專利名稱：納他霉素的制備方法
技術領域：
本發明屬于發酵生產納他霉素的方法，涉及以褐黃孢鏈霉菌為菌種，采用國內培養基，通過控制條件發酵和蒸發去甲醇法提取納他霉素的制備技術。
背景技術：
納他霉素(或叫匹馬菌素或田納西菌素)是一種多烯大環內酯類抗真菌抗生素，分子量約為666Dal，相應的實驗分子式為C33H47NO13，為兩性物質，等電點約為6.5。納他霉素對幾乎所有的真菌具有極強的抗生物活性，對細菌無效。目前，納他霉素被廣泛用做生物食品防腐劑，在醫藥等領域也有相關的應用。雖然人們已經認識到它有高價值的抗生素特性，但由于其生產成本太高，使國內的相關商業運作受到限制。
早在1960年，英國專利846,933中就描述了生產納他霉素的傳統發酵方法，但生產效率不高。在中國專利CN1070688A、CN1071460A和CN1072959A中提供的生產納他霉素方法，他們所用的培養基商標為Difco，在國內難以買到，即使買到其價格也是較高的。
目前現有技術從發酵液中提取納他霉素的工藝，要求發酵液的濃度需大于2％。由于它在各種溶液里的溶解度都不高，特別是在國內納他霉素的相關研究中其制備的納他霉素含量＜2g/L，所以納他霉素的提取過程沒有經濟性，故當前需要一種比較經濟的納他霉素提取工藝。在美國專利846933中，描述了用甲醇提取納他霉素的方法，其步驟包括吸附和洗脫；美國專利3892850中，用酸性丁醇提取納他霉素，再蒸餾最后沉淀，其中還提出用CaCl2增大納他霉素在甲醇中的溶解度，但這些工藝均需昂貴的費用，(像吸附，洗脫，蒸餾和蒸發；)另外，在專利WO9507998中，公開了通過在發酵液中加入甲醇，然后將其pH值調至1.0至4.5以溶解已沉淀的納他霉素，除去其他固體后，再將pH值調至6.0-9.0，使納他霉素沉淀出來的方法，但是這種提取工藝會產生一種副產物—納他霉素甲酯。
綜上所述，不難看出，發酵生產及提取納他霉素中的問題是影響其推廣應用的關鍵。為此，研究和開發一種經濟、實用的納他霉素的制備、提取方法是當務之急。

發明內容
本發明解決了發酵生產納他霉素使用國外培養基，在國內難以買到，并且價格較高及從發酵液提取納他霉素工藝復雜、費用昂貴或者有副產物的問題；提供了一種經濟、實用，采用國內培養基，通過控制條件發酵和蒸發去甲醇法提取納他霉素的制備工藝。
技術方案本發明是利用發酵法生產納他霉素，其菌種采用褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，經孢子懸浮液的制備、種子培養、發酵、提取工序；通過控制pH值和溶解氧水平，以及在發酵期間分批次流加葡萄糖進行生產納他霉素，并采用低溫蒸發法去除甲醇提取納他霉素。具體步驟包括如下(一)制備納他霉素發酵液●孢子懸浮液的制備生產菌種為褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)其原始菌種是從美國典型培養物收集中心處獲得，其保藏號為ATCC 13326，通過DES和UV誘變，篩選高產菌株，將該生產菌株在瓊脂斜面上生長4-8天后，4℃保藏待用。需要指出，新長好的瓊脂斜面孢子可以經4℃冰箱保藏5～15天后使用。其中，制作孢子懸浮液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養基，滅菌條件為121℃，滅菌20～30min。孢子濃度選擇為108個/mL。這是因為不同孢子懸浮液濃度對種子生長狀態的影響不同，具體見下表。
孢子濃度 種子生長狀態(個/mL)菌體形態種子進入對數生長期的時間(h)105種子液澄清，有菌絲體結團現象 45106種子液較澄清，有大小不均勻的菌絲體顆粒形 39成107種子液變渾濁，有均勻大量的菌絲體顆粒，顆 29粒直徑約為1-1.5mm108種子液渾濁，有極細密的大小均一的菌絲體微 24粒，微粒直徑約0.1-0.5mm109種子液渾濁且非常粘稠，無菌絲體微粒21
由上表可見孢子濃度選擇109個/mL以上和107個/mL以下時不可取。
●種子培養種子培養基由碳源、氮源、無機離子和微量元素組成，即普通蛋白胨 4-8g/L酵母粉 4-8g/L葡萄糖 15-30g/LNaCl8-15g/LpH 7.0將制備好的孢子懸浮液加入到上述種子培養基中，其滅菌條件為120～125℃，滅菌15～25min；在搖床上200rpm轉速下，28～30℃培養20～28h。在培養過程中不需要攪拌和通氣，即可得到適合接種的種子培養物。
●發酵制取納他霉素發酵培養基組成大豆蛋白胨15-30g/L酵母粉3.6-5.1g/L葡萄糖32-48g/LpH7.5其中，大豆蛋白胨和酵母浸粉，采用北京雙旋微生物培養基制品廠生產的產品，同樣獲得了可觀的納他霉素產量。發酵培養基滅菌采取大豆蛋白胨和酵母粉一起滅菌，條件為120～125℃ 15～25min；葡萄糖單獨滅菌，條件為114～118℃ 15～25min。
將長好的種子接入到經滅菌的發酵培養基中，按2％的體積比接種。接入的種子量對納他霉素的影響較大，當按發酵液體積比＞4％接種時，發酵液比較粘稠，產量不高；而接種量＜1％時，延遲期較長，同時發酵液中菌絲球較大，不利于溶解氧的傳遞；因此經考察后發現按發酵液體積比2％接種比較經濟和利于納他霉素的生產。
在發酵過程中，因生產菌的繁殖與代謝，必然有泡沫產生，因此需要流加消泡劑，控制泡沫，常用的消泡劑為硅酮和聚醚類，任何一種消泡劑均可用來控制泡沫，只要流加的消泡劑不影響納他霉素的合成即可。其中優選消泡劑為聚醚類。
發酵過程中，因生產菌的代謝，發酵液的pH不斷下降，經對發酵過程中產酸分析，發現當控制pH在5.5～6.0時更有利于納他霉素的合成。
同時還需不斷分批次流加50％的葡萄糖，(葡萄糖滅菌方法同上)。在流加葡萄糖的過程中，補料方式對納他霉素的合成也有一定影響。其補料的目的是使發酵培養基中維持一定量的葡萄糖，這樣即不影響納他霉素的代謝，同時有利于合成納他霉素。經比較，多次少量的補料方式流加葡萄糖以維持葡萄糖濃度在2％水平比少次多量方式維持葡萄糖濃度在2％水平好。
因納他霉素的合成走的是脂肪酸合成途徑，TCA循環較弱，故需要氧不是很高，但在代謝和合成納他霉素的過程中仍需要一定的溶解氧存在。若溶解氧控制過高，使生產菌代謝過于旺盛，反而不利于納他霉素的合成；若溶解氧太低，也不利于納他霉素的代謝和合成，故在發酵過程中控制溶解氧水平尤為重要。本發明就是通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓，控制發酵液中溶解氧水平在10～30％，發酵96～168h后即可得到含4.0～5.6g/L納他霉素的發酵液。
(二)從發酵液中提取納他霉素該步驟包括濃縮發酵液；加入甲醇，升高pH；去除菌絲體；再降低pH，蒸發甲醇；回收沉淀、進行干燥得到納他霉素固體；其具體方法是●濃縮發酵液本發明所需的提取液為任意濃度的納他霉素發酵液。納他霉素在提取液中的溶解度隨著水的增加而減少，故發酵液體積的減少有利于減少甲醇的用量。濃縮發酵液可任選一種濃縮液體的方法，如蒸發、過濾、離心或離心過濾法。
采用蒸發法濃縮發酵液時，使發酵液濃縮到原體積的1/2以下；采用過濾法濃縮發酵液時，其濾布孔徑不應太大，盡量減少發酵液中的懸浮物透過濾布；采用重力離心處理時，檢測離心上清液中納他霉素的含量，選擇一個合適的轉速使發酵液中的懸浮物離心下來；采用離心過濾法處理時，可將離心和過濾結合起來，在離心的過程中，同時完成過濾。
●加入甲醇、升高pH納他霉素在甲醇中有較好的溶解度，且隨著pH的升高其溶解度增大，故當發酵液濃縮之后可向上述濃縮的發酵液中加入甲醇，并加堿調節pH到10～11，使濃縮液中的納他霉素完全溶解。需要說明的是，所加甲醇的量也可以為濃縮前發酵液體積的1/2。因納他霉素是兩性物質，等電點為6.5，故將加入甲醇的濃縮液的pH降低或升高均可使納他霉素的溶解度升高，使納他霉素能夠完全溶解。本發明采用加堿的方法(所用堿為氫氧化物，如氫氧化鉀或氫氧化鈉)調節pH到10～11，此時，濃縮液從勻質狀態變為固液分離狀態，其中固體為菌絲體，懸浮于處理液中。
●去除菌絲體可采用任何固液分離的方法除去固體懸浮物，如采用重力離心或過濾的方法除去菌絲體；●降低pH、蒸發去甲醇加酸調節pH到6.5～7.5，使溶解的納他霉素部分沉淀下來。為保持納他霉素的活性，采用低溫蒸發去除甲醇，降低納他霉素的溶解度，加速納他霉素的沉淀；即任選一種蒸發液體的方法，如自然揮發、加熱蒸發、真空蒸發或薄膜蒸發，將甲醇從處理液中除去。蒸發溫度一般控制在20～80℃。其蒸發溫度也可控制在35℃～45℃。在該溫度下，蒸發速度較快，同時也能較好的保持納他霉素的活性。將甲醇蒸發后，可見處理液中厚厚的白色沉淀。
●固液分離和干燥將上述結晶的納他霉素，任選一種固液分離的方法，如過濾或離心得到沉淀；再經水多次洗滌，使獲得的固體顏色成為白色；或者通過以上的方法再次對獲得的納他霉素進行重結晶，或用活性炭脫色處理，提高納他霉素的純度；最后進行干燥。任何干燥的方法均是可行的，其方法如常溫干燥、真空干燥、噴霧干燥或真空冷凍干燥等。需要指出，進行干燥易采用真空干燥法，其溫度控制在＜80℃；即可得到純度不小于80％的納他霉素。
有益效果本發明包括納他霉素的發酵法生產和納他霉素的提取兩方面技術。本技術提供了制備、提取納他霉素的新工藝技術。解決了生產納他霉素使用國外培養基，在國內難以買到，并且價格較高及從發酵液提取納他霉素工藝復雜、費用昂貴或有副產物的問題。其生產方法顯著特點是在一級種子培養中不需要往種子液中通氣和攪拌，且發酵中納他霉素的含量達到4-5.6g/L。這樣，不僅簡化了工藝，而且提高了產率，降低了生產成本。其提取方法適于任意濃度的納他霉素發酵液，所得到的納他霉素純度達到80％以上。該提取納他霉素的方法同樣適用于本發明之外的發酵液的提取。本發明經濟、實用、促進其生產的工業化進程；為納他霉素的廣泛應用提供了先決條件；既有經濟效益又有社會效益。
具體實施例方式
實施例1生產菌種為褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，其原始菌種是從美國典型培養物收集中心處獲得，其保藏號為ATCC 13326，通過DES和UV誘變，篩選高產菌株。將該生產菌株在瓊脂斜面上生長5天后，經4℃冰箱保藏10天后使用。其中，制作孢子懸浮液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養基。滅菌條件為121℃，滅菌20～30min。孢子濃度選擇108個/mL。
種子培養基由碳源、氮源、無機離子和微量元素組成，即普通蛋白胨 6g/L酵母粉 6g/L葡萄糖 20g/LNaCl10g/LpH 7.0將制備好的孢子懸浮液加入到上述種子培養基中。滅菌條件為120～125℃，滅菌15～25min；在搖床上200rpm轉速下，28～30℃培養24h。在培養過程中不需要攪拌和通氣，即可得到適合接種的種子培養物。
發酵培養基組成大豆蛋白胨 20g/L酵母粉 4.5g/L葡萄糖 40g/LpH 7.5其中，大豆蛋白胨和酵母浸粉，采用北京雙旋微生物培養基制品廠生產的產品。發酵培養基滅菌采取大豆蛋白胨和酵母粉一起滅菌，條件為120～125℃ 15～25min；葡萄糖單獨滅菌，條件為114～118℃ 15～25min。
將長好的種子按照2％的接種量接入到5L發酵罐中，發酵初始通風量為0.4v/v-min(單位體積培養基每分鐘通氣量)，轉速為200rpm。在發酵過程中，通過流加氫氧化鈉維持發酵液pH為5.6。以多次少量法(按30g/次補加4次)補加50％葡萄糖以維持發酵液中葡萄糖含量為2％，同時加入聚醚類消泡劑以控制發酵液的泡沫水平。隨著發酵的進行，不斷提高通風量和攪拌轉速以維持發酵液中溶解氧水平在10～20％；最高通風量達到1.2v/v-min，最高轉速達到600rpm。在28-30℃下，發酵142h，共消耗葡萄糖80g/L。納他霉素產量達到4.8g/L。
取2.5L上述發酵液，在3500rpm轉速下，離心20min，獲得納他霉素和菌絲體固體混合物。加入1.25L甲醇，用氫氧化鈉調節pH到10.5，使納他霉素完全溶解；之后離心除去菌絲體，再用鹽酸調節pH到7，在45℃下薄膜蒸發除去甲醇；離心；-50℃真空冷凍干燥。獲得10.2g納他霉素；純度達到82％。
實施例2生產菌株在瓊脂斜面上生長8天后，經4℃冰箱保藏15天后使用，發酵過程中控制pH為6，發酵過程控制溶氧水平20-30％，發酵111h，共消耗葡萄糖72g/L，最終納他霉素產量達到4.0g/L。提取中，發酵液濃縮采用蒸發法，22℃真空蒸發法除去甲醇，加酸調pH到6.5以沉淀溶解的納他霉素，其它按實施例1中所述進行。獲得納他霉素沉淀的純度達到81％。
實施例3發酵罐為200L，裝液量為130L，種子培養為二級培養。二級種子在50L種子罐中進行，培養過程中恒定通氣0.5v/v-min，恒定攪拌速度，培養21h。其它同實施例1，發酵168h，共消耗葡萄糖18kg。納他霉素產量為5.4g/L，獲得的納他霉素純度達到85％。
實施例4-7為任意濃度(＜4g/L)的納他霉素發酵液提取例實施例4取3L含有2.8g/L納他霉素的發酵液，采用薄膜蒸發除去V/2的水后；加入1.5L甲醇，后用20％的氫氧化鈉調pH值到10；然后在3500rpm轉速下離心20min，除去菌絲體，得到上清液；之后用鹽酸調pH到7.0，在35℃下薄膜蒸發除去甲醇；后再在3500rpm轉速下離心20min；用蒸餾水洗滌沉淀3次后，-50℃冷凍干燥，獲得6.66g納他霉素。用HPLC檢測純度為85.1％。
實施例5方法同實施例4，不同之處在于用氫氧化鈉調pH為10.5，最后獲得了8.76g納他霉素，純度為82.1％。
實施例6方法同實施例4，不同之處在于用氫氧化鈉調pH為11，37℃自然蒸發除去甲醇，最后獲得了5.96g納他霉素，純度為84.4％。
實施例7取180mL含有1.86g/L的發酵液旋轉蒸發除去V/2的水后加入V/2的甲醇，調節pH到10.5，離心除去菌絲體，用活性炭處理上清液后過濾除去活性炭，調節pH到7.5，65℃薄膜蒸發除去甲醇，離心獲得沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀3次，真空干燥獲得0.3g納他霉素，純度達到91.5％。
權利要求
1.納他霉素的制備方法，其特征是發酵法生產納他霉素，采用褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，經孢子懸浮液的制備、種子培養、發酵、提取工序；通過控制pH值和溶解氧水平，以及在發酵期間分批次流加葡萄糖進行生產納他霉素，并采用低溫蒸發法去除甲醇提取納他霉素；具體步驟包括如下(一)制備納他霉素發酵液●孢子懸浮液的制備生產菌種為褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，其原始菌種是從美國典型培養物收集中心處獲得，其保藏號為ATCC 13326，通過DES和UV誘變，篩選高產菌株，將該生產菌株在瓊脂斜面上生長4-8天后，4℃保藏待用；其中，制作孢子懸浮液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養基，滅菌條件為121℃，滅菌15～25min，孢子濃度選擇為108個/mL；●種子培養將上述制備好的孢子懸浮液加入到含碳源、氮源、無機離子和微量元素組成的種子培養基中，滅菌條件為120～125℃，滅菌15～25min；在搖床上200rpm轉速下，28～30℃培養20～28h，在培養過程中不需要攪拌和通氣，即可得到適合接種的種子培養物；●發酵生產納他霉素將長好的種子接入到經滅菌的含有大豆蛋白胨、酵母粉和葡萄糖的發酵培養基中，按2％的體積比接種，在發酵過程中，需要流加消泡劑控制泡沫，同時還需不斷分批流加50％的葡萄糖溶液，并通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶解氧水平在10～30％，pH5.5～6.0，發酵96～168h后即可得到含4.0～5.6g/L納他霉素的發酵液；(二)從發酵液中提取納他霉素該步驟包括濃縮發酵液；加入甲醇，升高pH；去除菌絲體；再降低pH，蒸發甲醇；回收沉淀、進行干燥得到納他霉素固體；其具體方法是●濃縮發酵液任選一種濃縮液體的方法均可，如蒸發、過濾、離心或離心過濾法；采用蒸發法濃縮發酵液時，使發酵液濃縮到原體積的1/2以下；采用過濾法濃縮發酵液時，其濾布孔徑不應太大，盡量減少發酵液中的懸浮物透過濾布；采用重力離心處理時，檢測離心上清液中納他霉素的含量，選擇一個合適的轉速使發酵液中的懸浮物離心下來；采用離心過濾法處理時，可將離心和過濾結合起來，在離心的過程中，同時完成過濾；●加入甲醇、升高pH向上述濃縮的發酵液中加入甲醇，并加堿調節pH到10～11，使濃縮液中的納他霉素完全溶解；●去除菌絲體采用重力離心、過濾或離心過濾法除去菌絲體；●降低pH、蒸發除甲醇加酸調節pH到6.5～7.5，使溶解的納他霉素部分沉淀下來；為保持納他霉素的活性，采用低溫蒸發去除甲醇，降低納他霉素的溶解度，加速納他霉素的沉淀；●固液分離和干燥。將上述結晶的納他霉素，任選一種固液分離的方法，如過濾或離心得到沉淀，再經水多次洗滌，使獲得的固體顏色成為白色或者通過以上的方法再次對獲得的納他霉素進行重結晶，或用活性炭脫色處理，提高納他霉素的純度，最后干燥，其方法如常溫干燥、真空干燥、噴霧干燥或真空冷凍干燥等，即得到純度不小于80％的納他霉素。
2.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是在孢子懸浮液制備時，新長好的瓊脂斜面孢子需經4℃冰箱保藏5～15天后使用。
3.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是發酵培養基滅菌時采取大豆蛋白胨和酵母粉一起滅菌，條件為120～125℃，15～25min；葡萄糖單獨滅菌，條件為114～118℃，15～25min。
4.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是在發酵過程中，所加消泡劑為聚醚類。
5.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是在發酵過程中，采取多次少量的補料方式，分批次流加50％的葡萄糖溶液以維持葡萄糖濃度在2％水平。
6.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是提取液為任意濃度的納他霉素發酵液。
7.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是發酵液濃縮之后所加甲醇量為濃縮前發酵液體積的1/2。
8.按照權利要求1所述的納他霉素的制備方法，其特征是采用低溫蒸發法去除甲醇，即采用自然揮發，加熱蒸發、真空蒸發或薄膜蒸發將處理液中的甲醇除去，其蒸發溫度控制在20～80℃。
9.按照權利要求1或8所述的納他霉素的制備方法，其特征是低溫蒸發法采用低溫真空蒸發法，其蒸發溫度控制在35～45℃。
全文摘要
納他霉素的制備方法屬于以褐黃孢鏈霉菌為菌種，發酵法生產、提取納他霉素的技術。本發明解決了生產納他霉素使用國外培養基、在國內難以買到、并且價格較高及從發酵液提取納他霉素工藝復雜、費用昂貴或有副產物的問題。提供了制備、提取納他霉素的新工藝技術。其技術方案是采用褐黃孢鏈霉菌，經孢子懸浮液的制備、種子培養、發酵、提取工序；通過控制pH值和溶解氧水平，及在發酵期間分批次流加葡萄糖的方式制備納他霉素，提高其產量并采用低溫蒸發去除甲醇法提取納他霉素。本發明工藝簡單、經濟、實用、提高了納他霉素的產量和純度、降低了生產成本，促進其生產的工業化進程。為納他霉素的廣泛應用提供了先決條件。既有經濟效益又有社會效益。
文檔編號C12P19/62GK1515678SQ0314413
公開日2004年7月28日 申請日期2003年8月25日 優先權日2003年8月25日
發明者杜連祥, 王敏, 路福平, 王建玲, 鄔建國 申請人:天津科技大學