專利名稱：雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎發生與植株再生方法
技術領域：
本發明屬林業中通過組織培養的植物再生技術領域，具體涉及一種雜交鵝掌 楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎發生與植才朱再生技術。
二背景技術：
鵝掌楸，又稱馬褂木、鴨腳木、九層皮、楓荷樹等，是木蘭科(Mag朋"aceae) 鵝掌楸屬fZzWom/e"^ow)的植物。該屬現在僅存兩種， 一種是分布于我國中、北 亞熱帶地區(從東部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越邊界)的中國鵝掌楸 (丄.[Hemsl.] Sarg.)，另一種是分布于美國東部的北美鵝掌楸 (￡. L.)。鵝掌楸屬植物在被子植物分類地位中處于較原始的位置。雖
然分布區廣，但目前多呈小群體分布。其中分布于中國境內的鵝掌楸已被列為國 家二級珍稀瀕危保護樹種。
中國鵝掌楸干形通直、樹形美觀；葉形奇特，葉片寬大，微凹，兩側有一裂 片，先端截形，葉形,然如中國古裝馬褂一般，故俗稱馬褂木；春天枝條頂端開 淡黃色大型花朵，其狀如杯似碗，光杣悅目，觀賞價值高；果實圓錐形，亦極美 觀。該樹種對二氧化硫和氯氣有較強的抗性，廣泛用于園林綠化。另外，鵝掌楸 屬植物木材淡紅褐色，紋理通直，色澤美觀，結構細密，材質輕軟，刨面光潔， 適合于用作膠合板、紙漿、家具以及室內裝飾用材，也可用于建筑、造船等，經 濟價值極高，因此也是重要的用材樹種。
作為世界珍稀名貴觀賞風景樹的北美鵝掌楸，同樣樹姿挺秀，葉形美麗，樹 形端正，樹序整齊，花大而美。老齡樹枝條平展，或微向下垂。每屆花期，瓊英 壓樹，翠帷覆地，綺麗優雅。
葉培忠[1899 1978]教授于1963年首次選用中國鵝掌楸和北美鵝掌楸為親本進 行正、反交組合人工雜交，育成種間雜種雜交鵝掌楸(丄.c/n'"erae[Hems1.] Sarg. x丄.L. 禾口丄.L. x丄.c/w.wewse [Hemsl.] Sarg); 1970年 開始進行雜交鵝掌楸正、反交組合苗木栽培對比。試驗表明，種間雜交后代具有 明顯的雜交優勢，不僅樹形比親本更加通直，花葉更加幽麗，媲美眾芳，俯視眾 卉，而且生長也更加迅速。如栽植于浙江富陽中國林科院亞林所的雜交鵝掌楸， 25年生時樹高達21m，胸徑達63.7cm;另據北京市園林局將雜交鵝掌楸作城市 行道樹試種，在北京地區表現出耐寒性強，生長迅速的特點；同時該樹種無其他 樹種果毛、花絮飛散造成的空氣污染之弊。因此，林業上對優質雜交鵝掌楸苗木 的需求相當迫切。
但鵝掌楸的天然結實率很低，親本和雜交新種均僅有1%左右，有性繁殖能 力差；鵝掌楸的扦插技術要求很高，扦插周期長、成活率低，無性繁殖困難。因 此，目前的種苗繁殖技術無法滿足大面積植樹造林的需要。
體細胞胚胎發生及其植林再生技術是20世紀90年代形成的高新林業生物技 術的重要內容之一，可用于優良品種的大規模工業化繁殖和用于遺傳轉化體系的 建立。體細胞胚，是指二倍體或單倍體細胞在未經性細胞融合的過程，模擬合子 胚發生的各個階段而發育形成一個新的個體的形態發生和重建過程。在正常情況 下有些植物的珠心組織或助細胞也可自發產生體細胞胚。在大量的組織培養過程 中，許多離體培養的細胞、組織和器官，形成類似胚的結構。這種經體細胞胚發 生而形成的在形態結構和功能上類似于有性胚的結構被稱之為體細胞胚或胚狀 體。無性胚狀體可以像有性胚那樣在一定的條件下發育成完整的植抹。胚狀體按 其來源可分為兩類 一類是由普通植物孢子體的各種器官的二倍體體細胞產生而 來，通常稱為體細胞胚；另一類是由小孢子或其分裂產物等單倍體細胞產生的胚 狀體，通常簡稱為花粉胚，可發育成單倍體植林，但一般必須進行染色體加倍才 能正常開花結實。另外，在一些植物中也可從胚乳培養得到胚狀體，但未能成功 地由胚狀體發育成植抹。朱微認為胚狀體的定義包括三點含義
1. 胚狀體是組織培養的產物，只限于在組織培養范圍內使用，區別于無融 合生殖的胚；
2. 胚狀體起源于非合子細胞，區別于合子胚；
3. 胚狀體的形成經歷胚胎發育的過程，區別于與組織培養中分化的芽體。 1902年Haberlandt提出植物細胞的全能性觀點，即每一個細胞都能不斷分
裂，進而形成完整的植林.Steward(1958)和Reincrt(1959)差不多同時發現，培養 的胡蘿卜根細胞產生一種與胚相似的結構，并觀察到由這種結構長成完整的植 株。從而證明Haberlandt關于細胞全能性概念的正確性。此后，植物學家對此進 行了廣泛的研究，并已在許多植物中利用不同的器官、組織、細胞和原生質體進 行培養得到了體細胞胚。成功獲得體細胞胚的有棵子植物、雙子葉植物和單子葉 植物。林木體細胞胚胎發生研究始于20世紀七十年代后期，八十年代后期迅速 發展，并獲得極大成功。全世界目前已有40多種木本植物獲得了體細胞胚，尤 其是用常規無性繁殖技術很難生根的針葉樹的體胚發生取得了令人矚目的進展。 據初步統計，已從冷杉屬、落葉松屬、云杉屬、松屬、黃杉屬和北美紅杉屬的至 少20種不同的針葉樹的外植體誘導成功了體細胞胚。在闊葉樹種上，柳屬、楊 屬、栗屬、檀香屬、楓香屬、鵝掌楸屬、榛屬、櫟屬、板栗屬、山茶屬、桉樹 屬、七葉樹屬、柑橘屬、柚木、可可、油橄欖、橡膠、泡桐等20多個樹種的組 織培養中觀察到體細胞胚胎發生或獲得再生植林。其中，美國的惠豪公司、國際 紙業公司、維斯瓦庫公司和加拿大的一些公司、新西蘭林業研究中心等已分別將 火炬松、挪威云杉、花旗松和輻射松等樹種的體細胞胚誘導和植抹再生應用于生 產實踐。僅新西蘭一家公司就形成了年產200萬林輻射松體細胞胚再生植抹的能 力。中國科學院于1988年以華北云杉為實驗材料，將幼胚產生的愈傷組織誘導 出的體細胞胚胎發育成小苗。黑龍江農大(1993)進行黑穗醋粟末受精胚珠培養， 成功誘導體細胞胚胎和植林。四川農大王米力等(1996)用尾葉桉種子下胚軸誘導 體細胞胚胎發生，獲得根苗齊全的再生植抹。南京林業大學施季森、陳金慧等 (一種雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生與植林再生技術CNZL 02112948.7)用雜交鵝
掌楸未成熟胚通過固體培養的方式，成功誘導體細胞胚胎的發生，得到完整的植 抹。
目前研究人員誘導體細胞胚胎發生主要利用植物體的各種器官，如根、莖、 葉、花、果實、種子、子房中的胚珠、雄蕊的花絲、花藥及花粉等。但 S. Merkle(1996)認為，樹木的胚性培養只能來源于種子或幼苗，合子胚或種子的 發育程度是很重要的，在許多樹種的研究中表明，未成熟種子比成熟種子或幼苗 有更高的誘導潛能。
組織培養誘導脫分化都主要通過2,4-D來誘導。在多篇文獻中報道2,4-D能抑 制胚狀體的產生和發育，因此在誘導脫分化后必須降低或去掉2, 4-D,胚性細胞 才能正常發育.HaLperin(1970)取胡蘿卜的葉柄切段，培養于添加不同激素成分 的瓊脂培養基上，然后移至不加任何激素的基本培養基上(僅有無機鹽、蔗糖及維 生素B1)，以檢查對胚狀體形成的影響。結果表明
1. 促進胚性愈傷組織增殖的培養及其激素成分并不促進胚狀體的分化； 去除培養基申的2, 4-D，則使胚狀體形成；加入BA，組織增殖速度 增加，但抑制了轉移培養基上后胚狀體的形成，并且一旦胚狀體原始 細胞形成后，BA對其發育成胚狀體毫無影響。
2. 加入赤霉素，完全抑制其后胚狀體的分化。
3. 細胞增殖過程中的激素環境對下一步器官分化有著明顯的影響。 實驗結果表明，2, 4-D通過改變細胞內源IAA代謝而起作用，在水稻的早期
胚性愈傷組織中，用ELISA酶聯免疫分析證明胚性細胞出現時伴有較高的內源 IAA水平，并且在胚性細胞轉換時期添加外源IAA對胚性細胞出現有一定謙導效 果。
滲透劑在林木體胚發生的各個階段都發揮著重要作用。總的說來，滲透劑都 是高度水合性的多羥基分子，包括單糖、多糖、己糖醇和環多醇。環多醇是六碳 環的羥基復合物，較常用的環多醇有肌醇及其立體異構體肌醇等。蔗糖和葡萄糖 是常用的兩種糖類滲透劑，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直鏈醇形式、乙二醇 如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作滲透劑。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈傷組勢誘 導和植林再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高滲透壓，以促進后期胚的發 育。黃健秋(1995)將馬尾松的早期原胚轉至含9000mg/L肌醇的DCR培養基 上，形成后期原胚。可見，體胚形成過程中適當提高滲透壓可促進體胚形成。
在植物組織培養中，誘導體細胞胚胎發生和誘導器官發生相比具有顯著的特
點
1. 具有兩極性在體細胞胚發生早期就具有胚才艮和胚芽兩極，胚性細胞 分裂多為不均等分裂，形成頂細胞和基細胞，其后有較小的頂細胞繼 續分裂形成多細胞原胚，而較大的基細胞進行少數幾次分裂成為胚柄 部分，在形態上具有明顯的極性。
2. 存在生理隔離體細胞胚形成后與母體植物或外植體的維管束系統聯 系較少，即出現所謂生理上的隔離現象。胚性細胞細胞壁加厚，與其 它細胞分開，周圍細胞處于解體狀態，表明體細胞胚與合子胚相似， 從一開始就是完整的植物體的雛形。
3. 遺傳相對穩定通過體細胞胚形成的再生植抹的變異性小于器官發生 途徑形成的再生植抹，因為只有那些未經過畸變的細胞或變異較少的 細胞團才能形成體細胞胚，實現全能型表達。
4.重演受精卵形態發生的特征植物組織培養中形態發生的幾種方式， 雖然都是植物細胞全能性的具體表現，但體細胞胚胎發生途徑是細胞 全能型表達最完全的一種方式，它不僅表明植物體細胞具有全套遺傳 信息，而且重演了合子胚形態發生的進程。
植物組織培養中誘導體細胞胚發生途徑可歸納為兩種直接途徑與間接途 徑。直接途徑就是從外植體某些部位直接誘導脫分化出體細胞胚，如槐樹子葉在 切口處產生愈傷組織的同時，在子葉組織中分化產生體細胞胚。間接途徑通過脫 分化形成愈傷組織后，再從愈傷組織的某些細胞分化出體細胞胚。大多數植物的 體細胞胚胎發生多通過間接途徑進行，在愈傷組織中某些體細胞轉化為胚性細 胞、胚性細胞繼續分裂形成多細胞原胚以及不同發育時期的體細胞胚，如經過球 形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚而發育成小苗。
體細胞胚胎發生由于能在更短的時間內得到更多的無性繁殖體，以及獲得更 大的遺傳增益，并且由于體胚發生培養物也是分離原生質體的重要來源，可用于 林木的遺傳轉化以及體細胞雜交研究，在理論與應用研究中具有重要的作用。利 用懸浮細胞誘導產生體細胞胚胎具有數量多、速度快、結構完整等顯著特點，同 時可以節約大量的試驗場地，縮短培養時間，因而特別適合植物的大量繁殖。由 于易在體外培養，并且可以比較體外非合子胚與種子的合子胚的異同，所以廣泛 用于研究植物體的生長發育過程。在基因工程研究中，將分離到的基因導入單個 胚性細胞中，由這個胚性細胞長成植抹的組織中，就含有整合進去的基因。
目前有關植物組織培養技術的各類文獻中，除美國有北美鵝掌楸 (丄加omfe"&o"加/^/era L.)組培相關專利技術的報導，和陳金慧通過固體培養用 未成熟胚誘導用出雜交鵝掌楸(hWomfeadra" hybrid)體細胞胚胎的相關專利技術的 報導外，尚未見有雜交鵝掌楸成年樹營養體誘導體細胞胚胎發生和植林再生技術 報道。

發明內容
本發明的目的是利用雜交鵝掌楸(丄/n'o"&a^w7 hybrid)無性系的營養體器官或 組織，進行體細胞胚胎工程和克隆植抹的再生技術，尋找適用于雜交鵝掌楸組織 培養快速、高效繁殖的新方法。
由于種種原因，目前通過樹木的營養體獲得雜交鵝掌^c體細胞胚胎發生的難 度較大，而通過未成熟胚獲得雜交鵝掌楸體細胞胚胎和植林再生的方法則存在一 定的變異性。因此本發明所用具有優良性狀的雜交鵝掌楸不同部位的芽、莖尖、 葉、花器官及新枝誘導出胚狀體，能較好保持無性系的遺傳上的穩定性；且試驗 材料較易獲得，克服了未成熟胚取材受雜交和時間限制等因素的影響。該方法成 本較低，降低了可能由于授粉造成的結實率低，表型變異等情況。本發明中，采 用每10-14天繼代一次的工藝路線，可用兩個月左右的時間得到雜交鵝掌楸的 子葉胚，時間較短，縮短了繁殖時間；取材方便，解決了授粉中花期控制的難 題； 一年四季皆可取材，便于開展對體細胞胚胎形成機制的研究。
本發明的具體技術解決方案如下 一種雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系 誘導體細胞胚胎發生和植林再生的方法，其特征在于釆用雜交鵝掌楸不同基因型 的營養體器官或組織為體細胞胚胎發生誘導的材料，經歷愈傷組織誘導，懸浮細 胞系的建立和增殖，懸浮細胞系的胚胎發育誘導，胚胎發育成熟、體胚萌發和植 抹再生階段獲得幼苗。
其中，雜交鵝掌楸不同基因型的營養體器官或組織可為雜交鵝掌楸不同部位 的芽、莖尖、葉、花器官及新枝。
愈傷組織請導階段使用MS培養基，附加2.0mg/L 2, 4-D、 0.2 mg/L 6-BA、 瓊脂和5mg/L的維生素C;
懸浮細胞系的建立階段使用MS基本液體培養基，附加0.2mg/LKT、 0.2mg/L NAA、 0. 2mg/L2， 4-D,搖床暗培養；
胚性懸浮細胞的誘導階段使用MS基本液體培養基，附加2.0mg/LKT 、 0.1 mg/L NAA、 0.4 mg/L 6-BA、 30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然復合物水解酪 蛋白和1-5 mg/L的維生素C,搖床暗培養；
b.胚性懸浮細胞的成熟階段使用MS改良液體培養基，附加1.0-10.Omg / L的 ABA、 0-5.0mg/L的GA、 蔗糖20-60g/L、 l-5mg/L的維生素C,搖床暗培
養；
體細胞發育成熟階段使用MS基本液體培養基，附加1.0-10.0mg/L的 ABA、 0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、 l-5mg/L的維生素C、瓊脂5g/L,暗
培養；
球形胚形成以后，再轉入附加1.0-8.0 mg/L的ABA, 0-5.0mg/L的GA、蔗 糖20-60g/L、 l-5mg/L的維生素C、瓊脂5g/L的的MS改良固體培養基中繼續 暗培養，直至成幼苗。
附MS培養基(Murashing and Skoog medium)標準配方
NH4N031650 mg/1
KN031900 mg/1
CaCl2 ■ 2H20440 mg/1
MgS04 7H20370 mg/1
KH2P04170 mg/1
KI0.83 mg/1
H3B036.2 mg/1
MnS04 H2016.9 mg/1
ZnS04 7H208.6 mg/1
Na2Mo04 2H200.25 mg/1
CuS04 5H200.025 mg/1
CoCl2 6H200.025 mg/1
FeS04 7H2027.8 mg/1
Na2-EDTA37.3 mg/1
肌醇100 mg/1
煙酸0.5 mg/1
鹽酸硫胺素0.1 mg/1
鹽酸吡眵醇0.5 mg/1
甘氨酸2 mg/1
在該標準配方中添加使用肌醇80 mg/L,即可獲得MS基本固體培養基； 在該標準配方中添加使用KN03 1000 mg/L,即可獲得MS改良固體培養基； 在該標準配方中添加使用肌醇60 mg/L,即可獲得MS基本液體培養基； 在該標準配方中添加使用KN03 800 mg/L, CaNO3 400 mg/L,即可獲得MS改 良液體培養基。
四

圖1為胚性懸浮細胞誘導階段的細胞狀態；
圖2為胚性懸浮細胞成熟階段的細胞狀態；
圖3為體細胞發育、形成階段的狀態；
圖4為體細胞發育、形成后植抹再生階段的不同狀態。
五具體實施例方式
春季從野外采集雜交鵝掌楸無性系成年樹上采集新梢，取芽、莖尖、花器官 及新枝等不同部位材料，在實驗室內用洗滌精清洗10分鐘，然后用自來水沖洗2 小時，于超凈工作臺上用75。/。的酒精浸泡30s, 0. l%HgCl2:浸泡8-12min，無 菌水沖洗5-6次，用無菌濾紙吸干材料表面的水分，放入到愈傷誘導培養基MS 培養基，附加濃度2.0mg/L 2, 4-D、 0.2 mg/L6-BA、瓊脂和5 mg/L的維生素C， 調pH為5.7,暗培養溫度為24-26°C;
取上述材料誘導出的白色愈傷、外觀濕潤、質地松軟的愈傷組織，放入添加 了 0.2mg/L KT、 0.2mg/L NAA、 0. 2mg/L 2, 4-D的MS液體培養基中進行懸浮 培養7-10天，將培養的懸浮液用量筒沉淀后，棄上清，按照細胞和液體培養基 1: 9的比例進行繼代培養。繼代時，總體積不應超過50ml。培養條件為搖床 轉速100r.p.m, 25士rC,暗培養，共培養30-50d;
a. 胚性懸浮細胞的誘導階段__把上階段搖散獲得的均勻、松散的懸浮細胞 沉淀后，棄上清，將懸浮細胞轉入附加2.0 mg/L KT 、 0.1 mg/L NAA、 6-BA 0.3 mg/L、 30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然復合物水解酪蛋白和1-5 mg/L的 維生素C的MS基本液體培養基中進行胚性懸浮細胞誘導；搖床轉速為70-100 r.p.m，暗培養溫度為23-25 。C,調pH到5.7。
b. 胚性懸浮細胞的成熟階段一一把a階段獲得的胚性懸浮細胞沉淀后，棄上 清，轉入附加1.0-10.0mg/L的ABA、 0-5.0mg/L的GA、 蔗糖20-60g/L、 1-5mg/L的維生素C的MS改良液體培養基中培養；搖床轉速為70-100 r.p.m, 暗培養溫度為23-25。C.;調pH到5.7。
本階段中使用的脫落酸ABA,對體細胞胚胎的形成起著重要的作用。在高濃 度生長素的作用下，細胞生長速度很快，這樣形成的大量薄壁細胞并不有利于體 細胞胚胎的形成，而脫落酸ABA可以中和生長素的后續效應，調整細胞狀態， 減慢細胞生長速度，經過兩個階段懸浮處理以后，細胞逐漸開始分裂，開始形成 如附圖2所示形狀；
c. 體細胞發育成熟階段一_把b階段獲得的懸浮細胞沉淀后，棄上清，轉入 附加1.0-10.0mg/L的ABA、 0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、 l-5mg/L的維 生素C、瓊脂5g/L的MS液體培養基中培養；調pH到5.7,暗培養溫度為23-25 °C,直至培養形成球形胚；
球形胚形成以后，再轉入附加1.0-8.0 mg/L的ABA,蔗糖20-60g/L、 l-5mg /L的維生素C、瓊脂5g/L的MS改良培養基使其繼續發育，球形胚經過近兩個 月的發育，會依次經過球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段而發育成苗。
MS改良培養基可成功調整營養體懸浮細胞的生長狀況，使畸形苗的發生得 到有效控制，并且使懸浮細胞團能最大限度地發育形成子葉胚，最終形成植林。幼苗在MS培養基上發育成小植林后，轉入光照培養條件下，子葉不斷伸 長，最終形成一抹完整的植株。如附圖4。
移苗定植階段_一體胚長成植抹后，苗高在2厘米左右，且根葉發達時，從 瓶中取出洗去幼苗根部培養基，植入主要由珍珠巖構成的基質中，并按常規苗木 栽培工藝進行育苗、定植。
成年母樹上采集的芽、莖尖、和葉片等不同部位，在誘導體細胞胚胎發生頻 率之間存在一定的差異，其中葉片組織誘導體細胞胚胎發生頻率較易。在體細胞 胚發育成熟培養階段，在直徑0.5厘米大小的培養物。在30d天可誘導出12個體 胚，同時發現隨著培養時間繼續，培養物不斷有新的體細胞胚胎產生。
本方法突破了無法直接用雜交鵝掌楸成年樹營養體誘導體細胞胚胎發生和植 抹再生技術的難關。采用本發明提供的的方法，可以為雜交鵝掌楸的工廠化無性 繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，突破了鵝掌楸天然結實 率低，扦插困難，種苗繁殖技術無法滿足大面積植樹造林需要的限制。
權利要求
1.一種雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎發生和植株再生的方法，其特征在于采用雜交鵝掌楸不同基因型的營養體器官或組織為體細胞胚胎發生誘導的材料，經歷愈傷組織誘導，懸浮細胞系的建立和增殖，懸浮細胞系的胚胎發育誘導，胚胎發育成熟、體胚萌發和植株再生階段獲得幼苗。
2. 如權利要求1所述的雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎 發生和植抹再生的方法，其特征在于雜交鵝掌楸不同基因型的營養體器官或組織 為雜交鵝掌楸不同部位的芽、莖尖、葉、花器官及新枝。
3. 如權利要求1所述的雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎 發生和植林再生的方法，其特征在于不同階段使用的培養基和培養條件分別為愈傷組織誘導階段使用MS培養基，附加2.0mg/L 2, 4-D、 0.2 mg/L 6-BA、 瓊脂和5mg/L的維生素C;懸浮細胞系的建立階段使用MS基本液體培養基，附加0.2mg/LKT、 0.2mg/L NAA、 0. 2mg/L2， 4-D，搖床暗培養；胚性懸浮細胞的誘導階段使用MS基本液體培養基，附加2.0mg/LKT 、 0.1 mg/L NAA、 6-BA 0.3 mg/L、 30g/L蔗糖、500-1000mg/L的天然復合物水解酪 蛋白和1-5 mg / L的維生素C，搖床暗培養；b.胚性懸浮細胞的成熟階段使用MS改良液體培養基，附加1.0-10.0mg/L的 ABA、 0-5.0mg/L的GA、 蔗糖20-60g/L、 l-5mg/L的維生素C,搖床暗培 養；體細胞發育成熟階段使用MS基本液體培養基，附加1.0-10.0mg/L的 ABA、 0-5.0mg/L的GA、蔗糖20-60g/L、 l-5mg/L的維生素C、瓊脂5g/L,暗培養；球形胚形成以后，再轉入附加1.0-8.0 mg/L的ABA,蔗糖20-60g/L、 l-5mg /L的維生素C、瓊脂5g/L的MS改良固體培養基中繼續暗培養，直至成幼苗。
全文摘要
一種雜交鵝掌楸無性系營養體懸浮細胞系誘導體細胞胚胎發生和植株再生的方法，采用母樹不同部位的芽、莖尖、葉、花器官及新枝為體細胞胚胎發生誘導材料，經歷愈傷組織誘導，懸浮細胞系建立和增殖，懸浮細胞胚胎發育誘導，胚胎發育成熟、體胚萌發和植株再生階段獲得幼苗。本方法突破了無法直接用雜交鵝掌楸成年樹營養體誘導體細胞胚胎發生和植株再生技術的難關，為工廠化育苗提供了一種周期短、繁殖率高、成本低廉的新方法。
文檔編號C12N5/04GK101112178SQ20071013125
公開日2008年1月30日 申請日期2007年9月7日 優先權日2007年9月7日
發明者席夢利, 施季森, 邊黎明, 陳金慧, 偉 龍 申請人:南京林業大學 被以下專利引用 (1),