專利名稱：可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種應用基因工程與化學突變相結合的 技術制備谷胱甘肽人源含硒單鏈抗體酶的方法。
背景技術：
含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團 是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化 氫酶(CAT) —起構成了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發揮著重要的 作用，它以GSH為還原劑，分解體內的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清 除體內活性氧(ROS)，防止脂質過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如紫 外線輻射、心腦血管疾病、白內障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了 能清除ROS夕卜，還能降解脂質過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保 護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX 的來源相當有限、穩定性差，致使它的模擬物的研究備受關注。
小分子模擬物主要有PZ51 (ebselen)， AL3823A， BXT系列產品，它們的 弱點是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。80年代中期出現的抗體酶制備 技術為GPX的人工模擬開辟了新途徑，根據酶學原理、利用免疫學和化學知識， 設計了一種新的產生抗體酶的技術路線，并成功地制備了數種具有很高GPX活 力的含硒抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)。這些高活力的含硒抗體 酶氨基酸組成是鼠源的，可作為抗原刺激人體產生人抗鼠抗體，因此限制了該類 藥物的使用。為了解決這一問題，制備人源含硒單鏈抗體酶是一個最好的辦法， 噬菌體人抗體庫的成功構建為這一設想提供了可能。
中國專利99104234.4公開的人源單鏈含硒抗體酶的制備方法是半抗原 -GSH衍生物的設計與合成；以GSH的衍生物為靶抗原直接從噬菌體展示人抗體 庫中篩選GSH特異的單鏈抗體；在大腸桿菌中以包涵體形式表達無活性的單鏈 抗體蛋白；變性、復性、純化單鏈抗體蛋白；用化學突變(修飾)法將GPX的催化基團SeCys引入單鏈抗體可變區，因而在單鏈抗體可變區既有底物結合部 位又有催化基團，結果產生具有GPX活力的人源含硒抗體酶。該法制備的人源 含硒單鏈抗體酶的方法有以下缺點(l)制備過程中表達的包涵體蛋白，是一種 無正常空間構象，處于沉淀狀態下的無活性蛋白分子，需要經過變性-復性才能 有活性。包涵體蛋白復性是一個困難而復雜的過程，僅復性這一步就會損失大量 的單鏈抗體蛋白，導致該法制備抗體酶產率下降；(2)制備抗體酶的周期長、操 作繁瑣，因包涵體復性是使無活性的蛋白分子在適宜的條件下逐漸恢復活性的緩 慢過程；(3)制備的抗體酶活性低，僅為28.8-256U/txmo1，低于天然酶一個數量 級水平。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種應用標準的抗體庫免疫親和篩選技 術、基因工程技術、化學突變技術相結合的方法制備谷胱甘肽人源含硒單鏈抗體 酶的方法，達到提高抗體酶活性、可直接應用于人體、簡化步驟、縮短制備周期、 提高抗體酶產率的目的。
本發明的總體思路是，先篩選具有GPX底物結合部位的人源單鏈抗體，通 過測序確定其氨基酸序列，然后將編碼該氨基酸序列的人源單鏈抗體基因組裝到 原核或真核分泌型表達載體上，轉化大腸桿菌或酵母細胞，表達可溶性單鏈抗體 蛋白，再用化學突變法將GPX的催化基團引入到單鏈抗體的底物結合部位；或 用基因突變技術和營養缺陷型大腸桿菌直接表達在底物結合部位含有GPX催化 基團的可溶性單鏈抗體蛋白。因而在該單鏈抗體上既有GPX的底物結合部位， 又有催化基團，結果賦予該單鏈抗體高的GPX的催化活性，就產生了高活力的 人源含硒單鏈抗體酶。
具體制備方法是，利用噬菌體抗體展示技術，以谷胱甘肽衍生物為靶抗原， 通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進行篩選。分離并擴增 GSH特異性單鏈抗體基因。將上述基因組裝到分泌型原核或真核表達載體上， 轉化大腸桿菌或酵母細胞，在原核或真核中大量表達并純化單鏈抗體蛋白。用苯 甲基磺酰氟活化單鏈抗體中的絲氨酸(Ser)殘基上的羥基，再用硒氫化鈉處理， 則將Ser突變成SeCys，結果在抗體的底物結合部位引入GPX的催化基團SeCys， 賦予抗體以GPX的催化活性；或用基因突變技術和營養缺陷型大腸桿菌直接表達在底物結合部位含有GPX催化基團的可溶性單鏈抗體蛋白，賦予抗體以GPX 的催化活性。
本發明以谷胱甘肽衍生物為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示 人單鏈抗體庫進行篩選。得到的用于制備人源含硒單鏈抗體酶的人源單鏈抗體， 由15個氨基酸組成的短肽連接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變 區；具體的單鏈抗體B3和單鏈抗體D8的氨基酸序列分別是，
B3的氨基酸序列
MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEW
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GS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245;
D8的氨基酸序列
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制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第一種方法分離擴增單鏈抗體基因，組 裝到原核分泌型表達載體上，轉化大腸桿菌，表達可溶性單鏈抗體蛋白，再用化 學突變法將GPX的催化基團引入到單鏈抗體的底物結合部位。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可溶性 單鏈抗體的表達與純化、催化基團的引入的過程，
所述的人單鏈抗體的篩選，是按照已有技術(見專利96112628.0和 99104234.4)的方法合成系列半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。以合成的 半抗原為靶抗原，通過標準的免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進 行篩選，得到能與GSH及其衍生物結合的人源單鏈抗體B3或D8。
所述的可溶性單鏈抗體的表達與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據篩選的單鏈抗體B3或D8的基因序列設計引物，以含有單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應(PCR)擴增單鏈抗體基因。用 核酸內切酶切純化的單鏈抗體基因和原核表達載體pPELB，通過酶切位點將單 鏈抗體基因組裝到pPELB載體上。將含有單鏈抗體基因的原核表達載體轉化大 腸桿菌感受態細胞，篩選陽性轉化子，用異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘 導表達，單鏈抗體蛋白以可溶性形式分泌到菌體的周質腔里。收集菌體，低溫下 超聲破碎，離心去除菌體沉淀。用GSH親和層析純化單鏈抗體蛋白。透析凍干 后即得單鏈抗體蛋白純品。經電泳檢驗為一條帶，分子量為31000道爾頓。
所述的催化基團的引入，是用己公開的化學突變法(見專利99104234.4)將 GPX的催化基團SeCys引入到單鏈抗體的底物結合部位。即用苯甲基磺酰氟活 化單鏈抗體中的絲氨酸(Ser)殘基上的羥基，再用硒氫化鈉處理，則將Ser突 變成SeCys。由于GSH是GPX的底物,SeCys是GPX的催化基團，因而在該單 鏈抗體上既有GPX的底物結合部位，又有催化基團，結果產生高活力的人源含 硒單鏈抗體酶。
催化基團引入的具體方法可以是0.4-1.5X 10—5mmoI/L單鏈抗體純品溶于無 氧水中，加入2.0-6.0X 10'5mmol/L苯甲基磺酰氟，15-30 。C振蕩l-3h。 通高純 氮氣約20min以排除體系內氧氣。加入0.5-3.0Xl(T4mol/L硒氫化鈉(NaHSe) 溶液，在氮氣保護下30-40 'C反應25-40h。取出，開蓋使其充分氧化。10000g 離心15min，上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得具有GPX活力的人源含硒 單鏈抗體酶，其GPX活力為1005-1321U/U mol，達到天然GPX的數量級水平。
在可溶性單鏈抗體的表達與純化過程中，所述的引物，是5'端引物加入起 始密碼子和NcoI酶切位點，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點；或 抗 體 庫 公 共 引 物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所述的核酸內切酶可以是Ncol和Notl。
所說的篩選陽性轉化子，可以是將轉化后產物涂布在2xTY固體培養基上 (含100tig/mL氨芐青霉素和34pg/mL氯霉素)，37'C培養過夜，挑選在平板上 生長良好的單克隆菌落，通過DNA測序再次確定含有單鏈抗體基因的陽性轉化 子。
所說的誘導表達，可以是將陽性轉化子接種于2ml2xTY液體培養基里(含 100 )ng/mL氨芐青霉素和34 ng/mL氯霉素)，37。C振蕩培養至006()()為0.4-1.0。加入終濃度為0.5-1 mmol/L的IPTG， 30。C下誘導表達4-8 h。
所說的離心去除菌體沉淀，可以是將菌體破碎液在低溫下，S000-12000g離 心15-30min，去除菌體沉淀、獲得上清液。
制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第二種方法分離擴增單鏈抗體基因，組 裝到真核分泌型表達載體上，轉化酵母細胞，表達可溶性單鏈抗體蛋白，再用化 學突變法將GPX的催化基團引入到單鏈抗體的底物結合部位。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可溶性 單鏈抗體的表達與純化，催化基團的引入的過程，
人單鏈抗體的篩選過程與第一種方法相同。
所述的可溶性單鏈抗體的表達與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據篩選的單鏈抗體B3或D8的基因序列設計引物，5'端引物加入起始密碼子 和EcoRI酶切位點，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點；以含有陽 性單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用該引物和PCR擴增單鏈抗體基因， 用EcoRI和Notl酶切單鏈抗體基因和分泌型酵母表達載體PIC9K，通過 EcoRI/Notl酶切位點，將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上；用BglII單酶切，使含 有單鏈抗體基因的表達載體線性化，將含有單鏈抗體基因的載體轉化畢赤酵母感
受態細胞，在甲醇誘導下，在畢赤酵母細胞中表達人源單鏈抗體蛋白；單鏈抗體 蛋白以可溶性形式表達并分泌到培養基里，收集培養上清，濃縮后，用谷胱甘肽 親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品，再進行催化基 團的引入。
可溶性單鏈抗體表達與純化過程的細致步驟可以是在保持氨基酸序列不變 的前提下，根據單鏈抗體的基因序列設計引物。以含有單鏈抗體基因的噬菌體單 鏈DNA為模板，用引物和PCR技術擴增單鏈抗體基因。用瓊脂糖凝膠電泳分離 單鏈抗體基因，用DNA膠回收試劑盒純化單鏈抗體基因。用EcoRI和Notl酶切 純化的單鏈抗體基因和分泌型酵母表達載體PIC9K，通過EcoRI/Notl酶切位點， 將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上。用BglII單酶切使含有單鏈抗體基因的表達載 體PIC9K線性化，轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，轉化后的酵母細胞涂培養 平板，于3(TC培養箱倒置培養2-3天。從培養平板上挑取單克隆，通過DNA測 序確定含有單鏈抗體基因的陽性轉化子。將陽性轉化子接種于BMGY培養基中，30。C震蕩培養，至OD600達2-6，室溫離心(3000rpm) 5min，棄上清，用等體 積的BMMY培養基重懸細胞沉淀，3(TC震蕩培養，用甲醇誘導表達。在誘導過 程中，每24h補充一次甲醇至終濃度0.5M，同時補充滅菌超純水，使培養液總 體積保持不變。連續誘導培養7天，每24h取lml培養液，離心菌體，上清用于 SDS-PAGE蛋白分析，篩選陽性克隆的高表達菌株。取高表達菌株，擴大培養后 用適量甲醇誘導培養3天，單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達并分泌到培養基里， 收集培養上清，經10k分子量超濾膜濃縮20倍，用GSH親和層析純化單鏈抗體 蛋白(用pH7.5， 50mmol/LTris-Cl平衡，用含10mmol/LGSH的該緩沖液洗脫 目的蛋白)。透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品。經電泳檢驗為一條帶，分子量 為31000道爾頓。
催化基團的引入的過程與第一種方法相同。
制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第三種方法是通過基因突變法而不是化 學突變法引入催化基團。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，基因突 變法引入催化基團，抗體酶的表達與純化的過程。
人單鏈抗體的篩選過程與第一種方法相同。
所述的基因突變法引入催化基團，是在保持氨基酸序列不變的前提下，根據 單鏈抗體的基因序列設計引物，以含有單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板， 用引物和PCR擴增單鏈抗體基因，用核酸內切酶切純化的單鏈抗體基因和原核 表達載體pPELB，通過酶切位點將單鏈抗體基因組裝到pPELB載體上。在保持 其它氨基酸序列不變的前提下，設計將Ser突變為半胱氨酸(Cys)的定點突變 引物，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司產品，按試劑盒 說明書操作)，將構建在原核表達載體上的單鏈抗體基因中的0-32個絲氨酸的編 碼序列突變成Cys的密碼子(TGC) (O個是指無Ser突變的情況下也具有GPX 的活性)。通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，結果通 過基因突變在單鏈抗體的底物結合部位引入了催化基團。
所述的抗體酶的表達與純化，是將含有突變的單鏈抗體基因的載體轉化營養 缺陷型菌株-BL21(DE3)CysE的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽 性轉化子。將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys和必需的生長因子和營養素的培養基里，經IPTG誘導，營養缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE能用Cys的密碼子 合成SeCys，最后直接表達出在GSH的底物結合部位含有SeCys的人源含硒單 鏈抗體酶，單鏈抗體酶以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里。收集菌體， 低溫下超聲破碎，離心去除菌體沉淀。用GSH親和層析純化單鏈抗體酶。透析 凍干后即得單鏈抗體酶純品。經電泳檢驗為一條帶，分子量為31000道爾頓。由 于GSH是GPX的底物，SeCys是GPX的催化基團，因而產生高活力的人源含硒 單鏈抗體酶。
在基因突變法引入催化基團過程中，所述的引物，可以是5'端引物加入起 始密碼子和NcoI酶切位點，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點；或 者是抗體庫公共引物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所說的核酸內切酶可以是Ncol和Notl。
在基因突變法引入催化基團過程中，所述的定點突變引物，可以是根據要突 變為Cys的Ser的位置和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定 點突變引物，弓l物長35-50bp，以Cys的密碼子(TGC)為中心。
所說的離心去除菌體沉淀可以是將菌體破碎液在低溫下，8000 -12000g離心 15-30min，去除菌體沉淀，獲得上清液。
本發明還有第四種方法將單鏈抗體互補抗原決定區(CDR)的任何氨基酸 用基因突變或合成法進行鏈重組或替換為其它氨基酸，其它不變，也可用上述三 種方法制備單鏈抗體酶，使酶的活力提高。
本發明具有以下特點
(1) 本發明使用簡單的抗體庫篩選、基因工程和化學突變技術，制備方法簡
單；
(2) 本發明方法制備的人源含硒單鏈抗體酶活力高，已達到天然GPX活力的 數量級水平，細胞生物學實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細胞有防護作用；
(3) 本發明方法制備的人源含硒單鏈抗體酶，可以用于人體，不會引起免疫 反應，在生物制藥方面有廣闊的應用前景；
(4) 本發明使用的分泌型表達載體，能將單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達并 分泌到大腸桿菌的周質腔或酵母的體外，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體 自動切除，所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構象和活性，不需復性，可避免包涵體復性過程造成的產率下降和失活，因而生產周期短。
這些優點均有利于大規模生產，為今后的實際應用打下了堅實的基礎，解決
天然GPX來源不足的問題。
具體實施例方式
實施例1:
用已有的技術(見專利99104234.4的實施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50yg的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位點用BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標準的免疫親和 篩選法對噬菌體展示人單鏈抗體庫進行5輪篩選，最后再用ELISA法進一步篩 選陽性克隆，得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌體DNA作為模板，采用抗 體庫公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR擴增單鏈抗體B3基因。將PCR產物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，應用DNA膠回收試劑盒純化擴增的單鏈抗體B3 基因。
將純化后的B3基因用限制性內切酶Nco I和Not I雙酶切后，連接到同樣酶 切的載體pPELB載體上，將連接產物(pPELB-B3)轉化大腸桿菌Rosetta (或 BL21)。將轉化后產物涂布在2 x TY固體培養基上(含IOO ng/mL氨節青霉素 和34 pg/mL氯霉素)，37 'C培養過夜，挑選在平板上生長良好的單克隆菌落， 在2ml 2 x TY液體培養基上小量培養后，通過DNA測序確定含有單鏈抗體基因 的陽性轉化子。將陽性轉化子接種于2ml 2 x TY液體培養基里(含100 ng/mL 氨芐青霉素和34 pg/mL氯霉素)，37'C振蕩培養至006()()為0.6。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG， 3(TC下誘導表達4h。單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達并分泌 到菌體的周質腔里，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)篩選大量表達單 鏈抗體蛋白的高表達菌株。將高表達菌株接種到1 L 2 x TY培養基中(含100 pg/mL氨芐青霉素，34pg/mL氯霉素)，37。C振蕩培養至OD600為0.6.加入終濃 度為1 mmol/L的IPTG (異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)，30 'C下誘導表達4 h。 6000rpm離心10min，收集菌體并重懸在溶液中(300 mmol/L NaCl， 20 mmol/LTris， pH 7.4， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰浴下超聲破碎。將液體在4 °C， 8000
g離心15min，獲得上清液。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50 mmol/L
Tris， pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用
10 mmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人源單鏈抗體。經
電泳檢驗為一條帶，分子量為31KD。
1.2X 10—5mmol/L單鏈抗體純品溶于無氧水中，加入5.0X 10—5mmol/L苯甲基
磺酰氟，室溫振蕩3 h。通高純氮氣約20min以排除體系內氧氣。加入2.0X
104inol/L硒氫化鈉(NaHSe)溶液，在氮氣保護下37 。C反應40 h。
取出，開
蓋使其充分氧化，10000 g離心15min。上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得
人源含硒單鏈抗體酶，其GPX活力為1321u/!i mol，達到天然GPX的數量級水平。
實施例2:
按照專利99104234.4的方法合成半抗原-谷胱甘肽二丁酯，取50 u g的谷胱 甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上，剩余位點用 BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標準的免疫親和篩選法對噬 菌體展示人單鏈抗體庫進行5輪篩選，最后再用ELISA法進一步篩選陽性克隆， 得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因和氨基酸序列。
在保持氨基酸序列不變的前提下，根據單鏈抗體B3的基因序列設計引物(5 '-CGGAATTCATGGCCCGGGT-3'和5' -GTGCGGCCGCACCTAGGA-3' )，5 '端引物加入了起始密碼子(ATG)和EcoRI酶切位點，3'端引物在終止密碼 子下游加入了NotI酶切位點。提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌 體DNA作為模板，采用上述引物做PCR擴增單鏈抗體基因。將PCR產物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，應用DNA膠回收試劑盒純化擴增的單鏈抗體基 因。
將純化后的單鏈抗體基因用限制性內切酶EcoRI和Not I雙酶切后，連接到 同樣酶切的分泌型酵母表達載體PIC9K上。用BglII單酶切使含有單鏈抗體基因 的表達載體(PIC9K-B3)線性化，轉化畢赤酵母GS115感受態細胞。轉化后的酵 母細胞涂MD和MM培養平板，于3(TC培養箱倒置培養2 3天。能在MD和 MM上都生長的是甲醇利用快速型只能在MD上生長的是甲醇利用緩慢型。從MD和MM培養板上各挑取10個克隆，在2mlBMGY培養基中小量培養 后,進行DNA測序確定含有單鏈抗體基因的陽性轉化子。將陽性轉化子分別接種 于10ml BMGY培養基中，3(TC震蕩培養(225 rpm) 24h，至OD600達2-6，室 溫離心(3000 rpm) 5min，棄上清，用等體積(10ml)的BMMY培養基重懸細 胞沉淀，30'C震蕩培養，誘導表達。在誘導過程中，每24h補充一次甲醇至終濃 度0.5%，同時補充滅菌超純水，使培養液總體積保持不變。連續誘導培養7天， 每24h取lml培養液，離心菌體，上清用于SDS-PAGE蛋白分析，篩選高表達 菌株。取高表達菌株，在含1L培養液的5L搖瓶中誘導培養3天，收集培養液 上清，經10k分子量超濾膜濃縮20倍后。用GSH親和層析柱純化單鏈抗體(用 pH7.5，50 mmol/LTris-Cl平衡，用含10 mmol/L GSH的該緩沖液洗脫目的蛋白)。 收集有單鏈抗體的洗脫液，透析除鹽，凍干即得人源單鏈抗體。經電泳檢驗為一 條帶，分子量為31KD。
0.4X l(T5mmol/L單鏈抗體純品溶于無氧水中，加入2.0X 10'5mmol/L苯甲基 磺酰氟，30'C振蕩1.5h。通高純氮氣約20min以排除體系內氧氣。加入0.5X 10^mol/L硒氫化鈉(NaHSe)溶液，在氮氣保護下40'C反應25 h.取出，開蓋 使其充分氧化。10000 g離心15min.上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得人 源含硒單鏈抗體酶Sec -B3，其GPX活力為1235U/U mol，達到天然GPX的數 量級水平。
實施例3:
用已有的技術(見專利99104234.4的實施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50ug的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位點用BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標準的免疫親和 篩選法對噬菌體展示人單鏈抗體庫進行5輪篩選，最后再用ELISA法進一步篩 選陽性克隆，得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌體DNA作為模板，采用抗 體庫公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR擴增單鏈抗體B3基因。將PCR產物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進行電泳。應用DNA膠回收試劑盒純化擴增的單鏈抗體B3基因。將純化后的B3基因用限制性內切酶NcoI和Notl雙酶切后，連接到同樣 酶切的載體pPELB載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據63號絲 氨酸比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長 35-50bp，以Cys的密碼子(TGC)為中心。用這兩條完全互補的引物和快速定 點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構建在原核表達載 體pPelB上的單鏈抗體基因第63號絲氨酸的編碼序列(TCA)突變成Cys的密 碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生。
用裝有突變的單鏈抗體基因的載體(pPelB-B3)轉化營養缺陷型大腸桿菌 BL21 (DE3) CysE，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子。將陽性轉 化子接種于1.2LM9表達培養基(在M9培養基中加入100yg/ml氨芐青霉素、 50 n g/ml卡那霉素、50 u g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 n g/ml) 中至OD600為0. 1 ，培養至0D600約為0. 3-1,加入終濃度0. 1-lmM的IPTG， 10min 后加入終濃度10ng/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養液離心，低溫 6000rpra離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1. 2L，然后用生產培 養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400u g/ml)重懸， 并向培養基中補充終濃度400 ng的利福平和600 uM DL — SeCys。繼續培養 2-12h，使單鏈抗體酶以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm， 10min)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, pH7. 5，含lmM EDTA)洗滌 兩次。用BufferT重懸菌體沉淀，加入終濃度lmM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超 聲破碎菌體，4°C， 12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱， 應用緩沖液(50 mmol/L Tris， pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用 平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10 mmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍 干，即得人源單鏈抗體酶。經電泳檢驗為一條帶，分子量為31KD。其GPX活力 為1289U/u mol，達到天然GPX的數量級水平。
實施例4:
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進行篩選，篩選方法與實施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8。抗體的表達、純化和催化基團的引入也與實施例1完全相同。 得人源含硒單鏈抗體酶Sec-D8，其GPX活力為1005U/n mol，達到天然GPX的數 量級水平。實施例5
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進行篩選，篩選方法與實施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8。抗體的表達、純化和催化基團的引入與實施例2完全相同，只 是基因擴增引物的設計要根據D8的基因序列決定。得人源含硒單鏈抗體酶 Sec-D8，其GPX活力為1098U/umol，達到天然GPX的數量級水平。
實施例6
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進行篩選，篩選方法與實施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8。抗體的表達、純化和催化基團的引入與實施例3完全相同，只 是基因突變引物的設計要根據D8要突變的具體Ser的位置和它比鄰的基因序列 決定。得到人源含硒單鏈抗體酶Sec-D8，其GPX活力為1065U/ymo1，達到天然 GPX的數量級水平。
權利要求
1. 一種用于制備人源含硒單鏈抗體酶的人源單鏈抗體，其特征是，由15個氨基酸組成的短肽連接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區；人源單鏈抗體B3和人源單鏈抗體D8的氨基酸序列分別是，B3的氨基酸序列MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWM50GWINAGNGNTKYS63QKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245；D8的氨基酸序列MARVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTLTYRYLHWVRQAPGQALEWM50GWITPFNGNANYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVFGGGTKLTVLG244。
2、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可 溶性單鏈抗體的表達與純化，催化基團的引入的過程，其特征是，所述的人單鏈抗體的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯為 靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進行篩選，得到能 與谷胱甘肽及其衍生物結合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的可溶性單鏈抗體的表達與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設計引物；以含有單鏈抗體基因 的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應擴增單鏈抗體基因；用核酸 內切酶切單鏈抗體基因和分泌型原核表達載體pPELB，通過酶切位點將單鏈抗 體基因組裝到pPELB載體上；將含有單鏈抗體基因的原核表達載體轉化大腸桿 菌感受態細胞，篩選陽性轉化子；用異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導表達后，單 鏈抗體蛋白以可溶性形式分泌到菌體的周質腔里；收集菌體，低溫下超聲破碎， 離心去除菌體沉淀；用谷胱甘肽親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單 鏈抗體蛋白純品；再進行催化基團的引入。
3、 按照權利要求2所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密碼子和Ncol酶切位點，3'端引物在 終止密碼子下游加入Notl酶切位點；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸內切酶是Ncol和Notl。
4、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可 溶性單鏈抗體的表達與純化，催化基團的引入的過程，其特征是，所述的人單鏈抗體的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯為 靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進行篩選,得到能 與谷胱甘肽及其衍生物結合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的可溶性單鏈抗體的表達與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設計引物，5'端引物加入起始密 碼子和EcoRI酶切位點，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點；以含 有陽性單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應擴增單 鏈抗體基因，用EcoRI和Notl酶切單鏈抗體基因和分泌型酵母表達載體PIC9K， 通過EcoRI/Notl酶切位點，將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上；用BglII單酶切， 使含有單鏈抗體基因的表達載體線性化，將含有單鏈抗體基因的載體轉化畢赤酵 母感受態細胞，在甲醇誘導下，在畢赤酵母細胞中表達人源單鏈抗體蛋白，單鏈 抗體蛋白以可溶性形式表達并分泌到培養基里，收集培養上清，濃縮后，用谷胱 甘肽親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品；再進行催 化基團的引入。
5、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，基 因突變法引入催化基團，抗體酶的表達與純化的過程，所述的人單鏈抗體基因的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二 酯為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進行篩選，得 到能與谷胱甘肽及其衍生物結合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的通過基因突變引入催化基團，是在保持氨基酸序列不變的前提下，根 據篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設計引物；以含有單鏈抗體基因的 噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應擴增單鏈抗體基因，用核酸內 切酶切單鏈抗體基因和分泌型原核表達載體pPELB,通過酶切位點將單鏈抗體基因組裝到pPELB載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，設計將Ser 突變為Cys的定點突變引物，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒將構建在原 核表達載體上的單鏈抗體基因中的0-32個絲氨酸的編碼序列突變成Cys的密碼 子，通過DNA測序確定突變成功，結果通過基因突變在單鏈抗體的底物結合部 位引入了催化基團；所述的抗體酶的表達與純化，是將含有突變的單鏈抗體基因的載體轉化營養 缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽 性轉化子，將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys和必需的生長因子和營養素的 培養基里，經異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導，營養缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE 能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在谷胱甘肽的底物結合部位含有 SeCys的人源含硒單鏈抗體酶，單鏈抗體酶以可溶性形式表達并分泌到菌體的周 質腔里；收集菌體，低溫下超聲破碎，離心去除菌體沉淀，用谷胱甘肽親和層析 純化單鏈抗體酶，透析凍干后即得單鏈抗體酶純品。
6、 按照權利要求5所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密碼子和Ncol酶切位點，3'端引物在 終止密碼子下游加入Notl酶切位點；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸內切酶是Ncol和Notl。
7、 按照權利要求5或6所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其 特征是，所述的定點突變引物，是根據要突變為Cys的Ser的位置和它比鄰的氨 基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長35-50bp，以Cys 的密碼子為中心。
全文摘要
本發明的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法屬于生物技術領域。以谷胱甘肽衍生物為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進行篩選，得到單鏈抗體B3和D8。將單鏈抗體基因組裝到分泌型原核或真核表達載體上，轉化大腸桿菌或酵母細胞，在原核或真核中表達并純化單鏈抗體蛋白；用化學突變法在抗體的底物結合部位引入GPX的催化基團SeCys。或用基因突變技術和營養缺陷型大腸桿菌直接表達在底物結合部位含有GPX催化基團的可溶性單鏈抗體蛋白，賦予抗體以GPX的催化活性。本發明的制備方法簡單；制備的人源含硒單鏈抗體酶活力高；所表達的蛋白為可溶性；有利于大規模生產，在生物制藥方面有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/81GK101280015SQ20081005055
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月1日 優先權日2008年4月1日
發明者劉慧娟, 徐俊杰, 唯 李, 李杰帥, 羅貴民, 羅際巡, 閻崗林, 銳 霍, 魏景艷 申請人:吉林大學