專利名稱：一種新的體外研究減輕瘢痕愈合的方法
技術領域：
本研究利用Smad3基因剔除的小鼠及其成纖維細胞對皮膚創傷愈合過程中的瘢痕形成進行了研究，并對減輕瘢痕形成的機制作了進一步的探索。
目前，已知有眾多的細胞因子參與創傷組織修復過程，其中包括血小板衍生生長因子(PDGF)(2)、轉化生長因子α(TGF-α)(3)、酸性或堿性成纖維細胞生長因子(FGFs)(3)、上皮細胞生長因子(EGF)(4)、胰島素樣生長因子(IGF1)(5)等。轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是這其中重要的一員(6)。
TGF-β是一個由分泌型的多肽信號分子構成的細胞因子超家族，包括TGF-βs、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形態形成蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)等(7)。TGF-β在創傷愈合過程中是起關鍵作用的活性分子。但到目前為止，TGF-βs具體的作用機制尚不完全清楚。目前的研究表明，TGF-βs在創傷愈合過程中具有趨化作用、削弱瘢痕形成、改變傷口愈合進度、控制纖維化等作用(8)。
創傷修復是個復雜、漸進的過程，其最終結果是閉合創面，恢復組織結構的完整性。在無法完全恢復時，即形成瘢痕。瘢痕形成過程涉及的因素很多。在創傷修復早期，主要以膠原蛋白、彈力纖維、纖維連接蛋白、層蛋白的胞外基質的合成與分泌的過程為主，以分解基質的酶類合成為輔。其主要功能是填補組織缺損、封閉創面。而在愈合的晚期，ECM逐漸機化融合，分解基質的酶類合成較為活躍，降解部分多余的ECM，形成瘢痕。所以瘢痕的形成就取決于ECM的沉積和降解這兩個進程的關系。已知具有降解ECM功能的酶種類有很多，主要的是被稱為基質金屬蛋白酶(MMP)的一類蛋白酶(9)。
基質金屬蛋白酶因為可以降解ECM、其活性中心部位含有Zn++、Ca++等金屬離子而得名，不同的MMP作用底物雖不盡的相同，但相互之間有廣泛的交叉。其中基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)，又稱明膠酶A，是膠原酶的一種，其作用底物為明膠、IV型、V型、VII型、X型和XII型膠原、彈性纖維、玻連蛋白、層蛋白以及可聚蛋白多糖(10)。MMP-2在正常組織中可以檢測到，主要功能在于維持ECM的自穩平衡。但在一些病理過程中，MMP-2則參與膠原分解、組織重建、血管發生以及腫瘤轉移等重要病理生理過程。
本發明的第一個方面，提供了一種在實驗動物體外研究減輕瘢痕愈合的方法。包括步驟3.1.1 利用同源重組技術產生Smad3基因缺失小鼠、Smad3基因雜合子小鼠和Smad3基因野生型小鼠。3.1.2 利用3.1.1中產生的Smad3基因雜合子小鼠并交配，取14天的小鼠胚胎，提取成纖維細胞并進行基因型鑒定。3.1.3 將步驟3.1.2獲得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纖維細胞進行傳代培養。3.1.4 將步驟3.1.2獲得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纖維細胞體外培養并檢測細胞培養液基質金屬蛋白酶的活性。3.1.5 將步驟3.1.2獲得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纖維細胞體外培養并檢測細胞中基質金屬蛋白酶mRNA的表達情況3.1.6 將步驟3.1.2獲得的Smad3野生型小鼠成纖維細胞轉染Smad3 cDNA的顯性負效片段pFlag-CMV2-Smad3Rev，用以阻斷Smad3基因mRNA的表達。3.1.7 將步驟3.1.6獲得的成纖維細胞進行培養，檢測細胞培養液中基質金屬蛋白酶的活性。3.1.8 將步驟3.1.6獲得的成纖維細胞進行培養，檢測細胞MMP-2 mRNA表達情況。3.1.9 將步驟3.1.2獲得的Smad3基因缺失的小鼠成纖維細胞轉染野生型Smad3基因pFlag-CMV2-Smad3，使其瞬時表達野生型Smad3。3.1.10 將步驟3.1.9獲得的成纖維細胞進行培養，檢測細胞培養液中MMP-2的活性。3.1.11 將步驟3.1.9獲得的成纖維細胞進行培養，檢測細胞MMP-2的mRNA表達情況。
本發明的第二個方面，提供了一種在實驗動物體內驗證減輕瘢痕愈合的方法。包括步驟3.2.1 利用同源重組技術產生Smad3基因缺失小鼠和Smad3基因野生型小鼠。3.2.2 將3.2.1產生的小鼠按基因型分組，作皮膚缺失性創傷，依不同時間段收集皮膚創傷組織作病理學分析。3.2.3 將3.2.1產生的小鼠依據基因型不同分組，作皮膚缺失創傷，依不同時間段收集皮膚創傷組織作免疫組織化學分析。3.2.4 將3.2.1產生的小鼠依據基因型進行分組，取血清檢測，比較其中MMP-2的活性。
具體實施方式
本發明人采用分子生物學方法，應用不同的Smad3基因型小鼠及其成纖維細胞進行創傷愈合瘢痕形成的研究。在創傷愈合的主要效應細胞一成纖維細胞中可見Smad3的缺失增加MMP-2的表達。主要表現為Smad3抑制MMP-2的活性及mRNA表達。在Smad3基因缺失的實驗動物—小鼠中可見皮膚創傷愈合后瘢痕形成輕。同時實驗動物血清中MMP-2活性的增高。這為研究減輕創傷愈合后瘢痕的形成提供了一個方法，即利用各種方法，阻斷Smad3在創傷愈合局部的表達或者提高局部的MMP-2的活性可以減輕創傷愈合后的瘢痕形成。
4.1 Smad3基因剔除小鼠成纖維細胞培養液中MMP-2活性增高。
4.2 Smad3基因剔除小鼠成纖維細胞MMP-2的mRNA表達量升高。
4.3 在成纖維細胞水平阻斷Smad3野生型的成纖維細胞Smad3 mRNA的表達增加細胞表達MMP-2并提高細胞培養液中MMP-2的活性。
4.4 在成纖維細胞水平補償Smad3缺失的成纖維細胞Smad3 mRNA表達抑制細胞表達MMP-2并降低細胞培養液中MMP-2的活性。
4.5 Smad3基因剔除小鼠創傷愈合瘢痕形成減輕。
4.6 Smad3基因剔除小鼠創傷局部MMP-2表達量增高。
4.7 Smad3基因剔除小鼠血清中MMP-2活性增高。
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權利要求
1.一種體外研究創傷愈合機制的方法，其特征在于通過同源重組和成纖維細胞體外培養技術獲得Smad3雙等位基因剔除、單等位基因剔除和野生型等三種Smad3基因型的成纖維細胞。
2.一種刺激成纖維細胞中MMP-2活性的方法，其特征在于通過剔除Smad3基因增強成纖維細胞培養液中MMP-2的活性。
3.一種刺激成纖維細胞中MMP-2活性的方法，其特征在于利用顯性負效原理將反義Smad3cDNA導入Smad3野生型成纖維細胞中阻斷Smad3 mRNA翻譯以增加MMP-2的活性。
4.利用如權利要求1所述的成纖維細胞進行MMP-2活性分析，尋找抑制Smad3活性的分子。
5.利用如權利要求1所述的成纖維細胞進行MMP-2活性分析，尋找刺激MMP-2活性的分子。
6.利用如權利要求1所述的成纖維細胞進行MMP-2活性分析，尋找MMP-2功能類此物。
7.利用如權利要求1所述的成纖維細胞進行減輕瘢痕形成的藥物篩選。
8.利用如權利要求1所述的成纖維細胞進行減輕瘢痕形成的藥物的評價。
9.利用如權利要求2所述的方法進行減輕瘢痕形成的藥物設計。
10.利用如權利要求3所述的方法進行減輕瘢痕形成的藥物設計。
全文摘要
本發明提供了一種利用抑制Smad3基因增強基質金屬蛋白酶－2(MMP－2)的活性以減輕創傷后瘢痕愈合的方法。包括步驟1)獲得不同Smad3基因型的成纖維細胞并進行基因型鑒定；2)構建Smad3顯性負效表達載體；3)通過顯性負效方法抑制成纖維細胞的Smad3 mRNA的翻譯使MMP－2mRNA的表達升高及MMP－2活性增加；4)將野生型Smad3導入到Smad3缺失的成纖維細胞中可抑制MMP－2的活性和mRNA的表達。本發明還提供了研究創傷愈合瘢痕形成的機理以及用于研制減輕瘢痕形成的分子與藥物的方法。以及利用Smad3基因剔除的成纖維細胞研究減輕瘢痕形成的分子機制，為獲得可應用于臨床的減輕瘢痕形成的分子或藥物提供理論基礎與研究方向，即利用各種方法，阻斷Smad3在創傷愈合局部的表達或者提高局部的MMP－2的活性可以減輕創傷愈合后的瘢痕形成。
文檔編號C12Q1/02GK1451743SQ0211740
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月19日 優先權日2002年4月19日
發明者楊曉, 黃翠芬, 毛春明, 呂婭歆, 周江 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所