍體積的預冷的無水乙醇和1/10體積pH5. 2 3MNaAC溶液，混勻，然后于_70°C環境放置至少0. 5h以沉降DNA ；4°C 下12000rmf/min離心lOmin，去上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥后，沉淀溶于TE緩沖液中。上述提取液或DNA提取方法在通過提取DNA以檢測診斷罹病植物、土壤香蕉穿孔線蟲感染情況或鑒別香蕉穿孔線蟲中的應用。一種檢測植物罹患香蕉穿孔線蟲感染的PCR方法，包括如下步驟(1)從待檢測植物組織中提取DNA作為PCR模板，(2)配制PCR反應體系進行PCR擴增及電泳檢測，其特征在于從待檢測植物組織中提取DNA采用權利要求2 6任一所述的DNA 提取方法，所述PCR反應體系中的引物為香蕉穿孔線蟲DNA為模板設計的引物。所述引物為香蕉穿孔線蟲特異性引物上游引物RsFl5，-TGTCATCGCCTTTGGCAGCT-3，下游引物RsRl5，-TGGTAAACGACCCTGAACCAG-3，。所述PCR反應體系為5 μ 1 10Χ含Mg2+的PCR緩沖液，4 μ IlOmM的dNTPS， 1 μ 10. 1% BSA, 1. 5 μ 120uM 引物對 RSF1/RSR1，0. 5 μ 15U/ul 的 Taq DNA 聚合酶，1 μ 1 DNA 模板，滅菌ddH20補足至25 μ 1。所述PCR擴增的程序為95°C 4分鐘，95 °C變性45秒，56°C退火30秒，72°C延伸1 分鐘，40個循環；72°C再延伸10分鐘，4°C保存。所述PCR擴增的體系中的引物還包括如下通用引物5’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’5， -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3，。本發明發明人發現，取以鑒定感染了香蕉穿孔線蟲的植物組織為材料，以現有的 CTAB方法提取其中的香蕉穿孔線蟲DNA時，得到的提取物僅僅是植物組織基因組DNA，用香蕉穿孔線蟲特異性引物擴增不出任何條帶，說明香蕉穿孔線蟲DNA在提取過程中被降解。發明人在現有CTAB提取方法的基礎上，對CTAB傳統裂解液的配方進行了大幅度調整，獲得了一種專門能從待測患病植物之中提取香蕉穿孔線蟲DNA的提取液及提取方法，能夠防止植物組織、蛋白、酚等物質降解線蟲DNA，能有效地將微量線蟲DNA從寄主植物組織中提取出來，以便于進行分子檢測，實驗數據表明能從感染密布為70mg苗木約感染2 3頭線蟲的植物組織中提取出線蟲DNA，擴增出香蕉穿孔線蟲的特異性條帶。本發明還從提供了最優選的提取方法，使提取過程中，植物組織的蛋白及雜質去除得非常徹底，以避免殘留在DNA中干擾后續PCR檢測。本發明還提供了優選的PCR檢測方法，從特異性引物，PCR擴增體系及擴增程序上提供最優選方案。使得檢測香蕉穿孔線蟲的方法更為完善，從DNA提取到PCR檢測，步步相扣保證檢測的靈敏性和特異性。本發明提供的檢測方法的靈敏度可達到檢測單頭線蟲的水平，與重復性較差的RAPD技術(RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性內切酶技術(RFLP-PCR)檢測方法相比，更能夠省時、準確、靈敏，更能建立快速、準確的香蕉穿孔線蟲檢測技術。該技術可應用于對香蕉穿孔線蟲田間土壤樣品及植物上香蕉穿孔線蟲病發生的早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。本發明的檢測方法還可以用于香蕉穿孔線蟲分類鑒別。其中檢測采用的特異性引物為專門設計本發明利用線蟲rDNA-ITS區通用引物 (FerF/FerR)擴增核糖體DNA的ITSl和ITS2全序列以及18S、28S部分序列，通過生物信息學分析后設計特異性引物(RsFl/RsRl)，可以直接用來進行香蕉穿孔線蟲的PCR特異性檢測，本發明的實驗數據如實施例2證明了引物的特異性；本發明還提供了結合28S區的 D3 擴展區的通用引物 D3A/D3B (Amiri，S.，Subbotin, SA. &Moens, Μ. 2002. Identification ofthe beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR. European Journal of Plant Pathology 108 =497-506.)作為內標，采用一步雙重PCR方法檢測香蕉穿孔線蟲的方法，進一步保證了檢查的可靠性，降低假陽性。


圖1香蕉穿孔線蟲rDNA-ITS的PCR擴增M :DL2000 標準 DNA, 1-7 :HLH，SHH, LZH, SZH, HN13H, HN12H, HN12F, 8 陰性對照(代碼見表1)圖2香蕉穿孔線蟲特異引物RsFl/RsRl的PCR擴增M :DL2000 標準 DNA, 1-7 :HLH，SHH, LZH, SZH, HN13H, HN12H, HN12F, 8 陰性對照(代碼見表1)圖3香蕉穿孔線蟲RsFl/RsRl結合D2A/D3B的一步雙重PCR檢測M :DL2000 標準 DNA, 1 5 :RSSH，RSSZ，RSHZ，RSLZ，HK ；6 陰性對照(代碼見表 1、 表2)圖4香蕉穿孔線蟲RsFl/RsRl聯合D2A/D3B的雙重PCR特異性檢測M :DL2000 標準 DNA, 1 5 :RSSH, RSSZ, RSHZ, RSLZ, HK ；6 14 :PLD，PXM, DdCL, DdSH, GS-4，GS-14，GS-11, GS-18，MiLF，15 陰性對照(代碼見表 1、表 2)圖5香蕉穿孔線蟲特異性引物的靈敏度檢測M :DL2000plus，1-9 1 X，1/2 X，1/4 X，1/8 X，1/16 X，1/32 X，1/64 X， 1/128X，1/256X，10 陰性對照
圖6植物組織中香蕉穿孔線蟲的直接檢測M =DNAMarker DL2000,1 樣本 DNA, 2 陰性對照圖7罹病紅掌苗樣本中香蕉穿孔線蟲的特異性檢測用香蕉穿孔線蟲特異性引物對RsFl/RsRl檢測3. 1. 1中所提取的總DNA為泳道1， 泳道2、3為對應的無蟲紅掌苗木總DNA對照沒有擴增出特異性條帶，泳道4為陽性對照的純香蕉穿孔線蟲DNA模板擴增出很亮的特異性條帶，泳道5為無DNA模板的陰性對照沒有擴增出特異性條帶。圖8罹病紅掌苗樣本中香蕉穿孔線蟲的梯度檢測初始濃度DNA模板的擴增條帶最亮(泳道1)，隨1/2濃度稀釋擴增條帶逐漸減弱 (泳道2 6)，1/32X稀釋濃度的DNA模板仍然能擴增出明顯條帶(泳道6)，無DNA模板陰性對照無目的條帶。圖9罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲的一步雙重PCR檢測D2A/D3B、RsFl/RsRl檢測M =DNAMarker DL2000,1 :rZ, 2 :CK1，3 :CK2，4 陰性對照
具體實施例方式實驗材料共收集7 個香蕉穿孔線蟲種群(HN13H，HN12H, HN12F, HLH, SHH, LZH, SZH)(表 1)。 兩個香蕉穿孔線蟲種群樣品(HLH，SHH)為中國檢疫科學院葛建軍老師惠贈，一個樣品SZH 為深圳動植物檢疫局李一農老師惠贈，一個樣品LZH為華南農業大學廖金玲教授惠贈，其它種群為本實驗室自行采集。供試香蕉穿孔線蟲線蟲均為純培養試驗種群。表1供試香蕉穿孔線蟲種群及其來源
樣品代號學名樣品來源地寄主植物樣品來源CodeScientific nameOriginof populationHostsProviderHN13HRadopholus similis海南Hainan紅掌 Anthium本實驗室采集HN12HRadopholus similis海南hainan紅掌 Anthium本實驗室采集HN12FRadopholus similis海南hainan粉掌 Anthium本實驗室采集HLHRadopholus similis荷蘭Holand紅掌 Anthium葛建軍實驗室SHHRadopholus similis上海 shanghai生姜 ginger葛建軍實驗室LZHRadopholus similis廖州 liaozhou紅掌 Anthium華南農業大學廖金鈴教授提供SZHRadopholus similis深圳 Shenzhen紅掌 Anthium深圳動植物檢疫局李一農提供 主要試劑TaqDNA聚合酶、DNA普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根公司； DNA marker購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；pGEM-T Easy Vector (Promega，美國)購自北京綠生源科技有限公司，Pro K(蛋白酶K)購自Roche公司。
本發明的實驗所采用的表1、表2所列的各種屬的線蟲，其中本實驗室采集的線蟲種群，均采用常規方法采集，傳統形態學方法鑒定種類后供試；所有供試線蟲本實驗室均有保存，可向公眾發放作為實驗驗證使用。實施例1香蕉穿孔線蟲DNA的提取、rDNA-ITS擴增及序列分析與注冊1. 1香蕉穿孔線蟲DNA的提取所有樣本的DNA提取均參照彭德良等(2003)的方法并在此基礎上略加改動。挑取單頭至10頭線蟲放入裝有10 μ 1 ddH20的Eppendorf管中，_20°C冷凍過夜，取出后，用 75%酒精消毒的玻璃棒研磨至冰塊融化，加入7μ 1 WLB(worm lysis buffer)和3μ 1蛋白酶K(2mg/ml)溶液，混勻于5000rmp點動離心，_20°C冷凍30min以上，然后轉入PCR儀， 65°C溫浴60min，95°C反應lOmin，取出后點動離心，取上清液進行PCR擴增或于-20 V保存1. 2罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA的直接提取采用改進的CTAB 法，提取液成分200mM Tris-HCl, PH 8. O ；400mM NaCl ； 10mMEDTA,PH 8. O ；3% CTAB (W/V) ；4% β -巰基乙醇(V/V)。提取步驟液氮研磨感病紅掌根至細粉末狀，每0. 5g植物組織加入60 μ 1 prok(2mg/ml)和600 μ 1經65°C預熱的DNA 裂解液，充分混勻后65°C溫浴0. 5 2h，期間，每15min顛倒混勻一次。4°C 12000rmf/ min離心lOmin，取上清液用等體積酚/氯仿抽提2次直至分界面看不到白色沉淀物后 40C 12000rmf/min 離心 lOmin，上清用 2V 無水乙醇和 1/10V 3M NaAC (PH 5.2)于 _70°C沉降DNA 0. 5h，4°C 12000rmf/min離心15min，70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀后后用30 μ 1 Tris-HCl 復溶 DNA。1. 3香蕉穿孔線蟲rDNA-ITS擴增及序列分析采用通用引物Ferris et al. (1993)引物(Phap 等，2004)，序列如下FerF (5，-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3，)和 FerR (5，-TCCTCCGCTAAATGATATG-3，)。擴增香蕉穿孔線蟲的 rDNA-ITS，PCR 反應體系為 10 XBuffer (含 Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP 4μ 1, ddH20 32. 6μ 1,引物 Ferris F 禾口 Ferris FR(20 μ mol/L)各 1· 5 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1， Takara)0. 4μ 1，模板DNA 5μ 1，總計50μ 1。PCR擴增條件為95°C預變性5min，50°C退火 30s，72°C延伸2min ；94°C變性45s，50°C退火30s, 72°C延伸2min, 35個循環；72°C再次延伸 10min，4°C保存。PCR擴增后，取5μ 1擴增產物加1 μ 1加樣緩沖液在1. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，用0. 5 X TAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40分鐘，用EB染色，在紫外燈下觀測并照相。rDNA-ITS-PCR擴增結果表明7個不同的香蕉穿孔線蟲群體均產生一明顯的ITS擴增條帶，擴增產物長度均為706bp左右，在陰性對照中不加入線蟲DNA模板，沒有PCR產物(圖 1)。用離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN公司)回收純化PCR產物。進行克隆和測序，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。測定的7個香蕉穿孔線蟲ITS 序列在 GenBank 上的登錄號分別為 EF208207、EF208208、EF517226、EF208209、EF208206、 EF517228、EF517227。實施例2香蕉穿孔線蟲特異性引物的篩選及檢測2. 1香蕉穿孔線蟲特異性引物的設計和篩選采用發明單位擴增得到的7個香蕉穿孔線蟲ITS序列(NCBI登錄號EF208207、 EF208208、EF517226、EF208209、EF208206、EF517228、EF517227,具體序列見附錄)及由NCBI基因庫中下載的隸屬于香蕉穿孔線蟲屬的6個近緣種的ITS序列(NCBI登錄號 AF375369、AF375386、AF3753687、AF375389、AF375391、AF375393)進行比對分析，并設計篩選出一對香蕉穿孔線蟲特異性引物RsFl/RsRl，此香蕉穿孔線蟲上游特異性引物(RsFl)的序列位于ITSl序列第208bp至第228bp，下游特異性引物(RsRl位于458bp至479bp，擴增的特異性片段長度為271bp。2. 2用特異性引物對香蕉穿孔線蟲進行特異性PCR檢測PCR 反應體系2· 5μ 1 10XPCR Buffer (含 Mg2+)，2 μ 1 IOmM dNTP (2. 5mM)， 1. 5μ 1 引物對 RSF1/RSR1 (20uM)，0· 2 μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/ul)，2y 1 模板 DNA，滅菌 ddH20 補足至25 μ 1。采用無線蟲DNA模板為陰性對照。在EppendorfPCR擴增儀上進行擴增。PCR 反應程序如下:95V 4min，95°C變性 45s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35 個循環；72°C再延伸10min，4°C保存。PCR反應結束后5000rmp點動離心取上清液于_20°C保存或進行后續實驗。取5μ 1擴增產物加1 μ 1上樣緩沖液在1. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，用 0. 5 X TAE作為電泳緩沖液，100V/40min，用EB染色，在紫光燈下觀測并照相。7個香蕉穿孔線蟲種群經特異性引物RSF1/RSR1擴增出一條穩定的條帶，長度為 271bp，陰性對照中無擴增條帶出現，如圖2所示，說明設計的特異性引物符合要求。2. 3 一步雙重香蕉穿孔線蟲的特異性PCR檢測方法將構建的香蕉穿孔線蟲特異性引物對RsFl/RsRl與通用引物對D2A/D3B置于同一個PCR反應中，同時互不影響。其中RsFl/RsRl特異性擴增香蕉穿孔線蟲基因組DNA的ITS 片段，D2A和D3B用于擴增rDNA基因D2D3擴展區域的DNA片段。所用引物序列見表2。表2本發明所使用引物代碼和序列
引物代碼引物序列(5，to3，)
Code of PrimersSequences
RsFl5，-TGTCATCGCCTTTGGCAGCT -3'RsRl5，-TGGTAAACGACCCTGAACCAG-3 ‘D2A5，-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG -3'D3B5，-TCGGAAGGAACCAGCTACTA -3'該香蕉穿孔線蟲分子檢測方法采用25 μ 1的PCR反應體系10XPCR-buffer (含 Mg+) 2. 5 μ l,dNTPs 2. 0 μ 1，D2A/D3B 引物對 1. 5 μ 1，RSF1/RSR1 引物對 1. 5 μ 1，Taq DNA 多聚酶 0. 2 μ 1 (5U/ μ 1)，模板 DNA2. 0 μ 1，滅菌 ddH20 水補足至 25 μ L·PCR 反應擴增程序為95°C 4min，95°C變性 45s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35 個循環；72°C再延伸10min，4°C保存。PCR反應結束后5000rmp點動離心取上清液于_20°C 保存或進行后續實驗。取5 μ 1擴增產物加1 μ 1上樣緩沖液在1. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，用 0. 5 X TAE作為電泳緩沖液，100V/40min，用EB染色，在紫光燈下觀測并照相。相同樣品的雙重PCR至少重復兩次以證實結果的準確性。同一采樣地點的樣品的鑒定試驗重復三次。結果顯示引入D2A/D3B進行雙重PCR擴增，5個香蕉穿孔線蟲群體擴增出群體均擴增出兩個條帶分別為780bp和271bp，陰性對照中無擴增條帶出現。如圖3所示。
2. 4香蕉穿孔線蟲特異性引物的PCR驗證檢測收集2個短體線蟲群體(分別采集于海南PLD和北京PXM)、2個甘薯莖線蟲群體(分別采集于河北昌黎DdCL和江蘇泗洪DdSH)、2個大豆孢囊線蟲群體(均采集于甘肅 GS-4，GS-14)、2個禾谷孢囊線蟲(均采集于甘肅GS-11，GS-18)、1個根結線蟲群體(采集于河北廊坊MiLF)(見表3)，分別提取其DNA作為模板與香蕉穿孔線蟲群體DNA模板一起進行特異性引物的雙重PCR擴增，以檢測RsFl/RsRl引物的特異性。表3供試的其它植物線蟲群體樣品來源
權利要求
1.一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取液，其組分及各組分的終濃度如下 Tris-HC1200mM, PH 8. O ；NaCl 400mM ；EDTA IOmM, PH 8. 0 ；CTAB 3% (W/V) ； β-巰基乙醇 4% (V/V) ο
2.一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA的提取方法，步驟是(1)液氮研磨待測罹病植物組織使之成粉末狀；(2)將所述粉末狀的罹病植物組織加入到預熱的植物裂解液中，并加入蛋白酶K，混勻后抽提；(3)沉淀純化提取物；其特征在于，所述植物裂解液為上述DNA提取液。
3.根據權利要求2所述的提取方法，所述粉末狀的罹病植物組織與所述DNA提取液的比例為0. 1 0. 5g 500 IOOOul，所述預熱溫度為65攝氏度；加入的蛋白酶K為2mg/ ml蛋白酶K溶液，加入體積為所述DNA提取液的10%。
4.根據權利要求2所述的提取方法，所述抽提指于65°C溫浴0.5 2h，期間每隔 15min顛倒混勻一次；4°C下12000rmf/min離心lOmin，上清液轉移至另一離心管中，加等體積酚/氯仿抽提直至分界面看不到白色沉淀物；4°C下12000rmf/min離心lOmin，取上清液。
5.根據權利要求2所述的提取方法，所述沉淀純化指向抽提操作中最后得到的上清液加入2倍體積的預冷的無水乙醇和1/10體積pH5. 23MNaAC溶液，混勻，然后于_70°C環境放置至少0. 5h以沉降DNA;4°C下12000rmf/min離心lOmin，去上清，用70%乙醇洗滌沉淀2 次，干燥后，沉淀溶于TE緩沖液中。
6.權利要求1所述的提取液或權利要求2 5任一所述的DNA提取方法在通過提取 DNA以檢測診斷罹病植物、土壤香蕉穿孔線蟲感染情況或鑒別香蕉穿孔線蟲中的應用。
7.一種檢測植物罹患香蕉穿孔線蟲感染的PCR方法，包括如下步驟(1)從待檢測植物組織中提取DNA作為PCR模板，(2)配制PCR反應體系進行PCR擴增及電泳檢測，其特征在于從待檢測植物組織中提取DNA采用權利要求2 6任一所述的DNA提取方法，所述PCR反應體系中的引物為香蕉穿孔線蟲DNA為模板設計的引物。
8.根據權利要求7所述的PCR方法，所述引物為香蕉穿孔線蟲特異性引物上游引物RsFl 5’ -TGTCATCGCCTTTGGCAGCT-3’下游引物RsRl 5，-TGGTAAACGACCCTGAACCAG-3，。
9.根據權利要求7所述的PCR方法，所述PCR反應體系為5μ IlOX含Mg2+的PCR緩沖液，4 μ IlOmM 的 dNTPS, 1 μ 10. 1 % BSA, 1. 5 μ 120uM 引物對 RSF1/RSR1,0. 5 μ 15U/ul 的 Taq DNA聚合酶，1 μ 1 DNA模板，滅菌ddH20補足至25 μ 1，所述PCR擴增的程序為95°C 4 分鐘，95°C變性45秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，40個循環；72°C再延伸10分鐘，4°C 保存。10.根據權利要求7 9任一所述的PCR方法，所述PCR擴增的體系中的引物還包括如下通用引物5' -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3‘5’ -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3，。
全文摘要
本發明“一種罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取液、提取方法及其應用”，涉及植物病害的分子生物學檢測技術。所述DNA提取液其組分及各組分的終濃度如下Tris-HCl 200mM，pH 8.0；NaCl 400mM；EDTA 10mM，pH 8.0；CTAB 3％(W/V)；β-巰基乙醇4％(V/V)。該提取液作為罹病植物香蕉穿孔線蟲DNA的裂解液，能夠將感染植物組織的極少量的香蕉穿孔線蟲的DNA完好地提取出來，而不受植物組織的酚類、蛋白酶類、解酶等物質的降解。本發明提供的DNA提取液及提取方法是采用PCR等分子生物學手段早期監測香蕉穿孔線蟲感染以便于早期治理預防感染的重要基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102382819SQ20111034026
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月25日 優先權日2010年2月25日
發明者張東升, 彭德良, 彭煥, 李佳, 王瓊, 耿麗鳳 申請人:中國農業科學院植物保護研究所