專利名稱：檢測系統的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種用于檢測樣品中的靶多核苷酸的方法，例如，通過監測擴增反應，優選以定量方式監測，還涉及用于所述方法的試劑盒。所述方法還適用于檢測序列特征，如多態性或等位變異，因此可用于診斷方法。
已知的熒光聚合酶鏈式反應(PCR)監測技術包括鏈特異性和一般性DNA嵌入技術，所述技術可用在少數幾種第二代PCR熱循環裝置上。
一般性熒光PCR方法使用DNA嵌入染料，所述染料在與雙鏈DNA結合時具有增強了的熒光。在擴增期間，由于DNA的總濃度提高而導致的熒光的增強，可用于衡量反應的進展，并用于確定起始靶分子拷貝數。另外，通過監測熒光隨著溫度的受控制的改變而發生的變化，可以制備DNA解鏈曲線，例如，在PCR熱循環結束時進行。
所述一般性熒光PCR方法能監測核酸總濃度的提高，而沒有任何時間補償。可以在每一次反應的相同的時間點上采集一個熒光讀數。終點解鏈曲線分析可用于從擴增子中辨別偽跡，并且用于辨別擴增子。可以在不能通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到的濃度下看到產物的峰。
業已發現，DNA解鏈曲線分析一般來說是優化PCR熱循環的有效工具。通過確定擴增子的解鏈溫度，可以在隨后的PCR循環中將變性溫度降低到所確定的解鏈溫度。優化來自第一代反應產物而不是基因組DNA的擴增，減少了在隨后循環中出現的偽跡的形成。引物寡核苷酸及其互補體的解鏈溫度可用于確定它們的退火溫度，減少對經驗優化的需要。
不過，所述一般性嵌入方法只是準鏈特異性的，因此，不太適用于需要鏈特異性檢測的場合。
熒光PCR鏈特異性方法使用其他核酸反應成分監測擴增反應的進程。所述方法可以使用熒光能量轉移(FET)作為檢測的基礎。通過熒光分子標記一種或多種核酸探針，所述探針之一能夠起著能量供體的作用，而另一個是能量受體分子。有時候，上述分子分別被稱為報導分子和淬滅分子。所述供體分子用特殊波長的光線激發，在這種波長下，它通常會表現出熒光發射波長。所述受體分子是在所述發射波長下激發的，以便它能夠通過多種距離依賴性能量轉移機制接收所述供體分子的發射能量。可以發生熒光能量轉移的一種具體例子是熒光共振能量轉移或“FRET”。一般，當受體分子靠近供體分子(例如，在相同或相鄰分子上)時，受體分子接收供體分子的發射能量。FET或FRET檢測的基礎，是監測在供體反射波長下的變化。當所述受體同樣是熒光分子時，還可以監測受體發射波長。
存在兩種常用類型的FET或FRET探針，利用核酸探針的水解分離供體和受體的類型，以及利用雜交改變供體和受體分子的空間關系的類型。
水解探針是作為TaqManTM探針出售的。它包括DNA寡核苷酸，它是用供體和受體分子標記過的。將所述探針設計成與PCR產物的一條鏈上的特定區域結合。在PCR產物與該鏈退火之后，Taq酶通過5’→3’聚合酶活性延伸所述DNA。Taq酶還具有5’→3’外切核酸酶活性。TaqManTM探針的3’末端是通過磷酸化進行保護的，以防止它們啟動Taq延伸。如果TaqManTM探針與所述產物鏈雜交的話，延伸的Taq分子也能夠水解所述探針，從受體釋放所述供體，作為檢測的基礎。這種例子中的信號是累積性的，游離供體和受體分子的濃度隨著擴增反應的每一次循環而提高。
信號的產生取決于探針水解反應的出現這一事實，意味著存在與該方法相關的時間補償。另外，探針的存在可能打斷PCR過程的順利進行。
另外，業已發現，水解可能是非特異性的，特別是在需要大量的擴增循環，例如超過50次循環的場合更是如此。在這種情況下，探針的非特異性水解會導致過分加強的信號。
這意味著所述技術與快速PCR方法不是非常兼容，隨著快速熱空氣熱循環儀，如由Idaho Technologies Inc.所提供的RapidCyclerTM和LightCyclerTM的開發，這一問題變得更為突出。例如，其他快速PCR裝置用于共同未決的英國專利號2334904中。與常規熱循環相比，快速循環的優點業已在其他文獻中報導過。例如，所述技術特別適用于用于生物學競爭的檢測系統，其中，如果要避免生命損失或嚴重損傷的話，獲得結果的速度是重要的。
另外，水解探針不能提供有關解鏈滯后現象的大量信息，因為信號產生是通過，并且在很大程度上取決于探針的水解，而不是擴增子或探針的解鏈溫度。
雜交探針是以多種形式提供的。分子信號是具有互補的5’和3’序列的寡核苷酸，以便它們形成發卡環。在形成發卡結構時，末端熒光標記是非常接近的，以便發生FRET。在分子信號與互補序列雜交之后，分離熒光標記，以便不發生FRET，并且它構成了檢測的基礎。
還可以使用成對的標記寡核苷酸。它們在PCR產物鏈上的非常接近的部位雜交，將供體和受體分子聚在一起，以便可以發生FRET。增強的FRET是檢測的基礎。這種類型的變化形式包括使用具有單一相鄰探針的標記過的擴增引物。
兩種探針或包括兩種標記分子的分子信號類型的探針的使用，提高了相關方法的成本。另外，正如所公知的，該方法需要存在合理長度的已知序列，以便足夠長的兩個探針在非常接近的部位彼此特異性結合。這可能是某些診斷用途的問題，其中，一種生物體中的可用于設計有效探針的保守序列的長度可能相對短，如HIV病毒。
另外，成對的探針的使用涉及更復雜的實驗設計。例如，由探針解鏈所提供的信號受兩種探針解鏈的影響。小的錯配的研究或需要探針之一以跨剪接區結合的場合(例如，檢測樣品中與DNA相比的RNA，其中，位于內含子任一側的序列可以用作檢測位點)，如果另一個探針首先解鏈的話，可能產生不正確的結果。
共同未決的國際申請號WO99/28500披露了一種用于檢測特定靶核酸序列存在的方法，該方法包括a)將一種對所述序列特異的探針添加到所述樣品中，所述探針具有能夠給DNA雙鏈體結合試劑提供熒光或吸收來自它的熒光能量的部分，b)使所述混合物進行擴增反應，c)讓所述探針與所述靶序列雜交，并且檢測來自所述樣品的熒光。然后可以通過檢測所述樣品熒光的改變監測所述反應，因為在所述反應過程中熒光會發生改變，因為產生了更多的產物，所述產物能夠與所述探針雜交，并且產生DNA雙鏈體結合試劑和探針上的熒光部分之間FET或FRET相互作用。
共同未決的國際專利申請號PCT GB99/00504披露了一種用于檢測特定核酸序列存在的類似分析方法，該方法適用于對樣品中的靶序列的數量進行定量。在該分析中，擴增反應是使用一套核苷酸實現的，其中的至少一種核苷酸是熒光標記的。因此，在所述擴增產物中摻入了熒光標記。所述反應是在存在一種探針的條件下進行的，所述探針能與擴增產物雜交，并且，它包括能夠吸收來自所述熒光標記過的核苷酸的熒光或向所述核苷酸提供熒光能量的反應性分子。然后通過檢測所述樣品的熒光監測該反應，因為在反應過程中，隨著更多產物的形成，熒光會發生改變，所述產物能與所述探針雜交，并且在它們之間產生FET或FRET相互作用。
國際專利申請號WO01/11078披露了用于檢測樣品中靶核酸序列存在的另一種相關的方法。在本方法中，在第一階段，使所述靶序列成為單鏈形式，以便試劑的引物區能與它雜交。因此，它能啟動所述鏈的延伸，以便制備互補鏈，該互補鏈包括標記過的核苷酸，并且還具有它的5’末端上游的標記過的探針區，它與產物的下游區互補。所述延伸階段一旦結束，在解鏈階段，所述產物與它的模板鏈分離，以便成為單鏈形式。在這種形式下，標記過的探針區能夠纏繞在產物鏈的互補區上，并且與它雜交，以便所述標記能夠通過FET或FRET向另一標記提供熒光能量(供體)，因此改變了來自所述樣品的熒光。在所述反應過程中監測這種信號的改變，以便監測擴增反應的進程。
包括使用Scorpion探針系統的分析方法披露于以下文獻中GB2338301，和Nucleic Acids Research，2000，vol.28，no.19，3752-3761。所述Scorpion探針系統包括一個通過連接部分連接在探針部分上的引物部分。所述探針系統包括供體和受體部分。在該分析方法中，在第一階段，使靶序列成為單鏈形式，以便所述引物部分能夠與所述靶序列雜交。因此，可由此啟動所述鏈的延伸，以便產生一個互補鏈，該互補鏈具有它的5’末端上游的探針部分，該部分與產物的下游區互補。所述延伸階段一旦結束，在解鏈階段，所述產物與它的模板鏈分離，并因此成為單鏈形式。在這種形式下，所述標記過的探針區能夠纏繞在所述產物鏈的互補區上并且與它雜交。所述探針部分與所述產物的互補區的雜交，改變了供體和受體部分之間的空間關系，并因此改變了來自所述樣品的熒光信號。
本申請人業已發現了另一個改進的測定方法。
本發明提供了一種用于檢測靶核酸序列在樣品中的存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進行核酸擴增(a)DNA雙鏈體結合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學連接基團與具有標記的探針連接，所述標記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴增產物上的互補區雜交，并且，其中，所述標記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結合試劑的熒光能量或為所述DNA雙鏈體結合試劑提供熒光能量；以及監測所述樣品的熒光。
與WO01/11078中的現有測定方法相比，本發明更便宜和簡單，而且效果出奇的好。在本發明中，以非結合狀態將DNA雙鏈體結合試劑添加到反應混合物中，沒有必要結合在WO01/11078中的核苷酸上，或結合在GB2338301中的探針系統上。
在本發明的測定方法中，在第一階段，使靶序列成為單鏈形式，以便所述試劑的引物部分能夠與它雜交。這樣能夠啟動所述鏈的延伸，以便產生一條互補鏈。所述引物鏈也將具有在它的5’末端的上游的標記過的探針區，該探針區與所述產物的下游區互補。DNA雙鏈體結合材料(優選嵌入染料)將會夾帶在由此形成的雙鏈中。一旦延伸階段結束，所述產物就在解鏈階段與它的模板鏈分離，并因此形成單鏈形式。在這種形式下，標記過的探針區能夠纏繞在產物鏈的互補區，并且與它雜交，因此將DNA雙鏈體結合試劑夾雜在產物鏈的探針區和互補區之間。由于DNA雙鏈體結合試劑和探針標記相互靠近，所述熒光部分能夠通過FET或FRET向受體部分提供熒光能量(供體)，因此改變來自所述樣品的熒光信號。可以在反應過程中監測到這種信號變化，以便監測擴增反應的進程。
在擴增的第二和隨后階段，所述產物鏈本身起著用于延伸的模板鏈的作用。不過，探針和引物之間的化學鍵能在與所述探針互補的序列產生之前終止延伸反應。因此，所述探針區保持單鏈形式。
本發明的方法優選包括(a)向被懷疑含有靶核酸序列的樣品中添加DNA雙鏈體結合試劑，核酸聚合酶和試劑；(b)使所述樣品處于引物與靶核酸序列雜交，并且形成包括所述探針的擴增產物的條件；
(c)使所述樣品處于標記過的探針與所述擴增產物上的互補區雜交的條件；和(d)在步驟(b)和(c)中的至少一個中監測所述樣品的熒光。
如果需要，在擴增反應期間還可以存在沒有與標記過的探針區結合的相應的擴增引物。該引物會導致常規未標記過的擴增產物的產生，該產物可用于介導信號進入所使用的檢測器裝置的動態范圍。它還可以改善有可能因為復合的探針/引物結構的存在而受到不利影響的反應效率。
當能夠從供體標記中吸收熒光的受體標記發揮這種作用時，來自所述供體的熒光減弱。可以檢測這種減弱，并且它表明了所述探針區的結合。
最優選所述能吸收熒光的標記(受體)本身是熒光分子，它能在特征性波長下發射熒光。所述探針包括羅丹明染料或Cy5。在這種場合下，來自受體分子的熒光(它的波長與供體標記的波長不同)的增強，也表明了探針的結合。另外，所述受體不能發出熒光(暗受體)。這樣的受體包括DABCYL，甲基紅，QSY-7二芳基羅丹明染料和6-(二甲基氨基)-2-[4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，3-丁間二烯基-1-乙基喹啉鎓高氯酸鹽(CAS號181885-68-7)。
所述DNA雙鏈體結合試劑優選包括一種供體標記，并且所述受體標記提供在所述探針上。在這種情況下，并且如果受體發出熒光的話，所述標記過的擴增產物的存在就可以通過監測由探針上的受體分子發出的熒光而進行檢測，所述探針主要結合在相同產物鏈的下游區。在這種情況下，可以分辨來自擴增產物的信號和熒光標記的本底信號，以及來自任何非特異性擴增產物的信號。另外，所述DNA雙鏈體結合試劑可以包括一種受體標記，而所述探針包括所述供體標記。
在本發明的系統中，可以區別總體嵌入劑信號(如在擴增DNA時)和序列特異性信號的增強，所述信號特異性信號僅在兩種熒光部分緊密靠近時(即當探針與擴增產物雜交時)產生。所述序列特異性信號只能通過標記過的擴增產物產生這一事實表明，該系統在檢測含有大量本底DNA的反應混合物中的特異性靶序列方面是高度特異的。這是因為非特異性擴增產物不能與探針區雜交，并因此不能產生所述檢測信號。除了所述序列特異性信號之外，一般的嵌入劑信號的測定可以是有利的。一般的嵌入劑信號與反應混合物中的擴增程度成正比，因此可用于表明擴增的效力或阻斷。
可以用廉價試劑進行這種性質的測定。單一的標記探針比包括受體和供體分子的探針更經濟。
擴增優選是用已知擴增反應進行的，如聚合酶鏈式反應(PCR)或連接酶鏈式反應(LCR)，鏈置換測定(SDA)或NASBA，不過優選PCR。
監測供體和受體部分的熒光，并且計算它們的發射之間的關系。
所述標記在探針上的位置是不重要的，不過它通常位于探針的末端區。在所述試劑中可以使用一種以上標記，不過優選一種標記，因為更經濟一些。
為了進行FET，如FRET，所述供體部分的熒光發射的波長必須短于受體部分的波長。
因此，在下面的表1中列舉了合適的組合
*由Molecular Probes，UK提供。
本領域技術人員可以理解的是，很多其他類似的組合是可能的。
被用作供體和/或受體的分子，優選能產生尖銳的發射峰，并且在發射的波長上少有或沒有重疊。在這種條件下，可能不需要從通過擴增產物產生的信號中分辨“鏈特異性峰”。只是簡單地測定鏈特異性信號(即由受體部分提供的信號)，就能夠提供有關通過所述靶反應導致的FET或FRET的程度的信息。
不過，來自供體和受體部分的熒光信號存在光譜的重疊，在所述結果中證明了這一點，例如，通過憑經驗確定所述光譜之間的關系，并且利用這種關系對來自兩種信號的信號進行標準化。
將所述標記過的探針與引物分開的化學鍵優選是任何能連接核苷酸序列的分子，不過所述核苷酸序列不能被DNA聚合酶識別。可以獲得多種能滿足這種要求的化學接頭。
例如，在WO 95/08642中披露了可用于形成接頭的化合物和反應的類型的例子。具體地講，所述化學接頭包括將兩個多核苷酸序列、引物和探針連接在一起的一組原子。所述接頭可以通過任何常規方法連接相應的多核苷酸序列。
一般來說，所述接頭來自具有第一和第二官能團的有機化學物質，通過這種方式，它可以分別結合于探針和引物序列，或結合于各個核苷酸，然后再從核苷酸產生所述探針和引物序列。所述接頭通常被設計成不能結合核苷酸。
例如，接頭的合成詳細披露于以下文獻中S.Agrawal等，NucleicAcids Research，1986，14，6227和WO88/02004(AppliedBiosystems)；J.L.Ruth和D.E.Bergstrom，J.Org.Chem.，1978，43，2870；D.E.Bergstrom和M.K.Ogawa，J.Amer.Chem.Soc.，1978，10，8106；和C.F.Bigge，P.Kalaritis，J.R.Deck和M.P.Mertes，J.Amer.Chem.Soc.，1980，102，2033；和歐洲專利申請號063,879。有關具有連接探針和引物的化學連接基團的試劑的結構和合成的更詳細的說明，讀者還可以參見國際專利申請號WO01/11078。
具體地講，所述接頭包括多種形式的乙二醇，例如六乙二醇(HEG)。所述接頭可以具有以下結構-(CHOH-CHOH)n-，其中，n是大于1的整數，例如1-10，并且優選6。
所述包括連接探針和引物的接頭基團的試劑可以從OswelResearch Products Ltd，UK獲得。
本發明方法的用途是多種多樣的。正如在下文將要更詳細地討論的，所述方法可用于產生有關所述樣品中的靶核酸序列的定量和定性結果。更具體地講，本發明不僅提供了定量擴增，而且，作為補充或替代，它還可用于獲得特征性數據，如雙鏈脫穩定化溫度或解鏈溫度。
在本發明的方法中，所述標記過的探針與擴增引物整合，并且在擴增反應過程中一直存在。所述方法使得檢測能夠以均一的方式進行，就是說，擴增和監測可以在一個容器中進行，所有試劑都是最初添加的。不需要隨后的添加試劑的步驟。還可將本發明的方法用于某些非均一系統中。應當指出的是，沒有必要在存在固體支持物的情況下實施所述方法(盡管這也是選擇方案之一，正如下面將要進一步討論的)。
由于在整個擴增反應中都存在探針，所述熒光信號使得可以監測擴增反應的進程。這可以提供對存在于樣品中的靶序列進行定量的手段。
如果使用熒光受體部分的話，在擴增反應的每一次循環期間，含有靶序列和探針區的擴增子鏈能產生受體信號。隨著樣品中所述擴增子數量的增加，受體的信號也會增強。通過將增強速度隨循環進行作圖，可以確定所述增強的起始點。
所述標記過的探針可以包括核酸分子，如DNA或RNA，它能夠與單鏈形式的靶核酸序列雜交。在這種情況下，將使用的條件使得靶核酸序列成為單鏈形式。另外，所述探針可以包括諸如肽核酸或其他核酸類似物的分子，它還能結合雙鏈形式的靶序列。
具體地講，所使用的擴增反應包括讓所述樣品處于使樣品中所存在的所有靶核酸序列成為單鏈形式的條件，如PCR或LCR的步驟。如果滿足合適的雜交條件，在擴增反應過程中，所述探針區就能夠與含有它的擴增子鏈的下游區雜交。
在一種優選實施方案中，可以設計所述探針，以便在擴增反應的每一次循環期間滿足所述條件。因此，在擴增反應的每一次循環的某個時間點上，所述探針能與靶序列雜交，并且由于FET或FRET而產生信號。隨著擴增的進行，所述探針區將會分離或者從所述下游區解鏈，因此，由所述受體標記發生的信號，將會根據它是含有供體還是受體分子而減弱或增強。例如，當它是受體時，在擴增的每一次循環中，都產生了來自受體標記的熒光峰。隨著擴增的進行，所述峰的強度會增強，因為有更多的包括探針的擴增子鏈可以利用。
通過在每一次循環期間監測來自樣品的受體標記的熒光，可以用多種方式監測擴增反應的進程。例如，通過計算解鏈峰下面的面積，并且將該數據對循環次數作圖，可以分析由解鏈峰提供的數據。
熒光優選是用已知熒光計監測的。來自它的信號，例如，光學放大器電壓形式的信號，被傳送給數據處理器板，并且轉化成與每一個樣品試管相關的光譜。可以同時評估多個試管，例如96個試管。在反應過程中，能夠以頻繁的間隔，例如每10毫秒1次地收集數據。
例如，以這種方式產生的光譜可以使用預先選擇的諸如染料的熒光部分的″fits″進行分辨，以便形成代表每一種發出信號的部分的峰(即DNA雙鏈體結合試劑和/或探針標記)。可以確定所述峰下面的面積，該面積表示每一種信號的強度值，并且，如果必要的話，作為彼此的商數形式表示。信號強度和/或比例的差別，使得FET或FRET的變化可以通過反應或不同的反應條件，如溫度而記錄。上文所述的變化與探針和靶序列之間的結合現象相關。不同的峰下面的面積的積分，可以計算出FET或FRET作用的強度值。
以上數據提供了一種對存在于樣品中的靶核酸的量進行定量的方法。
引物/標記過的探針試劑在溶液中可以是游離的或者固定在固體支持物上，例如固定在用于分離產品的磁珠的珠表面上，或者固定在檢測器裝置的表面上，如表面等離子共振檢測器的波導管，和例如，DNA陣列。其選擇取決于要檢驗的特定陣列的性質和所采用的特定檢測方法。
可以對探針進行設計，以便它能被用于擴增反應中的DNA聚合酶水解，以便釋放受體分子。由此提供了一種累計性信號，存在于該系統中的游離探針標記的量隨著每一次循環而加強。不過，在本測定方法中，所述探針沒有必要以這種方式使用，因為所述信號不取決于所述探針的水解。
優選對所述探針進行設計，以便它能從靶序列上完整地釋放下來，并且，在擴增反應期間，如果滿足了合適的雜交條件，它能夠再次結合。例如，這可能發生在擴增反應的延伸階段。不過，由于所述信號不依賴于探針水解，可以將所述探針設計成能在擴增循環的任何階段與靶序列雜交并且從靶序列上解鏈。具體地講，優選將所述探針設計成在低于該反應的延伸溫度的溫度下雜交，因為這樣能確保對擴增反應的干擾最小。
這樣提供了一種完全可逆的信號，該信號直接與在所述反應的每一階段存在的擴增產物的數量相關。另外，當反應速度是最重要的時候是有利的，例如，在快速PCR中，因為要檢測的與擴增子鏈整合在一起的探針能夠與它快速雜交。
以這種方式產生的數據能夠以各種方式解讀。在它的最簡單的形式下，在擴增反應過程中或在擴增反應結束時受體分子熒光的增強是存在的靶序列數量增加的指標，表明擴增反應業已進行的事實，因此，所述靶序列確實存在于所述樣品中。不過，正如上文所述，還可以通過監測擴增反應的進程進行定量。最后，可以獲得表征數據，并且，特別是在解鏈溫度分析中，作為終點測定或進程測定，以便獲得有關所述序列的信號，正如下面將要進一步討論的。
因此，本發明的一種優選實施方案包括一種用于檢測核酸擴增的方法，包括在存在以下成分的條件下對靶多核苷酸進行核酸擴增(a)核酸聚合酶，(b)DNA雙鏈體結合試劑，和(c)含有擴增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學連接基團與具有第二種標記的探針連接，所述標記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴增產物上的互補區雜交，并且，其中，所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的一個包括一種供體標記，該標記能夠給所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的另一個提供熒光能量，所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的另一個包括一種能吸收來自所述供體分子的熒光能量的受體標記，所述引物能夠與所述靶多核苷酸雜交；并且在擴增過程中監測熒光的變化。
所述受體標記本身優選是熒光標記，并且能在特征性波長下發射熒光能量。所述擴增優選是用一對引物進行的，所述引物是設計過的，以便只有DNA鏈上的靶核苷酸序列被擴增，正如本領域技術人員所公知的。所述核酸聚合酶優選是熱穩定性聚合酶，如Taq聚合酶。
實施擴增反應的合適條件為本領域所熟知。在每一種情況下，最佳條件可以根據涉及到的特定擴增子、所使用的引物的性質和所使用的酶而改變。在每一種情況下，最佳條件可以由本領域技術人員來確定。典型的變性溫度為95℃的數量級，典型的退火溫度為55℃的數量級，而延伸溫度為72℃的數量級。
在本發明的一種優選實施方案中，可以用標記過的探針定量RNA轉錄物，例如，在表達實驗中，可將其用于藥物發現。具體地講，本實施方案適合在來自真核生物的組織中進行表達研究。真核細胞中編碼蛋白的DNA可以包括內含子，DNA序列的非編碼區，以及編碼蛋白序列的外顯子。在細胞“剪接”過程中，將非編碼內含子序列從源于DNA序列的RNA序列上去掉。PCR引物通常靶定編碼區，并且，在將逆轉錄酶PCR用于總核酸提取物時，產物將來自DNA依賴型擴增和RNA依賴型擴增。因此，在用于表達研究時，PCR本身包括來自基因組DNA和表達的RNA的擴增。
被設計用于跨編碼外顯子的相鄰末端區上的內顯子結合的標記過的探針因為所述內含子而具有有限的相互作用。剪接過的RNA業已除去了所述區，因為編碼外顯子的相鄰的末端區構成了一個連續序列，使得它能夠有效結合所述所述探針區。
相反，如果被設計成能結合內含子區，所述探針區只能檢測基因組DNA的擴增產物。由這樣的探針發生的信號，只與DNA濃度相關，而與樣品的RNA濃度無關。還可以使用兩種試劑，每一種試劑具有不同的探針和引物，一種試劑適用于RNA的剪接區，而另一種試劑適用于DNA中的內含子。
因此，在另一種實施方案中，所述探針區對于RNA的剪接區或DNA中的內含子是特異的，這樣，只檢測和/或定量擴增的RNA或擴增的DNA中的一種。
作為替代或補充，本發明的方法可用于確定序列特征的雜交測定。因此，在另一方面，本發明提供了一種用于確定靶核酸序列特征的方法，該方法包括(a)在存在DNA雙鏈體結合試劑和一種包括擴增引物的試劑的條件下擴增所述序列，所述引物的5’末端通過化學鍵與一種探針連接，所述探針包括相似于所述靶序列的一個區域的序列，并且它還包括一種標記，當所述DNA雙鏈體結合試劑和所述標記中的一個是供體標記，而其中的另一個是受體標記時，所述供體標記能夠向所述受體標記提供熒光能量；以便形成摻入了探針區的擴增產物，(b)讓擴增產物處于使它的探針區與擴增產物的互補區雜交的條件，和(c)監測所述樣品的熒光，并且確定特定的反應條件，所述序列的特征，在所述條件下，由于探針區與樣品的雜交或在探針區和靶核酸序列之間形成的雙鏈體的脫穩定化而導致熒光變化。
合適的反應條件包括溫度，電化學條件，或對特定酶或化學物質的存在的反應。通過監測當所述特性改變時熒光的變化，可以獲得所述序列精確性質的特有信息。例如，對于溫度來說，可以確定由于加熱而導致的樣品中的探針與所述序列分發生分離的溫度。例如，在檢測以及在遺傳診斷中需要定量多態性和/或等位變異時是極其有用的。“多態性”包括轉換，顛換，插入，缺失或倒位，這種現象可能發生在序列上，特別是自然出現的。
如果靶序列僅有一個堿基對的差別的話，解鏈的滯后將是不同的。因此，舉例來說，當一種樣品只包括一種等位變體時，所述探針區的解鏈溫度是特別有價值的，這一溫度不同于在僅含有另一種等位變體的樣品中的溫度。含有兩種等位變體的樣品具有相當于每一種等位變體的兩個解鏈點。
因此，在本發明的其他實施方案中，提供了一種用于檢測多態性和/或等位變異的方法，所述方法包括用本發明的方法擴增被懷疑含有所述多態性或變異的序列，用所產生的熒光信號測定探針區從擴增產物中的互補序列上解鏈的溫度，并且將這種信號與多態性或等位變異的存在相聯系。
類似的考慮適用于相應的電化學特征，或用于某些酶或化學物質的存在。可以將標記過的探針固定在固體表面上，在該表面上可以施加電化學電位。根據序列的確切性質，在特定電化學值下，下游靶序列能夠結合在所述探針上或者從所述探針排斥。
另外，探針雜交的動力學能夠以絕對值形式確定靶序列濃度。根據來自所述樣品的熒光變化，可以計算探針區與樣品的雜交速度。雜交速度的增加與樣品中所存在的靶序列的數量相關。隨著靶序列的濃度因為擴增反應的進行而提高，探針區的雜交將更快地進行。因此，該參數還可被用作定量的基礎。這種數據處理方式是有用的，因為它不直接依賴于信號強度而提供信息。
在本發明的另一種實施方案中，提供了一種用于本發明方法中的試劑盒，該試劑盒包括一種含有擴增引物的試劑，引物的5’末端通過化學鍵與對靶核苷酸序列特異的探針連接，其中，所述探針包括第一種標記，它可以起著供體或受體標記的作用；以及包括第二種標記的DNA嵌入試劑，所述第二種標記起著供體或受體標記的作用，其中，所述第一和第二種標記構成了供體-受體對。
如果必要的話，可以將所述探針固定在諸如磁珠的支持物上，或用于檢測器的支持物上，如消散性波檢測器裝置的波導管。所述試劑盒的其他可能在的成分，包括用于擴增反應的試劑，如DNA聚合酶。
非熒光受體分子的使用，還可用于披露于共同未決的國際專利申請號PCT/GB99/09054中的測定方法中。
下面將結合附圖，以舉例形式對本發明作具體說明，其中

圖1示意性地表示在本發明方法中發生的分子相互作用。
圖2表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統的循環次數的函數。
圖3表示用比較性現有技術的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統的循環次數的函數。
圖4表示用現有技術的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統的循環次數的函數。
圖5表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統的循環次數的函數。
圖6表示用比較性現有技術方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統的循環次數的函數。
圖7表示用現有技術的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的腦膜炎基因的腦膜炎系統的循環次數的函數。
圖8表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度衣原體基因的衣原體系統的循環次數的函數。
圖9表示用現有技術的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的衣原體基因的衣原體系統的循環次數的函數。
圖10表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的熒光，它是各種濃度的修飾基因的遺傳修飾過的大豆系統的循環次數的函數。和圖11表示用現有技術的TaqmanTM方法通過F1檢測器測定的熒光，它是各種濃度的修飾基因的GM大豆系統的循環次數的函數。
圖1示意性地表示在本發明方法中發生的分子相互作用。在所示出的擴增反應中，制備了DNA分子(1)，以便通過讓它與成對的擴增引物(2)，(3)接觸進行擴增。通過化學鍵(8)將引物之一(2)與包括受體標記(7)的探針(6)連接。在反應混合物中提供熒光供體成分(10)。
使DNA分子(1)成為單鏈形式(圖1B)，以便在擴增反應中，引物(2，3)分別作為正向和反向引物結合，正如眾所周知的。
在隨后的擴增反應過程中，積累了擴增子產物(9)(圖1C)。
在隨后的擴增階段，當該產物解鏈時，探針區(6)包括一個結合擴增子鏈中的互補區的受體標記(7)。嵌入劑部分(10)被夾雜在探針和所述產物之間。熒光嵌入劑部分(10)和受體標記(7)之間的FRET相互作用，在所述受體的特有波長下產生了一種信號。
然后可以用常規熒光檢測裝置監測來自受體分子(7)的信號。
本領域技術人員可以理解的是，對于本發明來說，使用第二種引物(3)不是必要的。另外，本領域技術人員可以理解的是，所述探針上的標記可以是供體標記，而所述嵌入劑部分可以是受體標記。
PCR擴增反應制備了含有具有工作濃度的以下試劑的PCR反應混合物。
其組成是50mM Trizma pH8.8，25℃，3mM氯化鎂，8％w/Vol.甘油，250ng/μl非乙酰化牛血清白蛋白，200μM dNTP′s PCR核苷酸，0.01單位/μl尿嘧啶-n-糖基化酶，0.04單位/μl Taq(外切5′-3′缺陷型)DNA聚合酶和0.0 3μM抗TaqStart抗-Taq抗體。
在添加到所述混合物中之前，將Taq DNA聚合酶和TaqStart抗-Taq抗體一起溫育10分鐘。
作為熒光供體標記，將SYBRGold添加到反應混合物中，最終濃度為參考溶液的1∶20,000-1∶200,000的稀釋度。
使用Taq DNA聚合酶以便確保所述試劑在反應過程中不會被水解。發現這種聚合酶的使用不是必須的，因為在本發明的方法中使用了非常短的保持時間。
靶模板研究了若干種靶模板和相關的基因。下面列舉了這些靶模板的基因。
靶模板基因人胎盤DNA ABI人β-肌動蛋白擴增子大豆 Le1凝集素遺傳修飾過的大豆 CP4 EPSPS腦膜炎萘瑟氏菌PorA沙眼衣原體Ct質粒為每一種靶基因制備了包括探針和引物的常規新型寡核苷酸試劑。每一種試劑具有以下一般性結構FL-PROBE-HEG-PRIMER，其中，FL是熒光部分，PROBE是探針序列，HEG是HEG(六乙二醇)，而PRIMER是引物序列，它能與合適的靶序列雜交。所述試劑可以從OswelResearch Products Ltd.，UK獲得。用于本發明方法中具有相同的一般性結構的試劑可以按照WO01/11078中披露的方法制備。
下面列舉了相應于每一種基因的試劑的結構基因試劑結構肌動蛋白$atgccctcccccatgccatcctgcgt*cagcggaaccgctcattgccaatgg (Seq No.1)凝集素 $tgccttctttctcgcaccaattgaca*cctgcatgtgtttgtggctt (seq.No.2)CP4 $ccttcatgttcggcggtctcgc*atgcgcgtttcaccgct (Seq.No.3)PorA$tcagcqgcagcgtccaattcg*acttgctgttttgggccg (Seq.No.4)PorA$ccaaacgcacttccgccatog*tcagccaagogccagac (Seq.No.5)Ct $tatgcttacacatttatcgactqggtgattacagc*ttttcgtctctttttcgcagc (Seq.No.6)$-5′Cy5標記*-HEG連接基團根據需要，改變要檢測的基因序列的濃度。所述試劑的最終濃度為0.2μM。
通過使用類似的TaqmanTM測定方法和WO99/28500的方法重復所述實驗，比較本發明方法和現有方法的性能。
熱循環實時PCR容器和消耗品是從Roche公司獲得的。用常規技術對該儀器進行校正。發現用特定產品和SYBRGold運行顏色校正程序是非常有利的。還發現用Cy5運行顏色校正程序是有利的。
熱循環方案如下對于本發明的方法和WO99/28500的方法來說50℃，保持1分鐘，以便進行抑制95℃，保持1分鐘，以便開始變性50輪(95℃，5秒；60℃，5秒；74℃5秒，5秒延伸，收集熒光)對于TaqmanTM來說50℃，保持1分鐘，以便進行抑制95℃，保持1分鐘，以便開始變性50輪(95℃，5秒；60℃，20-120秒；在步驟結束時收集熒光)以上結果表明，本發明的方法明顯快于使用現有TaqmanTM分析的方法。
所述熱循環PCR儀使用3個檢測器，它們是F1，F2和F3。F1在520nm波長下工作，優化而檢測SYBRGold和熒光素的發射。F2在640nm波長下工作，優化而檢測LC640產生的信號。F3在705nm波長下工作，優化而與LC705一起使用。
F1(520nm/熒光素)光學檢測器，被用于檢測由SYBRGold嵌入染料所產生的非鏈特異性擴增信號。F3(705nm/LC705染料)光學檢測器被用于使用由探針的Cy5部分產生的信號檢測特異產物的擴增。所述探針系統使用Cy5，而不是LC705，因為這樣在寡核苷酸合成期間能產生更好的結合染料。
實施例1-β-激動蛋白基因的檢測和定量圖2表示通過F3檢測器測定的熒光，它是用本發明的方法作為各種濃度的人DNA的β-肌動蛋白系統的循環次數的函數形式測定的。每一組數據表示特定循環次數的低水平的本底反應，它取決于所述樣品內的DNA濃度。在每一組數據內，所觀察到的熒光在某些循環次數下顯著增強，這取決于樣品中人DNA的濃度。熒光是通過結合于引物下游的擴增產物的所述試劑的探針部分產生的。這一結合過程使Cy5部分靠近了SYBRGold。SYBRGold發出熒光，所發射的光線被Cy5部分吸收。然后，Cy5本身發射光線，由F3檢測器檢測所發出的光線。隨著循環次數的進一步增加，熒光達到最大值，然后緩慢減弱。這種現象被認為是由于所述探針部分被擴增產物所取代(通常稱之為“鉤子效應”，這種現象還出現在雙雜交探針報導化學中)而導致的。
對圖2A的數據組進行分析，產生了圖2B所示的定量曲線。所述曲線的相關系數接近1.0，這表明本發明的方法在核酸序列的定量和鑒定方面是很出色的。
圖3表示用WO99/28500的測定方法獲得的β-肌動蛋白基因的比較數據。圖3A表示以循環次數的函數形式測定的熒光。對于β-肌動蛋白系統來說，是作為DNA濃度的函數形式測定的。通過現有系統獲得的數據的噪音，比通過本發明方法獲得的數據的噪音更高。另外，使用本發明的方法，反應梯度更陡，并且使用本發明的方法，循環閾值同樣略低一些。通過比較圖2B和3B證實了這一發現。
圖4表示用現有方法通過TaqmanTM測定獲得的比較數據。與本發明的曲線相比，其反應曲線相對矮一些。此外，與本發明的方法相比，TaqmanTM方法非常慢。
實施例2-porA基因的鑒定和定量圖5表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度的人DNA的腦膜炎系統的循環次數的函數的熒光。所示出的數據使用了具有Seq.No.5的結構的試劑。每一組數據表示特定循環次數的低水平的本底反應，取決于樣品內DNA的濃度。在每一組數據中，觀察到的熒光在特定循環次數下急劇增強，這取決于樣品中人DNA的濃度。
圖6表示用WO99/28500的測定方法獲得的porA基因的比較數據。
圖7表示用現有技術的TaqmanTM方法獲得的比較數據。同樣，與本發明的曲線相比，所述反應曲線較矮。另外，與本發明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。與本發明的方法相比，TaqmanTM反應曲線的噪音較大，并且由所述數據產生的定量曲線產生了更低的相關系數。
實施例3-Ct質粒DNA的鑒定和定量圖8表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度的人DNA的衣原體系統的循環次數的函數的熒光。每一組數據表示特定循環次數的低水平本底反應，取決于樣品內DNA的濃度。在每一組數據中，觀察到的熒光在特定循環次數下急劇增強，這取決于樣品中人DNA的濃度。
圖9表示用現有技術的TaqmanTM方法獲得的數據。同樣，與本發明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。
實施例4-CP4 EPSPS基因的鑒定和定量圖10表示用本發明的方法通過F3檢測器測定的作為各種濃度修飾基因的遺傳修飾過的大豆系統的循環次數的函數的熒光。該圖還示出了由lect系統產生的熒光。它是各種濃度的所述修飾基因的循環次數的函數。在每一組數據中，所觀察到的熒光在特定循環次數下急劇增強，這取決于樣品中相關基因的濃度。所述lect系統可有效用作對照，正如所預料的，熒光和循環次數的反應曲線實際上不取決于所述修飾基因的濃度。對于修飾基因系統來說，可以看出的是，修飾基因濃度的提高導致了熒光急劇增強所需要的循環次數的減少。
圖11表示用現有技術的TaqmanTM方法獲得的比較數據。同樣，與本發明的曲線相比，所述反應曲線較矮。另外，與本發明的方法相比，TaqmanTM方法非常緩慢。
應當指出的是，實際上在所有場合下，用現有技術的TaqmanTM方法獲得的數據的噪音都比用本發明方法獲得的數據的噪音高。另外，反應曲線也比本發明的反應矮，并且用本發明方法獲得的數據所產生的定量曲線與TaqmanTM方法獲得的曲線相比，具有更高的相關系數。
本發明還提供了一種有可能非常快速的方法。本文所提供的本發明方法的數據，是使用設備在最快的可能工作模式下獲得的。人們認為，較短的探針長度有助于產生快速反應。因此，預計本發明方法的速度受實施該方法的儀器的現有參數的制約。
權利要求
1.一種用于檢測靶核酸序列在樣品中的存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進行核酸擴增(a)DNA雙鏈體結合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學連接基團與具有標記的探針連接，所述標記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴增產物上的互補區雜交，并且，其中，所述標記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結合試劑的熒光能量或為所述DNA雙鏈體結合試劑提供熒光能量；以及監測所述樣品的熒光。
2.如權利要求1的方法，其中，所述方法包括(a)向被懷疑含有靶核酸序列的樣品中添加DNA雙鏈體結合試劑，核酸聚合酶和試劑；(b)使所述樣品處于引物與靶核酸序列雜交，并且形成包括所述探針的擴增產物的條件；(c)使所述樣品處于標記過的探針與所述擴增產物上的互補區雜交的條件；和(d)在步驟(b)和(c)中的至少一個中監測所述樣品的熒光。
3.如權利要求1的方法，其中，所述擴增產物包括所述探針。
4.如權利要求1-3中任意一項的方法，其中，所述DNA雙鏈體結合試劑是嵌入染料。
5.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述DNA雙鏈體結合試劑包括一種供體標記，而所述探針包括受體標記。
6.如權利要求1-4中任意一項的方法，其中，所述DNA雙鏈體結合試劑包括一種受體標記，而所述探針包括供體標記。
7.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述受體標記是發射特征性波長的能量的熒光分子。
8.如權利要求7的方法，其中，所述受體標記是羅丹明染料或Cy5。
9.如權利要求1-6中任意一項的方法，其中，所述受體標記是暗受體。
10.如權利要求9的方法，其中，所述暗受體選自下列任意一種DABCYL，甲基紅，QSY-7二芳基羅丹明染料和6-(二甲基氨基)-2-[4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，3-丁間二烯基-1-乙基喹啉鎓高氯酸鹽(CAS號181885-68-7)。
11.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述擴增反應包括聚合酶鏈式反應(PCR)。
12.如權利要求1-8和11中任意一項的方法，其中，所述受體分子是熒光分子，并且，其中，監測供體和受體分子的熒光，并且計算這兩種發射之間的關系。
13.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，在擴增反應過程中監測來自所述樣品的熒光信號，并且將結果用于對存在于所述樣品中的靶序列的數量進行定量。
14.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，在擴增反應是在存在不與標記探針結合的其他相應的擴增引物的條件下進行的。
15.一種用于檢測核酸擴增的方法，包括在存在以下成分的條件下對靶多核苷酸進行核酸擴增(a)核酸聚合酶，(b)DNA雙鏈體結合試劑，和(c)含有擴增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學連接基團與具有第二種標記的探針連接，所述標記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴增產物上的互補區雜交，并且，其中，所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的一個包括一種供體標記，該標記能夠給所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的另一個提供熒光能量，所述DNA雙鏈體結合試劑或第二種標記中的另一個包括一種能吸收來自所述供體分子的熒光能量的受體標記，所述引物能夠與所述靶多核苷酸雜交；并且在擴增過程中監測熒光的變化。
16.如權利要求15的方法，其中，所述擴增是用一對引物進行的，所述引物是設計過的，以便只有DNA鏈上的靶核苷酸序列被擴增。
17.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述探針對于RNA的剪接區或DNA中的內含子是特異的，這樣，只檢測和/或定量擴增的RNA或擴增的DNA中的一種。
18.一種用于確定靶核酸序列特征的方法，該方法包括(a)在存在DNA雙鏈體結合試劑和一種包括擴增引物的試劑的條件下擴增所述序列，所述引物的5’末端通過化學鍵與一種探針連接，所述探針包括相似于所述靶序列的一個區域的序列，并且它還包括一種標記，當所述DNA雙鏈體結合試劑和所述標記中的一個是供體標記，而其中的另一個是受體標記時，所述供體標記能夠向所述受體標記提供熒光能量；以便形成摻入了探針區的擴增產物，(b)讓擴增產物處于使它的探針區與擴增產物的互補區雜交的條件，和(c)監測所述樣品的熒光，并且確定特定的反應條件，所述序列的特征，在所述條件下，由于探針區與樣品的雜交或在探針區和靶核酸序列之間形成的雙鏈體的脫穩定化而導致熒光變化。
19.一種用于檢測多態性和/或等位變異的方法，所述方法包括用權利要求1-16中任意一項的方法擴增被懷疑含有所述多態性或變異的序列，用所產生的熒光信號測定探針區從擴增產物中的互補序列上解鏈的溫度，并且將這種信號與多態性或等位變異的存在相聯系。
20.一種用于上述權利要求中任意一項的方法中的試劑盒，該試劑盒包括一種含有擴增引物的試劑，引物的5’末端通過化學鍵與對靶核苷酸序列特異的探針連接，其中，所述探針包括第一種標記，它可以起著供體或受體標記的作用；以及包括第二種標記的DNA嵌入試劑，所述第二種標記起著供體或受體標記的作用，其中，所述第一和第二種標記構成了供體-受體對。
全文摘要
一種用于檢測樣品中的靶核酸序列存在的方法，該方法包括在存在以下成分的條件下對所述樣品進行核酸擴增(a)DNA雙鏈體結合試劑，(b)核酸聚合酶，和(c)含有擴增引物的試劑，該引物能與單鏈形式的所述靶序列雜交，并且，它的5’末端通過化學連接基團與具有標記的探針連接，所述標記過的探針是與所述靶核酸序列相似的序列，以便它能夠與擴增產物上的互補區雜交，并且，其中，所述標記能夠吸收來自所述DNA雙鏈體結合試劑的熒光能量或為所述DNA雙鏈體結合試劑提供熒光能量；以及監測所述樣品的熒光。
文檔編號C12Q1/68GK1527885SQ02814133
公開日2004年9月8日 申請日期2002年5月24日 優先權日2001年5月25日
發明者M·A·李, M A 李 申請人:英國國防部