一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，屬于應用微生物學領域。本發明方法包括氨基酸溶液配制、捕食線蟲真菌培養和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官誘導步驟。其中：a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸為纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的誘導步驟中采用捕食線蟲真菌的分生孢子，并通過氨基酸溶液進行浸泡的方式進行捕食器官的誘導。本發明的優點在于：通過培養和收集捕食線蟲真菌的孢子，利用纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸溶液進行侵泡，能夠誘導捕食線蟲真菌產生大量的捕食器官。本發明方法操作簡單，重復性好，能夠獲得大量的捕食器官，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
【專利說明】一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，屬于應用微生物學領域。
【背景技術】:
[0002]植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生線蟲所引起的農作物經濟損失高達1570億美元(Abad et al.，2008)。在我國，線蟲危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麥、水稻、林木和中藥材等幾乎所有的經濟作物，成為農業生產中重要的限制因子之一。目前對植物線蟲病害的防治仍然以化學防治為主，但由于化學農藥對生態環境的影響以及寄生線蟲抗藥性的增加，使其應用逐步受到限制，因此采用線蟲天敵進行生物防治日益受到研究人員的關注(劉杏忠等，2004 ;楊曉野等，2004 ；Moosavi andZare, 2012)。
[0003]捕食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)是線蟲的重要天敵之一，對于自然界中線蟲種群數量的控制具有重要的調節作用。捕食線蟲真菌根據形態學特征分為節叢抱屬(Arthrobotrys spp.)、單頂抱屬(Monacrosporium spp.)和隔指抱屬(Dactylella spp.)(張克勤等，2006)。這一類特殊類群真菌的營養菌絲能夠特化形成粘性菌網、粘球和收縮環等捕食器官，完成對植物寄生線蟲的捕捉和侵染過程(張克勤等，2006 ；Yang et al.，2012)。因此，捕食線蟲真菌是開發高效線蟲生防制劑的重要資源(Nordbring-Hertz, 2004 ；Moosavi and Zare, 2012)。捕食器官是真菌捕捉和侵染線蟲的重要武器，捕食器官形成的數量與真菌的捕食效率密切相關。目前，部分捕食線蟲真菌已經被開發成為生防制劑用于植物寄生線蟲的生物防治(劉杏忠等，2004)，但是由于土壤抑菌作用等抑制了真菌孢子的萌發和捕食器官的形成，現有的線蟲生防制劑存在防效不高和防效不穩的現象，嚴重的限制了線蟲生防制劑的推廣和應用。因此，闡明捕食器官形成的分子機制對于高效生防制劑的開發具有十分重要的意義。
[0004]捕食器官的形成是捕食線蟲真菌侵染線蟲的必要條件之一，在實驗室培養條件下，大多數捕食線蟲真菌的捕食器官能通過線蟲誘導產生，同時也能通過線蟲提取液、線蟲激素和小肽等誘導產生(Yang et al.，2011 ；Hsueh et al.，2013)。盡管前期有人報道氨基酸能夠誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢(Arthrobotrys oligospora)產生捕食器官(Frimanet al.，1985 ;王瑞等，2008)，但他們主要是通過在培養基中添加氨基酸進行誘導，每個平板中捕食器官形成的數量不到350個，而本發明的方法是利用合適濃度的氨基酸溶液浸泡捕食線蟲真菌的孢子，并把孢子涂布于水瓊脂平板，每個平板產生的捕食器官數量最多能夠達到1600個以上。
[0005]經文獻檢索，未發現與本
【發明內容】
相同文獻的公開報道。
【發明內容】
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[0006] 本發明的目的是克服現有技術之不足，而提供一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，迅速獲得大量的捕食器官，為進一步研究捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料，同時也為高效線蟲生防制劑的開發奠定基礎。
[0007]本發明涉及的氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和谷氨酸)為實驗室常規實驗用品，能從國內外市場購買得到。本發明涉及的捕食線蟲真菌，如寡孢節叢孢(Arthrobotrysoligospora)和環捕節叢孢(Arthrobotrys brochopaga)為常規實驗用真菌,能從國內外的微生物保藏機構購買得到。
[0008]本發明在常規方法基礎上改進而成。本發明實現的步驟如下:
[0009]1.氨基酸溶液的配制
[0010]I)實驗用品:滅菌去離子水、滅菌三角瓶、燒杯、0.22 μ m的濾膜、無菌醫用注射器、及磁力攪拌器。
[0011]2)配制方法:準確稱 取0.5g氨基酸(纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸)，放入燒杯中；用量筒準確量取IOOmL滅菌去離子水，倒入上述燒杯中，磁力攪拌使氨基酸充分溶解；用0.22 μ m的無菌濾膜對上述氨基酸溶液進行過濾除菌，濾液裝入事先滅菌的三角瓶中，于4°C冰箱中保存備用；用時稀釋得到不同終濃度(0.005，0.05和0.lg/L)的氨基酸溶液。
[0012]2.誘導培養基的配制
[0013]水瓊脂培養基:用于氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官。每1000mL去離子水，加入20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0014]3.捕食線蟲真菌的培養(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節叢孢A.0ligospora為例)
[0015]I)培養基:PDA培養基和CMA培養基的組成和配制方法如下:
[0016]PDA培養基:去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入葡萄糖20g，加水補充體積到1000mL，121°C滅菌20分鐘。
[0017]CMA培養基:稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，煮沸(100°C ) 20分鐘，用6層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0018]2)寡孢節叢孢的活化和孢子培養:保存的寡孢節叢孢菌種在PDA培養基上進行活化。按上述方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0019]4.捕食線蟲真菌孢子的收集(以寡孢節叢孢A.0ligospora為例)
[0020]I)實驗用品:滅菌去離子水、滅菌玻璃珠、及滅菌漏斗(4層擦鏡紙)。
[0021]2)操作步驟:為了不影響后續的誘導實驗，在收集過程中要避免孢子萌發，所以整個過程要在冰上操作。
[0022]①往培養寡孢節叢孢孢子的三角瓶中加入滅菌去離子水(8mL/瓶)，然后加入6-8個滅菌玻璃珠(直徑0.3-0.4cm)，振蕩2-3min ；
[0023]②用移液器將三角瓶中的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏斗內過濾；
[0024]③向上述三角瓶中再次加入8mL滅菌去離子水，用相同方法重洗一次孢子，液體轉移至同一漏斗內過濾；
[0025]④將濾液轉移至另一裝有無菌擦鏡紙的漏斗內再次過濾；[0026]⑤將第④步獲得的濾液用移液器轉移到Eppendorf管中，12000rpm/min,離心2min ；
[0027]⑥孢子懸液的濃縮:每250mL三角瓶中培養的孢子，得到的孢子懸液最終濃縮至lmL，然后用血球計數板觀察計數，計算孢子的濃度。
[0028]5.捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(以寡孢節叢孢A.0ligospora為例)
[0029]I)水瓊脂平板:為了便于后續觀察捕食器官的形成，水瓊脂板不宜倒的太厚，每個平板(直徑為9cm)的培養基體積為15-16mL。
[0030]2)將寡孢節叢孢孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，取ImL孢子懸液于Eppendorf 管中，12000rpm/min,離心 2min ；
[0031]3)小心吸去上清，實驗組往沉淀中加入360 μ L配好的氨基酸溶液，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照組，分別取等量加入孢子沉淀中，然后用移液器反復吹打，使孢子均勻懸浮；
[0032]4)將上述裝有孢子懸液的Eppendorf管冰浴20min ；
[0033]5)冰浴后的孢子懸液用移液器吹打均勻，然后加到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，每個樣品3個平行，之后用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平板于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網)產生，觀察拍照并統計捕食器官的數量。
[0034]與以往的報道相比，本發明有以下幾個特點:
[0035]I)特定氨基酸能夠有效誘導捕食線蟲真菌產生大量的捕食器官(最多可達到1600個/平皿，圖1)；
[0036]2)傳統方法大多采用真菌菌絲體進行誘導，而本發明采用捕食線蟲真菌的分生孢子進行誘導；
[0037]3)特定氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法具有簡單易行、重復性好和可控性強的特點。
[0038]4)氨基酸是單一化合物，誘導真菌產生捕食器官的同時不會像線蟲或線蟲提取物一樣激活其他的生物學途徑，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0039]圖1為纈氨酸(Val)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官。
[0040]圖2為纈氨酸(Val)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官。
[0041]圖3為亮氨酸(Leu)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官。
[0042]圖4為亮氨酸(Leu)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官。
[0043]圖5為谷氨酸(Glu)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官。
[0044]圖6為谷氨酸(Glu)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官。
【具體實施方式】:
[0045]以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。本發明的實施例所用方法同
【發明內容】
部分所描述的方法。[0046]實施例一:纈氨酸(Val)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官
[0047]按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0048]按照
【發明內容】
部分所描述孢子的收集方法，收集寡孢節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的纈氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網)產生(圖1)。
[0049]實施例二:纈氨酸(Val)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官
[0050]按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環捕節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0051]按照
【發明內容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環捕節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的纈氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環)產生(圖2)。
[0052]實施例三:亮氨酸(Leu)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官
[0053]按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0054]按照
【發明內容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網)產生(圖3)。
[0055]實施例四:亮氨酸(Leu)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官
[0056] 按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環捕節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0057]按照
【發明內容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環捕節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，OOO個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環)產生(圖4)。
[0058]實施例五:谷氨酸(Glu)誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢產生捕食器官
[0059]按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0060]按照
【發明內容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網)產生(圖5)。
[0061]實施例六:谷氨酸(Glu)誘導捕食線蟲真菌環捕節叢孢產生捕食器官
[0062]按照
【發明內容】
部分所描述的方法配制CMA培養基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環捕節叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養基上，28°C恒溫培養箱內培養14天，以得到大量的孢子。
[0063]按照
【發明內容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環捕節叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養箱內培養6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環)產生(圖6)。
【權利要求】
1.一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，包括氨基酸溶液配制、捕食線蟲真菌培養和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官誘導步驟；其特征在于:a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸為纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的誘導步驟中采用捕食線蟲真菌的分生孢子，并通過氨基酸溶液進行浸泡的方式進行捕食器官的誘導。
【文檔編號】A01P5/00GK104004668SQ201410271485
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】楊金奎, 蘇浩, 趙勇, 張克勤 申請人:云南大學