專利名稱：抗人胃癌單鏈抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程抗體，具體地說涉及一種抗人胃癌單鏈抗體及其應用。
胃癌是當今嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，多年來人們一直在尋找診斷和治療胃癌的各種途徑。隨著腫瘤免疫學和分子生物學技術的不斷發展。已有許多抗胃癌單克隆抗體及其單抗免疫偶聯物應用于胃癌的顯像、尋向治療等研究方面的報道。但是，由于鼠源性單克隆抗體具有較強的免疫原性，給其臨床應用帶來困難。基因工程抗體的問世，特別是被譽為抗體技術革命性進展的噬菌體抗體庫技術的出現，為克服單克隆抗體的缺陷提供了新途徑。目前，抗胃癌基因工程抗體的研究還處于初始階段，因此，獲得多種抗胃癌抗體可變區基因及其抗體分子片段，對于抗胃癌基因工程抗體的研制和應用具有重要意義。
噬菌體抗體庫技術無需經過雜交瘤技術，甚至無需經過免疫過程即可直接獲得特異性的各種抗體基因及其抗體分子片段。單鏈抗體具有分子量小，能在保持其與抗體親和活性的同時，降低免疫原性，對腫瘤有很強的穿透力等優勢，是具有很好應用前景的一種基因工程抗體。因此，利用噬菌體抗體庫技術，進一步研制更多、更好的抗胃癌基因工程抗體，無疑在胃癌的診斷和治療中有重要價值。
本發明的目的在于利用噬菌體抗體庫技術提供一種抗人胃癌單鏈抗體。
本發明的另一個目的是上述抗人胃癌單鏈抗體的應用。
本發明的抗人胃癌單鏈抗體是一種采用噬菌體抗體庫技術，直接從胃癌細胞抗原免疫的小鼠脾細胞出發，構建的抗人胃癌全套單鏈抗體基因噬菌體抗體庫中篩選出的具有抗胃癌活性的單鏈抗體，并可在大腸桿菌中進行可溶性表達。
本發明的抗人胃癌單鏈抗體，它由720個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTGAAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGGGTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGCAAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTTGAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GACTCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTGGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATGGCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TACAAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATTTAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGGTCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT GAA GAT GTT GCCACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACAAAG TTG GAA ATA AAA CCG本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中重鏈可變區基因VHCI由354個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTGAAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGGGTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGCAAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTTGAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC
TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中輕鏈可變區基因VLCI由321個核苷酸組成，其核苷酸序列如下GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATG GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACTATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TAC AAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGGACC TCT CCT AAA CCC TGG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCTCGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACT TCT TAC TCT GTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCTGAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCGGGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA CCG本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中VHCI編碼118個氨基酸，氨基酸序列如下Q V Q L Q Q S R A E L V K P G A S V K L S C K AS G Y T F T S Y W M H W V K Q R P G Q G L E W IG E I N P S N G R T N Y N E N F K S K A T L T VD K S S S S A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y CA R Y E D Y D L H D Y W G Q G T S V T V S S本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中VLCI編碼107個氨基酸，氨基酸序列如下D I K L T Q S P T A M A A S P G E K I T I T C SA S Q T Y N L V M W Y Q Q K S G T S P K P W I YR T S N L A S G V P A R F S G S G S G T S Y S LT I G T M E A E D V A T Y Y C Q Q S S T L P F TF G S G T K L E I K P本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中VHCI基因與鼠免疫球蛋白重鏈可變區基因MM 2F 2A同源性最高，分數為1464；且為單一開放讀框，它系重排后的功能性鼠抗體可變區基因。
本發明的抗人胃癌單鏈抗體，其中VLCI基因與鼠免疫球蛋白輕鏈可變區基因S61341同源性最高，分數為1074，且為單一開放讀框，它系重排后的功能性鼠抗體可變區基因。本發明的抗人胃癌單鏈抗體，利用其與抗原保持親和活性的同時，降低免疫原性，對腫瘤具有的強大穿透力優勢，在診斷和治療胃癌上的應用，以及在此基礎上篩選高親和力、高表達的抗胃癌單鏈抗體，為構建其他類型的基因工程抗體及臨床應用奠定基礎。
本發明的抗人胃癌單鏈抗體其應用的積極效果在于利用噬菌體抗體庫技術，繞過雜交瘤技術，構建了抗人胃癌全套ScFv基因的噬菌體抗體庫，從中獲得了一個新的VH基因和一個新的VL基因。經基因序列同源分析，表明VHCI基因與鼠免疫球蛋白重鏈可變區基因MM 2F 2A同源性最高，分數為1464；VLCI基因與鼠免疫球蛋白輕鏈可變區基因S61341同源性最高，分數為1074。經氨基酸序列推導分析，表明二者均為單一開放讀框。它們均系重排后的功能性鼠抗體中可變區基因。除此之外還建立了ScFvCⅠ的表達載體，在大腸桿菌中表達出噬菌體表面呈現和可溶性ScFv兩類抗體分子片段。經免疫印跡證實，IPTG誘導后可表達一分子量約30KDa的可溶性蛋白。經ELISA和間接免疫熒光染色流式細胞儀分析表明表達出的ScFvCⅠ片段與胃癌細胞系SGC-7901有良好的親和活性，而與正常胃粘膜細胞系無親和活性。為今后在此基礎上篩選高親和力、高表達的抗胃癌ScFv，構建其他類型的基因工程抗體積累了資料。對胃癌臨床診斷和治療的研究及應用具有重要意義。
下面對本發明抗人胃癌單鏈抗體的實施例進行詳細說明。
實施例(一)胃癌細胞膜抗原粗提物的制備取新鮮胃癌手術切除標本，病理診斷為低分化胃癌。用高濃度裂化鉀的方法，提取細胞膜抗原，制備膜抗原粗提物。用4℃滅菌生理鹽水洗凈血跡，冰浴下仔細剪切并研磨，邊研磨邊加入3MKCL溶液，研磨至勻漿，過篩網，置4℃過夜，不時用玻棒攪動，次晨4℃10000rpm離心20min，吸取上清液，加等體積飽和硫酸銨沉淀，4℃10000rpm離心20min。將沉淀用10mMPBS完全溶解后，對10mMPBS透析，透析畢，真空冷凍干燥，-20℃保存備用。
(二)免疫動物初次免疫以胃癌膜抗原(22μg／只)，加福氏完全佐劑行皮下多點注射第4周行第二次免疫，同樣劑量抗原(22μg／只)加福氏不完全佐劑行皮下多點注射；第6周行第3次免疫，以同樣劑量抗原(22μg／只)腹腔注射，第7周，取鼠尾血清，ELISA法檢測抗體濃度，測得滴度為1∶10，行第4次免疫，以同樣抗原(44μg／只)腹腔注射，第8周行加強免疫，以同樣抗原(22μg／只)腹腔注射，連續免疫3天。
(三)總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成待免疫結束后，取小鼠脾臟，采用異硫氰酸胍一步法，提取總RNA，經分光光度計定量后備用。取10μg總RNA，按反轉錄系統使用說明書加入各成分，42℃水浴1h。反應產物-20℃保存備用。
(四)全套VH、VL基因的擴增將反轉錄產物分為兩份，分別加入輕、重鏈可變區引物各2ul，10×緩沖液5ul，四種dNTP至終濃度2．5mmol／L，用去離子水補至50ul，95℃變性5min后，加入TaqDNA聚合酶5U，進入PCR循環，反應條件為94℃1min，55℃2min，72℃2min，30個循環。最后72℃保溫10min。取PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳，用PEAE-纖維素膜電泳回收法純化、回收。
(五)VH、VL的隨機拼接將近等摩爾濃度的VH、VL、Linker-Priner Mix混合，加dNTP至終濃度2．5mmol／L、TaqDNA聚合酶5U，去離子水補至25ul。進行隨機拼接反應，反應條件94℃1min，63℃4min，7次循環。
(六)全套ScFv基因的擴增上述7次循環結束后，再加入RS Primer Mix，進行PCR反應。反應條件94℃1min，55℃2min，72℃2min，30個循環后，72℃保溫10min。PCR產物用DEAE-纖維素膜電泳純化、回收。
(七)全套ScFv基因的克隆1、氯化鈣法制備感受態細胞取低營養瓊脂平皿上生長的TG1單菌落，接種于2ml不含Amp的LB培養液中，37℃振蕩培養過夜，次日1∶100轉種于100mlLB培養液中，37℃繼續培養2-4hr，生長至對數期。冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，棄上清。菌體重懸于1／2原體積的冰冷氯化鈣溶液(75mM CaCl；10mM Tris Cl pH8．0)，冰浴15min。4℃，4000rpm離心5min，棄上清。菌體重懸于1／15原體積的冰冷氯化鈣溶液中，4℃放置12-24hr后應用。
2、SfiⅠ、NotⅠ雙酶切反應及與載體PCANTAB5E的連接取純化的全套ScFv 20ul，先后加SfiⅠ，NotⅠ酶切，然后，與同種酶切開的pCANTAB5E載體在ATP的作用下用T4DNA連接酶進行連接，16℃保溫6小時。
3、宿主菌的轉化取上述制備的感受態細胞200μl，冰浴下加入連接產物5μl，輕混勻后冰浴30min，42℃熱休克90s，迅速置冰浴中1-2min。加入不含氨芐青霉素的LB培養液800μl，37℃保溫復蘇45min。取適量轉化菌液涂布于SOBAG(含100μg／ml Amp和2％葡萄糖的SOB培養基)營養瓊脂板上。待水份吸收后，倒置平皿于37℃溫箱中培養過夜。
(八)重組克隆的酶切鑒定在SOBAG培養板上隨機挑選6個轉化菌落，小量制備噬菌粒DNA，以EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切，酶切產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳。
(九)構建全套ScFv基因噬菌體表面呈現文庫從SOBAG瓊脂板上收集全部轉化菌，用2×YTAG(含100μg／ml Amp和2％葡萄糖)稀釋細菌懸液至OD600=0．2，取其中15ml培養至對數生長期，加入3×10pfu M13K07輔助噬菌體，37℃振蕩培養1h，離心后，用10ml 2×YTAK(含100μg Amp和50μl／ml Kan)懸浮沉淀，37℃振蕩培養過夜，離心后的上清即為全套ScFv噬菌體表面呈現文庫。上清4℃保存，并測定重組噬菌體滴度。取1μl上清，進行103倍系列稀釋，再將稀釋后上清，取400μl，加對數生長期TGI 200μl，搖30min，取100μl涂布于SOBAG板，計算cfu。
(十)Panning篩選用胃癌細胞膜抗原包被塑料培養皿后，將重組噬菌體上清傾至其上，37℃培養2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后將培養至對數生長期的TG1傾至免疫吸附后的培養皿上，37℃培養1小時。如此“吸附-洗脫-繁殖”的過程即為Panning篩選，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌體表面呈現文庫。以后按上述方法進行第2輪篩選。
(十一)單個重組噬菌體克隆的抗原結合活性的鑒定1．制備單克隆重組噬菌體Panning篩選后，將TG1菌液按原液、1∶10、1∶100、1∶10004個稀釋度稀釋，鋪于SOBAG瓊脂板上，30℃倒置培養過夜。挑選94個單菌落，分別接種于100μl的2×YTAG中，30℃培養過夜，取20μl培養物，加入200μl含5×10pfu／ml M13K07的2×YTAG中，37℃振蕩培養2h，離心，用2×YTAK 200μl重懸沉淀，30℃培養過夜，離心后的上清即為單個重組噬菌體。
2．ELISA檢測抗原結合活性設1個陰性對照孔，1個陽性對照孔，94個待測孔。100μ10．5％BSA包被陰性對照孔，100μl羊抗M13噬菌體抗體包被陽性對照孔，100μl／孔(10μg／ml)胃癌細胞膜抗原包被待測孔。1％BSA37℃封閉1小時。對照孔加M13噬菌體，待測孔加50μl待測上清與50μl封閉液的混合物，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，各孔加100μl工作濃度的HRP／羊抗M13噬菌體抗體，37℃反應1h。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在410nm測每孔OD值。
(十二)ScFv基因序列的測定1、雙鏈DNA模板的制備從4℃貯存的陽性克隆菌種取100μl接種于25μl含氨芐青霉素(100μg／ml)的SOC培養液中，30℃振蕩培養過夜，堿裂解法大量制備噬菌粒DNA，經FPLC Hi Trap Q柱純化，紫外分光光度計定量。
2、灌制聚丙烯酰胺凝膠將丙烯酰胺和N、N’-亞甲叉雙丙烯酰胺按19∶1配制成40％的儲存液；變性工作膠濃度為6％，內含尿素46g／100ml。
3、測序引物5’端放射性標記反應反應液成份10 X T4 Kinase Buffer 1．0μlT4多核苷酸激酶 5．0μlr-32p-ATP 10．0pmol測序引物 10．0pmol無菌雙蒸水至終體積 10．0μl標記過程先37℃30分鐘，然后于90℃2分鐘滅活殘留的多核苷酸激酶，-20℃備用。
4、測序反應(1)每套的反應各準備G、A、T、C4個管，分別加入相應d／ddNTP混合液2μl。
(2)針對每套反應準備1個管，加入下列試劑5X測序緩沖液5．0μl
標記引物1．5μl測序模板2-3μl無菌雙蒸水至16．0μl測序級Taq酶 5．0μl(3)將第(2)步的反應液混勻，分別取4．0μl加至第(1)步中的G、A、T、C4個管中，再各加石蠟油25μl。
(4)延伸／終止反應于熱循環儀中進行，循環參數為96℃預變性2分鐘，然后按95℃45秒、50℃45秒、70℃90秒，共30個循環。
(5)每管加測序終止液3．0μl，-20℃儲存，準備上樣前取出。
5、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)預電泳1800V，30-60分鐘(2)先將樣品90℃變性2分鐘，立即置冰中(3)按G、A、T、C順序，每個加樣孔中上樣2．5-3．0μl(4)電泳條件第1次上樣，電泳1800V 2-3小時。
然后進行第2次上樣，電泳1800V 6-10小時。
6、干膠與壓片用濾紙小心將凝膠揭下，于干膠儀內80℃真空干燥40分鐘，-20℃壓片12小時至7天不等。
7、將測序模板純化好后，同時在DNA序列分析儀上進行序列測定。
(十三)ScFv基因的表達1．ScFv的噬菌體表面呈現表達將pC1噬菌粒DNA轉化TG1感受態細胞，小量制備噬菌粒DNA，以EcoRl-HindⅢ酶切鑒定，篩選出重組噬菌粒克隆，再按上述制備單個重組噬菌粒克隆的方法制備。
2．可溶性ScFv C1在大腸桿菌中的誘導表達將pC1噬菌粒DNA轉化HB2151感受態細胞，小量制備噬菌粒DNA，篩選出含有ScFv插段的重組噬菌粒克隆。取5ml過夜培養物，接種于50ml SBAG(含100μg／ml Amp和2％葡萄糖的SB培養液)中，30℃培養1小時，離心，用50ml SBAI(含100μg／ml Amp和1mmol／LIPTG的SB培養液)重懸沉淀，37℃誘導3小時，離心，收集細菌培養上清，并收集菌體，接灌膠方法制備細菌外周質，將上清和外周質4℃下對10mMPBS透析12h，真空冷凍干燥，-20℃貯存。
(十四)可溶性ScFv C1的鑒定1．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制6％濃縮膠和12％分離膠，常規處理各樣品，上樣后進行恒壓電脈，120V電泳使樣品進入分離膠后，調至160V繼續在分離膠中電泳，電泳結束后，考馬斯亮藍R-250染色，或Western Blot檢測。
2．Western BlotSDS-PAGE結束后，將蛋白質從凝膠轉移至硝酸纖維素膜上。濾膜在TBS緩沖液中漂洗15min，然后用1％脫脂奶封閉30min，TBST洗滌2次，每次洗滌5min，然后將NC膜置于含鼠抗E-tag抗體的平皿中，室溫作用30min，TBST洗膜3次后(每次10min)，將膜置于含堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG的平皿中，室溫反應30min，洗膜后(同前)放入10ml顯色液中(10ml顯色緩沖液加66ul NBT和33ul BCIP)避光反應，待膜充分顯色后立即將膜置入三蒸水中終止反應。
(十五)ScFv C1生物學活性的鑒定間接免疫熒光染色和流式細胞儀分析1．細胞培養將正常胃粘膜細胞系、SGC-7901、SMMC-7721培養至對數生長期。用10％FCS RPMI 1640調整細胞濃度為1×107／ml。取40ul細胞懸液分別加入預先有特異性McAB的離心管，再加50ul 1∶20稀釋的正常滅活兔血清，4℃反應30min，用洗滌液洗2次，1000rpm離心5min，棄上清，加入2ul鼠抗E-tag抗體4℃反應30min，用洗滌液洗2次，1000rpm離心5min，棄上清，加入50ul工作濃度的羊抗鼠IgG熒光抗體，充分振搖，4℃反應30min，用洗滌液洗2次，加適量固定液用流式細胞儀進行分析。
2、ScFv的活性測定采用間接免疫熒光染色，并用流式細胞儀進行分析。采用三種細胞系正常胃粘膜細胞系，胃癌細胞系SGC-7901，肝細胞癌SMMC-7721。每個細胞系內均設陰性抗體對照組(抗出血熱IgGMcAb)，ScFvC1組以及未誘導組三組，另外，胃癌細胞系還設陽性對照組(抗胃癌McAb)，見表1。
表1 ScFv的活性測定 下面結合附圖進行相關的說明。


圖1是本發明全套VH、VL基因的PCR擴增圖。
圖2是本發明全套ScFv基因的PCR擴增圖。
圖3是本發明ScFv-CI表達產物考馬斯亮蘭染色結果圖。
圖4是本發明ScFv-CI表達產物Western 6lot的結果圖。
一、抗人胃癌細胞膜抗原全套ScFv基因噬菌體表面呈現文庫的構建與篩選(一)抗人胃癌細胞膜抗原全套VH、VL基因的擴增及鑒定用Heavy primer 1．2和ligh primer Mix分別擴增抗人胃癌細胞全套VH、VL基因，擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳分析，分別見一條PCR擴增帶，VH片段約為350左右，VL片段約為340左右，與預期大小相符，見圖1。圖1是本發明全套VH、VL基因的PCR擴增圖，其中HVH PCR產物；MpGEM-7zf／HaeⅢ；LVL PCR產物。
(二)全套ScFv基因的隨機拼接和擴增經過重疊延伸反應，將VH，VL隨機拼接為ScFv，再將此ScFv擴增，擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳分析，見一條PCR擴增帶，大小約為720bp，與預期結果相符，見圖2。圖2是本發明全套ScFv基因的PCR擴增圖，其中MpEGM-7zf／HaeⅢ；ScFvScFv基因擴增產物。
(三)全套ScFv基因的克隆和重組克隆的酶切鑒定隨機挑選6個菌落小量制備噬菌粒DNA，以EcoRⅠ，HindⅢ酶切鑒定，含有外源插段者應切出約2．0kb的片段。6個克隆均切出2．0Kb片段。與預期結果一致。
(四)ScFv重組噬菌體的表達和Panning篩選富集噬菌粒文庫經M13K07輔助噬菌體超感染后，產生重組噬菌體顆粒釋放于細菌培養上清中，經測定ScFv噬菌體表面呈現文庫的滴度為3．2×1012cfu。對兩輪Panning后的菌液進行適度稀釋，鋪于SOBAG瓊脂板上，經培養后，1∶1000，1∶100、1∶10和原液等四個稀釋度的平皿上分別長出11、205、302和1000以上菌落，分隔良好的菌落用于下一步單個克隆重組噬菌體的ELISA鑒定。
(五)單個重組噬菌體克隆的抗原結合活性鑒定ABTS顯色后，94個克隆中，共有18個克隆呈現陽性反應，其OD值見表2，陽性克隆檢出率約為19％。
表2 胃癌細胞膜抗原結合反應陽性噬菌體克隆ELISA顯色的光吸收值 二、ScFv基因的序列測定和分析(一)ScFv-C1基因序列測定分別用fmol DNA Sequencing system和全自動熒光測序儀對ScFv-C1進行核苷酸序列測定，結果表明，基因全長720bp，VH基因長度為354bp，VL為321bp，linker序列為45bp。VH、VL符合小鼠Ig可變區結構。Linker序列正確。基因核苷酸序列如下。
CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTGAAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGGGTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGCAAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTTGAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GACTCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTGGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATGGCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TACAAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATTTAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGGTCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT GAA GAT GTT GCCACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACAAAG TTG GAA ATA AAA CCG(二)ScFv-C1基因序列的計算機分析1、VHCl基因序列計算機分析1)基因同源性分析將VHCl基因序列輸入計算機與Internet網中的所有基因數據庫中的已知基因進行同源性比較，其同源序列均為鼠Ig重鏈可變區基因，與之同源性最高的為MM2F2A(分數1464)，該基因為記憶B淋巴細胞體細胞突變產生M．MusculusmRNA。
2)氨基酸序列的推導分析VHCI基因長度為354bp，系一開放讀框，基因內無終止碼，可編碼118個氨基酸，氨基酸序列見圖4。VHCI有明確的4個FR區和3個CDR區，CDR1區第31位-35位，CDR2區第50位-66位，CDR3區，第99位-107位，其中第22位和第96位為抗體可變區特征性的恒定半胱氨酸殘基，表明該序列符合小鼠Ig重鏈可變區的氨基酸序列特征。VHCI氨基酸序列推導為Q V Q L Q Q S R A E L V K P G A S V K L S C K ACAGGTCCAACTGCAGCAGTCTAGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCT12 24 36 48 60 72S G Y T F T S Y W M H W V K Q R P G Q G L E W ITCTGGCTACACCTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATT84 96 108 120 132144CDR1G E I N P S N G R T N Y N E N F K S K A T L T VGGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAACTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTT156 168 180 192 204 216CDR2D K S S S S A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y CGACAAATCCTCCAGCTCAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT228 240 252 264 276 288A R Y E D Y D L H D Y W G Q G T S V T V S SGCAAGATATGAGGACTACGATCTCCATGACTACTGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCCTCA300 312 324 336 348CDR32 VICl基因在序列的計算機分析1)基因同源性分析將VLCl基因在序列輸入計算機與Internet網中的所有基因數據庫中的已知基因進行同源性比較，，其同源序列均為鼠Ig Vk基因，與之同源性最高的為S61341(分數1074)，該基因為小鼠F10雜交瘤IgK輕鏈mRNA。
2)氨基酸序列的推導分析VLCI基因長度為321bp，系一開放讀框，可編碼107個氨基酸，序列中有明確的4個FR區和3個CDR區。CDR1區第24位-33位，CDR2區第49位-55位，CDR3區，第88位-96位，在第23位和第87位為特低性的恒定半胱氨酸殘基，表明其結構符合鼠Ig輕鏈可變區的氨基酸序列特征。VLCI氨基酸序列推導為D I K L T Q S P T A M A A S P G E K I T T T C SGACATCAAGCTCACTCAGTCTCCAACCGCCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGT12 24 36 48 60 72A S Q T Y N L V M W Y Q Q K S G T S P K P W I YGCCAGTCAGACATACAACTTAGTAATGTGGTACCAACAGAAGTCAGGGACCTCTCCTAAACCCTGGATTTAT84 96 108 120 132 144CDR1R T S N L A S G V P A R F S G S G S G T S Y S LAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTC156 168 180 192 204 216CDR2T I G T M E A E D V A T Y Y C Q Q S S T L P F TACAATTGGCACCATGGAAGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGAGTAGTACTTTACCATTCACG228 240 252 264 276 288CDR3F G S G T K L E I K PTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACCG300 312三、ScFv-C1在大腸桿菌中的表達和活性檢測(一)ScFv-C1在大腸桿菌中的表達含重組噬菌體的陽性克隆經IPTG誘導可表達ScFv-E-tag融合蛋白，預期分子量約為30KDa，將表達產物經PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，誘導組和未誘導組的蛋白帶未見明顯差異，見圖3。圖3是本發明ScFv-CI表達產物考馬斯亮蘭染色結果圖。，其中M標準蛋白；U未誘導細菌外周質；TIPTG誘導后的細菌外周質。以抗E-tag抗體進行Western Blot，可見誘導組的細菌外周質和上清有大小為30KD的表達蛋白，而未誘導組未見有蛋白的表達，見圖4。圖4是本發明ScFv-CI表達產物Western Blot的結果圖。其中M標準蛋白；U未誘導；IIPTG誘導。
(二)ScFv C1的活性測定采用間接免疫熒光染色，并用流式細胞儀分析ScFvCl與三種不同細胞系的親和活性，結果提示ScFvCl與正常胃粘膜細胞無親和活性，ScFvCl與胃癌細胞系SGC-7901有較強的親和活性，而與肝癌細胞系SMMC-7701亦有一定的交叉反應。
權利要求
1.一種抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于它是一種采用噬菌體抗體庫技術，直接從胃癌細胞抗原免疫的小鼠脾細胞出發，構建的抗人胃癌全套單鏈抗體基因噬菌體抗體中篩選出的具有抗胃癌活性的單鏈抗體，并可在大腸桿菌中進行可溶性表達。
2.根據權利要求1所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其基因由720個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTGAAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAG ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGGGTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGCAAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTTGAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAGTCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTGGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATGGCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TACAAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATTTAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGGTCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT GAA GAT GTT GCCACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACAAAG TTG GAA ATA AAA CCG
3.根據權利要求2所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中重鏈可變區基因VHCI由354個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTGAAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGGGTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGCAAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTTGAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GACTCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA
4.根據權利要求2所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中輕鏈可變區基因VLCI由321個核苷酸組成，其核苷酸序列如下GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATG GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACTATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TAC AAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGGACC TCT CCT AAA CCC TGG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCTCGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCTGAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCGGGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA CCG
5.根據權利要求2或3所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中VHCI編碼118個氨基酸，氨基酸序列如下Q V Q L Q Q S R A E L V K P G A S V K L S C K AS G Y T F T S Y W M H W V K Q R P G Q G L E W IG E I N P S N G R T N Y N E N F K S K A T L T VD K S S S S A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y CA R Y E D Y D L H D Y W G Q G T S V T V S S
6.根據權利要求2或4所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中VLCI編碼107個氨基酸，氨基酸序列如下D I K L T Q S P T A M A A S P G E K I T I T C SA S Q T Y N L V M W Y Q Q K S G T S P K P W I YR T S N L A S G V P A R F S G S G S G T S Y S LT I G T M E A E D V A T Y Y C Q Q S S T L P F TF G S G T K L E I K P
7.根據權利要求5所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中VHCI基因與鼠免疫球蛋白重鏈可變區基因MM 2F 2A同源性最高，分數為1464；且為單一開放讀框，它系重排后的功能性鼠抗體可變區基因。
8.根據權利要求6所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于其中VLCI基因與鼠免疫球蛋白輕鏈可變區基因S61341同源性最高，分數為1074，且為單一開放讀框，它系重排后的功能性鼠抗體可變區基因。
9.根據權利要求1所述的抗人胃癌單鏈抗體，其特征在于利用其與抗原保持親和活性的同時，降低免疫原性，對腫瘤具有的強大穿透力優勢，在診斷和治療胃癌上的應用，以及在此基礎上篩選高親和力、高表達的抗胃癌單鏈抗體，為構建其他類型的基因工程抗體及臨床應用奠定基礎。
全文摘要
本發明的抗人胃癌單鏈抗體是一種采用噬菌體抗體庫技術,直接從胃癌細胞抗原免疫的小鼠脾細胞出發,構建的抗人胃癌全套單鏈抗體基因噬菌體抗體庫中篩選出的具有抗胃癌活性的單鏈抗體,并可在大腸桿菌中進行可溶性表達。該單鏈抗體為今后在此基礎上篩選高親和力、高表達的抗胃癌單鏈抗體,構建其他類型的基因工程抗體積累了資料。對胃癌臨床診斷和治療的研究及應用具有重要意義。
文檔編號C07K16/18GK1293206SQ0012956
公開日2001年5月2日 申請日期2000年9月29日 優先權日2000年9月29日
發明者楊麗娟, 蘇成芝 申請人:楊麗娟, 蘇成芝