專利名稱：基于核酸內切酶消化的甲基化dna定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種甲基化DNA的定量檢測方法，尤其涉及一種基于核酸內切酶消化的甲基化DNA定量檢測方法。
背景技術：
DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5，碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發現的DNA修飾之一，是表觀遺傳學的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)殘基上，這常見于基因5’端表達調控序列。DNA甲基化在基因表達的調控中具有重要作用，參與了動物胚胎發育、基因印記和X 染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及蛋白質互相作用方式的改變，從而控制基因表達。DNA甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升高，可以導致基因組的不穩定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發生癌癥的機率就會提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在腫瘤的早期檢測中的應用，因為研究表明表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發生與發展，檢測DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發現。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測可以用于腫瘤發生的早期預測。CpG島甲基化的檢測方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測法。甲基化敏感性限制性內切酶/Southern法 (methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern,MSRE- Southern)是比較傳統的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測方法，是目前檢測DNA甲基化的常用方法，具有高靈敏度的同時，假陽性率也很高。

發明內容
本發明提供了一種甲基化DNA的定量檢測方法，能夠有效的分離出甲基化DNA和非甲基化DNA，并且解決了現有技術局限性大、方法復雜、需要樣本量大、容易被干擾、不適用混合樣本等缺點。本發明一種基于核酸內切酶消化的甲基化DNA定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟
步驟1，用亞硫酸鹽處理待測DNA，和標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA ； 步驟2，在要檢測的目標區域內，選擇富含CpG位點的一段序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端的一段序列的互補序列作為反向引物；
步驟3，亞硫酸鹽處理過的標準甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，用所述步驟2所設計的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，并測定標準甲基化和非甲基化DNA擴增產物的解鏈溫度；
步驟4，以亞硫酸鹽處理的待測DNA樣品作為PCR模板，在與步驟3相同的條件下，進行 PCR擴增，得到PCR產物；
步驟5，將步驟4所得PCR擴增產物進行加熱，使其溫度高于標準非甲基化DNA相應的 PCR擴增產物解鏈溫度，而低于標準甲基化DNA相應的PCR擴增產物的解鏈溫度；
步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產物進行冷卻，將冷卻后的產物分為兩部分，一部分加入單鏈DNA特異性核酸內切酶，另一部分不加單鏈DNA特異性核酸內切酶，在相同的反應條件下進行消化，得到消化產物；
步驟7，向步驟6所得消化產物中分別加入對雙鏈DNA特異的熒光染料，用熒光分光光度計測定雙鏈DNA的含量。上述檢測方法，其中，所述步驟1中所述亞硫酸鹽優選為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理方法為以0. 3M的NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的PH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時；脫硫并純化DNA。上述檢測方法，其中，所述步驟2中，使所設計的PCR引物優選為1纊32堿基長度， 在引物序列中所涉及的CpG位點數量可以為(Γ3個，且使所設計的引物的3’端的最后一個堿基不處于CpG的C的位置，以使PCR擴增的DNA片段大小為8(Tl80堿基長度，并使PCR 擴增的序列中含有盡可能多的CpG位點。上述檢測方法，其中，在所述的引物序列中所涉及的CpG位點的C的位置，正向引物中可以用c/τ混合代替C，反向引物中可以用G/A混合代替G。 上述檢測方法，其中，所述步驟3中，使用實時定量PCR擴增儀進行擴增，并分別測定標準甲基化和非甲基化DNA擴增產物解鏈溫度。上述檢測方法，其中，所述單鏈DNA特異性核酸內切酶為Τ7核酸內切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合。上述檢測方法，其中，所述對雙鏈DNA特異的熒光染料為STOR Green I。上述檢測方法，其中，所述待測DNA為人類基因組DNA，所述標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA為已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組 DNA。上述檢測方法，其中，所述待測DNA樣品為人類正常DNA，癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。上述檢測方法，其中，所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；
所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；
所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。本發明提供了一種甲基化DNA定量檢測方法，該方法具有適用范圍大、方法簡單、 需要樣本量小、不易被干擾、適用混合樣本等優點。在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發監控等方面有著重要的意義。


圖1為本發明甲基化DNA定量檢測方法流程圖。
具體實施例方式參照圖1，對本發明甲基化DNA定量檢測方法具體介紹如下 實施方式(一)
步驟1 采用亞硫酸鹽處理并純化已知的標準非甲基化DNA和甲基化DNA，將處理過的甲基化DNA作梯度稀釋，且與一定量的非甲基化DNA混合，作為待測DNA樣品。其中，標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA為已知的甲基化DNA和非甲基化DNA ； 所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理步驟為，以0. 3M NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌、pH5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時；脫硫并純化DNA。步驟2 確定待測基因檢測區域，按照基因序列設計并合成能同時擴增亞硫酸鹽處理過的非甲基化DNA和甲基化DNA的正向PCR引物和反向PCR引物。其中引物設計的要求為在所要檢測的基因序列中，選擇一段序列作為目標檢測序列進行引物設計，使這一段序列富含CpG位點。以這一段序列的5’端的一段序列作為PCR 的正向引物，以這一段序列的3’端的一段序列的互補序列作為PCR的反向引物，使PCR擴增的DNA片段大小為8(Γ180堿基長，使PCR擴增的序列中含有盡可能多的CpG位點，一般為壙20個；所設計的PCR引物為1壙32堿基長，在引物的序列中不含有或含有不超過3個 CpG位點，在所涉及CpG位點的“C”的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G ；且使所設計的引物的3’端的最后一個堿基不處于CpG的“C”的位置。步驟3 以上述的PCR引物，以標準的非甲基化DNA和甲基化DNA為模板，以Taq DNA聚合酶，加入熒光染料，以實時定量PCR儀，進行PCR擴增，并進行解鏈溫度測定。其中所述的PCR操作過程，由正向和反向PCR引物、PCR擴增緩沖液(Buffer)、 Taq DNA聚合酶、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)、所述亞硫酸鈉處理過的DNA模板 (Template)，純水組成的PCR體系，以熒光染料STOR Green I為指示劑，采用實時定量PCR 儀進行擴增，并進行解鏈溫度測定，分別測定標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA樣品的 PCR產物的解鏈溫度。步驟4 將一定量的亞硫酸鈉處理過的標準非甲基化DNA，與梯度稀釋的亞硫酸鈉處理過的標準甲基化DNA混合，作為待測樣品；在相同條件下進行PCR擴增。其中，相同條件是指除模板DNA以外，其他操作均與步驟2相同；但不進行解鏈溫度測定。步驟5 將步驟4中所得PCR產物進行加熱至一個特定溫度，使這一溫度高于非甲基化DNA相應的PCR產物解鏈溫度，而低于甲基化DNA相應的PCR產物的解鏈溫度，然后立即冷卻。步驟6:將步驟5中所加熱處理并冷卻的樣品，分為兩份，其中一份加入對單鏈DNA 特異的核酸內切酶和相應的反應緩沖液，在適當條件下進行消化處理，另一份作為對照。其中，所述對單鏈DNA特異的核酸內切酶為T7核酸內切酶I、S1核酸酶或綠豆核酸酶，或者是上述幾種的混合。步驟7 將步驟6所得消化產物，加入對雙鏈DNA特異的熒光染料STOR Green I， 以熒光分光光度計進行熒光強度測定，記錄所測定的加入單鏈DNA特異性核酸內切酶時及不加入單鏈DNA特異性核酸內切酶時雙鏈DNA的濃度比例變化，并計算待測樣品中所含甲基化DNA的量。本發明一種甲基化DNA檢測方法，通過上述步驟檢驗本發明的準確度和靈敏度。在醫學領域，能夠準確而靈敏地測出DNA中是否存在甲基化DNA，就能夠對于腫瘤的早期檢測、病情判斷和癌癥的復發監控提供一種很好的指標。實施方式(二)
在實施方式(一)的基礎上，以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品，在與上述實施方式 (一)相同的條件下，檢驗本發明的實用性。其中，與上述在實施方式(一)相同的條件，指的是除以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品外，所有操作與上述在實施方式(一)相同。所述臨床提取的待測DNA樣品，為人類正常和癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。所述癌細胞可以是肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織可以是肺癌組織、胃癌組織、結腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液可以是血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。實施方式(三)
在實施方式(一)和(二)的基礎上，以P16基因轉錄啟動區的序列為例，具體PCR引物設計如下
P16基因轉錄啟動區的甲基化是肺癌等多種癌癥細胞具有的特征。P16基因轉錄啟動區的序列如下，
Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds, DQ325544. 1
CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測的區域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測的區域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所設計的PCR引物正向引物 5’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’ 反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAA-3， 然后，按照實施方式(一)所述的方法，進行檢測。上述內容為本發明的具體實施例的例舉，對于其中未詳盡描述的試劑、設備、操作方法等，應當理解為采取本領域已有的普通及常規試劑、設備、操作方法等來予以實施。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
權利要求
1.一種基于核酸內切酶消化的甲基化DNA定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟1，用亞硫酸鹽處理待測DNA、和標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA ；步驟2，在要檢測的目標區域內，選擇含多個CpG位點的一段序列，以所選序列5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端的一段序列的互補序列作為反向引物；步驟3，以亞硫酸鹽處理過的標準甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，用所述步驟2所設計的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶，以實時定量PCR儀進行PCR擴增， 并測定標準甲基化和非甲基化DNA擴增產物的解鏈溫度；步驟4，以亞硫酸鹽處理的待測DNA樣品作為PCR模板，在與步驟3相同的條件下，進行 PCR擴增，得到PCR產物；步驟5，將步驟4所得PCR擴增產物進行加熱，使其溫度高于標準非甲基化DNA相應的 PCR擴增產物解鏈溫度，而低于標準甲基化DNA相應的PCR擴增產物的解鏈溫度；步驟6，立即將步驟5中加熱的PCR產物進行冷卻，將冷卻后的產物分為兩部分，一部分加入單鏈DNA特異性核酸內切酶，另一部分不加單鏈DNA特異性核酸內切酶，在相同的反應條件下進行消化，得到消化產物；步驟7，向步驟6所得消化產物中分別加入對雙鏈DNA特異的熒光染料，用熒光分光光度計測定雙鏈DNA的含量。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理方法為以0. 3M的NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌組成的pH值為5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時；脫硫并純化DNA。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，使所設計的PCR引物為1壙32堿基長度，在引物序列中所涉及的CpG位點數量可以為(Γ3個，且所設計的引物的3’端的最后一個堿基不處于CpG的C的位置；并使PCR擴增的DNA片段大小為8(Tl80堿基長度，使PCR 擴增的序列中含有盡可能多的CpG位點。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，在所述的引物序列中所涉及的CpG位點的C的位置，正向引物中用C/T混合代替C，反向引物中用G/A混合代替G。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述單鏈DNA特異性核酸內切酶為 Τ7核酸內切酶I、Sl核酸酶或綠豆核酸酶中的一種或幾種的混合。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述對雙鏈DNA特異的熒光染料為 SYBR Green I 。
7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述待測DNA為人類基因組DNA，所述標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA為已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組DNA。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述待測DNA樣品為人類正常DNA， 癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、 淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液為血液、腦脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液或陰道分泌液。
全文摘要
本發明涉及一種甲基化DNA的定量檢測方法，包括以下步驟步驟1，用亞硫酸鹽處理待測DNA樣品和標準DNA樣品；步驟2，設計并合成PCR引物；步驟3，對標準DNA進行PCR擴增，并測定解鏈溫度；步驟4，對待測DNA進行PCR擴增；步驟5，將待測DNA的PCR擴增產物加熱到一特定溫度后立即冷卻；步驟6，對PCR產物進行消化；步驟7，加入對雙鏈DNA特異的熒光染料，以熒光分光光度計測定熒光強度，并計算甲基化DNA含量。該方法操作簡單，檢測靈敏度高，特異性強，適用范圍大，并且不受干擾，在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發監控等方面有著重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102399865SQ20101028309
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月16日 優先權日2010年9月16日
發明者王建 申請人:上海迦美生物科技有限公司