專利名稱：利用酵母細胞不對稱合成d－(－)－扁桃酸系列化合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及(D)-(-)-扁桃酸系列化合物的生物不對稱合成。
背景技術：
扁桃酸(Mandelic acid)又稱α-羥基苯乙酸，α位碳原子具有手性特性。按照Prelog規則，(D)-(-)-扁桃酸也被稱為(R)-(-)-扁桃酸。扁桃酸系列化合物為重要的藥物中間體，用于合成常用藥物，如血管擴張藥環扁桃酯(Cyclandelate)、消炎藥物扁桃酸烏洛托品、鎮痙藥物扁桃酸芐酯、尿失禁的治療藥物奧昔布寧(Oxybutynin)等。國內外市場上奧昔布寧、環扁桃酯等藥物目前均為消旋對映體混合物。
目前國內外主要采用化學方法合成扁桃酸，產物為外消旋體。單一構型的扁桃酸是通過化學拆分方法制備的。扁桃酸系列衍生物的化學拆分多采用奎寧、(+)-苯異丙或(L)-酪氨酸甲酯為拆分劑。這些拆分劑價格較昂貴，而且拆分過程選擇性不高，需要多次重復操作才可得到較純的單一對映體，生產成本較高。
手性化合物的生產過程中，生物轉化是最具競爭力的手段之一。與化學方法相比，生物催化具有高效、專一、條件溫和等顯著的優點。國外從20世紀80年代開始研究扁桃酸的生物合成技術。生物合成包括酶催化和細胞催化兩種技術路線。
1983年，日本采用葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranium)完整細胞進行苯乙酮酸鈉的生物不對稱還原，產物為(D)-(-)-扁桃酸。
1983年，英國Hills C A等人發現可以(L)-(+)-扁桃酸為唯一碳源和能源的乙酸鈣不動桿菌(Actinetobacter calcoceticus)，培養出可生產L型和D型扁桃酸脫氫酶的突變株EBF65/65，并對兩種酶進行鑒定和基本特性的研究。
1986年，日本的Yamazaki Yoshimitsu等人從糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)中提取到的苯甲酰甲酸鹽還原酶，用于光學純(D)-(-)-扁桃酸和其他2-羥基羧酸的酶合成。同年，Yamazaki采用超濾膜反應器利用上述的酶實現(D)-(-)-扁桃酸的連續制備。
1989年，德國采用從彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus curvatus)中提取到的(D)-(-)-扁桃酸脫氫酶，將苯乙酮酸還原成(D)-(-)-扁桃酸。
1992年，英國的Basak等人對于從酵母菌(Rhodotorula graminis)中獲得的D型和L型扁桃酸脫氫酶進行結構研究，測定了D型脫氫酶的3D結構。
1993年，英國愛丁堡大學化學系的Stephen確定了D型和L型扁桃酸脫氫酶的結構，并進行克隆，在E.coli中表達，發現該酶與乳酸脫氫酶、甲酸鹽脫氫酶的基因序列極度相似，并重組該酶，進行重組酶特性研究。
本發明所涉及的(D)-(-)-扁桃酸系列化合物指化合物(2)，α位上的醇基具有(D)-(-)光學特性，取代基R1-6可為H、烷基或其他取代基。化合物(2)中的R1-6均為H時，即是扁桃酸；化合物(2)中的R1-5均為H，R6為CH3時，即是扁桃酸甲酯。
本發明所涉及的苯乙酮酸系列化合物指化合物(1)。它是含有α-酮基的羧酸(或酯)的潛手性化合物。化合物(1)中的R1-6可為H、烷基或其他取代基。生物催化合成過程的作用位點是潛手性化合物的α-酮基。α-酮基被還原后，生成手性醇酸(或酯)化合物。
酶具有復雜的三維立體結構，生物轉化過程具有很高的選擇性(包括光學選擇性)。采用合適的氧化還原酶可實現目標反應。游離的氧化還原酶的催化過程需消耗輔酶NADH。輔酶NADH價格昂貴。由于NADH尚未能實現大規模生產的催化循環，酶催化技術路線存在制約因素。
采用細胞轉化技術路線，要成功地實現(D)-(-)-扁桃酸系列化合物的生物合成，其必要前提是篩選出具有對α位酮基高度光學選擇性催化還原酶的微生物菌株；其充分條件是控制合適的工藝條件，使微生物體內的氧化還原酶充分表達活性，同時利用活細胞體內代謝系統，使NADH→NAD循環暢通。目前尚無采用生物轉化技術大規模生產單一對映體扁桃酸的報道。
(L)-(+)和(D)-(-)扁桃酸及其他扁桃酸系列化合物可用高效液相色譜儀(HPLC)或毛細管電泳儀(CE)進行拆分，并進行定量分析。

發明內容
本發明的目的是應用酵母細胞來制備具有單一旋光性質的(D)-(-)-扁桃酸系列化合物。為實現上述目的，本發明所采取的技術方案如下(1)菌種的篩選與馴化從不同種類的酵母屬酵母菌中篩選對苯甲酰甲酸系列化合物中的酮基具有高度光學選擇性氧化還原酶的面包酵母菌株FD1(為Saccharomyces cerevisiae，又稱釀酒酵母)。以FD1為出發菌株，經紫外誘變和高濃度底物馴化，進一步篩選得到(D)-(-)-扁桃酸產率高的菌株FD101，進行保存。
(2)種子培養取保存菌種，接種于含有葡萄糖、蛋白胨和無機鹽的種子培養基中，28-35℃，300rpm搖瓶培養，培養8-12h后，作為種子液備用。
(3)游離酵母細胞的生物轉化將種子液接種于含有葡萄糖或蔗糖、以及其它無機鹽的生產培養基中，接種量5-20％，28-35℃，好氧培養。接種后5-20h，加入潛手性化合物苯甲酰甲酸系列化合物，使終濃度達10-150mmol/L。在恒定溫度(28-35℃)、恒定pH(5.0-7.5)和厭氧條件下進行游離酵母細胞的生物還原反應。48-72h后，潛手性底物的轉化率達90％以上、產物扁桃酸中(D)-(-)-扁桃酸達95％以上。
(4)固定化酵母細胞的生物轉化取保存菌種，接種于種子培養基中，擴培后，離心得菌泥。采用海藻酸鈉法制備固定化酵母細胞顆粒。
將所制備的固定化細胞顆粒填充于柱形反應器或槽式反應器中。用泵連續進料，將反應物(生產培養基+苯甲酰甲酸系列化合物10-150mmol/L)連續泵入反應器，在厭氧條件下實現手性扁桃酸系列化合物的連續生物轉化。水力停留時間為24-72h時，潛手性底物的轉化率達90％以上、產物扁桃酸中(D)-(-)-扁桃酸達95％以上。
采用本項技術，以游離酵母細胞或固定化酵母細胞一步生物轉化制備(D)-(-)-扁桃酸，潛手性底物的轉化率可達90％以上，副產物少，目標產物(D)-(-)-扁桃酸占總扁桃酸的95％以上，可簡化后續的拆分分離步驟。
具體實施例方式
實施例1酵母細胞的篩選配制種子培養基，滅菌后備用。
種子培養基組成(g/L)蛋白胨5，葡萄糖30，K2HPO41，MgSO4·7H2O0.5，KCl 0.5，Fe2(SO4)30.01，自然pH。
配制生產培養基，滅菌后備用。
生產培養基組成(g/L)葡萄糖或蔗糖30，(NH4)2SO45，K2HPO42，CaCO31，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，Fe2(SO4)30.01，ZnSO40.01。
將斜面培養基上的各種酵母菌種分別轉接到種子培養基中，30℃培養8h的培養物作為種子液。取2ml種子液接種到25ml的生產培養基中(50ml的錐形瓶)，培養10h后加入底物(分別為苯乙酮酸或苯乙酮酸乙酯)，使底物終濃度為10mmol/L，30℃厭氧振蕩培養。反應結束后取出培養液，離心(10000rpm，10min)，取上清液進行高效液相色譜分析，測定產物濃度。
表1 酵母篩選實驗結果序號扁桃酸甲酯得率(％)扁桃酸得率(％)旋光性FD180.93 70.13 左旋FD234.55 3.33 左旋FD369.47 30.30 左旋FD445.27 3.36 左旋FD536.41 28.23 左旋FD621.57 19.95 右旋FD73.51 10.95 左旋FD867.90 42.34 左旋FD973.25 44.86 左旋FD1021.87 29.91 左旋FD1133.27 22.80 左旋FD1244.69 18.80 左旋FD132.23 3.42 左旋對菌株FD1進行進一步的紫外誘變和高濃度底物的馴化，經篩選得到4株耐較高濃度底物的菌株。其中FD101菌株生物還原速度快，產物得率最高，D構型產物含量也最高。
表2四種酵母還原苯乙酮酸的實驗結果D構型產物菌種 培養時間(h) 產物得率(％)含量(％)FD10148 90.8397.75FD10248 29.0595.07FD10348 49.7794.07FD10448 57.4992.63表3四種酵母還原苯乙酮酸乙酯的結果D構型產物菌種 培養時間(h)產物得率(％)含量(％)FD10148 92.11 95.60FD10248 83.02 93.52FD10348 82.82 91.64FD10448 87.32 94.45實施例2游離酵母細胞在全混批式反應器系統中制備(D)-(-)-扁桃酸按實施例1方法配制種子培養基和生產培養基。取甘油管保存菌種FD101，接種于種子培養基中，培養10小時，OD值達2.0以上，作為種子液，5℃保存使用。
將種子液20ml接種于生產培養基(100ml)中，好氧條件下，30℃培養。通過流加2mol/L NaOH維持pH恒定(pH6.5)。培養8h后，細胞濃度OD值達到2.5以上，加入潛手性底物苯甲酰甲酸，終濃度為10mmol/L。繼續厭氧培養40h后，全混批式反應系統中底物苯甲酰甲酸濃度下降至0.2mmol/L以下，底物轉化率大于98％。毛細管電泳分析表明，目標產物(D)-(-)-扁桃酸含量95.0％，(L)-(+)-扁桃酸含量5.0％。未觀察到明顯的其他副產物。
實施例3游離酵母細胞在全混批式反應器系統中制備(D)-(-)-扁桃酸乙酯按實施例1方法配制種子培養基和生產培養基。制備FD101的種子培養液。
將培養的種子液按10％(v/v)接種于生產培養基中。搖瓶培養8h，酵母大量繁殖，OD達2.5。加入溶于乙醇的苯甲酰甲酸乙酯溶液，苯甲酰甲酸乙酯終濃度為10mmol/L。厭氧條件下，恒pH(6.5)，恒溫(32℃)培養。培養50h后，培養液中底物(苯甲酰甲酸乙酯)濃度下降至0.95mmol/L。產物扁桃酸乙酯中(D)-(-)-扁桃酸乙酯含量達90％以上，(L)-(+)-扁桃酸乙酯含量小于10％。反應過程中約10％的扁桃酸乙酯水解成為扁桃酸。
實施例4固定化酵母細胞在連續攪拌釜式反應器(CSTR反應器)中制備(D)-(-)-扁桃酸按實施例2的方法，將FD101菌種接于種子培養基中，32℃培養10小時，離心得酵母菌泥。稱取濕菌體50克，加入到50ml濃度為40g/L，40℃的海藻酸鈉水溶液中，迅速混勻。用針筒逐滴注入到濃度為5％的氯化鈣溶液中，得到粒徑1-2mm的顆粒，在5-10℃溫度條件下固化24h，備用。
采用CSTR反應器，裝液量300ml，底物(生產培養基加苯甲酰甲酸20mmol/L)連續恒量加入，物料水力停留時間48h，反應溫度32℃，pH6.5，底物轉化率達90％以上，(D)-(-)-扁桃酸含量占總扁桃酸95％以上。連續運行25天，未觀察到細胞活性衰退現象。
實施例5固定化酵母細胞在填充床式反應器系統中制備(D)-(-)-扁桃酸乙酯按實施例4方法制備固定化酵母細胞顆粒。填充床反應器Φ34×1100mm，底部裝有進料分布裝置，固定化細胞顆粒裝填高度800mm。反應物料(生產培養基+苯甲酰甲酸乙酯30mmol/L)從底部流入，從頂部流出。pH6.5，32℃，底物停留時間48h的條件下，底物轉化率大于90％以上，目標產物(D)-(-)-扁桃酸乙酯含量占總扁桃酸乙酯95％以上。反應過程中約10％的扁桃酸乙酯水解成為扁桃酸。連續20天運行，未觀察到細胞活性衰退現象。
權利要求
1.利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，包括菌種的篩選與馴化、種子培養、生物轉化等幾個步驟，其特征在于(1)采用苯乙酮酸系列化合物為底物；(2)采用酵母菌為生物轉化菌種，該酵母菌可為游離細胞或固定化細胞；(3)游離酵母細胞的生物轉化過程中，菌體生長階段需好氧培養；加入苯乙酮酸系列化合物后，生物還原反應要求在厭氧條件下進行；(4)固定化酵母細胞的生物轉化過程在厭氧條件下進行。
2.如權利要求1所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物的通式為 其中R1-6可為H、烷基或其他取代基。
3.如權利要求2所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物為苯乙酮酸。
4.如權利要求2所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物為苯乙酮酸甲酯。
5.如權利要求2所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物為苯乙酮酸乙酯。
6.如權利要求1所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母細胞為酵母屬酵母菌。
7.如權利要求6所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母屬酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也稱為面包酵母。
8.如權利要求7所述的利用酵母細胞不對稱合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母菌為FD101。
全文摘要
利用酵母細胞不對稱合成D－(－)－扁桃酸系列化合物，涉及D－(－)－扁桃酸系列化合物的生物不對稱合成。本發明篩選出具有對α位酮基高度光學選擇性催化還原酶的面包酵母菌株FD
文檔編號C12P7/42GK1580270SQ03144058
公開日2005年2月16日 申請日期2003年7月30日 優先權日2003年7月30日
發明者郭養浩, 孟春, 石賢愛 申請人:福州大學